CN115916224A - 靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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M·R·吴
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Abstract

本公开的主题提供特异性靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)和包含这种靶向CD19的CAR的细胞。本公开的主题还提供靶向CD19的CAR用于治疗，例如用于治疗血癌的用途。

Description

靶向CD19的嵌合抗原受体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月24日提交的美国临时申请第63/015,362号和2020年9月1日提交的美国临时申请第63/073,133号的优先权，将其中每个的内容整体通过引用并入本文，并要求其中每个的优先权。
技术领域
本公开的主题提供了使用包含特异性靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的细胞治疗赘生物(例如癌症)的方法。
背景技术
基于细胞的免疫疗法是对癌症治疗具有治愈潜力的疗法。T细胞和其它免疫细胞通过引入编码针对抗原的人工或合成受体的遗传物质被修饰为靶向肿瘤抗原，所述受体称为嵌合抗原受体(CAR)，其对所选择的抗原具有特异性。使用CAR的靶向T细胞疗法已经显示最近在治疗血液恶性肿瘤中获得临床成功。
表达具有来自小鼠单克隆抗体的结合结构域的CD19特异性CAR的T细胞已显示可治疗B细胞恶性肿瘤。对CAR的小鼠scFv抗原结合结构域具有特异性的T细胞介导的免疫应答可在人类患者中发生，并导致CAR T细胞的过早消除，增加肿瘤复发的风险。因此，需要改善的靶向CD19的CAR，其毒性和免疫原性降低和/或安全性和有效性提高。
发明内容
本公开的主题提供靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)、包含该靶向CD19的CAR的细胞、以及所述细胞用于治疗，例如用于治疗赘生物的用途。
在某些实施方式中，CAR包括特异性结合CD19的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括单链可变片段(scFv)、Fab或F(ab)2。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括scFv。在某些实施方式中，scFv是人scFv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括(a)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；和/或(b)轻链可变区，其包括：
i)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
ii)包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
iii)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
iv)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
v)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
vi)包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
vii)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；或
viii)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ IDNO:65中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包含与SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，轻链可变区包含与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，轻链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，轻链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含与SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％同一性或同源性的氨基酸序列；并且轻链可变区包含与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:64中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括重链可变区和轻链可变区之间的接头。在某些实施方式中，接头由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，重链可变区和轻链可变区位置从N末端到C末端为：VL-VH。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括或是scFv，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:23中所示氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方式中，跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、或BTLA多肽。在某些实施方式中，跨膜结构域包含CD28多肽。
在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ多肽。在某些实施方式中，CD3ζ多肽是修饰的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、由两个功能缺失突变组成的ITAM2变体和由两个功能缺失突变组成的ITAM3。在某些实施方式中，天然ITAM1由SEQ ID NO:31中所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，ITAM2变体由SEQID NO:37中所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，ITAM3变体由SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域还包括至少一个共刺激信号传导区。在某些实施方式中，所述至少一个共刺激信号传导区包括CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽、或其组合。在某些实施方式中，所述至少一个共刺激信号传导区包括CD28的细胞内结构域或其部分、4-1BB的细胞内结构域或其部分、OX40的细胞内结构域或其部、ICOS的细胞内结构域或其部分、或DAP-10的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，所述至少一个共刺激信号传导区包括CD28多肽。
在某些实施方式中，CAR由载体表达。在某些实施方式中，所述载体是逆转录病毒载体。
本公开的主题还提供了包含本文公开的CAR的细胞。在某些实施方式中，细胞由CAR转导。在某些实施方式中，CAR在细胞表面上组成性表达。在某些实施方式中，细胞是免疫应答细胞。在某些实施方式中，细胞是淋巴谱系细胞或骨髓谱系细胞。在某些实施方式中，细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、从中可分化淋巴样细胞的干细胞、和从中可分化髓样细胞的干细胞。在某些实施方式中，细胞是T细胞。在某些实施方式中，T细胞选自辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞和γδT细胞。在某些实施方式中，细胞是NK细胞。在某些实施方式中，NK细胞源自干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，多能干细胞是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
此外，本公开的主题提供编码本文公开的CAR的核酸分子。在某些实施方式中，核酸分子还包含可操作地连接至CAR的启动子。所述启动子可以是内源性或外源性的。在某些实施方式中，所述启动子是外源性启动子。在某些实施方式中，所述外源性启动子选自延伸因子(EF)-1启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)启动子、猿猴病毒40早期启动子(SV40)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、金属硫蛋白启动子、和泛素C启动子。在某些实施方式中，所述启动子是内源性启动子。在某些实施方式中，所述内源性启动子选自TCRα启动子、TCRβ启动子、和β2-微球蛋白启动子。在某些实施方式中，所述启动子是诱导型启动子。在某些实施方式中，所述诱导型启动子选自NFAT转录应答元件(TRE)启动子、CD69启动子、CD25启动子、IL-2启动子、4-1BB启动子、PD1启动子、和LAG3启动子。
本公开的主题还提供包含本文公开的核酸分子的载体。在某些实施方式中，所述载体是逆转录病毒载体。
本公开的主题还提供表达本文公开的核酸分子的细胞。在某些实施方式中，所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
本公开的主题提供包含本文公开的细胞的组合物。在某些实施方式中，所述组合物是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方式中，所述组合物包含约1×106至约5×108个细胞。在某些实施方式中，所述组合物包含约1×106至约1×108个细胞。在某些实施方式中，所述组合物包含约1×106至约5×107个细胞。在某些实施方式中，所述组合物包含约2.5×107个细胞。
本公开的主题还提供使用本公开的细胞的各种方法。本公开的主题提供减少受试者的肿瘤负荷的方法。在某些实施方式中，所述方法包括向受试者施用本文公开的细胞或组合物。在某些实施方式中，所述方法减少受试者中肿瘤细胞的数量、减小受试者中肿瘤大小和/或根除受试者中肿瘤。
本公开的主题提供增加或延长患有赘生物的受试者的生存期的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用本文公开的细胞或组合物。
本公开的主题提供治疗和/或预防受试者中的赘生物的方法。在某些实施方式中，所述方法包括向受试者施用本文公开的细胞或组合物。
本公开的细胞和组合物可用于治疗。在某些实施方式中，本公开的细胞和组合物用于治疗和/或预防受试者中的赘生物。在某些实施方式中，本公开的细胞和组合物用于增加或延长患有赘生物的受试者的生存期。在某些实施方式中，本公开的细胞和组合物用于治疗和/或预防受试者中的赘生物。
在某些实施方式中，肿瘤和/或赘生物与CD19相关。在某些实施方式中，肿瘤和/或赘生物是血癌。在某些实施方式中，血癌选自多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。在某些实施方式中，所述白血病选自急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急早幼粒细胞白血病(APL)、混合表型急性白血病(MLL)、毛细胞白血病和B细胞前淋巴细胞白血病。在某些实施方式中，淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在某些实施方式中，肿瘤和/或赘生物是B细胞恶性肿瘤。在某些实施方式中，B细胞恶性肿瘤选自B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、具有Richter转化的CLL、和CNS淋巴瘤。在某些实施方式中，肿瘤和/或赘生物是B细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，B细胞淋巴瘤是复发性或难治性(R/R)B细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，受试者是人受试者。
此外，本公开的主题提供用于生产包含本公开的CAR的细胞的方法。在某些实施方式中，所述方法包括将编码本文公开的CAR的核酸分子引入细胞。
此外，本公开的主题提供用于减少受试者的肿瘤负荷、治疗和/或预防受试者中的赘生物和/或增加或延长患有赘生物的受试者生存期的试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒包括本文公开的细胞。在某些实施方式中，试剂盒还包括使用细胞来减少受试者的肿瘤负荷、治疗和/或预防受试者中的赘生物和/或增加或延长患有赘生物的受试者生存期的书面说明。
附图说明
图1A和1B描述了包含靶向CD19的CAR的T细胞对表达CD19的细胞的细胞毒性。图1A显示了对表达CD19的Raji癌细胞系的杀伤。图1B显示了对敲除CD19的Raji细胞的杀伤。阳性对照为1928z-1XX CAR。
图2A和2B描述了包含靶向CD19的CAR的T细胞对表达CD19的细胞的细胞毒性，通过基于流式的杀伤评估测量。图2A显示了对表达CD19的Raji癌细胞系的杀伤。图2B显示了对敲除CD19的Raji细胞的杀伤。阳性对照为1928z-1XX CAR。
图3A和3B描述了包含靶向CD19的CAR的T细胞分泌IL-2细胞因子的情况。图3A显示了与表达CD19的Raji癌细胞系共培养的包含靶向CD19的CAR的T细胞分泌IL-2细胞因子的情况。图3B显示了与敲除CD19的Raji细胞共培养的包含靶向CD19的CAR的T细胞分泌IL-2细胞因子的情况。阳性对照为1928z-1XX CAR。
图4A和4B描述了包含靶向CD19的CAR的T细胞分泌IFN-γ细胞因子的情况。图4A显示了与表达CD19的Raji癌细胞系共培养的包含靶向CD19的CAR的T细胞分泌IFN-γ细胞因子的情况。图4B显示了与敲除CD19的Raji细胞共培养的包含靶向CD19的CAR的T细胞分泌IFN-γ细胞因子的情况。阳性对照为1928z-1XX CAR。
图5显示了包含靶向CD19的CAR的T细胞的体内抗肿瘤活性。#17是阴性对照，其是没有可检测的体内活性的靶向CD19的CAR。
图6显示了CD19-HSA-His10的氨基酸序列。
图7显示了#2scFv、SJ25c1 scFv和FMC63 scFv的结合数据。在Biacore表面等离子体共振(SPR)测定中评估可溶性CD19抗原中共同表位的相对竞争。将可溶性CD19特异性抗体(FMC63或SJ25c1)和CD19抗原的混合物流到含有#2scFv的芯片上，以确定#2scFv是否与SJ25c1 scFv和FMC63-scFv相同的表位交叉竞争。19(T2)代表“#2scFv”。
图8描述了包含#2CAR的γ逆转录病毒载体。“19(T2)”代表“#2”。#2CAR包含CD19特异性T2(19(T2))scFv(或“#2scFv”)、CD8α前导肽、CD28基因片段和修饰的CD3ζ细胞内信号传导结构域。CD28基因片段包括其细胞外铰链、跨膜和细胞内结构域。修饰的CD3ζ链具有一个功能性野生型和两个突变的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，称为“1XX”。修饰的CD3ζ细胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。CD3ζ-1XX的氨基酸序列与CD3ζ-野生型的比对如图9所示。两个序列之间的氨基酸差异被标记。
图9描述了CD3ζ-1XX的氨基酸序列与CD3ζ-野生型的比对。
图10描述了#2CAR-T细胞和1928z-1XX CAR-T细胞的体外细胞毒性活性。“19(T2)28z1xx”代表“#2CAR”。
图11描述了#2CAR T细胞和1928z-1XX CAR T细胞消除肿瘤的情况。“19(T2)28z1xx”代表“#2CAR”。
图12描述了包含1928z CAR的γ逆转录病毒载体。野生型hCD3ζ的氨基酸序列在图9中显示为SEQ ID NO:30。
图13描述了γ-逆转录病毒转导的CD4+和CD8+T细胞中CAR的表达情况。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图14描述了表型1928z CAR T细胞和#2CAR T细胞。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图15描述了#2CAR T细胞和1928z CAR T细胞消除肿瘤的动力学。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。每条曲线代表一只小鼠的肿瘤负荷。
图16描述了静脉内输注#2CAR T细胞或1928z CAR T细胞后携带NALM6白血病小鼠的存活情况。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图17描述了用#2CAR T细胞或1928z CAR T细胞治疗的小鼠骨髓中CAR T的定量和表型(第17天)。所有数据均为均值±标准误差，使用双尾非配对学生t检验计算p值。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图18描述了用#2CAR T细胞或1928z CAR T细胞治疗后小鼠的体重。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。星号表示计划外死亡发生的时间点。较短的曲线表示所有小鼠在指定时间点的损失。
图19描述了输注后第10天和27/28天用1×106个CAR T细胞治疗的小鼠血清中肝酶的定量。对同一天的两个队列进行统计比较。所有数据均为平均值±s.e.m；使用双尾非配对学生t检验计算p值。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图20描述了在输注后第10天和第27/28天用1×106个#2CAR T细胞或1928z CAR T细胞治疗的小鼠中人细胞因子水平的定量。所有数据均为平均值±s.e.m；使用双尾非配对学生t检验来计算p值。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图21输注后第10天和第27/28天用1×106个#2CAR T细胞或1928z CAR T细胞治疗的小鼠中小鼠细胞因子水平的定量。所有数据均为平均值±标准误差；使用双尾非配对学生t检验来计算p值。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图22描述了在输注后27/28天用#2CAR T细胞和1928z CAR T细胞治疗的小鼠中基本血细胞的定量。所有数据均为平均值±s.e.m；使用双尾非配对学生t检验来计算p值。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图23描述了输注后27/28天用#2CAR T细胞和1928z CAR T细胞治疗的小鼠的体重和关键器官重量的比较。每组小鼠的数量如图中图例所示。所有数据均为平均值±标准误差；使用双尾非配对学生t检验来计算p值。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图24描述了用CAR T细胞治疗的小鼠的肝脏、脾脏和骨髓中淋巴细胞和肿瘤浸润的定量。所有数据均为平均值±s.e.m；使用双尾非配对学生t检验来计算p值。“19(T2)28z1XX”代表“#2CAR”。
图25描绘了与表达CD19的Raji和NALM-6细胞野生型和CD19敲除型结合的抗CD19抗体的示例性流式细胞术色谱图。
图26A-26C描绘了在NALM-6细胞上结合CD19的抗CD19抗体的示例性结合曲线。
具体实施方式
本公开的主题提供特异性靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)和包含这种靶向CD19的CAR的细胞。所述细胞可以是免疫应答细胞，例如基因修饰的免疫应答细胞(例如T细胞或NK细胞)。本公开的主题还提供细胞和包含其的组合物用于治疗例如治疗赘生物的用途。本公开的靶向CD19的CAR显示出比其他靶向CD19的CAR更安全和/或更有效，例如，如其更强的持久性所证明的(参见实施例6和7)。这种更强的持久性也被证明不会带来安全风险。因此，本公开的靶向CD19的CAR T细胞可以以比当前免疫治疗中使用的大多数靶向CD19的CAR T细胞更低的剂量使用。本公开的靶向CD19的CAR T细胞预计更安全，例如，因此，副作用更少，包括但不限于细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性(NT)的发生率更低。
本公开的非限制性实施方式通过本说明书和实施例进行描述。
出于使本公开清楚的目的，而不是通过限制的方式，将详细描述分为以下小节：
5.1.定义；
5.2.CD19；
5.3.嵌合抗原受体(CAR)；
5.4.细胞；
5.5.核酸分子和载体；
5.6.剂型和给药；和
5.7.治疗方法。
5.1.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本公开主题所属领域的技术人员通常理解的含义。
本文使用的术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量***的局限性。例如，根据本领域的惯例，“约”可以指在3个或多于3个标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值的高达20％、优选高达10％、更优选高达5％、再更优选高达1％的范围。或者，特别是关于生物***或过程，该术语可以表示在数值的一个数量级内、优选在5倍以内、更优选在2倍以内。
本文使用的术语“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞或其祖细胞或其后代。在某些实施方式中，免疫应答细胞是淋巴谱系的细胞。淋巴谱系细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞和从中可分化淋巴样细胞的干细胞。在某些实施方式中，免疫应答细胞是骨髓谱系细胞。
本文使用的术语“激活免疫应答细胞”是指信号转导的诱导或细胞中蛋白质表达的变化，导致免疫应答的启动。例如，当CD3链响应于配体结合和免疫受体酪氨酸抑制基序(ITAM)聚集时，就会产生信号转导级联反应。在某些实施方式中，当CAR与抗原结合时，发生免疫突触的形成，其包括在结合受体(例如，CD4或CD8，CD3γ/δ/ε/ζ等)附近的许多分子的聚集。膜结合信号传导分子的这种聚集使CD3链中包含的ITAM基序磷酸化。该磷酸化反过来启动了T细胞激活通路，最终激活转录因子，例如NF-κB和AP-1。这些转录因子诱导T细胞的整体基因表达，从而增加IL-2的产生，促进主调节T细胞蛋白的增殖和表达，进而启动T细胞介导的免疫应答。
本文使用的术语“刺激免疫应答细胞”是指导致强烈和持续的免疫应答的信号。在某些实施方式中，这发生在免疫应答细胞(例如，T细胞)激活之后或通过包括但不限于CD28、4-1BB、OX40、CD40和ICOS的受体同时介导。接收多种刺激信号对于建立强烈且长期的T细胞介导的免疫应答可能很重要。T细胞可以迅速被抑制并且对抗原无应答。尽管这些共刺激信号的作用可能有所不同，但它们通常会导致基因表达增加，从而产生长寿命、增殖性和抗凋亡性T细胞，其对抗原应答强烈，可彻底和持续根除。
如本文所用，“互补决定区”或“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在某些实施方式中，可变结构域的“CDR”是根据Kabat、Chothia、Kabat和Chothia的累积、AbM、接触(contact)和/或构象定义或本领域众所周知的任意CDR测定方法识别的可变区内的氨基酸残基。可以将抗体CDR识别为最初由Kabat等人定义的高变区。参见，例如Kabat等人,1992,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,NIH,Washington D.C。还可以将CDR的位置识别为最初由Chothia等描述的结构环结构。参见，例如Chothia等人,Nature 342:877-883,1989。CDR识别的其它方法包括“AbM定义”，其是Kabat与Chothia之间的折中，并且使用Oxford Molecular的AbM抗体模型化软件(现在的
Figure BDA0003988369050000151
)衍生或基于MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745,1996中举出的基于观察到的抗原接触的CDR的“接触定义”。在另一个方法中，本文称作CDR的“构象定义”是CDR的位置可以被识别为对抗原结合提供热焓贡献的残基。参见，例如Makabe等人,Journal ofBiological Chemistry,283:1156-1166,2008。另外的CDR边界定义并不严格遵循上述方法之一，尽管如此，但与Kabat CDR的至少一部分重叠，不过，它们可以根据预测或实验发现缩短或延长，所述预测或实验发现为特定残基或残基组乃至完整CDR并不显著影响抗原结合。在一些实施方式中，CDR可以指本领域已知的任意方法包括方法的组合定义的CDR。本文使用的方法可以应用根据这些方法的任意方法定义的CDR。对于含有一种以上CDR的任意给定的实施方式，可以根据Kabat、Chothia、扩展的、AbM、接触和/或构象定义的任意来定义CDR。通常，抗体在可变区中包含三个重链和三个轻链CDR或CDR区。CDR提供大多数接触残基，以使抗体与抗原或表位结合。在某些实施方式中，使用Kabat编号***勾勒CDR区。
本文使用的术语“单链可变片段”或“scFv”是免疫球蛋白(例如小鼠或人)的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其共价连接形成VH::VL异二聚体。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过肽编码接头(例如，10、15、20、25个氨基酸)连接，其将VH的N末端与VL的C末端连接或将VH的C末端与VL的N末端连接。接头通常富含用于柔性的甘氨酸，以及用于溶解性的丝氨酸或苏氨酸。接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。接头的非限制性实例公开于Shen等,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010，其内容整体并入本文以供参考。在某些实施方式中，接头是G4S接头。
在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或由其组成，其在下文提供：
Figure BDA0003988369050000161
在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列或由其组成，其在下文提供：
Figure BDA0003988369050000162
在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列或由其组成，其在下文提供：
Figure BDA0003988369050000163
在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列或由其组成，其在下文提供：
Figure BDA0003988369050000164
如本文所用，术语“基本同一性”或“基本同源性”是指与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任意氨基酸序列)或参考核酸序列(例如，本文描述的任意核酸序列)表现出至少约50％同一性或同源性的多肽或核酸分子。在某些实施方式中，这样的序列与用于比较的氨基酸序列或核酸序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％同一性或同源性。
序列同一性可以通过使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包，威斯康星州麦迪逊市53705大学大道1710号，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)进行测量。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其它修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率得分指示密切相关的序列。
可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的算法确定两个氨基酸序列之间的同源性百分比，该算法已合并到ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120重量残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的同源性百分比可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法来确定，该算法已被整合到GCG软件包(可从www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。另外或可替代地，本公开的主题的氨基酸序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如识别相关序列。可以使用Altschul等((1990)J.Mol.Biol.215:403-10)的XBLAST程序(2.0版)执行此类搜索。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本文公开的指定序列(例如，scFv703的重链和轻链可变区序列)同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变本公开的包含氨基酸序列的靶向CD19的CAR(例如，CAR的细胞外抗原结合结构域)的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰可以包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域中。氨基酸可根据其物理化学性质(例如电荷和极性)分为几组。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被相同组内的氨基酸取代的氨基酸取代。例如，氨基酸可以按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸，异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。另外，氨基酸可以按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，CDR区内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同组的其它氨基酸残基取代，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的抗体的保留功能(即，上述(c)至(l)中列出的功能)。在某些实施方式中，在指定序列或CDR区内不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基被改变。
如本文所用，术语“有效量”是足以在治疗时影响有益或期望的临床结果的量。可以以一个或多个剂量向受试者施用有效量。在某些实施方式中，有效量可以是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病进展或以其他方式降低疾病的病理后果的量。有效量可以由医生根据具体情况确定并且在本领域技术人员的技能范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常要考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾病、疾病的严重程度以及所施用的细胞的形式和有效浓度。
如本文所用，术语“赘生物”是指以细胞或组织的病理性增生及其随后向其它组织或器官的迁移或侵袭为特征的疾病。瘤形成的生长通常是不受控制的和进行性的，并且在不引起正常细胞增殖或者导致正常细胞增殖停止的条件下发生。赘生物可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自以下的器官：膀胱、骨骼、大脑、***、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺、***、神经组织、卵巢、胰腺、***、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道，子宫和***、或其组织或细胞类型。赘生物包括癌症，例如肉瘤、肿瘤或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。赘生物可以是原发性肿瘤或原发性癌症。
如本文所用，术语“信号序列”或“前导序列”是指存在于新合成的蛋白质的N-末端，指导它们进入分泌通路的肽序列(例如5、10、15、20、25或30个氨基酸)。
术语“包含”，“包括”旨在具有美国专利法中赋予它们的广义含义，并且可以表示“含有”，“包含”等。
如本文所用，“治疗”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗作用包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、和缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗不仅可以预防在受影响或诊断的受试者或怀疑患有该病症的受试者中由于病症引起的恶化，而且治疗可以在有患病症或怀疑患有该病症风险的受试者中预防该病症的发作或该病症的症状。
本文中的“个体”或“受试者”是脊椎动物，例如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类动物，例如猿和猴子。
5.2.CD19
CD19是一种细胞表面95kDa糖蛋白，存在于正常B细胞发育早期直至分化为浆细胞。CD19不存在于其他正常组织中，包括多能血干细胞。其在B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病和一组急性髓系白血病中表达，这使其成为免疫治疗的一个有吸引力的靶点，其自身免疫疾病(B细胞再生障碍除外)或不可逆骨髓毒性的风险最小。
CD19是免疫球蛋白超家族的成员以及细胞表面信号转导复合物的组成部分，该复合物包括Leu13、CD81和CD21，其通过B细胞受体积极调节信号转导。
在某些实施方式中，本公开的CAR与人CD19结合。在某些实施方式中，人CD19包含NCBI参考号：NP_001171569.1(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或由其组成。
SEQ ID NO:5如下提供：
Figure BDA0003988369050000201
在某些实施方式中，人CD19包含NCBI参考号：NP_001761.3(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列或由其组成。
SEQ ID NO:6如下提供：
Figure BDA0003988369050000202
在某些实施方式中，CAR结合CD19的细胞外结构域。在某些实施方式中，CAR与人CD19的细胞外结构域结合。在某些实施方式中，人CD19的细胞外结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸20-291或由其组成。在某些实施方式中，人CD19的细胞外结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸20-291或由其组成。
在某些实施方式中，CD19包含与SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方式中，CD19包含与SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
5.3.嵌合抗原受体(CAR)
CAR是工程化受体，其将目的特异性移植或赋予免疫效应细胞。CAR可用于将单克隆抗体的特异性移植到细胞上，例如免疫应答细胞，例如T细胞或NK细胞；通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。
共有三代CAR。“第一代”CAR通常由细胞外抗原结合结构域(例如scFv)组成，该结构域与跨膜结构域融合，而跨膜结构域与细胞内信号传导结构域融合。“第一代”CAR可以提供从头抗原识别，并通过单个融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域激活CD4+和CD8+T细胞，而与HLA介导的抗原呈递无关。“第二代”CAR将来自共刺激分子(包括但不限于CD28、4-1BB、ICOS、OX40)的细胞内信号传导结构域添加到CAR的胞质尾区，以向细胞提供其它信号。“第二代”CAR包括提供共刺激(例如CD28或4-1BB)和激活(CD3ζ)的CAR。“第三代”CAR包括提供多重共刺激(例如，CD28和4-1BB)和激活(CD3ζ)的那些。在某些实施方式中，靶向CD19的CAR是第一代CAR。在某些实施方式中，靶向CD19的CAR不包含共刺激分子的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，靶向CD19的CAR是第二代CAR。在某些实施方式中，靶向CD19的CAR包含共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，CAR包含特异性结合CD19的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域融合，跨膜结构域与细胞内信号传导结构域融合。
5.3.1.CAR的细胞外抗原结合结构域
在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括或是scFv。scFv可以是人scFv、人源化scFv或鼠scFv。在某些实施方式中，scFv是人scFv。scFv可以从融合抗体的可变重区和轻区获得。可替代地或另外地，scFv可源自Fab’s(而不是源自抗体，例如从Fab文库获得)。
在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括或是Fab。在某些实施方式中，Fab是交联的。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括或是F(ab)2。
任何前述分子可包含在具有异源序列的融合蛋白中，以形成CAR的细胞外抗原结合结构域。
在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域以至少约1×10-6M、至少约1×10-7M、至少约1×10-8M、至少约1×10-9M、或至少约1×10-10M的解离常数(Kd)与CD19(例如人CD19)结合。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域以至少约2×10-8M的解离常数(Kd)与CD19(例如人CD19)结合。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域以至少约2×10-8M至约8×10-9M的解离常数(Kd)与CD19(例如人CD19)结合。
在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域以约1nM至50nM、约5nM至30nM、约5nM至25nM或约8nM至20nM之间的解离常数(Kd)与CD19(例如人CD19)结合。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域以至少约50nM、至少约40nM、至少约35nM、至少约30nM、至少约25nM、至少约20nM、至少约19nM、至少约18nM、至少约17nM、至少约16nM、至少约15nM、至少约14nM、至少约13nM、至少约12nM、至少约11nM、至少约10nM、至少约9nM、至少约8nM、至少约7nM、至少约6nM或至少约5nM的解离常数(Kd)与CD19(例如人CD19)结合。
CAR的细胞外抗原结合结构域的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、FACS分析法、生物测定法(例如生长抑制)、或Western Blot测定法来测定。这些测定法中的每一种通常通过采用对目的复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体或scFv)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，scFv可以被放射性标记并用于放射免疫测定法(RIA)(参见，例如，Weintraub,B.，放射免疫测定的原理，放射配体测定技术的第七培训课程，内分泌学会，1986年3月，并入本文以供参考)。放射性同位素可通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的方法或通过放射自显影来检测。在某些实施方式中，靶向CD127的细胞外抗原结合结构域用荧光标志物标记。荧光标志物的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite和mKalamal)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean和CyPet)和黄色荧光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus和YPet)。在某些实施方式中，靶向CD19的人scFv用GFP标记。
在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3。SEQ ID NO:7-9如下提供。
Figure BDA0003988369050000231
在某些实施方式中，VH包含与SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VH包含与SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:10如下提供。
Figure BDA0003988369050000232
在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列或其保守性修饰的CDR3。在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3。SEQ ID NO:11-13如下提供。
Figure BDA0003988369050000233
在某些实施方式中，VL包含与SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VL包含与SEQ ID NO:14中所示氨基酸序具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VL包含SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:14如下提供。
Figure BDA0003988369050000241
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或保守修饰的CDR2、以及包含SEQID NO:13中所示氨基酸序列或其保守性修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:14中所示氨基酸序列。
VH和VL可以例如通过接头彼此连接。从N末端到C末端的可变区可以是VL-VH或VL-VH。在某些实施方式中，VL位于细胞外抗原结合结构域的N末端，即VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含VH，该VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；以及VL，该VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，scFv包括包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:15中所示氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:15如下提供。在某些实施方式中，抗CD19scFv被指定为“#2scFv”。
Figure BDA0003988369050000251
在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3。SEQ ID NO:16和17如下提供。
Figure BDA0003988369050000252
在某些实施方式中，VL包含与SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VL包含与SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VL包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:18如下提供。
Figure BDA0003988369050000253
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:18中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，VL位于细胞外抗原结合结构域的N末端，即VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含VH，该VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；以及VL，其包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，scFv包括VH和VL，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，scFv包含SEQID NO:19中所示氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:19如下提供。在某些实施方式中，抗CD19 scFv被指定为“#8scFv”。
Figure BDA0003988369050000261
在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3。下文提供SEQ ID NO:20和21。
Figure BDA0003988369050000262
在某些实施方式中，VL包含与SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VL包括与SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VL包含SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:22如下提供。
Figure BDA0003988369050000271
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列或其中保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:22中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，VL位于细胞外抗原结合结构域的N末端，即VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv，其包括VH，该VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；以及VL，其包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，scFv包括VH和VL，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，scFv包含SEQID NO:23中所示氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:23如下提供。在某些实施方式中，抗CD19 scFv被指定为“#15 scFv”。
Figure BDA0003988369050000281
在某些实施方式中，根据Kabat编号***来识别CDR。
在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的CDR3。SEQ ID NO:57如下提供。
Figure BDA0003988369050000282
在某些实施方式中，VL包含与SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VL包含与SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VL包含SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:58如下提供。
Figure BDA0003988369050000283
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:58中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，VL位于细胞外抗原结合结构域的N末端，即VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv，其包括VH，该VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；以及VL，其包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，scFv包括包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD19 scFv被指定为“#4scFv”。
在某些实施例中，根据Kabat编号***来识别CDR。
在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的CDR3。SEQ ID NO:59如下提供。
Figure BDA0003988369050000291
在某些实施方式中，VL包含与SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VL包括与SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VL包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:60如下提供。
Figure BDA0003988369050000301
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:60中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，VL位于细胞外抗原结合结构域的N末端，即VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含VH，该VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；以及VL，其包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，scFv包括包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD19 scFv被指定为“#5scFv”。
在某些实施例中，根据Kabat编号***来识别CDR。
在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR3。SEQ ID NO:61如下提供。
Figure BDA0003988369050000311
在某些实施方式中，VL包含与SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VL包含与SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VL包含SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:62如下提供。
Figure BDA0003988369050000312
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:62中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，VL位于细胞外抗原结合结构域的N末端，即VH和VL从N末端到C末端的位置为VL-VH。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含VH，该VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；以及VL，其包括包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，scFv包括包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD19 scFv被指定为“#6scFv”。
在某些实施例中，根据Kabat编号***来识别CDR。
在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的CDR3。SEQ ID NO:63如下提供。
Figure BDA0003988369050000321
在某些实施方式中，VL包含与SEQ ID NO:64中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VL包含与SEQ ID NO:64中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VL包含SEQ ID NO:64中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:64如下提供。
Figure BDA0003988369050000322
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:64中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，VL位于细胞外抗原结合结构域的N末端，即VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含VH，该VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；以及VL，其包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，scFv包括包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:64中所示氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD19 scFv被指定为“#7scFv”。
在某些实施例中，根据Kabat编号***来识别CDR。
在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR3。SEQ ID NO:66和67如下提供。
Figure BDA0003988369050000331
在某些实施方式中，VL包含与SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同一性或同源性的氨基酸序列。例如，VL包含与SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，VL包含SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列。SEQ ID NO:67如下提供。
Figure BDA0003988369050000341
在某些实施方式中，VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；并且VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，VH包括包含SEQID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述VL包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所述的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:66中所述核酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，VH包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:67中所示氨基酸序列。
在某些实施方式中，VL位于细胞外抗原结合结构域的N末端，即VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含VH，该VH包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的CDR3；以及VL，其包括包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，scFv包括包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD19 scFv被指定为“#1scFv”。
在某些实施例中，根据Kabat编号***来识别CDR。
编码SEQ ID NO:10的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于SEQ ID NO:68中。SEQID NO:68如下提供。
Figure BDA0003988369050000351
编码SEQ ID NO:14的氨基酸序列的示例性核苷酸序列列于SEQ ID NO:69中。SEQID NO:69如下提供。
Figure BDA0003988369050000352
编码SEQ ID NO:18的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于SEQ ID NO:70中。SEQID NO:70如下提供。
Figure BDA0003988369050000353
编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于SEQ ID NO:71中。SEQID NO:71如下提供。
Figure BDA0003988369050000354
编码SEQ ID NO:58的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于SEQ ID NO:72中。SEQID NO:72如下提供。
Figure BDA0003988369050000355
编码SEQ ID NO:60的氨基酸序列的示例性核苷酸序列列于SEQ ID NO:73中。SEQID NO:73如下提供。
Figure BDA0003988369050000361
编码SEQ ID NO:62的氨基酸序列的示例性核苷酸序列列于SEQ ID NO:74中。SEQID NO:74如下提供。
Figure BDA0003988369050000362
编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列的示例性核苷酸序列列于SEQ ID NO:75中。SEQID NO:75如下提供。
Figure BDA0003988369050000363
编码SEQ ID NO:67的氨基酸序列的示例性核苷酸序列列于SEQ ID NO:76中。SEQID NO:76如下提供。
Figure BDA0003988369050000364
在某些实施方式中，VH和VL通过接头连接。在某些实施方式中，所述接头包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或由其组成。
由与特定序列(例如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67)具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％(例如，约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)同源性或同一性组成的VH和/或VL氨基酸序列可包含相对于该特定序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但保留与靶抗原(例如，间皮素)结合的能力。在某些实施方式中，总共1至10个氨基酸在特定序列(例如，SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:67)中被取代、***和/或删除。在某些实施方式中，取代、***或缺失发生在细胞外抗原结合结构域的CDR之外的区域(例如在FR中)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:10、14、18、22、59、61、63、65和68的VH和/或VL序列，包括SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67的翻译后修饰。
此外，细胞外抗原结合结构域可以包括引导新生蛋白进入内质网的前导肽或信号肽。如果CAR要被糖基化并锚定在细胞膜中，信号肽或前导肽可能是必不可少的。信号序列或前导序列可以是存在于新合成的蛋白质的N端的肽序列(长约5、约10、约15、约20、约25或约30个氨基酸)，指导它们进入分泌通路。在某些实施方式中，信号肽共价连接至细胞外抗原结合结构域的5’末端(N末端)。在某些实施方式中，信号肽包括CD8多肽，例如，CAR包含截短的CD8信号肽。在某些实施方式中，信号肽由其衍生的抗体生成。在某些实施方式中，#2scFv的信号肽示于SEQ ID NO:54中。在某些实施方式中，#8scFv的信号肽示于SEQ ID NO:54。在某些实施方式中，#15scFv的信号肽示于SEQ ID NO:55中。
Figure BDA0003988369050000371
5.3.2.CAR的跨膜结构域
在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包括跨越膜的至少部分的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。抗原识别后，受体聚集并向细胞传递信号。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包括CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CD84、CD166、CD8a、CD8b、ICAM-1、CTLA-4、CD27、CD40、NKGD2、或其组合的天然或修饰的跨膜结构域。
在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD28多肽(例如，CD28的跨膜结构域或其部分)。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包括人CD28的跨膜结构域或其部分。CD28多肽可包含与具有NCBI参考号：NP_006130(SEQ ID NO:24)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同一性或同源性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD28多肽包含作为SEQ ID NO:24的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、或至少约60、和/或至多约70、至多约80、至多约90、至多约100、至多约150、至多约200、或至多约220个氨基酸。在某些实施方式中，CD28多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸1-220、1-50、50-100、100-150、154-179、150-200、153-179或200-220的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD28多肽，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸154-179的氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:24如下提供。
Figure BDA0003988369050000381
编码SEQ ID NO:24的氨基酸154-179的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在下文提供的SEQ ID NO:25中示出。
Figure BDA0003988369050000382
在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包括小鼠CD28的跨膜结构域或其部分。CD28多肽可由与具有NCBI参考号：NP_031668.3(SEQ ID NO:26)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同一性或同源性的氨基酸序列或其片段组成，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD28多肽包含作为SEQ ID NO:26的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、且至多约218个氨基酸。在某些实施方式中，CD28多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸1-218、1-50、50-100、100-150、150-200、151-177或200-218的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD28多肽，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸151-177的氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:26如下提供。
Figure BDA0003988369050000391
在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD8多肽(例如CD8的跨膜结构域或其部分)。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含人CD8的跨膜结构域或其部分。在某些实施方式中，CD8多肽包含或含有与具有NCBI参考号：NP_001139345.1(SEQ ID NO:27)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD8多肽包含作为SEQ ID NO:27的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、且至多约235个氨基酸。可替代地或另外地，在某些实施方式中，CD8多肽包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-235、1-50、50-100、100-150、150-200、137-209或200-235的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD8多肽，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸137-209的氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:27如下提供。
Figure BDA0003988369050000392
在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含小鼠CD8的跨膜结构域或其部分。在某些实施方式中，CD8多肽包含或含有与具有NCBI参考号：AAA92533.1(SEQ ID NO:28)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD8多肽包含或含有作为SEQ ID NO:28的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、或至少约60、或至少约70、或至少约100、或至少约200且至多247个氨基酸。可替代地或另外地，在某些实施方式中，CD8多肽包含SEQ ID NO:28的氨基酸1-247、1-50、50-100、100-150、150-200、151-219、或200-247的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD8多肽，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸151-219的氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:28在下文提供。
Figure BDA0003988369050000401
在某些非限制性实施方式中，CAR还包含将细胞外抗原结合结构域连接到跨膜结构域的间隔区。间隔区可以足够柔韧，以允许抗原结合域在不同方向上定向，以促进抗原识别，同时保持CAR的活化活性。
在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包括CD8、CD28、CD3ζ、CD40、4-1BB、OX40、CD84、CD166、CD8a、CD8b、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、CD27、CD40和NKGD2、或其组合的天然或修饰铰链区。铰链/间隔区可以是来自以下的铰链区：IgG1、或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分、CD28多肽的部分(例如，SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26的部分)、CD8多肽的部分(例如SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的部分)、前述任一项的变体，其与前述任一项具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约100％同一性或同源性、或合成间隔序列。
在某些实施方式中，CAR的铰链结构域包含CD28的天然或修饰铰链区。在某些实施方式中，CAR的铰链结构域包含CD28的天然铰链区。在某些实施方式中，CAR的铰链结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸114-153的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:24的氨基酸114-153的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如下文提供的SEQ ID NO:56所示。
Figure BDA0003988369050000402
5.3.3.CAR的细胞内信号传导结构域
在某些实施方式中，CAR包含细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ多肽，CD3ζ可以激活或刺激细胞(例如淋巴谱系的细胞，例如T细胞)。野生型(“天然”)CD3ζ包含三个功能性免疫受体酪氨酸抑制基序(ITAM)、三个功能性富碱性拉伸(BRS)区域(BRS1、BRS2和BRS3)。CD3ζ在抗原结合后将激活信号传递至细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)。CD3ζ-链的细胞内信号传导结构域是来自内源性TCR的信号的主要传递者。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含天然CD3ζ。在某些实施方式中，天然CD3ζ包含与具有NCBI参考号：NP_932170(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％同一性或同源性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD3ζ多肽包含作为SEQ ID NO:29的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50且至多约164个氨基酸长度。在某些实施方式中，天然CD3ζ包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至164、1至50、50至100、52至164、100至150、或150至164的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含天然CD3ζ，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸52-164的氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:29在下文提供：
Figure BDA0003988369050000411
在某些实施方式中，天然CD3ζ包含与SEQ ID NO:30中所示氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或同源性的氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:30如下提供：
Figure BDA0003988369050000412
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含一个、两个或三个ITAM。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1。在某些实施方式中，天然ITAM1包含SEQ ID NO:31中所示氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:31如下提供：
Figure BDA0003988369050000421
编码SEQ ID NO:31的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的SEQ ID NO:32中。
Figure BDA0003988369050000422
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含含有一个或多个功能缺失突变的ITAM1变体。在某些实施方式中，ITAM1变体包括两个功能缺失突变或由其组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如，两个)功能缺失突变中的每一个都包括ITAM1中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，ITAM1变体由两个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，ITAM1变体包含下文提供的SEQ ID NO:33中所示氨基酸序列或由其组成。
Figure BDA0003988369050000423
编码SEQ ID NO:33的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的SEQ ID NO:34中。
Figure BDA0003988369050000424
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM2。在某些实施方式中，天然ITAM2包含如下提供的SEQ ID NO:35中所示氨基酸序列或由其组成。
Figure BDA0003988369050000425
编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:36中示出。
Figure BDA0003988369050000426
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2变体。在某些实施方式中，ITAM2变体包含一个或多个功能缺失突变或由其组成。在某些实施方式中，ITAM2变体包括两个功能缺失突变或由其组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如，两个)功能缺失突变中的每一个包括ITAM2中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，ITAM1变体由两个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，ITAM2变体包含下文提供的SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列或由其组成。
Figure BDA0003988369050000431
编码SEQ ID NO:37的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:38中示出。
Figure BDA0003988369050000432
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM3。在某些实施方式中，天然ITAM3包含如下提供的SEQ ID NO:39中所示氨基酸序列或由其组成。
Figure BDA0003988369050000433
编码SEQ ID NO:39的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的SEQ ID NO:40中。
Figure BDA0003988369050000434
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM3变体。在某些实施方式中，ITAM3变体包括两个功能缺失突变或由其组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如，两个)功能缺失突变中的每一个都包括ITAM3中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，ITAM3变体包括两个功能缺失突变或由其组成。在某些实施方式中，ITAM3变体包含如下提供的SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列或由其组成。
Figure BDA0003988369050000435
编码SEQ ID NO:41的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的SEQ ID NO:42中。
Figure BDA0003988369050000436
各种修饰的CD3ζ多肽和包含修饰的CD3ζ多肽的CAR公开于国际专利申请公开号WO2019/133969中，其全文通过引用并入本文。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，所述修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、包含一个或多个(例如两个)功能缺失突变或由其组成的ITAM2变体、和包含一个或多个(例如两个)功能缺失突变或由其组成的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，所述修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、由两个功能缺失突变组成的ITAM2变体和由两个功能缺失突变组成的ITEM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，所述修饰的CD3ζ多肽包含由SEQ ID NO:31中所示氨基酸序列组成的天然ITAM1、由SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列组成的ITAM2变体和由SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列组成的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR被指定为“1XX”。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:43如下提供：
Figure BDA0003988369050000441
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含与SEQ ID NO:43具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
编码SEQ ID NO:43的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的SEQ ID NO:44中。
Figure BDA0003988369050000442
编码SEQ ID NO:43的氨基酸序列的另一个示例性核酸序列在下文提供的SEQ IDNO:45中示出。
Figure BDA0003988369050000443
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域还包含至少一个共刺激性信号传导区。在某些实施方式中，所述至少一个共刺激区包含共刺激分子或其部分。在某些实施方式中，所述至少一个共刺激区包含至少一个共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
如本文所用，“共刺激分子”是指除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其可以提供淋巴细胞对抗原的有效应答。在某些实施方式中，共刺激分子可以提供最佳的淋巴细胞活化。共刺激分子的非限制性实例包括CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP-10，及其组合。共刺激分子可以与共刺激配体结合，该配体是一种在细胞表面表达的蛋白质，在与其受体结合后会产生共刺激应答，即当抗原识别受体(例如嵌合抗原受体(CAR))与其靶抗原结合时影响所提供刺激的细胞内应答。作为一个实例，4-1BB配体(即，4-1BBL)可以结合4-1BB以提供细胞内信号，其与CAR信号组合诱导CAR+T细胞的效应细胞功能。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括CD28的细胞内信号传导结构域或其部分、4-1BB的细胞内结构域或其部分、OX40的细胞内结构域或其部分、ICOS的细胞内结构域或其部分、或DAP-10的细胞内结构域或其部分。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包括包含CD28多肽(例如CD28的细胞内结构域或其部分)的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导区，其包含人CD28的细胞内结构域或其部分。
在某些实施方式中，在CAR的共刺激信号传导区中包含的CD28多肽包含与SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约100％同一性或同源性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的CD28多肽包含作为SEQ ID NO:24的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50且至多约220个氨基酸。可替代地或另外地，在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的CD28多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸1-220、1-50、50-100、100-150、114-220、150-200、180-220或200-220的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，其包含CD28多肽，该CD28多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列或由其组成。
编码SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列的示例性核酸序列如SEQ IDNO:46所示，其在下文提供。
Figure BDA0003988369050000461
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包括包含小鼠CD28多肽或其部分的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的CD28多肽包含与SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同一性或同源性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的CD28多肽包含作为SEQID NO:26的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50且至多218个氨基酸。在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的CD28多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸1-218、1-50、50-100、100-150、150-218、178-218、或200-218的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，本公开的CAR的共刺激信号传导区包含CD28多肽，该CD28多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸178-218的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含含有4-1BB多肽例如4-1BB的细胞内结构域或其片段的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含人4-1BB的细胞内结构域或其片段。在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的4-1BB多肽包含与具有NCBI参考号：NP_001552(SEQ ID NO:47)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同一性或同源性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的4-1BB多肽包含作为SEQ ID NO:47的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、和/或至多约50、至多约60、至多约70、至多约80、至多约90、至多约100、至多约200、或至多约255个氨基酸。在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的4-1BB多肽包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-255、1-50、50-100、100-150、150-200或200-255的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含4-1BB多肽，该4-1BB多肽包含SEQ ID NO:46的氨基酸214-255的氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:47在下文提供。
Figure BDA0003988369050000471
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含两种或多种共刺激分子的细胞内结构域或其部分，例如CD28的细胞内结构域或其部分和4-1BB的细胞内结构域或其部分，或CD28的细胞内结构域或其部分和OX40的细胞内结构域或其部分。
5.3.4.示例性CAR
在某些实施方式中，CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，其包含(i)VH，其包含由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成的CDR2；和由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的CDR3，以及(ii)VL，其包含由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成的CDR2，和由SEQID NO:13所示的氨基酸序列组成的CDR3；(b)铰链结构域，其包含CD28多肽(例如，人CD28的铰链结构域或其部分，例如，由SEQ ID NO:24的氨基酸114-153的氨基酸序列组成的CD28多肽)；(c)包含CD28多肽的跨膜结构域(例如人CD28的跨膜结构域或其部分，例如由SEQ IDNO:24的氨基酸154-179的氨基酸序列组成的CD28多肽)，和(d)细胞内信号传导结构域，其包含(i)CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽，例如由SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列组成的多肽)和(ii)包含CD28多肽(例如人CD28的细胞内结构域或其部分，例如由SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列组成的CD28多肽)的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，VH和VL通过由SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列组成的接头连接。在某些实施方式中，VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR被指定为“CAR#2”。在某些实施方式中，CAR包含SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列，其在下文提供。
Figure BDA0003988369050000481
SEQ ID NO:48的氨基酸序列的示例性核酸序列如SEQ ID NO:49所示，其在下文提供。
Figure BDA0003988369050000482
在某些实施方式中，CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，其包含(i)VH，其包含由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成的CDR2；和由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的CDR3，以及(ii)VL，其包含由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成的CDR2，和由SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列组成的CDR3；(b)铰链结构域，其包含CD28多肽(例如，人CD28的铰链结构域或其部分，例如，由SEQ ID NO:24的氨基酸114-153的氨基酸序列组成的CD28多肽)；(c)包含CD28多肽的跨膜结构域(例如人CD28的跨膜结构域或其部分，例如由SEQ IDNO:24的氨基酸114-179的氨基酸序列组成的CD28多肽)，和(c)细胞内信号传导结构域，其包含(i)CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽，例如由SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列组成的多肽)和(ii)包含CD28多肽(例如人CD28的细胞内结构域或其部分，例如由SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列组成的CD28多肽)的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，VH和VL通过由SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列组成的接头连接。在某些实施方式中，VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR被指定为“CAR#8”。在某些实施方式中，CAR包含SEQ ID NO:50中所示氨基酸序列，其在下文提供。
Figure BDA0003988369050000491
编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列的示例性核酸序列如SEQ ID NO:51所示，其在下文提供。
Figure BDA0003988369050000501
在某些实施方式中，CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，其包含(i)VH，其包含由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成的CDR2；和由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的CDR3，以及(ii)VL，其包含由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的CDR2，和由SEQID NO:21所示的氨基酸序列组成的CDR3；(b)铰链结构域，其包含CD28多肽(例如，人CD28的铰链结构域或其部分，例如，由SEQ ID NO:24的氨基酸114-153的氨基酸序列组成的CD28多肽)；(c)包含CD28多肽的跨膜结构域(例如人CD28的跨膜结构域或其部分，例如由SEQ IDNO:24的氨基酸114-179的氨基酸序列组成的CD28多肽)，和(c)细胞内信号传导结构域，其包含(i)CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽，例如由SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列组成的多肽)和(ii)包含CD28多肽(例如人CD28的细胞内结构域或其部分，例如由SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列组成的CD28多肽)的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，VH和VL通过由SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列组成的接头连接。在某些实施方式中，VH和VL从N末端到C末端的位置为：VL-VH。在某些实施方式中，CAR被指定为“CAR#15”。在某些实施方式中，CAR包含SEQ ID NO:51中所示氨基酸序列，其在下文提供。
Figure BDA0003988369050000511
编码SEQ ID NO:52的氨基酸序列的示例性核酸序列如SEQ ID NO:53所示，其在下文提供。
Figure BDA0003988369050000512
5.4.细胞
本公开的主题提供包含本公开的靶向CD19的CAR(例如，在第5.3节中公开的一种)的细胞。在某些实施方式中，细胞选自淋巴谱系的细胞和骨髓谱系的细胞。在某些实施方式中，细胞是免疫应答细胞。在某些实施方式中，免疫应答细胞是淋巴谱系的细胞。
在某些实施方式中，细胞是淋巴谱系的细胞。淋巴谱系的细胞可以提供抗体的产生、细胞免疫***的调节、血液中外来物质的检测、宿主外来细胞的检测等。淋巴谱系细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、树突细胞、从中可分化淋巴样细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)。
在某些实施方式中，细胞是T细胞。T细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与适应性免疫***。本公开主题的T细胞可以是任何类型的T细胞，包括但不限于辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)、和两种效应记忆T细胞：例如TEM细胞和TEMRA细胞)、调节T细胞(也称为抑制性T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞和γδT细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导被感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞的一个子集。患者自身的T细胞可以被基因修饰以通过CAR的引入靶向特定的抗原。在某些实施方式中，免疫应答细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在某些实施方式中，T细胞是CD4+T细胞。在某些实施方式中，T细胞是CD8+T细胞。在某些实施方式中，细胞是T细胞，并且本公开的靶向CD19的CAR整合在T细胞基因组内的位点。位点的非限制性实例包括TRAC位点、TRBC位点、TRDC位点和TRGC位点。在某些实施方式中，该位点是TRAC位点或TRBC位点。将CAR靶向T细胞基因组内位点的方法公开于WO2017180989和Eyquem等人,Nature.(2017Mar 2)；543(7643):113–117，两者通过引用以其整体并入。
在某些实施方式中，细胞是NK细胞。自然杀伤(NK)细胞可以是淋巴细胞，它是细胞介导的免疫力的一部分，并在先天免疫应答中起作用。NK细胞不需要事先激活即可对靶细胞执行细胞毒性作用。在某些实施方式中，细胞是基因修饰的NK细胞。在某些实施方式中，细胞是编辑后的NK细胞。在某些实施方式中，细胞是源自干细胞的NK细胞。在某些实施方式中，细胞是源自多能干细胞的NK细胞。在某些实施方式中，所述细胞是诱导多能干细胞(iPSC)衍生的NK细胞。
细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)、或者是体外从工程化的祖细胞或干细胞衍生的。
本公开主题的细胞可以是骨髓谱系的细胞。骨髓谱系细胞的非限制性实例包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、肥大细胞、红细胞、血小板和从中可分化髓样细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)。
在某些实施方式中，可以用本公开的靶向CD19的CAR转导细胞，使得细胞表达靶向CD19的CAR。
5.5.核酸分子和载体
本公开的主题提供编码本公开的靶向CD19的CAR(例如，在第5.3节中公开的那些)的核酸分子。还提供包含此类核酸分子的细胞。
在某些实施方式中，核酸分子还包含与本公开的靶向CD19的CAR可操作地连接的启动子。
在某些实施方式中，启动子是内源的或外源的。在某些实施方式中，外源性启动子选自延伸因子(EF)-1启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)启动子、猿病毒40早期启动子(SV40)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、金属硫蛋白启动子、和泛素C启动子。在某些实施方式中，内源性启动子选自TCRα启动子、TCRβ启动子和β2-微球蛋白启动子。在某些实施方式中，启动子是诱导型启动子。在某些实施方式中，诱导型启动子选自NFAT转录反应元件(TRE)启动子、CD69启动子、CD25启动子、IL-2启动子、4-1BB启动子、PD1启动子、和LAG3启动子。
本公开的主题还提供包含本公开的核酸分子的载体。
核酸分子可以通过本领域已知的方法或如本文所述的方法递送到细胞中。细胞的遗传修饰可以通过用重组DNA构建体转导基本上均质的细胞组合物来完成。在某些实施方式中，逆转录病毒载体(例如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体)用于将DNA构建体引入细胞。例如，可以将编码CAR的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或对目的靶细胞类型特异性的启动子驱动表达。也可以使用非病毒载体。
对于细胞的初始遗传修饰以包括本公开的靶向CD19的CAR，逆转录病毒载体可以用于转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送***。可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中构建CAR。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES，例如，FGF-1 IRES、FGF-2IRES、VEGF IRES、IGF-II IRES、NF-κB IRES、RUNX1 IRES、p53 IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、***病毒IRES、小核糖核酸病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可切割的接头(例如2A肽，例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。逆转录病毒载体和合适的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知各种产生两性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等,(1985)Mol Cell Biol(1985)；5:431-437)；PA317(Miller等,Mol Cell Biol(1986)；6:2895-2902)；和CRIP(Danos等,Proc NatlAcad Sci USA(1988)；85:6460-6464)。非两性粒子也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域已知的任何其它假型化的粒子。
可能的转导方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养(Bregni等.Blood(1992)；80:1418-1422)，或单独用病毒上清液或含有或不含有适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原种培养(Xu,等.Exp.Hemat.(1994)；22:223-230)；和Hughes,等.J.Clin.Invest.(1992)；89:1817)。
其它转导病毒载体可用于修饰细胞。在某些实施方式中，所选择的载体表现出高的感染效率和稳定的整合和表达(参见，例如，Cayouette等,Human Gene Therapy 8:423-430,1997；Kido等,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer等,Journal ofVirology 71:6641-6649,1997；Naldini等,Science 272:263-267,1996；和Miyoshi等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。可以使用的其它病毒载体包括，例如，腺病毒、慢病毒和与腺相关的病毒载体、牛痘病毒、牛***瘤病毒或疱疹病毒，例如爱泼斯坦-巴尔病毒(也参见例如Miller,Human Gene Thera(1990)；15-14；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis等,BioTechniques(1988)；6:608-614；Tolstoshev等,Cur OpinBiotechnol(1990)；1:55-61；Sharp,The Lancet(1991)；337:1277-78；Cornetta等,Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-22,1987；Anderson,Science(1984)；226:401-409；Moen,Blood Cells 17:407-16,1991；Miller等,Biotechnol(1989)；7:980-90；LeGal La Salle等,Science(1993)；259:988-90；和Johnson,Chest(1995)107:77S-83S的载体)。逆转录病毒载体发展地特别好，并已用于临床(Rosenberg等,N.Engl.J.Med(1990)；323:370,1990；Anderson等，美国专利第5,399,346号)。
非病毒方法也可以用于细胞的遗传修饰。例如，可以通过在脂质转染(Feigner等,Proc Natl Acad Sci U.S.A.(1987)；84:7413；Ono等,Neurosci Lett(1990)；17:259；Brigham等,Am J Med Sci(1989)；298:278；Staubinger等,Methods in Enzymol(1983)；101:512；Wu等,JBiol Chem(1988)；263:14621；Wu等,JBiol Chem(1989)；264:16985)，或手术条件下的微注射(Wolff等,Science(1990)；247:1465)的情况下施用核酸来将核酸分子引入细胞中。其它非病毒的基因转移方法包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。脂质体也可能对将DNA递送到细胞中有益。也可以通过将正常核酸转移到可离体培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其后代)中，之后，将细胞(或其后代)注射到目标组织中或全身注射来完成将正常基因移植到受试者的受影响组织中。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶或TALEN、CRISPR)衍生或获得。瞬时表达可通过RNA电穿孔获得。
任何靶向基因组编辑方法也可用于将本公开的靶向CD19的CAR递送至细胞。在某些实施方式中，CRISPR***用于递送本公开的靶向CD19的CAR。在某些实施方式中，锌指核酸酶用于递送本公开的靶向CD19的CAR。在某些实施方式中，TALEN***用于递送本公开的靶向CD19的CAR。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)***是在原核细胞中发现的基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该***包括Cas9(一种能够使用crRNA作为其向导来修饰DNA的蛋白质)，CRISPR RNA(crRNA，包含Cas9用来引导其到达宿主DNA正确片段的RNA，以及与tracrRNA结合的区域(通常以发夹环形式)，与Cas9形成活性复合物)，反式激活crRNA(tracrRNA，与crRNA结合，与Cas9形成活性复合物)，以及DNA修复模板的可选片段(可指导细胞修复过程允许***特定的DNA序列的DNA)。CRISPR/Cas9通常采用质粒转染靶细胞。crRNA需要针对每种应用进行设计，因为这是Cas9用来识别并直接结合细胞中靶DNA的序列。携带CAR表达盒的修复模板还需要针对每种应用进行设计，因为它必须与切口两侧的序列重叠，并为***序列编码。多个crRNA和tracrRNA可以包装在一起以形成单向导RNA(sgRNA)。该sgRNA可以与Cas9基因连接在一起并制成质粒，以便被转染到细胞中。
锌指核酸酶(ZFN)是一种人工限制性酶，通过将锌指DNA结合结构域与DNA裂解结构域结合而产生。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的DNA序列，其允许锌指核酸酶靶向基因组内的期望序列。各个ZFN的DNA结合结构域通常包含多个独立的锌指重复序列，并且每个都可以识别多个碱基对。产生新的锌指结构域的最常见方法是结合已知特异性的较小锌指“模块”。ZFN中最常见的裂解结构域是来自II型限制性核酸内切酶FokI的非特异性裂解结构域。使用内源性同源重组(HR)机器和带有CAR表达盒的同源DNA模板，ZFN可以用于将CAR表达盒***基因组。当靶序列被ZFN切割后，HR机器搜索受损染色体与同源DNA模板之间的同源性，然后在染色体的两个断裂末端之间复制模板的序列，从而将同源DNA模板整合到基因组。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是限制性酶，可以工程化为切割DNA的特定序列。TALEN***的工作原理几乎与ZFN相同。它们是通过将转录激活因子样效应物DNA结合结构域与DNA裂解结构域结合而产生的。转录激活因子样效应物(TALE)由具有两个可变位置的33-34个氨基酸重复基序组成，这些位置对特定核苷酸有很强的识别能力。通过组装这些TALE的阵列，可以对TALE DNA结合结构域进行改造以结合所需的DNA序列，从而指导核酸酶切割基因组中的特定位置。用于多核苷酸疗法的cDNA表达可以从任何合适的启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、金属硫蛋白启动子、或泛素C启动子)中进行指导，并由任何适当的哺乳动物调节元件或内含子(例如延伸因子1a增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要的话，已知优先在特定细胞类型中指导基因表达的增强子可以用于指导核酸的表达。所使用的增强剂可以包括但不限于被表征为组织或细胞特异性增强子的那些。或者，如果将基因组克隆用作治疗构建体，则可以通过同源调控序列或，如果需要，通过衍生自包括上述任何启动子或调控元件的异源的调控序列来介导调控。
用于递送基因组编辑剂/***的方法可以根据需要而变化。在某些实施方式中，选择的基因组编辑方法的组分作为DNA构建体在一个或多个质粒中递送。在某些实施方式中，通过病毒载体递送组分。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺转染(impalefection)、流体静压力、连续输注、超声处理、磁转染、腺相关病毒、病毒载体的包膜蛋白假型、可复制的载体顺式和反式元件、单纯疱疹病毒和化学媒介物(例如寡核苷酸、脂复合物、聚合物小体、多复合物、树状聚合物、无机纳米颗粒和穿透细胞的肽)。
5.6.剂型和给药
本公开的主题还提供包含本公开的细胞所述的组合物，所述细胞包含本公开的靶向CD19的CAR。在某些实施方式中，所述组合物是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。
包含本公开的细胞所述的组合物可以方便地以无菌液体制剂的形式提供，例如等渗水溶液剂、悬浮液、乳剂，分散剂或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
可以将包含本公开的细胞的组合物***地或直接提供给受试者，以诱导和/或增强对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防赘生物。在某些实施方式中，将本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物直接注射到目的器官(例如，受赘生物影响的器官)中。或者，例如通过向循环***(例如，肿瘤脉管***)给药，将本公开的细胞或包含其的组合物间接地提供给目的器官。可以在施用细胞或组合物之前，之中或之后提供扩增和分化剂，以增加体外或体内细胞的产生。
对于所治疗的受试者，要施用的细胞数量可以有所不同。在某些实施方式中，向受试者(例如，人受试者)施用的本公开的细胞为约104至约1010之间、约104至约107之间、约105至约107、约105至约109之间、或约106至约108之间。在某些实施方式中，向受试者施用约1×106至约5×108个本公开的细胞。可以以更少的数量施用更有效的细胞。通常，至少会施用约l×l05个细胞，最终达到约l×l010或更多。在某些实施方式中，将至少约1×105、5×105、1×106、约5×106、约1×107、约2.5×107、约5×107、约1×108、约1.5×108、约2×108或约5×108个本公开的细胞施用于受试者。在某些实施方式中，将约1×106个本公开的细胞施用于受试者。可以根据每个受试者的个体因素，包括其大小、年龄、性别、体重和具体受试者的状况，来确定有效剂量的精确确定。本领域技术人员从本公开和本领域知识中可以容易地确定剂量。
本公开的细胞和组合物可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内施用、皮下施用、结内施用、瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用、骨内施用、腹膜内施用、胸膜施用和直接施用于受试者。在任何生理上可接受的载体中的本公开的细胞可以通常在血管内施用，然而它们也可以被引入骨骼或其它方便的部位，在这些部位细胞可以找到合适的再生和分化部位(例如胸腺)。
5.7.治疗方法
本公开的主题提供使用本公开的细胞或包含其的组合物的各种方法。本公开的细胞和包含其的组合物可用于疗法或药物。例如，本公开的主题提供用于在有需要的受试者中诱导和/或增加免疫应答的方法。本公开的细胞及包含其的组合物可用于减少受试者的肿瘤负荷。本公开的细胞及包含其的组合物可以减少受试者中肿瘤细胞的数量、减小受试者中肿瘤大小和/或根除受试者中肿瘤。本公开的细胞及包含其的组合物可用于治疗和/或预防受试者的赘生物。本公开的细胞及包含其的组合物可用于延长患有赘生物的受试者的生存期。在某些实施方式中，上述方法中的每一种包括施用本公开的细胞或包含其的组合物(例如，药物组合物)以实现期望的效果，例如，缓解现有状况或预防复发。对于治疗，给药量是有效产生所需效果的量。可以在一次或一系列的给药中提供有效量。有效量可通过推注或连续灌注提供。
在某些实施方式中，肿瘤和/或赘生物与CD19相关。在某些实施例中，肿瘤和/或赘生物表达CD19。在某些实施方式中，肿瘤和/或赘生物过表达CD19。在某些实施方式中，可通过本公开的细胞和组合物治疗的肿瘤和/或赘生物是血癌。血癌的非限制性实例包括多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。白血病的非限制性实例包括急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、混合表型急性白血病(MLL)、毛细胞白血病和B细胞前淋巴细胞白血病。淋巴瘤可以是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在某些实施方式中，淋巴瘤是B细胞淋巴瘤(BCL)。
在某些实施方式中，肿瘤和/或赘生物是B细胞恶性肿瘤。B细胞恶性肿瘤的非限制性实例包括B细胞淋巴瘤(BCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、具有Richter转化的CLL和CNS淋巴瘤。B细胞淋巴瘤包括B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和B细胞霍奇金淋巴瘤。在某些实施方式中，肿瘤和/或赘生物是B细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，B细胞淋巴瘤是复发性或难治性(R/R)B细胞淋巴瘤。
在某些实施方式中，受试者是人受试者。受试者可以患有疾病的晚期形式，在这种情况下，治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展和/或减轻副作用。受试者可以具有已经对其进行过治疗的病史，在这种情况下，治疗目标通常包括降低或延迟复发风险。
由于本公开的靶向CD19的CAR的表面表达，过继转移细胞在肿瘤部位被赋予增强的和选择性的溶细胞活性。此外，在其定位于肿瘤及其增殖之后，细胞将肿瘤位点转变成高传导性环境，以用于广泛涉及生理抗肿瘤应答的多种细胞。
可以对本公开的细胞进行进一步修饰，以避免或最小化免疫并发症(称为“恶性T细胞转化”)，例如移植物抗宿主病(GvHD)，或当健康组织表达与肿瘤细胞相同的靶抗原时，会导致类似于GvHD的结果的风险。该问题的潜在解决方案是将***基因改造到本公开的细胞中。合适的***基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型Caspase 9***基因(iCasp-9)和截短的人表皮生长因子受体(EGFRt)多肽。在某些实施方式中，***基因是EGFRt多肽。EGFRt多肽可通过施用抗EGFR单克隆抗体(例如西妥昔单抗)来使T细胞消除。EGFRt可以共价连接至靶向CD19的CAR的上游。***基因可以包含在包含编码本公开的靶向CD19的CAR的核酸的载体内。以此方式，在恶性T细胞转化(例如，GVHD)过程中施用旨在激活***基因的前药(例如，前药(例如，可以激活iCasp-9的AP1903))，可以触发由***基因激活的表达靶向CD19的CAR的细胞的凋亡。将***基因掺入本公开的靶向CD19的CAR中可提高安全性，并能够在很短的时间内消除大部分受体表达细胞。可以在细胞输注后的给定时间点抢先消除掺入了***基因的本公开的细胞，或在毒性的最早迹象时将其消除。
7.实施例
通过参考以下实施例将更好地理解本公开的主题，该实施例作为本公开主题的示例而提供，而不是作为限制。
实施例1–抗CD19抗体的鉴定和表征
本实施例证明了包含本文公开的scFv的VH和VL的抗CD19抗体的特征。人抗CD19抗体来源于Adimab酵母并在其中产生。使用EZ-Link Sulfo-NHS生物素化试剂盒(ThermoScientific，Cat#21425)对抗原进行生物素化。将抗原浓缩至约1mg/mL，并在加入1:7.5摩尔比的生物素化试剂之前将缓冲液交换到PBS中。在进行另一次缓冲液交换以除去溶液中的游离生物素之前，将混合物在4℃保持过夜。生物素化通过ForteBio上的标记蛋白的链霉亲和素传感器结合来确认。
如前所述，繁殖了8个幼稚的人合成酵母库，每个库具有约109种多样性(参见，例如，Y.Xu等人,PEDS 26(10),663-70(2013)；WO2009036379；WO2010105256；和WO2012009568。)
对于前两轮选择，使用Miltenyi MACS***进行磁珠分选技术，如前所述(参见例如Siegel等人，J Immunol Methods 286(1-2),141-153(2004))。简言之，将酵母细胞(约1010个细胞/文库)与生物素化抗原在30℃的洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)/0.1％牛血清白蛋白(BSA))中孵育30分钟。用40mL冰冷洗涤缓冲液洗涤一次后，将细胞沉淀重新悬浮在20mL洗涤缓冲液中，并将Streptavidin MicroBeads(500μl)添加到酵母中，并在4℃孵育15分钟。接下来，将酵母沉淀，再悬浮在5mL洗涤缓冲液中，并装载到Miltenyi LS柱上。装入5mL后，用3mL洗涤缓冲液洗涤柱3次。然后将柱从磁场中取出，用5mL生长培养基洗脱酵母，然后生长过夜。
使用流式细胞术(FACS)进行第三轮选择。将约2×107个酵母沉淀，用洗涤缓冲液洗涤三次，并在平衡条件下与100-200nM生物素化抗原在30℃孵育。第四轮和第五轮选择是通过将生物素化的NALM-6和Raji细胞与从第3轮FACS选择的酵母产出孵育来进行的。孵育后，将预先洗涤的M-280 Strepavidin Dynabeads(Cat#60210)添加到酵母/哺乳动物细胞复合物中并孵育。接下来，使用DynaMag-2磁体分离复合物，并去除不结合的上清液。珠/细胞复合物用1mL选择缓冲液洗涤三次。然后将捕获的复合物转移到含有酵母生长培养基的烧瓶中进行繁殖。在第六轮选择中，将繁殖的酵母进行任一另外轮次的NALM-6/Raji细胞选择，用100nM重组CD19抗原进行选择，或用多特异性试剂(PSR)进行阴性选择，以去除非特异性抗体。
对于PSR耗尽，如前所述，用1:10稀释的生物素化PSR试剂孵育文库(参见，例如，Y.Xu等人,PEDS 26(10),663-70(2013))。然后用洗涤缓冲液洗涤酵母两次，并用1:100稀释的山羊F(ab’)2抗人kappa-FITC(LC-FITC)(Southern Biotech，Cat#2062-02)和1:500稀释的Streptavidin-AF633(SA-633)(Life Technologies，Cat#S21375)或1:50稀释的Extravidin-phycoethyrin(EA-PE)(Sigma Aldrich，Cat#E4011)二级试剂在4℃染色15分钟。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤两次后，将细胞沉淀重新悬浮在0.3mL洗涤缓冲液中，并转移到过滤器盖分选管(strainer-capped sort tube)中。使用FACS ARIA分选仪(BDBiosciences)进行分选，并确定分选门以选择具有所需特征的抗体。重复选择轮，直到获得具有所有期望特征的群体。在最后一轮分选后，对酵母进行平板接种，并挑选单个菌落进行表征。
轻链多样化
来自幼稚产出的重链被用于制备轻链多样化库，用于额外的选择轮。从酵母中提取重链质粒，在大肠杆菌中繁殖并随后纯化，并转化为具有5×106多样性的轻链文库。如上所述，对这些文库进行选择，即，使用一轮MACS，使用Raji或NALM-6细胞进行两轮细胞选择，随后使用重组CD19抗原进行第四轮FACS选择。针对轻链多样化，Raji和NALM-6细胞选择包含经历了CD19基因的靶向基因敲除的工程化Raji和NALM-6细胞的初始阴性选择。在用CD19敲除细胞耗尽后，使用表达内源性CD19并过表达的工程化Raji和NALM-6细胞进行阳性选择。在不同的FACS选择轮次中，通过抗原滴定评估文库的(多特异性试剂)PSR结合、物种交叉反应性和亲和力压力。进行分选以获得具有所需特征的群体。从上述每一轮FACS选择中挑选单个菌落进行测序和鉴定。
抗体生产和纯化
酵母克隆生长至饱和，然后在30℃条件下振荡诱导48小时。诱导后，将酵母细胞沉淀并收获上清液进行纯化。使用蛋白A柱纯化IgG并用pH 2.0的乙酸洗脱。
ForteBio KD 测定
在ForteBio Octet***中测试这些抗CD19抗体对可溶性CD19的结合亲和力(Octet RED384通常如前所述(参见，例如，Estep等人，Mabs 5(2),270-278(2013))。简而言之，ForteBio亲和力测定通过将IgG在线装载到AHC传感器上进行。将抗体固定在抗人IgG针上，并与可溶性CD19-HSA融合蛋白(CD19细胞外结构域与人血清白蛋白融合)结合。传感器在测定缓冲液中离线平衡30分钟，然后在线监测60秒以建立基线。将带有装载IgG的传感器暴露于100nM可溶性CD19-HSA融合蛋白抗原3分钟，然后将其转移到测定缓冲液中3分钟，以进行解离速率(off-rate)测量。使用1:1结合模型分析所有动力学。表1中提供结合动力学的总结。示例性抗体的亲和力范围在8nM和20nM之间。表1中所示的所有抗CD19抗体包括包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的VH。
表1.抗CD19抗体的结合动力学
Figure BDA0003988369050000631
实施例2-靶向CD19的CAR的生成和CAR表达
生成了三个靶向CD19的CAR，“CAR#2”、“CAR#8”和“CAR#15”。使用PE偶联抗人LNGFR抗体检查细胞表面上CAR分子的表达，随后进行流式细胞术分析。LNGFR通过自切割接头2A序列与CAR共表达，因此LNGFR的表达被用作CAR表达的指示。结果如表2所示。
表2
CAR-T# LNGFR+％
CAR#2 53.7％
CAR#8 64.1％
CAR#15 18.5％
阳性对照 31.6％
UTD 0.35％
UTD：未转导T细胞
阳性对照是靶向CD19的CAR，其包含小鼠scFv SJ25c1和CD3ζ1XX，称为“1928z1XXCAR”。
实施例3–靶向CD19的CAR的体外活性
检查这些靶向CD19的CAR对表达CD19的Raji癌细胞系和CD19敲除的Raji细胞的细胞毒性。将每个靶细胞系接种在384孔板中，并以4效应细胞与靶细胞(E:T)比率添加CD19CAR-T或未转导T细胞(UTD)。仅含有靶细胞的孔和仅含有效应细胞的孔作为对照。24小时后，使用CellTiter
Figure BDA0003988369050000641
One Solution Assay(Promega，G8462)测量细胞活力。通过共培养孔的发光信号，首先减去仅效应细胞孔的信号，然后除以仅靶细胞孔的信号之后，计算靶细胞的存活百分比。通过从100％中减去靶细胞的存活百分比来计算杀伤百分比。如图1A和1B所示，与CD19敲除Raji细胞相比，包含CAR#2的T细胞、包含CAR#8的T细胞和包含CAR#15的T细胞均显示出对Raji细胞的细胞杀伤活性，表明包含这些靶向CD19的CAR的T细胞的杀伤活性是抗原依赖性的。
为了证实抗原依赖性细胞毒性，将包含这些靶向CD19的CAR的T细胞与表达CD19的Raji癌细胞系或CD19敲除的Raji细胞共培养。每个靶细胞系用细胞微量紫色染料标记，然后接种在96孔板中，以2个效应细胞与靶细胞(E:T)比率添加CD19 CAR-T或未转导T细胞(UTD)。仅含有靶细胞的孔和仅含有效应细胞的孔作为对照。20小时后，使用活/死染料染色，然后进行流式细胞术分析，测量细胞活力。通过流式细胞术测量活细胞，然后除以仅靶细胞孔的信号，计算靶细胞的存活百分比。通过从100％中减去靶细胞的存活百分比来计算杀伤百分比。如图2A和2B所示，与CD19敲除Raji细胞相比，包含CAR#2的T细胞、包含CAR#8的T细胞和包含CAR#15的T细胞均显示出对Raji细胞的细胞杀伤活性，证实了包含这些靶向CD19的CAR的T细胞的杀伤活性是抗原依赖性的。
用包含CAR#2的T细胞、包含CAR#8的T细胞和包含CAR#15的T细胞与表达CD19的Raji癌细胞系和CD19敲除的Raji细胞共培养，评估抗原非依赖性细胞因子(IL-2和IFN-γ)的分泌。将每个靶细胞系接种在384孔板中，并以4效应细胞与靶细胞(E:T)比率添加CD19CAR-T或未转导T细胞(UTD)。仅含有靶细胞的孔和仅含有效应细胞的孔作为对照。24小时后，收获上清液，并使用Intellicyt QBeads Human PlexScreen试剂盒(Sartorius，90702)检测上清液中分泌的IFN-γ和IL2。IL-2分泌结果见图3A和3B，IFN-γ分泌结果见图4A和4B。与CD19敲除的Raji细胞相比，包含这些靶向CD19的CAR的T细胞在与Raji细胞共培养时显示出IL-2和IFN-γ分泌，这表明包含这些靶向CD19的CAR的T细胞的抗原依赖性细胞因子释放。
实施例4–靶向CD19的CAR的体内活性
接下来研究包含这些靶向CD19的CAR的T细胞的体内活性。
将NOD-scid IL2Rgnull(NSG)小鼠静脉注射(iv)0.5×106个表达萤火虫荧光素酶的NALM6细胞(B-ALL细胞系)，其具有野生型CD19水平(CD19-WT)或降低的CD19水平(CD19-低，通过CRISPR-Cas9编辑CD19基因产生的NALM6克隆，随后使用慢病毒载体重新表达CD19)。4天后，用单次静脉注射新鲜的5×104个(红色)或2×105个(蓝色，绿色)#17、#8、#15或#2CART细胞来治疗携带CD19-WT(蓝色，红色)和CD19-低(绿色)NALM6的小鼠。在60-100天内对CART细胞治疗的小鼠进行重复成像，以评估肿瘤反应和潜在复发，从而严格评估CAR T细胞效力。通过生物发光成像分析T细胞输注后第30天的肿瘤负荷，并在图5中所示的时间点对每只小鼠进行了展示。#2CAR T细胞显示出快速有效的抗肿瘤活性，导致在所有测试的T细胞剂量下NALM6 WT和NALM6 CD19-低细胞完全消除肿瘤。#17显示肿瘤控制不足，导致肿瘤快速进展，并作为对照。
实施例5-#2scFv的结合表位
通过连续稀释和流式细胞术测定与表达CD19的NALM6细胞系结合的抗CD19抗体。通过Biacore SPR评估CD19-T2结合体、SJ25c1(来自19-28z CAR)和FMC63(来自Kymriah的“Tisagenleleucel”和Yescarta的“Axicabtagene ciloleucel”)scFv与CD19的竞争性结合。将100nM CD19-HSA-His(Takeda，Cambridge)和增加浓度的可溶性CD19-T2 SJ25c1或FMC63-scFv(0、50nM、100nM、200nM、400nM和800nM)的混合物流过具有固定化CD19-T2 scFv的Biacore CMS芯片3分钟。通过使HBS-EP缓冲液(300mM NaCl)流动5分钟来评估结合在芯片上的复合物的解离。CD19-HSA-His从HEK293中纯化，HEK293为用pcDNA3.4质粒(ThermoFisher)瞬时转染，所述质粒包含表达CD19细胞外结构域的基因，所述CD19细胞外结构域与10decahistine标签、TEV切割位点、GS接头和HAS融合。通过使用镍亲和层析纯化重组CD19-HSA-His10。CD19-HSA-His10的氨基酸序列如图6所示。
SJ25c、FMC63和#2scFv的表位结合数据如图7所示。如图7中所示，#2scFv与FMC63及SJ25C1竞争与CD19结合。这些发现证实#2scFv、FMC63与SJ25C1 scFv与CD19上的重叠表位结合。不与CD19结合的非相关抗体(抗CTLA4 VHH)未能与#2scFv竞争与CD19的结合。
实施例6–药理学研究
总结
为了支持第一次人体临床试验，进行了一系列研究，以证明#2CAR T细胞(在本实施例中表示为“19(T2)28z1XX CAR”)相对于1928z CAR T细胞(其在先前的临床试验中已被广泛施用)的疗效有所改善，通过在低T细胞剂量下抗肿瘤效力提高和应答耐久性提高来衡量。被工程化以表达CAR的CAR T细胞在体外显示出相当的细胞溶解活性、细胞因子分泌和增殖，但#2CAR T细胞由于其更强大的功能持久性而在体内获得了更大的效力(Feucht等人，Nature Medicine(2019)；25(1):82-88)。
结果
使用18小时生物发光测定法测量#2CAR T细胞和1928z-1XX CAR T细胞的体外细胞毒性活性。这两个CAR相同，但scFv不同(#2vs.SJ25c1)。包含#2CAR的逆转录病毒载体如图8所示。如前所述(Przybylowski等人，(2006)；13(1):95-100)，重组逆转录病毒颗粒由HEK293 GalV9包装细胞产生。表达萤火虫萤光素酶(FFL)的NALM6细胞用作靶细胞。通过阴性选择从人PMBC中分离T细胞，用与磁珠结合的CD3/CD28抗体激活48小时，在磁珠去除后，用表达CAR的γ-逆转录病毒载体转导。通过与CAR基因共表达的LNGFR检测确定CAR+群体。CAR+T细胞与靶NALM6细胞在不同效应子(E)与靶标(T)比率下孵育18h，然后定量FFL活性。将#2CAR T细胞的细胞毒性活性与1928z-1xx CAR T细胞的细胞毒活性进行了比较，先前显示1928z-1xx CAR T细胞在体外有效杀伤CD19+NALM6细胞(Feucht等人，Nature Medicine(2019)；25(1):82-88)。未转导(UT)T细胞用作阴性对照。NALM6-CD19KO是通过CRISPR-Cas9编辑CD19基因产生的细胞系(Hamieh等人,Nature(2019)；568(7750):112-116)，并用于证明CAR T细胞细胞毒性活性的特异性。显示了一个代表性实验(n＝2在2个健康供体上的独立实验)。如图10所示，#2CAR T细胞和1928z-1XX CAR T细胞显示出相当的细胞毒性。
接下来，测量#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)和1928z-1XX CAR T细胞的体内活性。用萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)转导NALM6，其是表达正常(wt)或低(low)水平CD19抗原的前B急性淋巴细胞白血病人肿瘤细胞系(Zhao等人,Cancer Cell(2015)；28:415-428)。携带CD19+wt(蓝色)和CD19+low(红色)NALM6的小鼠通过单次静脉注射新鲜的2×105个未转导T细胞、#2CAR T细胞或1928z-1XX CAR T细胞进行治疗。通过生物发光成像(BLI)监测每只小鼠的肿瘤负荷85天。每组有5只小鼠，每只小鼠的反应如图11所示。如图11中所示，#2CAR T细胞和1928z1XX CAR T细胞具有相似的肿瘤消除动力学。CARcDNA与LNGFR报告子共表达(以监测T细胞转导)。“19(T2)28z1XX CAR”代表“#2CAR”。
研究并比较了#2CAR T细胞和1928z CAR T细胞的活性。首先，测量1928z CAR T细胞和#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T”)的CAR表达和表型。包含1928z CAR的载体如图12所示。用γ-逆转录病毒载体转导CD4+和CD8+T细胞，其表达1928z CAR或#2CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)，并使用具有临床制造代表性的工艺生产。由于SGF-1928z中的SJ25c1 scFv来源于小鼠，而#2scFv(表示为“19(T2)scFv”)是人源化的，因此使用两种对IgG重链的小鼠(GAM)或人(GAH)Fc部分特异的不同山羊抗体来检测CAR表面表达。如图13所示，超过50％的CD4+和CD8+T细胞表达CAR。
接下来，通过流式细胞术使用识别幼稚、中央记忆、效应记忆和效应T细胞以及耗竭标志物(LAG3、PD1和Tim3)的标志物的抗体来确定CAR T细胞的表型。“SFG-T2-1XX-GAH”是指用表达19(T2)28z1XX CAR(代表“#2CAR”)的γ-逆转录病毒载体转导的CD4/CD8 T细胞，而“SFG-1928z-GAM”是来自用表达1928z CAR的γ逆转录病毒载体转导的T细胞。如图14所示，1928z CAR T细胞和#2CAR T细胞的表型相似。1928z和#2CAR T细胞中CD4/CD8 T细胞的比例相似，通过CD62L/CD45RA和CD45RA/CCR7染色测定，两个CAR组(CD4和CD8 T细胞)的T细胞分化状态相当。耗竭标志物PD1、LAG3和TIM3的表达没有显示两个CAR T细胞组之间的主要差异。
随后，评估并比较#2CAR T细胞和1928z CAR T细胞的体内活性。在小鼠尾静脉注射5×105个CD19+NALM6-FFLuc/GFP细胞4天后，给予解冻后的冷冻保存的未转导或CAR T细胞。如图15所示，#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)提供了优于1928z CART细胞的肿瘤控制。用未转导或CAR T细胞治疗的携带CD19+NALM6的小鼠的存活率绘制在图16所示的Kaplan-Meier曲线图中。如图16中所示，用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XXCAR T细胞”)治疗的携带CD19+NALM6小鼠的生存时间比用1928z CAR T细胞治疗的小鼠的生存时间更长(所有CAR T细胞剂量均低于每只小鼠1×106个细胞)。所有1928z CAR T细胞接受者在第25天死亡，而在接受#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)的研究组中只有一只小鼠死亡。在最高剂量(1×106)时，对照组和试验组均有一只小鼠死亡。
还测量了CD19+NALM6白血病小鼠模型中#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CART细胞”)和1928z CAR T细胞的体内持久性。治疗后17天CAR T细胞的持续性和骨髓中CAR T细胞的数量(每组n＝5)如图17所示。图17中显示了CAR T细胞的PD1、LAG3和TIM3表达百分比，以及CAR T细胞的Tn、Tcm、Teff和Tem百分比。
如图17所示，到第17天，在骨髓中很容易检测到#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)，包括CD4+和CD8+CAR T细胞。1928z CAR T细胞很少，与它们的有限持久性一致(Zhao等人，Cancer Cell(2015)；28:415-428)。第17天检测到的持久性T细胞的各自表型总体相似(Tn、Tcm和Tem)，显示#2CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)组中效应T细胞(Teff)的比例略高。后者表达了更多的PD1和相当水平的LAG3和TIM3。这一观察证实了表达CD28/CD3z-1XX信号传导基序的CAR T细胞更持久(Feucht等人，Nature Medicine(2019)；25(1):82-88)。
这些结果证实了#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)相对于1928zCAR T细胞的更强效力(在4个剂量水平下更高的肿瘤根除率)。这项研究进一步证实，#2CART细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)的表型与1928z CAR T细胞的表型总体相似，并且与#2CAR T细胞(表示“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)一致，由于其与寿命较短的1928z CART细胞相比具有更强的持久性，因此实现了更好的肿瘤控制。
方法和材料
细胞溶解测定
基于荧光素酶的测定用于测量用不同CAR构建体转导的T细胞的细胞毒性。表达FFLuc-GFP的NALM6作为靶细胞。效应细胞和肿瘤靶细胞在黑壁96孔板中以指定的效应细胞/靶细胞比例共培养，三个重复。在X-VIVO15中添加5％的人AB血清(Gemini)、10U/ml IL7和10U/ml IL15(PeproTech,Inc)，以每孔100μL的总体积接种5×104个靶细胞。使用以相同细胞密度单独接种的靶细胞来测定最大荧光素酶表达(相对光单位(RLU))。共培养18小时后，将100μL荧光素酶底物(Bright Glo；Promega)直接添加到每个孔中。使用发光板读取器测定发射光。肿瘤细胞裂解计算为(1-(RLU样品)/(RLU最大))×100。
基因修饰的人T细胞的分离、转导和扩增
从纽约血液中心(不受机构审查委员会的限制)购买了身份不明的健康供体的血沉棕黄层。所有血液样品均按照规定的道德和安全程序进行处理。如前所述(Zhao等人，Cancer Cell(2015)；28:415-428)，通过密度梯度离心分离外周血单核细胞，并用
Figure BDA0003988369050000691
ClinExVivoTMCD3/CD28抗体珠活化，随后通过在RetroNectin包被板(Takara)上离心用γ-逆转录病毒载体转导。两天后，如前所述(Hollyman等人，J.Immunotherapy(2009)；32(2):160-180)，活化的T细胞去除珠并通过离心接种法(spinoculation)转导。然后，根据制造商的说明(Wilson Wolf Corporation)，在G-Rex 6M孔板中扩增转导的细胞。转导效率在转导后5天测定。CAR-T细胞新鲜使用或在Plasmalyte中的50％CS10和5％HSA中冷冻保存后解冻使用。
小鼠全身肿瘤模型
根据纪念斯隆凯特琳癌症中心(MSKCC)机构动物护理和使用委员会批准的方案，使用6至12周大的NOD/SCID/IL-2Rγnull雄性小鼠。遵守了所有相关的动物使用指南和道德规范。通常，小鼠通过尾静脉注射接种0.5×106个NALM6(CD19+wt或低表达)-FFLuc-GFP肿瘤细胞，然后在肿瘤注射后4天每只小鼠接受特定剂量的CAR-T细胞治疗。NALM6细胞提供了均匀的肿瘤负荷，在CAR-T细胞治疗之前没有小鼠被排除在外。未使用随机或盲法。
生物发光成像
如前所述评估肿瘤负荷(Gade等人，Cancer Research(2005)；65(16):9080-9088)。简言之，在2％异氟烷麻醉下10分钟的小鼠腹腔内注射重悬在PBS中的D-荧光素(Xenogen，每只小鼠3mg)，并成像。IVIS成像***(PerkinElmer)用于成像注射肿瘤的生物发光。使用活体图像软件(PerkinElmer)分析数据。
用于流式细胞术的抗体
使用以下荧光团偶联抗体检测离体生成的或在1×106个CAR T治疗17天后从小鼠骨髓和脾脏中分离的CAR T细胞的表面标志物的表达：APC-Cy7抗人CD8(SK1)、APC-Cy7小鼠抗人CD45(2D1)、BUV395小鼠抗人CD4(SK3)、BV421小鼠抗人CD62L(DREG-56)、BV650小鼠抗人CD45RA(HI100)、BV480或BV510小鼠抗人PD-1(EH12.1)和BUV737小鼠抗人CD19(SJ25C1)(BD Bioscience)；PE-Cy7抗人CD8(SK1)和PerCP-eFluor 710抗人LAG-3(3DS223H)(eBioscience)；PerCP抗人CD45RA(HI100)、Brilliant Violet 785抗人Tim-3(F38-2E2)和PE抗人CD127(IL7Ra)(Biolegend)。使用Alexa Fluor 647山羊抗小鼠AffiniPure IgG，F(ab’)2片段检测1928z CAR的表达。为了检测#2CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)，使用Alexa Fluor 647山羊抗人IgG，F(ab’)2片段。7-AAD(Beckman Coulter)用作活性染料。在Cytek Aurora仪器(CytekBiosciences)上进行流式细胞术。使用FlowJo软件v.10.1(FlowJo LLC)分析数据。
统计分析
使用Prism 8(GraphPad)软件进行所有统计分析。通过双尾非配对t检验确定两组之间的统计比较。对于体内研究，使用Kaplan-Meier曲线显示总生存率。统计学意义定义为p值<0.05。
实施例7–毒性评估
总结
在携带NALM6白血病的NSG小鼠体内评估了#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XXCAR T细胞”)的毒性。小鼠以相同剂量静脉注射1928z CAR T细胞作为对照。记录的参数包括所有小鼠的体重、肿瘤负荷和生存时间。更广泛的毒理学研究集中于以最高剂量(1×106个CAR T细胞/接受者)治疗的小鼠，该剂量超过了该小鼠模型(10x)中的最低治疗(治愈)剂量，也超过了临床上以与接受者体重成比例(10-100x)使用的CAR T细胞剂量。这些研究包括主要肿瘤部位(骨髓)T细胞的计数和表型、血清细胞因子测定(人，即T细胞来源的，和鼠，即宿主来源的)、基础血清生化(包括肝酶、外周血细胞计数和器官重量)以及研究结束时(第27-28天)的综合组织免疫组织化学。输注的CAR T细胞以临床相关的方式生产，并且在两种CAR T细胞产品之间相当。
试验组和对照组的体重和生存时间没有显著差异。血清细胞因子水平也相当，且两组均未出现CRS。第10天，两个研究组的ALT和AST酶水平相当。第27/28天，用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)治疗的小鼠的酶水平低于用1928z CAR T细胞治疗的小鼠。
正如预期的那样，#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)比1928z CART细胞寿命更长。#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)治疗组的小鼠的淋巴细胞和网织红细胞计数高于1928z CAR T细胞组。接受1928z CAR T细胞的小鼠表现出弥漫性肿瘤浸润，但在接受#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)中没有。具有持久性#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)的小鼠显示轻度至中度异种GVHD和肝细胞坏死。
尽管用高剂量人CAR T细胞治疗的NSG小鼠预计会出现GVHD，但后者的机制尚不确定。考虑到研究的异种性质(人T细胞容易对小鼠组织产生异种反应)及其使用单一供体(未知的潜在T细胞受体库)的行为，该不良事件对人自体治疗的意义尚不确定。
动物模型的合理性
NSG小鼠中的NALM6模型已广泛用于评估Sadelain实验室中CD19特异性CAR T细胞的活性(Zhao等人，Cancer Cell(2015)；28:415-428、Feucht等人，NatureMedicine(2019)；25(1):82-88、Hamieh等人，Nature(2019)；568(7750):112-116、Eyquem等人，Nature(2017)；543(7643):113-117)和其他。NALM6是一种人前B急性淋巴细胞白血病(ALL)，表达CD19，但不表达CD80、CD86、4-1BBL或其他主要共刺激配体。
剂量和时间表的合理性
基于％转导效率和总活细胞，单次静脉注射1×106个活CAR T细胞是选定的剂量，这相当于该动物模型中最低有效治疗量(1×105个CAR T细胞)的10倍(见图15)。对于成人，当由小鼠体重换算成人体重时，CAR T细胞剂量大约比批准的CD19 CAR T细胞剂量高10-100倍(例如，批准的剂量为0.1-1.5×108个活CAR T细胞)。#2CAR T细胞的人临床试验方案中建议的起始单位剂量为25×106个CAR T细胞。
方法
供试品和载体
供试品是1928z CAR T细胞、#2CAR T细胞(在本实施例中表示为“19(T2)28z1XXCAR T细胞”)和由MSKCC的细胞治疗和细胞工程设施(CTCEF)制备的未转导T细胞。在研究开始之前，将细胞在液氮中冷冻。在T细胞注射当天，将细胞在37℃下解冻，并含1％HSA的Plasmalyte洗涤。然后使用含1％HSA的Plasmalyte将细胞配制成每只小鼠200μL体积中1×106、5×105、2×105和1×105个CAR-T细胞的剂量。CAR T细胞的数量通过将总细胞数量乘以CAR+百分比来确定，CAR+百分比已使用流式细胞术预先确定。
测试***
使用注射0.5×106个FFLuc-GFP NALM6癌细胞的6-12周龄NOD/SCID/IL-2Rγnull雄性小鼠进行实验。在输注肿瘤细胞4天后，将解冻的冷冻保存的1×106个CD4/CD8选择的T细胞输注到小鼠体内，该T细胞转导了1928z CAR或#2CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)的γ-逆转录病毒载体。未经治疗的小鼠预计在第16-18天因骨髓浸润性白血病而发生后肢瘫痪。
野生型NALM6人肿瘤细胞系是前B急性淋巴细胞白血病的一种很好的模型，Sadelain实验室已在许多同行评审的出版物中使用该模型(Zhao等人，Cancer Cell(2015)；28:415-428，Feucht等人，Nature Medicine(2019)；25(1):82-88，Hamieh等人，Nature(2019)；568(7750):112-116，Eyquem等人，Nature(2017)；543(7643):113-117)。
研究设计
115只小鼠被分为1928z CAR、#2CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)和未转导组。所有小鼠在T细胞治疗前4天通过尾静脉注射接受0.5×106个FFLuc-GFP NALM6肿瘤细胞。在研究第0天，将小鼠分到治疗组中。每组通过静脉给药接受一次单剂量(200μl)的供试品。表3列出了小组分配情况。
表3–实验设计和小组分配
Figure BDA0003988369050000731
Figure BDA0003988369050000741
*BLI–从第0天开始每周进行一次生物发光成像(输注CAR T细胞)
Figure BDA0003988369050000742
-未转导的CD4/CD8T细胞。
Figure BDA0003988369050000743
-所有小鼠在第7天、第11天、第21天和第27天称重，直到动物的中期(interim)或最终处死。
毒理学参数
通过供试品施用后体重的变化监测毒性。供试品施用10天和28天后，在2％异氟烷麻醉后，从眼眶静脉丛采集1928z CAR T细胞和#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)的1×106剂量组的血液样品。将血液样品收集到含有血清分离器的试管中，并用于测量细胞因子和肝酶的水平。在第27天和第28天，来自1928z CAR和#2 CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)的1×106剂量组的小鼠在指定的每一天进行全面尸检分析。
细胞因子分析
在CAR T治疗后的第10天和第28天，从接受1×106CAR T细胞剂量的1928z CAR和#2CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)组收集小鼠血清。样品在-80℃下储存，直至分析。ProcartaPlex测定用于定量小鼠细胞因子(MCP-1、IL-6和G-CSF)和人细胞因子(IL2、IL3、IFN-g、GM-CSF、颗粒酶B和TNF-a)的水平。本研究中所有ProcartaPlex相关试剂均购自ThermoFisher Scientific。从患有严重细胞因子释放综合征的小鼠模型收集的血清用作阳性对照(Giavridis等人，Nature Medicine(2018)；24(6):731-738)。将来自单个细胞因子的单参数试剂盒(simplex kit)的60μL珠子合并，并根据制造商的方案将50μL珠子混合物分配到96孔板的每个孔中。将标准品、质控品和使用通用分析缓冲液1:4稀释的样品添加到孔中。将板密封，在室温下以500rpm振荡30分钟，并转移至4℃。培养过夜后，在室温下以500rpm将板再振荡30分钟。洗涤板，并将检测抗体添加到每个孔中。将板密封并在室温下以500rpm振荡30分钟。洗涤后，向每个孔中加入Streptavidin RPE溶液。将板密封并在室温下以500rpm振荡30分钟。在最后的洗涤步骤之后，将珠重新悬浮在读数缓冲液中，并在Luminex 200仪器上获得测定信号。使用5参数logistic方程生成单个细胞因子的标准曲线，并通过xPONENT软件(版本4.2.1509.0)计算每个样品中单个细胞因子浓度。
统计
所有统计分析均使用Prism 8(GraphPad)软件完成。通过双尾非配对t检验确定两组之间的统计比较。统计学意义定义为p值<0.05。
结果
测量1928z CAR T细胞和#2 CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)治疗期间小鼠体重的变化。NALM6荷瘤小鼠用1×106、5×105、2×105或1×105个1928z CAR T细胞或#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)治疗(每组n＝10)，而未转导T细胞治疗作为对照组(n＝5)。结果如图18所示。如图18中所示，两种CAR T细胞治疗之间的体重变化相似。
接下来，测量用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)和1928z CAR T细胞治疗的小鼠血清中的肝酶。图19显示了在第10天和第27/28天(剂量水平＝1×106个CAR T，每组n＝10)两种CAR T治疗的小鼠的肝酶水平的量化。在第10和第27/28天评估用1×106个1928z CAR T细胞或#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)治疗的NALM6荷瘤小鼠的ALT和AST水平。如图19所示，第10天，两个研究组的ALT和AST酶水平相当。第27/28天，用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)治疗的小鼠的酶水平低于用1928z CAR T细胞治疗的小鼠。
在输注后的第10天和第27/29天，测量用1×106个#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)或1928z CAR T细胞治疗的小鼠中的人和小鼠细胞因子水平。图20显示了在第10天和第27/28天从两组不同CAR T治疗小鼠获得的血清中人细胞因子水平的定量(剂量水平＝1×106CAR T，每组n＝10)。从患有严重细胞因子释放综合征的小鼠模型收集的血清用作阳性对照(n＝2)(Giavridis等人，Nature Medicine(2018)；24(6):731-738)。IL2、IL3、GM-CSF、颗粒酶B和TNF-α水平在第10天和第27/28天的两个CAR T细胞组之间相当。第27/28天，19(T2)28z1XX CAR T治疗组的IFN-γ水平高于接受1928z CAR T细胞的小鼠。
图21显示了在第10天和第27/28天用1928z CAR T细胞或#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)(剂量水平＝1×106个CAR T，每组n＝10)治疗的小鼠血清中小鼠细胞因子水平的定量结果。从患有严重细胞因子释放综合征的小鼠模型中采集的血清用作阳性对照(n＝2)(Giavridis等人，Nature Medicine(2018)；24(6):731-738)。在第10天，用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX-CAR T细胞”)治疗的小鼠的MCP-1和G-CSF的水平略高于输注1928z CAR T细胞的小鼠，而IL6的水平在两个CAR T细胞组中相当。在27/28天，用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)治疗的小鼠的MCP-1、IL-6和G-CSF水平与1928z CAR T组相似。这些观察结果表明，两组均无细胞因子释放综合征(CRS)的证据。
在输注后27/28天，测量用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)和1928z CAR T细胞治疗的小鼠的血细胞计数。图22显示了第27/28天两个不同CAR T治疗组(剂量水平＝1×106个CAR T，每组n＝10)的基本血细胞定量。显示了中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞计数以及网织红细胞计数的比较。如图22所示，中性粒细胞和单核细胞在两个CAR T组(1×106剂量水平)之间相当。19(T2)28z1XX CAR T细胞治疗组小鼠的淋巴细胞和网织红细胞计数高于1928z CAR T细胞组。
此外，还测量了用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)和1928z CART细胞治疗的小鼠在尸检时的体重和器官重量。比较了第27/28天两个不同CAR T治疗组(剂量水平＝1×106个CAR T)的体重和主要器官重量。结果如图23所示。如图23中所示，两个治疗组1和2的体重、脾脏和肾脏重量相当。19(T2)28z1XX CAR T治疗组(标记为“SFG-19(T2)28z-1XX”)的小鼠的肝脏重量比1928z CAR T组(标记为“SFG-1928z”)的小鼠轻。心脏重量的差异归因于不均匀的技术处理。
测量用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)和1928z CAR T细胞治疗的小鼠的肝脏、骨髓和脾脏的CD3+和CD19+免疫组织化学。CAR T治疗(剂量水平＝1×106个CAR T，n＝6)后27/28天小鼠肝脏、脾脏和骨髓中淋巴细胞和肿瘤浸润水平的评估如图24所示。如图24所示，19(T2)28z1XX CAR T治疗组(标记为“SFG-19(T2)28z-1XX”)的小鼠在所有评估器官中的CD3+细胞水平高于用1928z CAR T细胞(标记为“SFG-1928z”)治疗的动物。1928z CAR T组的所有受试器官中均观察到肿瘤浸润，但19(T2)28z1XX CAR T组中未观察到。
结论
在每个接受者的高剂量为1×106个CAR T下，将#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)的毒性曲线与1928z CAR T细胞的毒性曲线进行了比较。未发现全身体重或生存率的差异。第10天测得的血清细胞因子水平在两组之间相当，表明#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)比1928z CAR T细胞更不可能诱发细胞因子释放综合征(CRS)。在第10天和第17天，两组的肝酶都升高了，但在#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)的接受者中，肝酶的升高程度低于给予1928z CAR T细胞的接受者。#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)接受者的外周血细胞计数显示出较高的淋巴细胞计数，这与FACs分析(第17天)和组织IHC(第27/28天)记录的后者的更强持久性一致。观察到孤立的网状细胞增多症，没有贫血、红细胞增多症或红细胞增生，因此不被视为不良事件。
两组之间的器官重量相似，但肝脏除外，1928z CAR T细胞治疗的小鼠肝脏重量更重，这是由于肿瘤的实质性进展(BLI和IHC)。相反，用#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XXCAR T细胞”)治疗的小鼠由IHC显示没有肿瘤，证实了这些相同小鼠的BLI结果。在#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)受体小鼠中观察到多器官淋巴细胞浸润，与异种GVHD一致。后者通过在这些组织中发现上皮坏死得到证实。在输注#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)的小鼠中也观察到轻度至中度肝细胞坏死。这一微观结果通常与GVHD无关，因此代表可能的不良事件。考虑到肝酶(仅AST，而非ALT)的适度升高和正常胆红素值，其对肝功能的影响有限。其他病理结果是次要的，在两个治疗组之间表现相同，因此不被视为代表重要结果。两个治疗组之间的T细胞流式细胞术图谱相似，这与预期的结果一致，即#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)由于CAR T细胞的更强持久性而显示出更强的治疗效力。
评估#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)与临床测试的1928z CART细胞(Park等人，N.Engl.J.Med.(2018)；378(5):449-459)的比较的毒性研究，在用#2CART细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)治疗的小鼠中发现轻度至中度GVHD以及轻度至中度肝细胞坏死。
从本实施例和实施例6中显示的数据可以得出结论，#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)更有效，因为它们相对于1928z CAR T细胞具有更强的持久性，但不会带来更大的风险。#2CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)的相对增强的效力支持了从25×106个CAR T细胞的剂量开始的人临床试验设计，与大多数靶向CD19的CAR T试验相比，这是一个相对较低的剂量。
实施例8–药理学研究
抗CD19抗体的细胞上(on-cell)结合
通过流式细胞术在表达内源性CD19的Raji和NALM-6细胞系上评估包含本公开的scFv的VH和VL的抗CD19抗体的细胞上结合。在CD19阳性亲本系和相应的CD19敲除Raji和NALM-6系上测试每种抗体，以确认细胞上靶向特异性结合。图25所示的流式细胞术色谱图显示，CD19阳性细胞系与相应敲除细胞系的背景结合相比，有1-2个对数偏移。
图26A-26C所示的连续稀释流式细胞术结果显示了NALM-6细胞上的饱和结合。由曲线计算的EC50值在表4中提供。示例性抗CD19抗体以至少0.2nM的高亲和力结合CD19阳性NALM-6细胞。在CD19阳性细胞上观察到的与可溶性蛋白相比更高的亲和力表明，这些抗体结合的表位可能比在CD19-HSA融合蛋白中更天然地存在于细胞上。表4中所示的所有抗CD19抗体包括包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的VH。
表4.NALM6细胞上抗CD19抗体的EC50
Figure BDA0003988369050000791
实施例9–靶向CD19的19(T2)28z1XX CAR T细胞在复发或难治性B细胞恶性肿瘤成 年患者中的I期研究
本实施例描述了靶向CD19的19(T2)28z1XX CAR T细胞在复发或难治性B细胞恶性肿瘤的成年患者中的I期研究。此处可互换地使用“19(T2)28z1XX”和“19(2)28z1XX”。靶向B细胞特异性表面抗原CD19的自体CAR T细胞治疗在复发或难治性(R/R)B细胞淋巴瘤(BCL)中显示出良好的临床反应。然而，尽管初始完全缓解(CR)率为40-60％，但只有一部分患者经历了持久缓解，需要通过预防复发和获得更深入的临床反应(CR)来进一步提高CAR疗法的疗效。
研究设计和方法：本研究为19(T2)28z1XX在R/R B细胞恶性肿瘤患者中的单中心I期临床试验。关键疾病资格标准包括R/R弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别BCL、原发性纵隔BCL、惰性BCL和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。只要证实CD19的表达，既往接受CD19 CAR治疗的患者就符合资格。关键排除标准包括持续的免疫抑制，如全身GvHD治疗和活动性CNS疾病。
该研究采用3+3剂量递增设计来确定BCL的最大耐受剂量。有5个计划的平剂量水平：25×106、50×106、100×106、150×106和200×106个CAR T细胞。患者接受为期3天的氟达拉滨和环磷酰胺的调理化疗，然后单次输注19(T2)28z1XX CAR T细胞。在剂量递增阶段，DLBCL、高级别BCL和原发性纵隔BCL患者有资格参与。一旦确定了推荐的2期剂量(RP2D)，该研究将进入两个队列的剂量扩展阶段。队列1包括DLBCL、高等级BCL和原发性纵隔BCL(即与剂量递增阶段相同的资格标准)。队列2包括患有惰性BCL、CLL和Richter转化的患者。试验的剂量扩展部分旨在进一步表征19(T2)28z1XX CAR在多个适应症中的安全性、有效性和药代动力学。最多登记60名患者。
试验的主要目的是评估安全性和耐受性，并确定19(T2)28z1XX的推荐的2期剂量。关键次要目标包括评估19(T2)28z1XX的疗效和药代动力学。探索性目标包括评估B细胞再生障碍和可测量的残余疾病(MRD)，输注前后19(T2)28z1XX CAR T细胞表型的特征，以及血清细胞因子的分析。
尽管已经详细描述了本公开的主题及其某些优点，但是应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以在这里进行各种改变、取代和更改。此外，本申请的范围不限于说明书中描述的工艺、机器、制造和物质组成以及方法的特定实施方式。本领域普通技术人员将从本公开的主题、工艺、机器、制造、物质组成或方法的公开中容易地理解，可以根据本公开的主题来利用当前存在的或将来开发的来执行与本文描述的相应实施方式基本相同的功能或实现基本相同的结果。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括这样的工艺、机器、制造、物质组成或方法。
本申请中引用了各种专利、专利申请、出版物、产品描述、协议和序列号，出于所有目的，其公开内容通过全文引用并入本文。
序列表
<110> 纪念斯隆-凯瑟琳癌症中心
千年制药公司
<120> 靶向CD19的嵌合抗原受体及其用途
<130> 087108.0107
<150> US 63/073,133
<151> 2020-09-01
<150> US 63/015,362
<151> 2020-04-24
<160> 77
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            20
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25
<210> 5
<211> 557
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1               5                   10                  15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
            20                  25                  30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
        35                  40                  45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
    50                  55                  60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65                  70                  75                  80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
                85                  90                  95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
            100                 105                 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
        115                 120                 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145                 150                 155                 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
                165                 170                 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
            180                 185                 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
        195                 200                 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225                 230                 235                 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
                245                 250                 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
            260                 265                 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
        275                 280                 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
    290                 295                 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305                 310                 315                 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
                325                 330                 335
Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
            340                 345                 350
Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
        355                 360                 365
Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
    370                 375                 380
Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly
385                 390                 395                 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
                405                 410                 415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
            420                 425                 430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
        435                 440                 445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
    450                 455                 460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser
465                 470                 475                 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Ala
                485                 490                 495
Gly Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro
            500                 505                 510
Gln Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp
        515                 520                 525
Ala Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala
    530                 535                 540
Trp Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545                 550                 555
<210> 6
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1               5                   10                  15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
            20                  25                  30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
        35                  40                  45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
    50                  55                  60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65                  70                  75                  80
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Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145                 150                 155                 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
                165                 170                 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
            180                 185                 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
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Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
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465                 470                 475                 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly
                485                 490                 495
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln
            500                 505                 510
Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala
        515                 520                 525
Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp
    530                 535                 540
Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545                 550                 555
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
Ser Tyr Gly Met His
1               5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
Pro Val Glu Gly Leu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Pro Val Glu Gly Leu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Gln Gln Ala Gly Ala Val Pro Ile Thr
1               5
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Ala Val Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 15
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Ala Val Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
            100                 105                 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
        115                 120                 125
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
    130                 135                 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val
145                 150                 155                 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Trp Tyr
                165                 170                 175
Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
            180                 185                 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
        195                 200                 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Val Glu
    210                 215                 220
Gly Leu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225                 230                 235                 240
Val Ser Ser
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Gln Gln Leu Phe Asp Ser Pro Tyr Thr
1               5
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Phe Asp Ser Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 19
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Phe Asp Ser Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys
    130                 135                 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg
145                 150                 155                 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Trp Tyr Asp
                165                 170                 175
Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
            180                 185                 190
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
        195                 200                 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Val Glu Gly
    210                 215                 220
Leu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225                 230                 235                 240
Ser Ser
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr
1               5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Gln Gln Ala Gly Ile Pro Pro Tyr Thr
1               5
<210> 22
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Ile Pro Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 23
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Pro Val Glu Gly Leu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
    130                 135                 140
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
145                 150                 155                 160
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
                165                 170                 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr
            180                 185                 190
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Gln Ala Gly Ile Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225                 230                 235                 240
Glu Ile Lys
<210> 24
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1               5                   10                  15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
        35                  40                  45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
    50                  55                  60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
                85                  90                  95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
        115                 120                 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
    130                 135                 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145                 150                 155                 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
                165                 170                 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
            180                 185                 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
        195                 200                 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
    210                 215                 220
<210> 25
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 60
tttattattt tctgggtg 78
<210> 26
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 26
Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gln
1               5                   10                  15
Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val
            20                  25                  30
Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val
    50                  55                  60
Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val
                85                  90                  95
Thr Phe Arg Leu Trp Asn Leu His Val Asn His Thr Asp Ile Tyr Phe
            100                 105                 110
Cys Lys Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg
        115                 120                 125
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val
145                 150                 155                 160
Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp
                165                 170                 175
Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met
            180                 185                 190
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala
        195                 200                 205
Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
    210                 215
<210> 27
<211> 235
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr
            20                  25                  30
Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser
        35                  40                  45
Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala
    50                  55                  60
Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala
65                  70                  75                  80
Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp
                85                  90                  95
Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe
        115                 120                 125
Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
    130                 135                 140
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
145                 150                 155                 160
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
                165                 170                 175
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
            180                 185                 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
        195                 200                 205
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser
    210                 215                 220
Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
225                 230                 235
<210> 28
<211> 247
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 28
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Met
1               5                   10                  15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Pro
            20                  25                  30
Glu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Lys Met Asp Ala Glu Leu Gly Gln Lys
        35                  40                  45
Val Asp Leu Val Cys Glu Val Leu Gly Ser Val Ser Gln Gly Cys Ser
    50                  55                  60
Trp Leu Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Leu Pro Gln Pro Thr Phe Val
65                  70                  75                  80
Val Tyr Met Ala Ser Ser His Asn Lys Ile Thr Trp Asp Glu Lys Leu
                85                  90                  95
Asn Ser Ser Lys Leu Phe Ser Ala Val Arg Asp Thr Asn Asn Lys Tyr
            100                 105                 110
Val Leu Thr Leu Asn Lys Phe Ser Lys Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe
        115                 120                 125
Cys Ser Val Ile Ser Asn Ser Val Met Tyr Phe Ser Ser Val Val Pro
    130                 135                 140
Val Leu Gln Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu
                165                 170                 175
Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Pro
        195                 200                 205
Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Lys
    210                 215                 220
Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Leu Val Arg Gln Glu Gly Lys Pro
225                 230                 235                 240
Arg Pro Ser Glu Lys Ile Val
                245
<210> 29
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1               5                   10                  15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
            20                  25                  30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
        35                  40                  45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
    50                  55                  60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65                  70                  75                  80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
                85                  90                  95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
            100                 105                 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
        115                 120                 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
    130                 135                 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145                 150                 155                 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
            20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
        35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
            100                 105                 110
<210> 31
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
1               5                   10                  15
Asp Val Leu Asp Lys Arg
            20
<210> 32
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 60
aagaga 66
<210> 33
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Gln Asn Gln Leu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Phe
1               5                   10                  15
Asp Val Leu Asp Lys Arg
            20
<210> 34
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
cagaaccagc tctttaacga gctcaatcta ggacgaagag aggagttcga tgttttggac 60
aagaga 66
<210> 35
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
1               5                   10                  15
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
            20
<210> 36
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 60
gggatgaaa 69
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
1               5                   10                  15
Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys
            20
<210> 38
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
caggaaggcc tgttcaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggcctt cagtgagatt 60
gggatgaaa 69
<210> 39
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu His Met Gln
            20
<210> 40
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 60
atgcag 66
<210> 41
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu His Met Gln
            20
<210> 42
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
cacgatggcc ttttccaggg gctcagtaca gccaccaagg acaccttcga cgcccttcac 60
atgcag 66
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
            20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
        35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
            100                 105                 110
<210> 44
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgttcaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc ttcagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggccttttc caggggctca gtacagccac caaggacacc 300
ttcgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 45
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgttcaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc ttcagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggccttttc cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
ttcgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 46
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 47
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
            20                  25                  30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
    50                  55                  60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
                85                  90                  95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
            100                 105                 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
        115                 120                 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
    130                 135                 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145                 150                 155                 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
                165                 170                 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
            180                 185                 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
        195                 200                 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
    210                 215                 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225                 230                 235                 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
                245                 250                 255
<210> 48
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Pro Asp Thr Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
            20                  25                  30
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
        35                  40                  45
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
    50                  55                  60
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
65                  70                  75                  80
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
                85                  90                  95
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
            100                 105                 110
Gln Ala Gly Ala Val Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
        115                 120                 125
Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
145                 150                 155                 160
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
            180                 185                 190
Val Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
        195                 200                 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
    210                 215                 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Ala Lys Pro Val Glu Gly Leu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
                245                 250                 255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val
            260                 265                 270
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile
        275                 280                 285
Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
    290                 295                 300
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
305                 310                 315                 320
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
                325                 330                 335
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
            340                 345                 350
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
        355                 360                 365
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
    370                 375                 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385                 390                 395                 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
            420                 425                 430
Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser
        435                 440                 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
    450                 455                 460
Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu
465                 470                 475                 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
                485
<210> 49
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
atggatatga gagtaccagc tcagctgctg ggcctgctgc ttttgtggtt gccggacaca 60
cgctgtgaga ttgtcctgac tcagtctccc gggactctgt ccctcagccc cggtgaacgc 120
gctacccttt catgcagagc ctctcagtct gtgtccagca gctacctcgc atggtatcag 180
cagaagcccg gacaggctcc caggctgttg atctatggag ctagtagtcg agcaacaggc 240
atcccagatc gcttctcagg gagcggttca ggtacagact tcacgctgac gatttcaagg 300
ctggaacccg aagattttgc cgtctattat tgtcaacagg caggggctgt gccaatcact 360
ttcgggggcg ggaccaaggt ggaaatcaaa ggaggcggag gaagtggagg aggagggagc 420
ggtggaggag ggtcacaggt gcagctggta gaatctggcg gaggggtcgt tcaaccaggg 480
aggtcattgc ggttgagctg cgcagcgagt ggttttacct tcagcagtta tggaatgcat 540
tgggtgagac aagcaccagg aaaaggtctg gagtgggtgg ctttgatttg gtacgacggc 600
agtaataaat actacgccga ttctgttaag ggcagattta ctatttctcg cgacaacagc 660
aagaacacgc tgtacctgca gatgaactct ctgagagccg aagatacagc agtgtactat 720
tgtgctaagc ccgtagaagg gctcctgagg ggattcgatt attggggcca gggtacgctt 780
gtgacagtgt ctagtcgggc ggccgcaatt gaagttatgt atcctcctcc ttacctagac 840
aatgagaaga gcaatggaac cattatccat gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc 900
ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 960
tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 1020
aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 1080
cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 1140
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgttcaatga actgcagaaa 1320
gataagatgg cggaggcctt cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380
gggcacgatg gccttttcca gggtctcagt acagccacca aggacacctt cgacgccctt 1440
cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1464
<210> 50
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Pro Asp Thr Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
            20                  25                  30
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
        35                  40                  45
Gln Ser Val Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
    50                  55                  60
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
65                  70                  75                  80
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
                85                  90                  95
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
            100                 105                 110
Gln Leu Phe Asp Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
        115                 120                 125
Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
145                 150                 155                 160
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
            180                 185                 190
Val Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
        195                 200                 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
    210                 215                 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Ala Lys Pro Val Glu Gly Leu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
                245                 250                 255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val
            260                 265                 270
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile
        275                 280                 285
Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
    290                 295                 300
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
305                 310                 315                 320
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
                325                 330                 335
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
            340                 345                 350
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
        355                 360                 365
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
    370                 375                 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385                 390                 395                 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
            420                 425                 430
Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser
        435                 440                 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
    450                 455                 460
Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu
465                 470                 475                 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
                485
<210> 51
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
atggatatga gagtaccagc tcagctgctg ggcctgctgc ttttgtggtt gccggacaca 60
cgctgtgaga ttgtgctgac acagtctcca ggcacactct cccttagccc gggcgagagg 120
gccactctga gctgtcgggc tagtcagtca gtaaggagct cttatctggc ctggtatcag 180
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atcccagatc gctttagcgg tagcgggagt gggaccgatt tcactctgac catctcccgc 300
cttgagcccg aggatttcgc tgtctattat tgccagcaac tgtttgactc accctatacg 360
ttcggtggag ggaccaaagt ggagatcaag ggaggcggag gaagtggagg aggagggagc 420
ggtggaggag ggtcacaggt gcagctggta gaatctggcg gaggggtcgt tcaaccaggg 480
aggtcattgc ggttgagctg cgcagcgagt ggttttacct tcagcagtta tggaatgcat 540
tgggtgagac aagcaccagg aaaaggtctg gagtgggtgg ctttgatttg gtacgacggc 600
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cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1464
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<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Val Glu Gly Leu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145                 150                 155                 160
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
            180                 185                 190
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg
        195                 200                 205
Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
    210                 215                 220
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
225                 230                 235                 240
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Ile Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
                245                 250                 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro
            260                 265                 270
Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val
        275                 280                 285
Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
    290                 295                 300
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
305                 310                 315                 320
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
                325                 330                 335
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
            340                 345                 350
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
        355                 360                 365
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
    370                 375                 380
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385                 390                 395                 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
                405                 410                 415
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            420                 425                 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly
        435                 440                 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln
    450                 455                 460
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Ala Leu Pro Pro Arg
                485
<210> 53
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
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gtgcagctgg tagaatctgg cggaggggtc gttcaaccag ggaggtcatt gcggttgagc 120
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tccccgggaa cactgagtct ctctccaggg gaaagagcaa cattgtcctg cagagcatcc 540
cagagcgtga gctccagcta cctcgcctgg tatcagcaga aaccaggcca ggcaccccgc 600
ctgcttatct acggtgcatc caggagagcc actgggatcc ccgatcgatt ctctggatca 660
gggtctggca ctgactttac attgacgatc tcacggctgg aacccgagga tttcgccgtg 720
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ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 960
ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1020
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gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgttcaatg aactgcagaa agataagatg 1320
gcggaggcct tcagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380
ggccttttcc aggggctcag tacagccacc aaggacacct tcgacgccct tcacatgcag 1440
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<210> 54
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Pro Asp Thr Arg Cys
            20
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys
<210> 56
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
Gln Gln Val Asp Ser Leu His Pro Phe Thr
1               5                   10
<210> 58
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Asp Ser Leu His
                85                  90                  95
Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
Gln Gln Ala Gly Gly Val Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210> 60
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Gly Val Pro
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
Gln Gln Ala Gly Val Pro Pro Leu Thr
1               5
<210> 62
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Val Pro Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
Gln Gln Ala Gly Gly Val Pro Pro Phe Thr
1               5                   10
<210> 64
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Gly Val Pro
                85                  90                  95
Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Gln Gln Ala Gly Val Phe Pro Phe Thr
1               5
<210> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Val Phe Pro
                85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 68
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactg atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt actactgcgc caagccagtg 300
gaaggactat taagaggatt cgattactgg ggacagggta cattggtcac cgtctcctca 360
<210> 69
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggccggag ccgtccctat cacttttggc 300
ggagggacca aggttgagat caaa 324
<210> 70
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagg agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagctcttcg acagtcctta cacttttggc 300
ggagggacca aggttgagat caaa 324
<210> 71
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gaagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggccggca tcccccctta cacttttggc 300
ggagggacca aggttgagat caaa 324
<210> 72
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggtcgaca gtctccatcc tttcactttt 300
ggcggaggga ccaaggttga gatcaaa 327
<210> 73
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggccggag gcgtccctcc tctcactttt 300
ggcggaggga ccaaggttga gatcaaa 327
<210> 74
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagg agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggccggag tcccccctct cacttttggc 300
ggagggacca aggttgagat caaa 324
<210> 75
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
gaaattgtga tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggccggag gcgtccctcc tttcactttt 300
ggcggaggga ccaaggttga gatcaaa 327
<210> 76
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
gaaattgtga tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca acagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggccggag tcttcccttt cacttttggc 300
ggagggacca aggttgagat caaa 324
<210> 77
<211> 920
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1               5                   10                  15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
            20                  25                  30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
        35                  40                  45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
    50                  55                  60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65                  70                  75                  80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
                85                  90                  95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
            100                 105                 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
        115                 120                 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145                 150                 155                 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
                165                 170                 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
            180                 185                 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
        195                 200                 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225                 230                 235                 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
                245                 250                 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
            260                 265                 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
        275                 280                 285
Gly Trp Lys His His His His His His His His His His Asp Tyr Asp
    290                 295                 300
Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Gly Ser
305                 310                 315                 320
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
                325                 330                 335
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
            340                 345                 350
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
        355                 360                 365
Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
    370                 375                 380
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
385                 390                 395                 400
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
                405                 410                 415
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
            420                 425                 430
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
        435                 440                 445
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
    450                 455                 460
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
465                 470                 475                 480
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
                485                 490                 495
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
            500                 505                 510
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
        515                 520                 525
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
    530                 535                 540
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
545                 550                 555                 560
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
                565                 570                 575
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
            580                 585                 590
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
        595                 600                 605
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
    610                 615                 620
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
625                 630                 635                 640
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu
                645                 650                 655
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
            660                 665                 670
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
        675                 680                 685
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
    690                 695                 700
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
705                 710                 715                 720
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
                725                 730                 735
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
            740                 745                 750
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
        755                 760                 765
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
    770                 775                 780
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
785                 790                 795                 800
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
                805                 810                 815
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
            820                 825                 830
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
        835                 840                 845
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
    850                 855                 860
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
865                 870                 875                 880
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
                885                 890                 895
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
            900                 905                 910
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
        915                 920

Claims (99)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括特异性结合CD19的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包括：
a)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；和/或
b)轻链可变区，其包括：
i)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ IDNO:13中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
ii)包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
iii)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
iv)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
v)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
vi)包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；
vii)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ IDNO:63中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；或
viii)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2、以及包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包括单链可变片段(scFv)、Fab或F(ab)2。
3.根据权利要求2所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包括scFv。
4.根据权利要求3所述的CAR，其中所述scFv是人scFv。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的CAR，其中所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的CAR，其中所述轻链可变区包括：
(a)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:20中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的CDR3；
(e)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的CDR3；
(f)包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR3；
(g)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的CDR3；或
(h)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:65中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR3。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的CAR，其中所述轻链可变区包括：
(a)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3；或
(c)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:20中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的CAR，其中：
(a)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸的CDR2、以及包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3；
(b)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3；
(c)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3；
(d)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的CDR3；
(e)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸的CDR2、以及包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的CDR3；
(f)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR3；
(g)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的CDR3；或
(h)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR3。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的CAR，其中：
(a)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸的CDR2、以及包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的CDR3；
(b)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:16中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的CDR3；或
(c)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的CDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:11中所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的CDR2、以及包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的CDR3。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的CAR，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性或同源性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的CAR，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的CAR，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性或同源性的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的CAR，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的CAR，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的CAR，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性或同源性的氨基酸序列；并且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性或同源性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的CAR，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列；并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的CAR，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列；并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的CAR，其中：
(a)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列；
(b)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列；
(c)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列；
(d)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列；
(e)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列；
(f)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列；
(g)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:64中所示氨基酸序列；或
(h)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:67中所示氨基酸序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的CAR，其中：
(a)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列；
(b)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列；或
20.(c)所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域在所述重链可变区和所述轻链可变区之间包含接头。
22.根据权利要求21所述的CAR，其中所述接头由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列组成。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的CAR，其中所述重链可变区和轻链可变区位置从N末端到C末端为：VL-VH。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包括或是scFv，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:23中所示氨基酸序列或由其组成。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽或BTLA多肽。
26.根据权利要求25所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD28多肽。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ多肽。
28.根据权利要求27所述的CAR，其中所述CD3ζ多肽是修饰的CD3ζ多肽。
29.根据权利要求28所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、由两个功能缺失突变组成的ITAM2变体和由两个功能缺失突变组成的ITEM3。
30.根据权利要求29所述的CAR，其中所述天然ITAM1由SEQ IDNO:31中所示氨基酸序列组成。
31.根据权利要求29所述的CAR，其中所述ITAM2变体由SEQ IDNO:37中所示氨基酸序列组成。
32.根据权利要求29所述的CAR，其中所述ITAM3变体由SEQ IDNO:41中所示氨基酸序列组成。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含SEQ IDNO:43中所示氨基酸序列或由其组成。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域还包含至少一个共刺激信号传导区。
35.根据权利要求34所述的CAR，其中所述至少一个共刺激信号传导区包含CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽、或其组合。
36.根据权利要求35所述的CAR，其中所述至少一个共刺激信号传导区包含CD28多肽。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的CAR，其中所述CAR由载体表达。
38.根据权利要求37所述的CAR，其中所述载体是逆转录病毒载体。
39.一种细胞，其包含根据权利要求1-38中任一项所述的CAR。
40.根据权利要求39所述的细胞，其中所述细胞由CAR转导。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的细胞，其中所述CAR在所述细胞的表面上组成性表达。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫应答细胞。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的细胞，其中所述细胞是淋巴谱系细胞或骨髓谱系细胞。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、从中可分化淋巴样细胞的干细胞、和从中可分化髓样细胞的干细胞。
45.根据权利要求39-44中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
46.根据权利要求38或权利要求45所述的细胞，其中所述T细胞选自辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞、和γδT细胞。
47.根据权利要求39-44中任一项所述的细胞，其中所述细胞是NK细胞。
48.根据权利要求47所述的细胞，其中所述NK细胞源自干细胞。
49.根据权利要求44或48所述的细胞，其中所述干细胞是多能干细胞。
50.根据权利要求49所述的细胞，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
51.一种核酸分子，其编码根据权利要求1-38中任一项所述的CAR。
52.根据权利要求51所述的核酸分子，其还包含可操作地连接至所述CAR的启动子。
53.根据权利要求52所述的核酸分子，其中所述启动子是内源性或外源性的。
54.根据权利要求53所述的核酸分子，其中所述外源性启动子选自延伸因子(EF)-1启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)启动子、猿猴病毒40早期启动子(SV40)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、金属硫蛋白启动子、和泛素C启动子。
55.根据权利要求51所述的核酸分子，其中所述启动子是诱导型启动子。
56.根据权利要求55所述的核酸分子，其中所述诱导型启动子选自NFAT转录应答元件(TRE)启动子、CD69启动子、CD25启动子、IL-2启动子、4-1BB启动子、PD1启动子、和LAG3启动子。
57.根据权利要求53所述的核酸分子，其中所述启动子是内源性启动子。
58.根据权利要求57所述的核酸分子，其中所述内源性启动子选自TCRα启动子、TCRβ启动子、和β2-微球蛋白启动子。
59.一种载体，其包含根据权利要求51-58中任一项所述的核酸分子。
60.根据权利要求59所述的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。
61.一种细胞，其表达根据权利要求51-58中任一项所述的核酸分子。
62.根据权利要求61所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
63.一种组合物，其包含根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞。
64.根据权利要求63所述的组合物，其是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。
65.根据权利要求63或64所述的组合物，其包含约1×106至约5×108个细胞。
66.根据权利要求63或64所述的组合物，其包含约1×106至约1×108个细胞。
67.根据权利要求63或64所述的组合物，其包含约1×106至约5×107个细胞。
68.根据权利要求63-67中任一项所述的组合物，其包含约2.5×107个细胞。
69.一种减少受试者肿瘤负荷的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞或根据权利要求63-68中任一项所述的组合物。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述方法减少所述受试者中肿瘤细胞的数量、减小所述受试者中肿瘤大小和/或根除所述受试者中肿瘤。
71.一种增加或延长患有赘生物的受试者的生存期的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞或根据权利要求63-68中任一项所述的组合物。
72.一种治疗和/或预防受试者中的赘生物的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞或根据权利要求63-68中任一项所述的组合物。
73.根据权利要求69-72中任一项所述的方法，其中所述肿瘤和/或赘生物与CD19相关。
74.根据权利要求69-73中任一项所述的方法，其中所述肿瘤和/或赘生物是血癌。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述血癌选自多发性骨髓瘤、白血病、和淋巴瘤。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述白血病选自急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急早幼粒细胞白血病(APL)、混合表型急性白血病(MLL)、毛细胞白血病、和B细胞前淋巴细胞白血病。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
78.根据权利要求69-73中任一项所述的方法，其中所述肿瘤和/或赘生物是B细胞恶性肿瘤。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤选自B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、具有Richter转化的CLL、和CNS淋巴瘤。
80.根据权利要求69-79中任一项所述的方法，其中所述肿瘤和/或赘生物是B细胞淋巴瘤。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是复发性或难治性(R/R)B细胞淋巴瘤。
82.根据权利要求69-81中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
83.根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞或根据权利要求63-68中任一项所述的组合物，其用于治疗的用途。
84.根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞或根据权利要求63-68中任一项所述的组合物，其用于治疗和/或预防受试者中的赘生物的用途。
85.根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞或根据权利要求63-68中任一项所述的组合物，其用于增加或延长患有赘生物的受试者的生存期的用途。
86.根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞或根据权利要求63-68中任一项所述的组合物，其用于治疗和/或预防受试者中的赘生物的用途。
87.用于权利要求84-86中任一项所述用途的细胞或组合物，其中所述肿瘤和/或赘生物与CD19相关。
88.用于权利要求84-87中任一项所述用途的细胞或组合物，其中所述肿瘤和/或赘生物是血癌。
89.用于权利要求88所述用途的细胞或组合物，其中所述血癌选自多发性骨髓瘤、白血病、和淋巴瘤。
90.用于权利要求89所述用途的细胞或组合物，其中所述白血病选自急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急早幼粒细胞白血病(APL)、混合表型急性白血病(MLL)、毛细胞白血病、和B细胞前淋巴细胞白血病。
91.用于权利要求89所述用途的细胞或组合物，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
92.用于权利要求84-87中任一项所述用途的细胞或组合物，其中所述肿瘤和/或赘生物是B细胞恶性肿瘤。
93.用于权利要求92所述用途的细胞或组合物，其中所述B细胞恶性肿瘤选自B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、具有Richter转化的CLL、和CNS淋巴瘤。
94.用于权利要求84-93中任一项所述用途的细胞或组合物，其中所述肿瘤和/或赘生物是B细胞淋巴瘤。
95.用于权利要求94所述用途的细胞或组合物，其中所述B细胞淋巴瘤是复发性或难治性(R/R)B细胞淋巴瘤。
96.用于权利要求84-95中任一项所述用途的细胞或组合物，其中所述受试者是人受试者。
97.一种生产包含根据权利要求1-38中任一项所述的CAR的细胞的方法，其包括将编码根据权利要求1-38中任一项所述的CAR的核酸分子引入细胞。
98.一种用于减少受试者的肿瘤负荷、治疗和/或预防受试者中的赘生物和/或增加或延长患有赘生物的受试者的生存期的试剂盒，其包含根据权利要求39-50、61和62中任一项所述的细胞。
99.根据权利要求98所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括使用所述细胞来减少受试者的肿瘤负荷、治疗和/或预防受试者中的赘生物和/或增加或延长患有赘生物的受试者的生存期的书面说明。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3176425A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd19 antibodies and uses thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7605238B2 (en) * 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP3322732A2 (en) * 2015-07-13 2018-05-23 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
GB201610515D0 (en) * 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Cell

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117402261A (zh) * 2023-10-17 2024-01-16 北京景达生物科技有限公司 一种基于重组腺病毒的car-nk细胞制备方法及其应用

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