CN110343636A - 一种斯塔普氏属菌株及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新菌种斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759及其应用。本发明通过在新疆乌拉泊地区盐生植物根际土壤分离筛选出一株斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759，分离出的菌种具耐盐、生长温度宽、易培养等特点，该菌株液体发酵液可有效降解培养基中的玉米赤霉烯酮，在玉米赤霉烯酮生物分解应用中，具有显著和稳定的技术效果，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

Description

一种斯塔普氏属菌株及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用

技术领域

本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及一种斯塔普氏属菌株及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用的技术领域。

背景技术

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN），又称为F-2毒素，分子式为C₁₈H₂₂O₅，是谷物作物中比较常见的霉菌毒素，它的污染不仅会直接影响作物的生长，还会给动物带来危害，而且会通过食物链直接或间接传入人体，严重危害人体健康。玉米赤霉烯酮具有生殖毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性，另外其对心脏、肾脏、肝脏、肺脏也有毒害作用，对神经***、血液***也会产生影响，会导致神经***的亢奋，脏器器官出血，严重时还会导致机体死亡。玉米赤霉烯酮导致身体的激素平衡紊乱，还可能导致许多生殖***疾病，例如***癌，卵巢癌，子***或乳腺癌。

作物受到霉菌毒素污染，会导致作物的产量减少，也可能导致牲畜产量减少，还会通过贸易在世界各国进行传播而扩大污染范围，这将导致巨大的经济损失。许多报告显示全世界谷类作物和其他食物中玉米赤霉烯酮污染严重，在欧洲的一项研究中，报道了这种霉菌毒素在5010份混合谷物样品中的存在率高达32％。对饲料中玉米赤霉烯酮发生率的调查显示，来自澳大利亚的5402个样本中污染率为45％，来自日本的1402个样品中污染率为40%，来自中国的1820个样本的污染率为49％。玉米赤霉烯酮毒素的污染已经非常普遍，引起各国高度重视。

为了减少食品和饲料中残留的玉米赤霉烯酮毒素，国内外的研究人员对多种脱毒技术进行了研究，生物脱毒法因更便宜，更安全和更环保越来越受到人们的关注。其中，生物脱毒法包括微生物菌体吸附毒素和微生物降解毒素两种。生物降解法主要是通过微生物转化作用，利用微生物产生的次级代谢产物或者所分泌的胞内、胞外的酶，将毒素的毒性基团分解破坏，降解或转化为毒性更低甚至无毒的产物，该方法的优点是特异性高，只针对玉米赤霉烯酮起作用而不会破坏饲料和原料中的其它成分，不会影响食物的味道，也不会降低营养价值，已成为重要的研究方向。

近些年，国内外在利用生物法处理玉米赤霉烯酮毒素的研究上取得了一些进展，已分离筛选出了一些对玉米赤霉烯酮有清除能力的菌株。Megharaj M等在1997年首次报道，从土壤中富集得到的细菌混合培养物能够从培养基中除去霉菌毒素玉米赤霉烯酮；K.J. Cho等从土壤中分离出一株枯草芽孢杆菌亚种，可有效降解玉米赤霉烯酮。虽然国内外目前已发现一定数量的玉米赤霉烯酮毒素降解菌，但分离到降解菌株的种类比较单一，各个菌株降解能力也还存在着一定的差异，降解机制不清，降解菌分泌的降解酶种类少，且关键酶的应用到生产还存在许多限制等问题。随着生物技术的不断发展，利用微生物去除玉米赤霉烯酮的技术将越来越成熟，探索有效去除玉米赤霉烯酮能力的生物方法势在必行。因此，利用新疆特殊生境筛选和开发利用玉米赤霉烯酮降解菌，对解决粮食、饲料中化玉米赤霉烯酮污染具有重要的实用价值。

发明内容

针对现未见通过新疆乌拉泊地区盐生植物根际土壤分离筛选获得斯塔普氏属（Stappia sp.）新菌种的现状，本发明提供一种新菌种斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29CGMCC No.17759及其应用。本发明通过在新疆乌拉泊地区盐生植物根际土壤分离筛选出一株斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759，利用分离出的菌种具耐盐、生长温度宽、易培养等特点，该菌株液体发酵液可有效降解培养基中的玉米赤霉烯酮，在玉米赤霉烯酮生物分解应用中，具有显著和稳定的技术效果，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

本发明采用的主要技术方案：

本发明具体提供一种斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759。通过从新疆乌拉泊地区盐生植物根际土壤筛选、分离出一株编号为YM29的斯塔普氏属（Stappia sp.）菌种，将斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29通过现在常见的菌种鉴定手段获悉是一株新菌种，分离出的菌种具耐盐、生长温度宽、易培养等特点，该菌株液体发酵液具有降解培养基中的玉米赤霉烯酮的作用，在玉米赤霉烯酮生物分解应用中，具有显著和稳定的技术效果，体现了筛选该菌种具有鲜明的应用价值导向。

具体的，本发明根据新疆乌拉泊地区地理环境的特殊性，通过对新疆乌拉泊地区地区盐生植物根际土壤进行微生物菌种的培养、分离，筛选一批优良菌种，并从中分离筛选出一株编号为YM29的斯塔普氏属（Stappia sp.）菌种，经微生物学分类与鉴定属于斯塔普氏属，该菌株最适生长条件为：10-45℃，最适生长温度是30℃；pH生长范围5.0-10，可耐受0-10%的NaCl，培养基为LB培养基。参照《伯杰氏***细菌学鉴定手册》（第九版）等常见的菌种鉴定手册对编号为YM29菌株进行形态学、生理生化试验，确定YM29菌株为斯塔普氏属中成员，但是具有与常见的斯塔普氏属成员菌种不同的特点，具有一些新菌种的特性。

进一步，本发明通过对上述编号为YM29菌种进行基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见网站进行比对分析，并构建***发育树，经比对分析发现，菌株YM29的16S rDNA序列与标准模式Stappia indica B106^T同源性最高，序列相似度为97.47%，具有新菌种的鲜明技术特征，菌株YM29与Stappia indica B106^T的亲缘关系最近，利用本领域常见采用的MEGA 5.0 软件通过Neighbor-Joining方法建立***进化树，结果经比对分析发现，菌株YM29与Stappia indica B106^T的置信值为99，标明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种分子水平鉴定可知该菌株YM29确定为斯塔普氏属（Stappia sp.）新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29。

具体的，该菌株YM29已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2019年5月13日，菌种保藏号为CGMCCNo.17759。经微生物学鉴定暂命名为斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29。

新菌种斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29在含LB培养基上生长良好，在30℃下培养48h后，形成可见的菌落，其菌落较小且为圆形，直径约为1mm，乳白色，半透明，表面比较有光泽，较湿润，边缘比较平整；菌体生长温度范围在10-45℃，最适生长温度是30℃，pH生长范围5.0-10.0，可耐受0-10%的NaCl。

进一步，本发明提供斯塔普氏属(Stappia)YM29 CGMCC No.17759，具有去除溶液中的玉米赤霉烯酮毒素的作用，具有显著和稳定的技术效果，具有广泛的应用价值。

通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：

（1）本发明提供的斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759是一种典型的新菌种，该菌株最适生长条件为：生长温度范围在10-45℃，最适生长温度是30℃；pH生长范围5.0-10.0，可耐受0-10%的NaCl，利用分离出的菌种具耐盐、生长温度宽、易培养等特点，该菌株液体发酵液具有效降解培养基中的玉米赤霉烯酮的作用，定其为斯塔普氏属（Stappia sp.）新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29。

（2）将本发明分离筛选的斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759，在最适培养基LB培养基、最佳培养温度37 ℃、最适pH值8.0和菌液接种量2%和玉米赤霉烯酮10μg/mL的条件下，最高玉米赤霉烯酮去除率可达到92.56%，且发现高浓度的玉米赤霉烯酮对菌株的生长和降解无明显抑制，为工业化应用菌株对玉米赤霉烯酮生物处理提供了可能。

附图说明

图1所示为斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759***发育树图。

图2所示为不同培养基对斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759的生长和玉米赤霉烯酮降解率图。

图3所示为不同培养温度下斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759生长和玉米赤霉烯酮降解率图。

图4所示为不同培养基起始pH值下斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCCNo.17759生长和玉米赤霉烯酮降解率图。

图5所示为不同玉米赤霉烯酮(ZEN)浓度下斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCCNo.17759生长和玉米赤霉烯酮降解率图。

图6所示为斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759的生长曲线和玉米赤霉烯酮的降解动力曲线图。

具体实施方式

下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的%都为重量百分比，除非特别指出除外。

本发明实施例中采用如下基础培养基：

无机盐培养基：KH₂PO₄ 1.52g/L，Na₂HPO₄ 2.44g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.2g/L，CaCl₂ 0.05g/L，琼脂20.0g/L，pH 7.2。

Luria-Bertani（LB）培养基：胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0 g/L，酵母浸粉5.0g/L，琼脂20.0g/L（固体培养基），pH 7.2。

所有培养基在121℃下高压灭菌20分钟。

实施例一：斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29的分离、筛选及鉴定

（一）分离、筛选：

采集新疆乌拉泊地区地区植物根际土壤样品，通过梯度稀释法进行微生物的分离和纯化。称取土样10g，放入100ml无菌水中，加入灭菌的玻璃珠，150rpm，30℃，震荡20min，使样品充分分散。无菌操作吸取上清液100μl加入900μl无菌水中，用无菌水稀释制成10^-2-10^-5浓度的稀释液。取100μl的各浓度稀释液，采用常规涂布法在含有10μg/mL玉米赤霉烯酮的无机盐培养基中，放置于30℃恒温培养箱内培养72小时后，待平板上长出菌落后，挑取平板上的单菌落进行纯化培养，直至无杂菌落。从中优选出一株编号为YM29的菌株，转接到含10μg/mL玉米赤霉烯酮的LB培养基斜面上保存备用。

（二）分类、鉴定：

1、斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 16S rDNA的序列测定与分析：

（1）PCR模板DNA的提取：

将纯化后的菌种接种于10μg/mL玉米赤霉烯酮的LB培养基中，30℃摇床培养2天，收集菌体，采用DNA抽提试剂盒提取基因组总DNA。

（2）PCR扩增

采用特异性引物:

27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

PCR反应体系总体积25μL，PCR扩增条件为，94℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 10min。

（3）序列测定

PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，获取长度为1384bp的16S rDNA序列，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见的NCBI网站进行比对分析，并构建***发育树，该菌的***发育树，参见附图1，经比对分析发现，菌株YM29与该属标准模式Stappia indica B106^T同源性最高，序列相似度为97.47%，利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立***进化树，结果经比对分析发现，菌株YM29与Stappia indica B106^T聚类在一个分枝上，置信值为99，表明该菌种作为新菌种的可能性极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种分子水平鉴定可将该菌株YM29确定为斯塔普氏属（Stappia sp.）新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29。

2、生理生化测定

（1）通过生长条件研究结果显示斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29为一种革兰氏阴性、球状细菌。菌株YM29接种到LB平板上，在30℃下培养48h后，形成可见的菌落，其菌落较小且为圆形，直径约为1mm，乳白色，半透明，表面比较有光泽，较湿润，边缘比较平整；菌体生长温度范围在10-45℃，最适温度生长是30℃，pH生长范围5.0-10.0，可耐受0-10%的NaCl。

（2）氧化氢酶和氧化酶活性为阳性。

（3）使用Biolog菌种鉴定仪GN II测试板鉴定，确定斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29能利用的碳源为L-***糖、D-***醇、D-纤维二糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、i-赤藓糖醇、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、α-D-葡萄糖、m-肌醇、麦芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-蜜二糖、D-阿洛酮糖、D-蜜三糖/棉子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、蔗糖、松二糖、丙酮酸甲酯、琥珀酸单甲酯、顺式乌头酸、柠檬酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸、葡萄糖酸、D-葡萄糖胺酸、D-葡萄糖醛酸、α-羟丁酸、β-羟丁酸、p-羟基苯乙酸、衣康酸、α-丁酮酸、α-戊酮酸、D,L-乳酸、丙二酸、丙酸、奎宁酸/金鸡纳酸、琥珀酸、溴代丁二酸、琥珀酰胺酸、L-丙胺酰胺、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天门冬氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-组氨酸、羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、γ-氨基丁酸、尿刊酸、甘油/丙三醇。

综合16SrDNA序列分析、***发育分析、微生物学特性分析结果，表明本发明提供的斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29为斯塔普氏属的一株细菌新种，将其暂命名为斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29。菌株已于2019年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.17759。

实施例二：不同培养基对斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29降解玉米赤霉烯酮的影响

挑取斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29新鲜菌苔接种至LB液培养基中，于摇床120r/min、30℃下培养24h，获得种子液；将种子液按2%接种于含有10μg/mL玉米赤霉烯酮的不同培养基中，120r/min、30℃下培养120h，测定菌株YM29的生长和降解效率。

试验结果参见附图2所示，菌株YM29在LB培养基上生长最好，其玉米赤霉烯酮降解率也最高，而菌株在胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和营养肉汤培养基（NB）尽管生长也较好，但对玉米赤霉烯酮降解率较低；在海盐肉汤培养基（BD）中菌株生长和降解玉米赤霉烯酮能力都较差。

实施例三:不同培养温度对斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29降解玉米赤霉烯酮的影响

挑取新鲜菌苔接种至LB液培养基中，于摇床120r/min、30℃下培养24h，获得种子液；将种子液按2%接种于含有10μg/mL玉米赤霉烯酮的LB培养基中，在不同温度下，120r/min、培养120h，测定菌株YM29的生长和降解效率。

试验结果参见附图3所示，菌株虽然可在所有实验温度均可生长，但在30℃−37℃内生长情况较好，且菌液的OD值较高。在20℃−37℃内，降解率与温度呈正相关，随着温度的升高到42℃时，速率逐渐下降。

实施例四:不同初始pH对斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29降解玉米赤霉烯酮的影响

挑取新鲜菌苔接种至LB液培养基中，于摇床120r/min、37℃下培养24h，获得种子液；将种子液按2%接种于含有10μg/mL玉米赤霉烯酮并调节不同pH的LB培养基中，120r/min、培养120h，测定菌株YM29的生长和降解效率。

试验结果参见附图4所示，菌株YM29的生长与培养基的pH值呈负相关，随着pH值的增加，菌液浓度逐渐减小，而菌株YM29对玉米赤霉烯酮的降解率与培养基的pH值呈正相关，随着pH的增加，降解率逐渐增加，当pH的增加到8.0时，菌株对玉米赤霉烯酮的降解率最高。

实施例五:不同玉米赤霉烯酮浓度对斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29降解率的影响

挑取新鲜菌苔接种至LB液培养基中，于摇床120 r/min、37℃下培养24h，获得种子液；将种子液按2%接种于含有不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEN）的LB培养基中，37℃、120r/min、培养120h，测定菌株YM29的生长和降解效率。

试验结果参见附图5所示，菌株YM29的生长几乎不受培养基中玉米赤霉烯酮浓度增加的影响，而其降解率与培养基中的玉米赤霉烯酮浓度呈正相关，当培养基内玉米赤霉烯酮的浓度从8 μg/mL增加到10 μg/mL之后，降解率增加不明显。

实施例六:斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29对玉米赤霉烯酮的降解动力学

挑取新鲜菌苔接种至LB液培养基中，于摇床120 r/min、37℃下培养24h获得种子液；将种子液按2%接种于10μg/mL玉米赤霉烯酮的LB培养基中，37℃、120 r/min、培养10d，并间隔测样，分别测菌液OD₆₀₀值和玉米赤霉烯酮的降解效率。

试验结果参见附图6所示的降解曲线和生长曲线。菌株在0−8h内处于迟缓期，生长量较少，在8h后进入对数增长期，菌体迅速增长，OD₆₀₀值快速升高，菌株在48h逐渐进入稳定期，菌株对玉米赤霉烯酮的降解随着菌体的增加逐渐发生，但降解过程主要发生在稳定期，培养至144h时菌株对培养物中玉米赤霉烯酮降解率达到92.56%。

通过上述系列实施例提供的斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29 CGMCC No.17759是一种典型的新菌种，该菌株最适生长条件为：长温度范围在10-45℃，最适温度生长是30℃；pH生长范围5.0-10.0，可耐受0-10%的NaCl，利用分离出的菌种具耐盐、生长温度宽、易培养等特点，该菌株液体发酵液具有效降解培养基中的玉米赤霉烯酮的作用，在玉米赤霉烯酮生物分解应用中，具有显著和稳定的技术效果，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆-亚美尼亚生物工程研究开发中心）

<120> 一种斯塔普氏属菌株及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1384

<212> DNA

<213> 斯塔普氏属(Stappia sp.)

<400> 1

cccatgcgca gcttaccatg cagtcgacgg tctcttcgga ggcagtggca gacgggtgag 60

taacgcgtgg gaacatacct ttcggtacgg aacaacagtt ggaaacgact gctaataccg 120

tatacgccct gagggggaaa gatttatcgc cgagagattg gcccgcgttg gattagctag 180

ttggtggggt aatggcctac caaggcgacg atccatagct ggtctgagag gatgatcagc 240

cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga 300

caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa 360

agctctttcg ccggtgaaga taatgacggt aaccggaaaa gaagccccgg ctaacttcgt 420

gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc 480

gcacgtaggc tgacttttaa gtcaggggtg aaatcccggg gctcaacctc ggaactgcct 540

ttgatactgg aagtcttgag tccgagagag gtgagtggaa ctccgagtgt agaggtgaaa 600

ttcgtagata ttcggaagaa caccagtggc gaaggcggct cactggctct gtactgacgc 660

tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 720

cgatggaagc tagctgtcag gtagcatgct atttggtggc gcagctaacg cattaagctt 780

cccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 840

agcggtggag catgtggttt aattagaagc aacgcgcaga accttaccag cccttgacat 900

gtctggcaca ctccagagat ggggttttcc ctttggggac cggagcacag gtgctgcatg 960

gctgtggtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctct 1020

cccttagttg ccagcattca gttgggcact ctagggggac tgccggtgat aagccgagag 1080

gaaggtgggg aggacgtcaa gtcttcatgg cccctacggg gtgggctaca cacgtgttac 1140

aatggcggtg acaatgggca gagaaggggc gacccggaga taatcttgaa aaaccgtctc 1200

agttcggatt gttctctgca actcgagagc acgaagttgg aatcgctagt aatcgcgtaa 1260

cagcacgacg cggtgaatac gttcccgggc cctgtacaca ccgcccgtca caccatggga 1320

gttggcttta cccgaaggtg gtgcgtaacc cgcaagggag gcagccaacc acgtagtaag 1380

gagg 1384

Claims (3)

1.一种斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29，其特征在于，所述的斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29的菌种保藏号为CGMCC No.17759。

2.如权利要求1所述的斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1或2所述的斯塔普氏属（Stappia sp.）YM29在降解玉米赤霉烯酮毒素中的应用。