CN111323288A - 一种具翼烟草单染色体鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)染色体标本制备：具翼烟草成熟饱满种子萌发，待根长至0.5～1cm时，于上午9:00‑11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α‑溴奈溶液室温预处理，清洗后，置入蒸馏水前低渗，用纤维素‑果胶酶混合酶液处理，制备染色体制片，饱和醋酸地衣红染液染色；(2)然后对前述染色体制片进行核型分析、异染色质带谱分析和45s和5s rDNA染色体图谱分析；(3)单染色体鉴定：对比分析具翼烟草每条同源染色体的核型分析结果、异染色质带谱与45S和5SrDNA染色***点特征，完成具翼烟草染色体组每条单染色体的准确鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及具翼烟草单染色体鉴定方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物根尖细胞有丝***及染色体制片技术：植物生长旺盛的分生组织如根尖、茎尖、幼叶等都在进行着有丝***。取这些组织为材料，经过固定后迅速杀死细胞，并使细胞内的物质和生活状态得以保持，再经过解离、染色、压片等过程，可以迅速地将细胞分散附着于载玻片和盖玻片之间，在显微镜下就可以看到大量处于有丝***各个时期的细胞，并进行染色体观察。***中期，各染色体的着丝粒排列在赤道面上，两臂伸向赤道面的两旁。纺锤体完全形成，其一端与染色体的着丝粒相连接，另一端集中于细胞的极处。中期染色体高度浓缩，具有各物种染色体的典型形态，是染色体观察的最好时期。
染色体核型分析：染色体核型分析是以***中期染色体为研究对象，根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，进行分析、比较、排序和编号。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。
染色体带型分析：染色体带型，染色体经过特殊处理并用特定染料染色后，在光学显微镜下可见其臂上显示不同深浅颜色的条纹，此称为染色体带。各号染色体带的形态称为带型。对每种染色方法，每条染色体显示的带纹分布是一定的。通过染色体的分带技术，可以使染色体组型分析更为准确。主要的显带技术有G带(Giemsa显带)、Q显带(奎丫因显带)、R显带(逆转显带)、C显带(着丝粒显带)、前期显带(高分辨技术)。
染色体带型是鉴别染色体的重要依据。通过分带机理的研究，可获得染色体在成分、结构、行为和功能等方面的许多信息。染色体分带的研究工作始于60年代末。染色体分带技术就是经理化因素处理后，用染色法使染色体呈现特定的深浅不同的带纹的方法，又称显带技术。而用一般细胞学染色法，染色体的着色是均匀的。经分带技术处理后，在染色体上所呈现的带纹反映了染色体的固有结构，可显示不同物种染色体的差异或同一物种不同染色体的差异。
现有的鉴定烟草单染色体的方法：运用核型分析技术鉴定烟草单染色体：取种子在室温25℃条件下，摇床上水培振荡萌发，待幼根长至1～3mm时，转移进行预处理，一般在材料进行有丝***高峰期前2～3h，即8:30～11:30之间处理。预处理液一般有5种：①对二氯苯饱和液；②0.2％的秋水仙素；③0.002mol/L浓度的8-羟基喹啉溶液；④5％的风油精溶液；⑤20％的风油精溶液。预处理时间均为2h，温度20～25℃。弃处理液后，用乙醇、冰乙酸(3:1)固定材料24h，在转移至70％酒精溶液中，于0～4℃条件下储存备用。制片材料取根尖分生组织部分，用60℃1mol/L HCl恒温解离4～8min，常规压片法制片，镜检。根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，进行分析、比较、排序和编号。
由于烟草染色体微小，细胞壁难以充分解离，上述技术难以得到***相多、分散度高的制片；染色体微小且同源染色体间形态差异不明显，仅从形态特征进行区分，难以准确鉴定单染色体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种具翼烟草单染色体鉴定方法，准确鉴定具翼烟草单染色体，为具翼烟草的单染色体分离及其体外克隆提供技术。同时，为其他具有微小染色体的植物单染色体鉴定提供技术参考。
本发明的技术方案是：一种具翼烟草单染色体鉴定方法，包含以下步骤：(1)染色体标本制备：具翼烟草成熟饱满种子萌发，待根长至0.5～1cm时，于上午9:00-11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α-溴奈溶液室温预处理，固定液固定过夜，清洗后，置入蒸馏水前低渗，用纤维素-果胶酶混合酶液处理，置入蒸馏水后低渗，制备染色体制片，饱和醋酸地衣红染液染色，光学显微镜检查染色体分散良好的细胞相；(2)然后对前述染色体制片进行核型分析、异染色质带谱分析和45s和5s rDNA染色体图谱分析；(3)单染色体鉴定：对比分析具翼烟草每条同源染色体的核型分析结果、异染色质带谱与45S和5SrDNA染色***点特征，完成具翼烟草染色体组每条单染色体的准确鉴定。
所述的核型分析具体为：①测量：运用图像处理软件，测出每条染色体的长度，确定着丝粒位置，测出每条染色体的长臂、短臂，计算出着丝粒指数；②随体：通过目测确定每条染色体是否具有随体；③配对和排序：基于每条染色体的染色体全长、长/短臂的长度、着丝粒指数、以及是否具有随体等特征，将染色体两两配对，并按染色体全长递减排序。
所述的异染色质带谱分析具体为：①图像增强：经醋酸地衣红染液染色后的染色体显示出异染色质带，经图像处理软件增强对比度后，染色体更加清晰显示出异染色质带；②带谱分析：检查每条染色体的异染色质带谱情况，记录每条染色体显带数量和位置，获得每对同源染色体的异染色质带谱特征。
所述的45s和5s rDNA染色体图谱分析具体为：①探针标记：用缺刻平移方法进行探针标记，45S rDNA探针用地高辛标记，5S rDNA探针用生物素标记；②杂交液的配制：每张染色体制片配制30-40μL杂交液，待用；③染色体变性及杂交：将染色体制片置于80℃变性液中变性，在-20℃下依次用75％、95％和100％的梯度酒精脱水，气干后，滴加杂交液，于保湿皿中37℃杂交12-48h；④原位杂交信号的荧光检测：杂交后的染色体制片经2×SSC在室温及37℃各洗10min，1×PBS室温洗1次；地高辛标记的探针第一步加入羊抗地高辛抗体,温育后用1×PBS温室洗，第二步加入兔抗羊地高辛偶联物,温育和洗脱同第一步；生物素标记的探针第一步加入链亲和素-Cy3,温育和洗脱与地高辛检测相同，再加入生物素化链抗亲和素，温育和洗脱同第一步；⑤图像检测及分析：染色体制片用加入抗淬灭剂Vectorshield的5mg/L DAPI复染，荧光原位杂交信号观察由荧光显微镜完成，CCD照相装置俘获图像，检查记录每条染色体的45S和5S rDNA图谱的数量和位置，获得每对同源染色体45S和5S rDNA的图谱特征。
所述的杂交液，含50％的去离子甲酰胺，10％的硫酸葡聚糖，2×SSC，50mg/LssDNA，2mg/L的探针DNA,75℃变性5min。
本发明的有益效果：
(1)采用去壁低渗法获得的具翼烟草染色体制片，中期***相多、分散度高，中期染色体清晰；
(2)采用饱和醋酸地衣红染液进行具翼烟草染色体染色，清晰显示异染色质带；
(3)运用双色荧光原位杂交技术成功完成具翼烟草45S和5S rDNA染色体物理定位；
(4)综合运用核型分析、异染色质带谱分析与45S和5S rDNA作图结果，准确鉴定具翼烟草9对同源染色体。
附图说明
图1为具翼烟草根尖有丝***中期染色体(A)及其核型配对(B)；
图2为具翼烟草中期染色体醋酸地衣红染色(A)、染色体配对(B)及异染色质带谱分析(C)；
图3为具翼烟草45S和5S rDNA染色体定位(A)及单染色体鉴定(B)；
图4为传统的技术进行的具翼烟草染色体核型分析结果。
具体实施方式
具翼烟草单染色体分离鉴定方法，具体方法如下：
(1)染色体标本制备：具翼烟草成熟饱满种子在40℃蒸馏水浸泡50min后，播种在潮湿滤纸上，放置于培养皿内(培养皿底铺上一张滤纸，保持湿润)，于26℃条件下萌发。待根长至0.5～1cm时，于上午9:00-11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α-溴奈溶液室温预处理5h。蒸馏水清洗3次，经卡诺I氏固定液(乙醇︰冰醋酸＝3:1)固定过夜。蒸馏水清洗3次后，置入蒸馏水前低渗1h，用3％纤维素-果胶酶混合酶液在37℃条件下处理2.5h，清洗3次后，置入蒸馏水后低渗60min。剪取1-2mm根尖分生组织于洁净玻片上，滴加1滴固定液，用镊子迅速将材料压碎涂布并除去大组织残渣。然后加固定液，将玻片的一端抬起使悬液迅速扩散，在酒精灯上微烤至干。饱和醋酸地衣红染液染色30mins，然后经自来水冲洗去除染色液，光学显微镜检查染色体分散良好的细胞相，并拍照，进一步开展核型分析和异染色体带分析。
(2)核型分析：①测量：运用图像处理软件，测出每条染色体的长度，确定着丝粒位置，测出每条染色体的长臂、短臂，计算出着丝粒指数；②随体：通过目测确定每条染色体是否具有随体；③配对和排序：基于每条染色体的染色体全长、长/短臂的长度、着丝粒指数、以及是否具有随体等特征，将染色体两两配对，并按染色体全长递减排序。
(3)异染色质带谱分析：①图像增强：经醋酸地衣红染液染色后的染色体可以显示出异染色质带，经图像处理软件增强对比度后，染色体更加清晰显示出异染色质带；②带谱分析：检查每条染色体的异染色质带谱情况，记录每条染色体显带数量和位置，获得每对同源染色体的异染色质带谱特征。
(4)45s和5s rDNA染色体图谱分析：①探针标记：用缺刻平移方法进行探针标记，45S rDNA探针用地高辛(Digoxigenin-dUTP)标记，5S rDNA探针用生物素(Biotin-dUTP)标记；②杂交液的配制及探针变性：每张片子大约需要40μL杂交液，含50％的去离子甲酰胺(Sigma)，10％的硫酸葡聚糖(Sigma)，2×SSC，50mg/L ssDNA，2mg/L的探针DNA，75℃变性5min，待用；③染色体变性及杂交：将染色体制片置于80℃变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)中变性3min，在-20℃下依次用75％、95％、和100％的酒精脱水5min，气干后，滴加杂交液，加22mm×22mm盖玻片，于保湿皿中37℃杂交12～48h；④原位杂交信号的荧光检测：杂交后的染色体制片经2×SSC在室温及37℃各洗10min，1×PBS室温洗1次，5min。地高辛标记的探针第一步加入羊抗地高辛抗体(anti-digoxigenin-FITC),37℃温育30min后用1×PBS温室洗3次，每次5min，第二步加入兔抗羊地高辛偶联物(rabbit anti-sheep-FITC),温育和洗脱同第一步。生物素标记的探针第一步加入链亲和素-Cy3,温育和洗脱与地高辛检测相同，再加入生物素化链抗亲和素，温育和洗脱同第一步；⑤图像检测及分析：染色体制片用加入抗淬灭剂Vectorshield(vector lab)的5mg/L DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)复染，荧光原位杂交信号观察由荧光显微镜完成，CCD照相装置俘获图像，检查记录每条染色体的45S和5S rDNA图谱的数量和位置，获得每对同源染色体45S和5S rDNA的图谱特征。
(5)单染色体鉴定：对比分析具翼烟草每条同源染色体的核型分析结果、异染色质带谱与45S和5SrDNA染色***点特征，完成具翼烟草染色体组每条单染色体的准确鉴定。
本方法将传统的染色体核型分析技术与rDNA染色体物理定位、染色体异染色质分带技术相结合，结果显示，该技术体系能够很好的将具翼染色体组9对同源染色体鉴定出来，每对同源染色体均具有显著特征。
具翼烟草收集系根尖细胞有丝***中期染色体核型参数
由于烟草染色体微小，同源染色体间差异不明显，传统染色体核型分析无法准确鉴定出烟草染色体组中所有单染色体。传统的技术进行的具翼烟草染色体核型分析结果无法准确鉴定出每条单染色体，详见图4。
Claims (5)
1.一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)染色体标本制备：具翼烟草成熟饱满种子萌发，待根长至0.5～1cm时，于上午9:00-11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α-溴奈溶液室温预处理，固定液固定过夜，清洗后，置入蒸馏水前低渗，用纤维素-果胶酶混合酶液处理，置入蒸馏水后低渗，制备染色体制片，饱和醋酸地衣红染液染色，光学显微镜检查染色体分散良好的细胞相；(2)然后对前述染色体制片进行核型分析、异染色质带谱分析和45s和5s rDNA染色体图谱分析；(3)单染色体鉴定：对比分析具翼烟草每条同源染色体的核型分析结果、异染色质带谱与45S和5SrDNA染色***点特征，完成具翼烟草染色体组每条单染色体的准确鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：所述的核型分析具体为：①测量：运用图像处理软件，测出每条染色体的长度，确定着丝粒位置，测出每条染色体的长臂、短臂，计算出着丝粒指数；②随体：通过目测确定每条染色体是否具有随体；③配对和排序：基于每条染色体的染色体全长、长/短臂的长度、着丝粒指数、以及是否具有随体等特征，将染色体两两配对，并按染色体全长递减排序。
3.根据权利要求1所述的一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：所述的异染色质带谱分析具体为：①图像增强：经醋酸地衣红染液染色后的染色体显示出异染色质带，经图像处理软件增强对比度后，染色体更加清晰显示出异染色质带；②带谱分析：检查每条染色体的异染色质带谱情况，记录每条染色体显带数量和位置，获得每对同源染色体的异染色质带谱特征。
4.根据权利要求1所述的一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：所述的45s和5s rDNA染色体图谱分析具体为：①探针标记：用缺刻平移方法进行探针标记，45S rDNA探针用地高辛标记，5S rDNA探针用生物素标记；②杂交液的配制：每张染色体制片配制30-40μL杂交液，待用；③染色体变性及杂交：将染色体制片置于80℃变性液中变性，在-20℃下依次用75％、95％和100％的梯度酒精脱水，气干后，滴加杂交液，于保湿皿中37℃杂交12-48h；④原位杂交信号的荧光检测：杂交后的染色体制片经2×SSC在室温及37℃各洗10min，1×PBS室温洗1次；地高辛标记的探针第一步加入羊抗地高辛抗体,温育后用1×PBS温室洗，第二步加入兔抗羊地高辛偶联物,温育和洗脱同第一步；生物素标记的探针第一步加入链亲和素-Cy3,温育和洗脱与地高辛检测相同，再加入生物素化链抗亲和素，温育和洗脱同第一步；⑤图像检测及分析：染色体制片用加入抗淬灭剂Vectorshield的5mg/L DAPI复染，荧光原位杂交信号观察由荧光显微镜完成，CCD照相装置俘获图像，检查记录每条染色体的45S和5S rDNA图谱的数量和位置，获得每对同源染色体45S和5S rDNA的图谱特征。
5.根据权利要求4所述的一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：所述的杂交液，含50％的去离子甲酰胺，10％的硫酸葡聚糖，2×SSC，50mg/L ssDNA，2mg/L的探针DNA,75℃变性5min。
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