CN111321231B - 一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法 - Google Patents

一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其方法为：选取美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍提取基因组DNA，然后通过PCR反应体系及程序、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后，通过显示条带上的泳道中是否含有雄性父本的标记验证来鉴别虹鳟雌核发育后代情况。本发明是通过应用筛选出的分子标记AOMM108开展虹鳟雌核发育后代的筛选，从虹鳟幼鱼期就能够较早的开始鉴别雌核发育后代，降低养殖后期造成的经济损失，提高选育效果。该方法简单、快捷，准确率高，在虹鳟遗传育种领域中能够发挥重要作用。

Description

一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法
技术领域
本发明属于水产遗传育种技术领域，具体涉及一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法。
背景技术
鱼类雌核发育技术在水产养殖领域具有极重要的应用价值，人工诱导鱼类雌核发育就是用遗传失活的***激活卵子后，再通过抑制受精卵的极体排除或第一次卵裂，而发育成子代的一种特殊的有性生殖方式。虹鳟的雄鱼一般2龄达到性成熟，雌鱼3龄性成熟。成熟后的个体表现出生长率降低，死亡率提高，同时肉质和外观都较差等特性，对养殖生产不利。采用美洲红点鲑的***进行异源***诱导虹鳟雌核发育获得的后代全为雌鱼的种群，能够减少不利影响，同时还可为下一步的育种工作提供育种材料。但是实验后代的外部形态很难区分开是否是真正的雌核发育后代，尤其是在幼鱼期，目前还没有一种有效的手段来准确鉴别虹鳟的雌核发育后代。由于杂交后代的个体是不育的，这给育种工作造成了很大的浪费，这也是虹鳟育种工作上的一个难题，因此，较早的高效准确鉴定出虹鳟雌核发育后代是需要解决的核心问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的问题，而提供一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，本发明利用新开发的分子标记将实验后代中混入父本遗传物质的个体准确鉴定出来，该方法是一种操作简单、成本低、准确率高的鉴别虹鳟雌核发育后代的分子方法。
为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：
一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其方法为：选取美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍提取基因组DNA，然后通过PCR反应体系及程序、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后，通过显示条带上的泳道中是否含有雄性父本的标记验证来鉴别虹鳟雌核发育后代情况；
其中PCR反应体系中的引物为AOMM108，
F:GGAGGCAGCTCCTGTTTTC，R:GCTGCGCCATCTCTCTATCT。
所述PCR反应体系为：总体系为13 μL，其中2倍浓度的PCR预混酶6.5 μL；TaqDNA聚合酶：0.1U/ML；氯化镁：4mmol/L；dNTP混合物：0.4mmol/L，两条为10mmol/L的引物各0.5 μL；0.5 μL DNA模板；其余双蒸水补足；
所述PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃预变性35 s，59℃退火温度45 s，72℃延伸45 s，共30个循环；反应结束后在72℃再延伸8 min。
上述分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其具体方法如下：
（1）、DNA的提取与检测
采集美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍样本，采用高盐浓度抽提法提取基因组DNA；
（2）、引物设计
1对引物为AOMM108，F:GGAGGCAGCTCCTGTTTTCT，R:GCTGCGCCATCTCTCTATCT；
（3）、PCR反应体系及程序
用合成的上下游引物扩增目的片段，其中PCR反应体系：总体系为13 μL，其中包括总体系为13 μL，其中2倍浓度的PCR预混酶6.5 μL；TaqDNA聚合酶：0.1U/ML；氯化镁：4mmol/L；dNTP混合物：0.4mmol/L，两条为10mmol/L的引物各0.5 μL；0.5 μL DNA模板；其余双蒸水补足；
所述PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃预变性35 s，59℃退火温度45 s，72℃延伸45 s，共30个循环；反应结束后在72℃再延伸8 min；
（4）、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物在质量分数为10%的琼脂糖凝胶和1×TAE缓冲液中以5V/cm电压电泳15min，检测是否有条带；
（5）、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
取双蒸水、丙烯酰胺、5×TBE、四甲基乙二胺TEMED、AP配置凝胶，将配置好的凝胶注入胶槽中，***梳子，静置凝固后，取下梳子，组装到电泳槽上，产物上样，电泳完成后，取出凝胶放入装有纯水的瓷盘中，清洗一次后加入硝酸银，放置在摇床上染色，倒掉硝酸银，加入纯水洗涤，向磁盘中加入NaOH溶液，放置在摇床上染色后，条带开始呈现，倒掉NaOH溶液，加入纯水洗涤后，将胶片平铺于观片箱上，拍照记录；
（6）、标记验证
结果显示雌核发育后代的泳道中不含有雄性父本的条带，可以鉴定为雌核发育后代的遗传物质来自母本，没有发现父本的遗传物质渗入；结果显示雌核发育后代的泳道中含有雄性父本的条带，可以鉴定为杂交后代。
所述步骤（2）中的引物设计为：根据GenBank数据库中登录号为AF352758.1的序列信息，用Primer3 、v.0.4.0设计1对引物AOMM108，F:GGAGGCAGCTCCTGTTTTCT，R:GCTGCGCCATCTCTCTATCT，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
所述步骤（5）中电泳条件为：电泳缓冲液为1×TBE，电压200V，电泳时间2.5-3h。
所述步骤（1）的DNA的提取与检测具体方法如下：
a、 消化
取美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍样本0.5-1g加至离心管中，加入500ulHom Buffer和15ul蛋白酶K，放入55-60℃的水浴锅中2-3h，每30分钟摇匀一次；
b、抽提
向离心管中加入500ul、4.5mol/L的NaCL和300ul氯仿，持续摇匀15min，然后离心10min，离心后吸取上清液800ul于新的离心管中；
c、沉淀与干燥
在新的离心管中加入595ul异丙醇，混匀1-2分钟，置于-20℃下沉淀2小时后，在转速为12000-13000rpm离心10min，除去上清液，加入500ul、体积分数为70%乙醇洗涤5min，离心10min，去上清液，置于无菌超净台中自然晾干，加无菌双蒸水60ul于晾干的离心管中，使DNA充分溶解后，在-20℃下保存备用；
所述步骤b和步骤c中离心速率均为12000-13000rpm/min。
所述步骤（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染的具体方法如下：取双蒸水25.6ml，质量分数为30%丙烯酰胺18.4ml，11ml5×TBE，0.134ml四甲基乙二胺TEMED， 质量分数为10% 的AP350ul搅拌均匀配置凝胶，将配置好的凝胶注入到组装好的胶槽中，***梳子，静置2-3h凝固后，取下梳子，组装到电泳槽上，PCR产物上样量为5 μL，电泳完成后，取出凝胶放入装有纯水的瓷盘中，清洗一次后加入质量分数为1%的硝酸银800ml，放置在摇床上染色8-10分钟后，倒掉硝酸银，加入纯水，快速洗涤10s，向磁盘中加入质量分数为2%的NaOH溶液1000ml，放置在摇床上染色10分钟后，条带开始呈现，倒掉NaOH溶液，加入纯水洗涤后，将胶片平铺于观片箱上，拍照记录。
本发明的有益效果是：通过应用筛选出的分子标记AOMM108开展虹鳟雌核发育后代的筛选，从虹鳟幼鱼期就能够较早的开始鉴别雌核发育后代，降低养殖后期造成的经济损失，提高选育效果。该方法简单、快捷，准确率高，在虹鳟遗传育种领域中能够发挥重要作用。
附图说明
图1为本发明雌核发育后代及其亲本在所用微卫星分子标记AF352758.1中的扩增图谱；雌核发育个体：1-13泳道，M: marker，雄性亲本：M14-M17，雌性亲本：F18-F21。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，具体方法如下：
1、DNA的提取与检测
采集样品取美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍样本0.5 g，采用高盐浓度抽提法提取基因组DNA。
1.1 消化
取尾鳍组织加至离心管中，加入500ul Hom Buffer和15ul蛋白酶K，放入60℃的水浴锅中3h，每30分钟摇匀一次；
1.2 抽提
向离心管中加入4.5mol/L的NaCL500ul和300ul氯仿，摇匀15min，在12000rpm/min转速下离心10min，离心后吸取上清液800ul于新的离心管中；
1.3 沉淀与干燥
加入595ul异丙醇，混匀1分钟，置于-20℃下沉淀2小时，再在转速13000rpm/min下离心10min，除去上清液，加入500ul体积分数70%的乙醇洗涤5min，在转速12000rpm/min离心10min，去上清液，置于无菌超净台中自然晾干，加无菌双蒸水60ul于晾干的离心管中，使DNA充分溶解后，在-20℃下保存备用。
2、引物设计
根据GenBank数据库中登录号为AF352758.1的序列信息，用Primer3 (v.0.4.0)设计1对引物AOMM108(F:GGAGGCAGCTCCTGTTTTCT，R:GCTGCGCCATCTCTCTATCT)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3、PCR反应体系及程序
用合成的上下游引物扩增目的片段。PCR反应体系：总体系为13 μL，其中包括6.5μL含染料的2×Taq PCR Mastermix（TaqDNA Polymerae：0.1U/ML；MgCl2：4mmol/L；dNTPseach：0.4mmol/L），两条引物（10 mmol/L）个0.5 μL，0.5 μL DNA模板，其余双蒸水补足。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃预变性35 s，59℃退火温度45 s，72℃延伸45s，共30个循环；反应结束后在72℃再延伸8 min。
4、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物在质量分数10%的琼脂糖凝胶和1×TAE缓冲液中以5V/cm电压电泳15min，检测是否有条带。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
取双蒸水25.6ml，质量分数30%的丙烯酰胺18.4ml，11ml5×TBE，0.134ml TEMED，350ul质量分数10%的AP，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入到组装好的胶槽中，***梳子，静置3h凝固后，取下梳子，组装到电泳槽上。PCR产物上样量为5 μL。电泳条件：电泳缓冲液为1×TBE，电压200V，电泳时间3h。电泳完成后，取出凝胶放入装有纯水的瓷盘中，快速清洗一次。加入800ml 质量分数1%的硝酸银，放置在摇床上染色8分钟后，倒掉硝酸银，加入纯水，快速洗涤10s，向磁盘中加入1000ml质量分数2%的NaOH溶液，放置在摇床上染色10分钟后，条带开始呈现，倒掉NaOH溶液，加入纯水洗涤后，将胶片平铺于观片箱上，拍照记录。
6、标记验证
结果显示雌核发育后代的泳道中不含有雄性父本的条带，可以鉴定为雌核发育后代的遗传物质来自母本，没有发现父本的遗传物质渗入；结果显示雌核发育后代的泳道中含有雄性父本的条带，可以鉴定为杂交后代。
实施例2
一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，具体方法如下：
1、DNA的提取与检测
采集样品取美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍样本1g，采用高盐浓度抽提法提取基因组DNA。
1.1 消化
取尾鳍组织加至离心管中，加入500ul Hom Buffer和15ul蛋白酶K，放入55℃的水浴锅中2h，每30分钟摇匀一次；
1.2 抽提
向离心管中加入4.5mol/L的NaCL500ul和300ul氯仿，摇匀15min，在转速13000rpm/min下离心10min，离心后吸取上清液800ul于新的离心管中；
1.3 沉淀与干燥
加入595ul异丙醇，混匀2分钟，置于-20℃下沉淀2小时，再在转速12000rpm/min下离心10min，除去上清液，加入500ul体积分数70%乙醇洗涤5min，在转速13000rpm/min离心10min，去上清液，置于无菌超净台中自然晾干，加无菌双蒸水60ul于晾干的离心管中，使DNA充分溶解后，在-20℃下保存备用。
2、引物设计
根据GenBank数据库中登录号为AF352758.1的序列信息，用Primer3 (v.0.4.0)设计1对引物AOMM108(F:GGAGGCAGCTCCTGTTTTCT，R:GCTGCGCCATCTCTCTATCT)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3、PCR反应体系及程序
用合成的上下游引物扩增目的片段。PCR反应体系：总体系为13 μL，其中包括6.5μL含染料的2×Taq PCR Mastermix（TaqDNA Polymerae：0.1U/ML；MgCl2：4mmol/L；dNTPseach:0.4mmol/L），两条引物（10 mmol/L）个0.5 μL，0.5 μL DNA模板，其余双蒸水补足。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃预变性35 s，59℃退火温度45 s，72℃延伸45s，共30个循环；反应结束后在72℃再延伸8 min。
4、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物在质量分数10%的琼脂糖凝胶和1×TAE缓冲液中以5V/cm电压电泳15min，检测是否有条带。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
取双蒸水25.6ml， 质量分数30%的丙烯酰胺18.4ml，11ml5×TBE，0.134ml TEMED，350ul质量分数10%的AP，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入到组装好的胶槽中，***梳子，静置2h凝固后，取下梳子，组装到电泳槽上。PCR产物上样量为5 μL。电泳条件：电泳缓冲液为1×TBE，电压200V，电泳时间2.5h。电泳完成后，取出凝胶放入装有纯水的瓷盘中，快速清洗一次。加入800ml 质量分数1%的硝酸银，放置在摇床上染色10分钟后，倒掉硝酸银，加入纯水，快速洗涤10s，向磁盘中加入1000ml质量分数2%的NaOH溶液，放置在摇床上染色10分钟后，条带开始呈现，倒掉NaOH溶液，加入纯水洗涤后，将胶片平铺于观片箱上，拍照记录。
6、标记验证
结果显示雌核发育后代的泳道中不含有雄性父本的条带，可以鉴定为雌核发育后代的遗传物质来自母本，没有发现父本的遗传物质渗入；结果显示雌核发育后代的泳道中含有雄性父本的条带，可以鉴定为杂交后代。

Claims (8)

1.一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其特征在于方法为：选取美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍提取基因组DNA，然后通过PCR反应体系及程序、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后，通过显示条带上的泳道中是否含有雄性父本的标记验证来鉴别虹鳟雌核发育后代情况；其中PCR反应体系中的引物为AOMM108，F:GGAGGCAGCTCCTGTTTTC，R:GCTGCGCCATCTCTCTATCT。
2.根据权利要求1所述的一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其特征在于：所述PCR反应体系为：总体系为13 μL，其中2倍浓度的PCR预混酶6.5 μL；TaqDNA聚合酶：0.1U/ML；氯化镁：4mmol/L；dNTP混合物：0.4mmol/L，两条为10mmol/L的引物各0.5 μL；0.5 μLDNA模板；其余双蒸水补足；所述PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃预变性35 s，59℃退火温度45 s，72℃延伸45 s，共30个循环；反应结束后在72℃再延伸8 min。
3.根据权利要求1或2所述的一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其特征在于具体方法如下：（1）、DNA的提取与检测采集美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍样本，采用高盐浓度抽提法提取基因组DNA；（2）、引物设计1对引物为AOMM108，F:GGAGGCAGCTCCTGTTTTCT，R:GCTGCGCCATCTCTCTATCT；（3）、PCR反应体系及程序用合成的上下游引物扩增目的片段，其中PCR反应体系：其中包括总体系为13 μL，其中2倍浓度的PCR预混酶6.5 μL；TaqDNA聚合酶：0.1U/ML；氯化镁：4mmol/L；dNTP混合物：0.4mmol/L，两条为10mmol/L的引物各0.5 μL；0.5 μL DNA模板；其余双蒸水补足；所述PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃预变性35 s，59℃退火温度45 s，72℃延伸45 s，共30个循环；反应结束后在72℃再延伸8 min；（4）、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物在质量分数为10%的琼脂糖凝胶和1×TAE缓冲液中以5V/cm电压电泳15 min，检测是否有条带；（5）、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染取双蒸水、丙烯酰胺、5×TBE、四甲基乙二胺TEMED、AP配置凝胶，将配置好的凝胶注入胶槽中，***梳子，静置凝固后，取下梳子，组装到电泳槽上，产物上样，电泳完成后，取出凝胶放入装有纯水的瓷盘中，清洗一次后加入硝酸银，放置在摇床上染色，倒掉硝酸银，加入纯水洗涤，向磁盘中加入NaOH溶液，放置在摇床上染色后，条带开始呈现，倒掉NaOH溶液，加入纯水洗涤后，将胶片平铺于观片箱上，拍照记录；（6）、标记验证结果显示雌核发育后代的泳道中不含有雄性父本的条带，可以鉴定为雌核发育后代的遗传物质来自母本，没有发现父本的遗传物质渗入；结果显示雌核发育后代的泳道中含有雄性父本的条带，可以鉴定为杂交后代。
4.根据权利要求3所述的一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的引物设计为：根据GenBank数据库中登录号为AF352758.1的序列信息，用Primer3、v.0.4.0设计1对引物AOMM108，F:GGAGGCAGCTCCTGTTTTCT，R:GCTGCGCCATCTCTCTATCT，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
5.根据权利要求4所述的一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其特征在于：所述步骤（5）中电泳条件为：电泳缓冲液为1×TBE，电压200V，电泳时间2.5-3h。
6.根据权利要求5所述的一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其特征在于所述步骤（1）的DNA的提取与检测具体方法如下： a、 消化取美洲红点鲑、虹鳟雌核发育子代的尾鳍样本0.5-1g加至离心管中，加入500ul Hom Buffer和15ul蛋白酶K，放入55-60℃的水浴锅中2-3h，每30分钟摇匀一次；b、抽提向离心管中加入500ul、4.5mol/L的NaCL和300ul氯仿，持续摇匀15min，然后离心10min，离心后吸取上清液800ul于新的离心管中；c、沉淀与干燥在新的离心管中加入595ul异丙醇，混匀1-2分钟，置于-20℃下沉淀2小时后，在转速为12000-13000rpm离心10min，除去上清液，加入500ul、体积分数为70%乙醇洗涤5min，离心10min，去上清液，置于无菌超净台中自然晾干，加无菌双蒸水60ul于晾干的离心管中，使DNA充分溶解后，在-20℃下保存备用。
7.根据权利要求6所述的一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其特征在于：所述步骤b和步骤c中离心速率均为12000-13000rpm/min。
8.根据权利要求7所述的一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法，其特征在于：所述步骤（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染的具体方法如下：取双蒸水25.6ml，质量分数为30%丙烯酰胺18.4ml，11ml5×TBE，0.134ml四甲基乙二胺TEMED， 质量分数为10% 的AP350ul搅拌均匀配置凝胶，将配置好的凝胶注入到组装好的胶槽中，***梳子，静置2-3h凝固后，取下梳子，组装到电泳槽上，PCR产物上样量为5 μL，电泳完成后，取出凝胶放入装有纯水的瓷盘中，清洗一次后加入质量分数为1%的硝酸银800ml，放置在摇床上染色8-10分钟后，倒掉硝酸银，加入纯水，快速洗涤10s，向磁盘中加入质量分数为2%的NaOH溶液1000ml，放置在摇床上染色10分钟后，条带开始呈现，倒掉NaOH溶液，加入纯水洗涤后，将胶片平铺于观片箱上，拍照记录。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113699256B (zh) * 2021-09-26 2023-06-20 浙江省农业科学院 一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用
CN116064824B (zh) * 2022-07-06 2024-06-21 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 一种虹鳟耐高温snp分子标记及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597648A (zh) * 2009-06-26 2009-12-09 集美大学 大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法
CN102134593A (zh) * 2010-12-23 2011-07-27 中国水产科学研究院黄海水产研究所 半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用
CN102783445A (zh) * 2012-08-31 2012-11-21 北京卧佛山庄养殖有限公司 一种全雌化虹鳟的培育方法
CN103993081A (zh) * 2014-05-16 2014-08-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597648A (zh) * 2009-06-26 2009-12-09 集美大学 大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法
CN102134593A (zh) * 2010-12-23 2011-07-27 中国水产科学研究院黄海水产研究所 半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用
CN102783445A (zh) * 2012-08-31 2012-11-21 北京卧佛山庄养殖有限公司 一种全雌化虹鳟的培育方法
CN103993081A (zh) * 2014-05-16 2014-08-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Zhiying JIA 等.Genetic diversity and differentiation of masu salmon(Oncorhynchus masou masou) between and within cultured populations inferred from microsatellite DNA analysis.Zoological Research.2012,第33卷(第E3-4期),全文. *
张艳萍 等.甘肃金鳟遗传资源评价及其与日本金鳟和道氏虹鳟遗传分化研究.水生生物学报.2010,第34卷(第02期),全文. *
张艳萍 等.虹鳟3群体遗传变异的RAPD和SSR分析.西北师范大学学报(自然科学版).2011,第47卷(第05期),全文. *
张艳萍 等.虹鳟性别控制技术研究.万方科技成果数据库.2016,全文. *
徐浩 等.4个虹鳟养殖品系的分子鉴定和遗传多样性分析.中国水产科学.2013,第20卷(第04期),全文. *
杨濯羽 等.基于微卫星标记的22个道氏虹鳟选育家系的遗传多样性研究.淡水渔业.2016,第46卷(第03期),全文. *

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