CN111321143A - 一种制备环状rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备环状RNA的方法，主要解决线性RNA成环过程中存在的大分子聚合副产物随着底物浓度的增加而急剧增加，目的环状RNA产率低；并需要借助夹板链或辅助链，后期处理步骤繁琐的问题。针对要连接成环的线性RNA序列，先用Mfold或RNAstructure program等软件模拟成环后的二级结构，根据环状RNA的二级结构设计断开位点；以设计好的线性RNA为原料，采用T4RNA连接酶2(T4RNA Ligase 2)直接进行连接。连接过程中无需借助夹板链或辅助链，降低了后续纯化工艺的难度；成环的过程当中大分子副产物的产生被显著抑制，从而实现了目的环状RNA的高效制备。

Description

一种制备环状RNA的方法
技术领域
本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备环状RNA的方法。
背景技术
与线性RNA(L-RNA)相比，单链环状RNA(C-RNA)因无游离末端而对核酸外切酶具有较强抗性(J.Am.Chem.Soc.,2007,129,15108–15109；J.Biotechnol.,2009,139,265-272.)。环状RNA(circRNA)几乎在所有生物界中都有存在，相关研究表明其可作为miRNA或RNA抑制剂，还可被翻译，并具有调节其他蛋白质功能等诸多作用(Nature,2013,495,333-338；Nat.Rev.Genet.,2019,20,675-691.)。也有相关研究表明，哑铃形C-RNA可使活细胞中的siRNA寿命大大延长(Chem.Sci.,2018,9,44–51；Bioorg.Med.Chem.,2013,21,6198–6204.)。通过将siRNA中的反义RNA链环化并与线性的正义链相结合，可显著降低脱靶效应(Mol.Ther.Nucl.Acids,2017,10,237-244.)。核酶(Ribozyme)和RNA适配体(Aptamer)的环化还被广泛应用于对其功能的调控当中(Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52,7004-7008；Sci.Reports,2015,5,16435.)。当L-RNA被环化后，其功能被暂时抑制(如核酶的切割活性以及siRNA与miRNA的基因沉默作用等)，当利用光照或其他外部刺激将环打开时，又可以在恰当的时间和地点释放其功能(Bioorg.Med.Chem.,2013,21,6198–6204；Chem.Sci.,2018,9,44-51；Mol.Ther.Nucl.Acids,2017,10,237-244.)。同时，C-RNA在纳米结构的构建和纳米机器的设计当中也具有相当重要的作用(Bull.Chem.Soc.Jpn.,2017,90,967-1004；Bull.Chem.Soc.Jpn.,2018,91,1075-1111.)。因此，C-RNA的人工合成具有相当大的实际应用价值。然而，目前关于C-RNA合成的信息严重匮乏，规模化制备所需序列和尺寸的C-RNA的方法尚未被建立。
目前常用酶法环化L-RNA来制备C-RNA。T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2，一种双链RNA连接酶)常被作为工具酶来使用(RNA Biol.,2017,14,1018–1027；Nucleic Acids Res.,2015,43,2454-2465.)。而直接利用Yin等人(Virology,2004,319,141–151.)所建立的方法进行环化时，由于环化效率高度依赖于L-RNA的结构，所以制备不是很成功。因此，需要添加与L-RNA末端互补的辅助寡核苷酸(splint，下称夹板)以使两末端靠近形成“切口”(Nick)，再由Rnl2识别这个“切口”而发挥连接作用(RNA,2005,11,1909-1914.)。然而，在利用这种方法进行环化时，常伴随着分子间连接反应的发生，产生相当多的聚合副产物，尤其在高底物浓度条件下，分子间连接反应更加占据主导地位，这显著降低了C-RNA的产量，并使得实际合成以及后续的产物纯化回收过程(需用DNase等去除夹板)更加复杂化。此外，由于短链L-RNA(e.g.<30nt)和夹板形成的环化中间体在环化体系中不能稳定存在(Nucleic AcidsRes.,2018,46,e132；Nucleic Acids Res.,2009,37,e19.)，因此利用上述方法难以制备得到尺寸较小的环。即便使用T4 RNA连接酶1(T4 Rnl1，一种单链RNA连接酶)，当底物浓度较高时，分子间连接反应仍较分子内环化更易发生(RNA Biol.,2017,14,1018–1027；Sci.Reports,2015,5,16435.)。为了抑制分子间连接反应的发生，须使用专门设计的DNA辅助链(helper)，这给后续的产物纯化和回收造成了困难(RNA Biol.,2017,14,1018–1027；Nucleic Acids Res.,1998,26,2502–2504.)。单链RNA环化酶(ssRNA CircLigase)的环化过程需要以Mn2+作为辅因子，且要实现高效环化需要消耗大量的环化酶，成本较高(NucleicAcids Res.,2017,45,e139；Nucleic Acids Res.,2008,36,e40；Cell,2006,127,71-84.)。因此，亟需建立一种能同时满足在高底物浓度条件下获得较高环化产率和较高产物纯度的单链RNA环化方法。
发明内容
针对线性RNA成环过程中存在的大分子聚合副产物随着底物浓度的增加而急剧增加，目的环状RNA产率低；并需要借助夹板链(splint)或辅助链(helper)，后期处理步骤繁琐的问题，本发明提供了一种环状RNA的制备方法，针对要连接成环的线性RNA序列，先用Mfold或RNAstructure program等软件模拟成环后的二级结构，根据环状RNA的二级结构设计断开位点；以设计好的线性RNA为原料，采用T4 RNA连接酶2(T4 RNA Ligase 2)直接进行连接。连接过程中无需借助夹板链(splint)或辅助链(helper)，降低了后续纯化工艺的难度；成环的过程当中大分子副产物的产生被显著抑制，从而实现了目的环状RNA的高效制备。
本发明采用的技术方案如下：
一种制备环状RNA的方法，包括以下步骤：
步骤一，设计对T4 RNA连接酶2具有适当反应性的线性RNA(L-RNA)底物，采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状RNA(C-RNA)的二级结构，ΔG值＜0，模拟结果为结构①或结构②，所述结构①中间为凸环，凸环的两侧各有一个稳定的二级结构，凸环的长度为1-50nt；中间凸环两侧的稳定二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对，其余部分为任意长度的RNA或者任意的二级结构；所述结构②环状部位的一侧有一个稳定的二级结构，其环状部位的长度应为6-50nt，一侧的二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对；ΔG值＞0，模拟结果为结构③：结构③为环状结构，其长度为12-50nt；
步骤二，设计断开位点：1)当模拟结构符合结构①时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；2)当模拟得到的结构符合结构②时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；当模拟得到的结构符合结构③时，断开位点在该环状结构中的任一位置；
步骤三，按步骤二所设计的断开位点，重新确定线性RNA(L-RNA)底物的序列，作为连接成环的底物，合成并进行5′端磷酸化修饰；
步骤四，将步骤三得到的线性RNA、T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)、连接酶缓冲液(T4Rnl2 buffer)和RNA酶抑制剂(RiboLock RNase Inhibitor)混合，0-37℃下恒温反应2-12h。
进一步地，所述步骤四成环反应中线性RNA链不存在干扰连接酶识别和结合的复杂二级结构，尤其是回文结构、叠加(Overlap)或缺失(Gap)。
进一步地，所述步骤四成环反应中线性RNA链3’端的倒数第一个和倒数第二个均为核糖核苷酸，其余位置为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
进一步地，所述结构①凸环的长度为12-30nt。
进一步地，所述结构②环状部位的长度为12-30nt。
进一步地，所述结构③环状结构的长度应为15-30nt。
不考虑原料获取的难易程度，所述本发明线性RNA底物的长度为12nt以上；优选12-3000nt，再优选为12-319nt。
进一步地，所述步骤四中线性RNA的浓度为0.5-100μM；再进一步地，为1-50μM。
进一步地，所述连接酶缓冲液浓度为标准浓度的0.05～2倍。
进一步地，当反应体系中连接酶缓冲液终浓度为1×时，其组成为50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mM DTT,400μM ATP。
本发明提供的方法，根据环状RNA的二级结构确定断开位点，从而确定线性RNA底物的序列，即成环链。在具体实施方式部分，本发明提供的方法称为“自身二级结构辅助成环法”。
利用本方法制备得到的环状RNA本身纯度较高(只有少量的多聚线性副产物产生；可能还会有少量的线性RNA剩余；当反应不够充分时，还会有少量的反应中间体(腺苷酸化RNA，AppRNA)积累)。
本发明制备环状RNA的方法中底物不必形成Nick结构而连接。相较于现有的夹板链及辅助链辅助成环法，本发明所涉及的制备环状RNA的方法简单易操作，无需苛刻条件，且可实现超高成环链浓度(10-100μM)下环状RNA的高效制备。因此可为核酸药物设计及癌症、肿瘤等疾病的靶向治疗，纳米结构设计及纳米机器研发等以环状RNA或环状DNA为研究基础的相关研究领域提供充足的实验材料。此外，本方法几乎可抑制一切大分子副产物的产生，直接制备得到高浓度高纯度的环状RNA，因此后续只需外切酶(Exo T)酶切、醇沉等简单纯化步骤就可直接使用，大大简化了环状RNA的制备过程。
附图说明
图1利用T4 Rnl2环化单链RNA的示意图；
图2成环所需三种二级结构示意图；
图3实施例1SEQ-1环化结果；
图4实施例2SEQ-2和SEQ-3环化结果；
图5实施例3SEQ-4环化结果；
图6实施例4SEQ-5环化结果；
图7实施例5SEQ-6环化结果；
图8实施例6SEQ-7环化结果；
图9实施例7 0.05-2.0×连接buffer下的环化结果；
图10实施例8 37℃反应的环化结果；
图11实施例9不同底物浓度下的环化结果；
图12实施例10ATP浓度为60μM、80μM或100μM的环化结果；
图13实施例11ATP浓度为400μM的环化结果；
图14实施例12SEQ-8环化结果；
图15实施例13SEQ-9环化结果；
图16实施例14SEQ-10环化结果；
图17实施例15SEQ-11环化结果；
图18实施例16SEQ-12环化结果；
图19实施例17SEQ-13环化结果；
图20实施例18SEQ-14环化结果；
图21实施例19SEQ-15环化结果；
图22实施例20SEQ-16环化结果；
图23实施例21SEQ-17环化结果；
图24实施例22SEQ-18环化结果；
图25实施例23SEQ-19环化结果；
图26实施例24SEQ-20环化结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
下述实施例使用的成环链除实施例24是由转录制备得到的以外，其余均购自苏州金唯智生物科技有限公司，为人工合成；T4 RNA ligase 2和10×T4 Rnl2 buffer购自安诺伦(北京)生物科技有限公司(NEW ENGLAND BioLabs)；核酸外切酶T(EXO T)及对应的NEBBuffer4购自安诺伦(北京)生物科技有限公司(NEW ENGLAND BioLabs)；核酸酶抑制剂(RiboLock RNase Inhibitor)购自美国赛默飞世尔生物科技有限公司；核酸染液(UltraGelRed)购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司；其他化学用品购自美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
以下实施例是为了证明本发明的方法具有优越性。采用的原料成环链是根据Mfold或RNAstructure program等软件模拟成环后的二级结构确定的。模拟结果为图2所示的三种结构之一。上述预测软件的应用方法是已知的，此处不再赘述。
实施例1
1)原料
成环链1(5’→3’)：GAAACACUUUGAUUCCCUCCUGAUGAGUCGUGAGAC(5’-磷酸化，长度为36nt，SEQ ID NO：1)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图3A(属于类型③(长度为36nt))。
2)连接成环
自身二级结构辅助成环法：
将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂和连接酶缓冲液等混合，该体系含2μM或10μM成环链，0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×T4 RNA连接酶2缓冲液(Rnl2 buffer)，总体积为10μL；25℃条件下连接2h或6h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
采用自身二级结构辅助成环法环化不同浓度的单链RNA，并对实验结果进行12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，再用Image Lab软件通过分析条带亮度对RNA环的产率及产物选择性进行定量分析。
图3为结果图，其中图3A为环状RNA的结构模拟图及模拟结构的类型示意图，结构模拟图中箭头所示位置为断开位点；图3B为RNA环的产率及产物选择性的电泳分析结果。结果表明，相较于单链RNA，RNA环的电泳迁移速率较快，说明连接反应完成。此外，随着单链RNA浓度的增加，目的RNA环的产率降低，大分子聚合副产物的产量增加。当单链RNA的浓度为2μM时，RNA环的产率为74％，选择性为91％；当单链RNA的浓度提高到10μM时，RNA环的产率为57％，选择性下降到61％。由上述结果可知，利用自身二级结构辅助成环法实现了单链RNA的高效环化。
实施例2
1)原料
成环链2(5’→3’)：AUGCCGUUCUUGUUCACCUUG(5’-磷酸化，长度为21nt，SEQ ID NO：2)；
成环链3(5’→3’)：UGCCGUUCUUGUUCACCUUGA(5’-磷酸化，长度为21nt，SEQ ID NO：3)。
成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图4A(均属于类型③(长度为21nt))。
2)连接成环
自身二级结构辅助成环法：
参考实施例1的末端碱基配对法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM成环链，0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2U RiboLockRNase Inhibitor/μL反应液，1×T4 RNA连接酶2缓冲液(Rnl2 buffer)，总体积为10μL；25℃条件下连接2h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图4B为利用自身二级结构辅助成环法对线性RNA链(SEQ 2和SEQ 3)环化的结果图(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)，应当注意的是这两条线性RNA链是同一个目的环状RNA的前体线性链。结果显示，利用这两条前体线性链进行环化时，环化产率均可达90％以上，且无聚合副产物产生。
实施例3
1)原料
成环链4(5’→3’)：ACAUCAGUCUGAUAAGCUAUCA(5’-磷酸化，长度为22nt，SEQ IDNO：4)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图5A(属于类型③(长度为22nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含10μM成环链，1U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×T4 RNA连接酶2缓冲液(Rnl2 buffer)，总体积为10μL；25℃条件下连接12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图5B为利用自身二级结构辅助成环法对SEQ 4进行环化的结果图(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，当连接位点一端存在5bp长的稳定二级结构时，环化产率为56％，选择性为61％。
实施例4
1)原料
成环链5(5’→3’)：AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUC(5’-磷酸化，长度为22nt，SEQ IDNO：5)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图6A(属于类型③(长度为22nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含10μM成环链，1U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×T4 RNA连接酶2缓冲液(Rnl2 buffer)，总体积为10μL；25℃条件下连接12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图6B为利用自身二级结构辅助成环法对SEQ 5进行环化的结果示意图(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，环化产物产率为60％，选择性为61％。
实施例5
1)原料
成环链6(5’→3’)：CAACAUCAGUCUGAUAAGCUAU(5’-磷酸化，长度为22nt，SEQ IDNO：6)；成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图7A(属于类型③(长度为22nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含10μM成环链，1U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×T4 RNA连接酶2缓冲液(Rnl2 buffer)，总体积为10μL；25℃条件下连接12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图7B为利用自身二级结构辅助成环法对SEQ 6进行环化的产物选择性示意图(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，环化产物产率为50％，选择性为60％。
实施例6
1)原料
成环链7(5’→3’)：UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA(5’-磷酸化，长度为22nt，SEQ IDNO：7)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图8A(属于类型③(长度为22nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含10μM成环链，1U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×T4 RNA连接酶2缓冲液(Rnl2 buffer)，总体积为10μL；25℃条件下连接12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图8B为利用自身二级结构辅助成环法对SEQ 7进行环化时的产物选择性示意图(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，环化产物产率为32％，选择性为33％。综合实施例3-6，我们可以看出对于长度介于12-50nt之间的目的环化产物，通过在不同位置断开来设计线性底物链(只要无干扰连接酶识别和结合的复杂二级结构存在)，均能实现高效环化。
实施例7-实施例9采用的原料成环链为成环链5(5’→3’)：AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUC(5’-磷酸化，长度为22nt，SEQ ID NO：5)。
实施例7
1)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含10μM成环链，1U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，总体积为10μL，体系中的buffer浓度为2×、1×、0.5×、0.25×、0.1×或0.05×，25℃条件下连接12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
2)电泳检测
图9为不同浓度连接buffer下的实验结果，这里以SEQ 5为例进行说明(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，当反应体系中的buffer浓度为2×时，经过12h的连接反应，体系中除了目的单环，还有大量分子间聚合副产物产生，产物产率仅为56％，选择性为57％；当连接体系中buffer浓度为0.1×时，经过12h的连接反应后，得到了纯度较高的目的单环，仅有微量的分子间连接副产物出现，产物产率高达81％，选择性也提高到了89％；当反应体系中的buffer浓度为0.05×时，经过12h的连接反应后，得到了纯度较高的目的单环，仅有微量的分子间连接副产物出现。但由于buffer浓度过低，使得环化反应速率极大降低，最终反应体系中存在大量的腺苷酸化中间产物，且有部分线性RNA未被转化，最终使得产物产率仅为23％，选择性降低到64％。说明低buffer浓度(0.1×)下，环化产率和产物选择性相较于高buffer浓度(2×)分别提高了20％和30％。
实施例8
1)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含10μM成环链，1U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，总体积为10μL。连接体系中的buffer浓度为1×，37℃条件下连接12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
2)电泳检测
图10为反应温度为37℃下的环化结果(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，较高反应温度(37℃)有利于提高产物选择性，抑制分子间连接副产物的产生(相较于25℃下的环化结果(实验结果见实施例4)，产物产率由60％提高到了85％，选择性由61％提高到了85％)。
实施例9
1)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，当体系含1μM成环链时，T4 RNA Ligase 2浓度为0.2U/μL反应液；当体系中含20或50μM成环链时，T4 RNA Ligase 2浓度为2U/μL反应液。2U RiboLockRNase Inhibitor/μL反应液，0.1×Rnl2 buffer，总体积为10μL，37℃条件下连接12h。
0.1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：5mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),0.2mM MgCl2,0.1mMDTT,40μM ATP。
2)纯化与酶切确认
为了对RNA环进行纯化，并确认条带为RNA环，使用外切酶EXO T对环化产物进行酶切。将环化产物稀释至浓度为1μM。酶切体系：取4μL稀释后的产物，加入0.5μL EXO T原液，使酶切体系中的EXO T终浓度为5U/μL反应液，1×EXO T Buffer(NEB Buffer 4)，总体积为5μL；25℃酶切6h。
3)电泳检测
图11为不同SEQ 5浓度下，体系中buffer浓度为0.1×，反应温度为37℃时的环化结果(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，当底物链浓度为1μM时，环化产率可达93％，产物选择性高达93％；当成环链浓度为20μM时，在37℃条件下经过12h反应，环化产率可达72％，产物选择性可达81％；当成环链浓度进一步被提高到50μM时，环化产率为60％，产物选择性为74％。说明低buffer条件(0.1×)联合高反应温度(37℃)能进一步提高自身二级结构辅助成环法的环化效果(当成环链浓度为1μM时，产率和选择性均＞90％，相较于高buffer浓度(1×)、较低反应温度(25℃)下的环化结果(附图9，泳道3)提高了30％)。应当注意的是这里没有大分子聚合副产物产生，但因为反应速率的降低(由buffer稀释导致)，有部分腺苷酸化中间产物积累，还有少量的成环链尚未被转化。但酶切后这些线性RNA均可被去除，得到纯净的目的环化产物，经简单醇沉就可直接使用。
实施例10
1)原料
成环链4(5’→3’)：ACAUCAGUCUGAUAAGCUAUCA(5’-磷酸化，长度为22nt，SEQ IDNO：4)。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含20μM成环链，2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，0.1×Rnl2 buffer，此外，20μM、40μM或60μM ATP被补加到该体系中(体系中的ATP总量为60、80或100μM)，总体积为10μL；37℃条件下连接12h。
0.1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：5mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),0.2mM MgCl2,0.1mM DTT,40μM ATP。
3)电泳检测
图12为在被稀释的buffer中补加ATP后的环化结果(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，补加ATP可进一步提高环化产率大约10％。
实施例11
1)原料
成环链1(5’→3’)：GAAACACUUUGAUUCCCUCCUGAUGAGUCGUGAGAC(5’-磷酸化，长度为36nt，SEQ ID NO：1)。
2)连接成环
辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含20μM成环链，2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，0.1×Rnl2 buffer，此外，360μM ATP被补加到该体系(体系中ATP终浓度为400μM)，总体积为10μL；37℃条件下进行连接。
0.1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：5mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),0.2mM MgCl2,0.1mM DTT,40μM ATP。
3)电泳检测
图13为高成环链(SEQ 1)浓度(20μM)条件下，进一步补加ATP后的环化结果(12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果显示，经过10h，环化产率高达89％，且无分子间连接副产物产生，相当于从100mL反应体系(20μM)中，可制备得到21mg的环化产物。
实施例12
1)原料
成环链8(5’→3’)：TTUCAACAAGGAUGAAGUCUA(5’-磷酸化，长度为21nt，SEQ ID NO：8)；成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图14A(属于类型③(长度为21nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM或10μM成环链，当成环链浓度为2μM时，Rnl2用量为：0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液；当成环链浓度为10μM时，Rnl2用量为：1U T4RNALigase 2/μL反应液。其他反应条件：2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h或12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图14B和14C为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 8的实验结果。结果表明，对于RNA链中含有几个脱氧核糖核苷酸的序列，Rnl2同样能进行高效环化，只要确保在连接位点处3’端的倒数第一个和倒数第二个为核糖核苷酸就可以。
实施例13
1)原料
成环链9(5’→3’)：UGCCGUUCUUGUUCACCUUGAA(5’-磷酸化，长度为22nt，SEQ IDNO：9)；成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图15A(属于类型③(长度为22nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM或10μM成环链，当成环链浓度为2μM时，Rnl2用量为：0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液；当成环链浓度为10μM时，Rnl2用量为：1U T4RNALigase 2/μL反应液。其他反应条件：2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h或12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图15B和15C为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 9的实验结果。结果表明，当底物链浓度为2μM时，环化产物产率为75％，选择性高达83％；当进一步提高底物链浓度到10μM时，产物产率和选择性仍接近80％。
实施例14
1)原料
成环链10(5’→3’)：GCCGUUCUUGUUCACCUUGAU(5’-磷酸化，长度为21nt，SEQ IDNO：10)；成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图16A(属于类型③(长度为21nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM或10μM成环链，当成环链浓度为2μM时，Rnl2用量为：0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液；当成环链浓度为10μM时，Rnl2用量为：1U T4RNALigase 2/μL反应液。其他反应条件：2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h或12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图16B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 10的实验结果，这里在原始序列的U12和G13之间设计了断开位点。结果表明，采用强化条件(如增加Rnl2的量)时，Rnl2会帮助稳定成环底物链在反应体系中的稳定性，最终使得环化反应能够高效进行(产率高达83％)。
实施例15
1)原料
成环链11(5’→3’)：CCGUUCUUGUUCACCUUGAUG(5’-磷酸化，长度为21nt，SEQ IDNO：11)；成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图17A(属于类型③(长度为21nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM或10μM成环链，当成环链浓度为2μM时，Rnl2用量为：0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液；当成环链浓度为10μM时，Rnl2用量为：1U T4RNALigase 2/μL反应液。其他反应条件：2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h或12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图17B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 11的实验结果，这里在原始序列的G13和C14之间设计了断开位点。结果表明，当底物链浓度为2μM，T4 Rnl2浓度为0.2U/μL时，经过2h反应，环化产物产率为58％；当进一步提高底物链浓度到10μM，提高T4 Rnl2浓度到1U/μL时，环化产率提高到90％以上。
实施例16
1)原料
成环链12(5’→3’)：GUUCACCUUGAUGCCGUUCUU(5’-磷酸化，长度为21nt，SEQID NO：12)；成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图18A(属于类型③(长度为21nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM或10μM成环链，当成环链浓度为2μM时，Rnl2用量为：0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液；当成环链浓度为10μM时，Rnl2用量为：1U T4RNALigase 2/μL反应液。其他反应条件：2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h或12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图18B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 12的实验结果。结果表明，当底物链浓度为2μM，T4 Rnl2浓度为0.2U/μL时，经过2h反应，环化产物产率就高达92％。
实施例17
1)原料
成环链13(5’→3’)：UGUUCACCUUGAUGCCGUUCU(5’-磷酸化，长度为21nt，SEQ IDNO：13)；成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图19A(属于类型③(长度为21nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM或10μM成环链，当成环链浓度为2μM时，Rnl2用量为：0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液；当成环链浓度为10μM时，Rnl2用量为：1U T4RNALigase 2/μL反应液。其他反应条件：2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h或12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图19B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 13的实验结果，这里在原始序列的U20和U21之间设计了断开位点。结果表明，条件强化能进一步提高环化效率(当酶量增加到1U/μL时，产率由74％提高到了82％)。
实施例18
1)原料
成环链14(5’→3’)：GAUGCCGUUCUUGUUCACCUU(5’-磷酸化，长度为21nt，SEQ IDNO：14)；成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图20A(属于类型③(长度为21nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM或10μM成环链，当成环链浓度为2μM时，Rnl2用量为：0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液；当成环链浓度为10μM时，Rnl2用量为：1U T4RNALigase 2/μL反应液。其他反应条件：2U RiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h或12h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图20B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 14的实验结果，这里在原始序列的U9和G10之间设计了断开位点。结果进一步表明，即使在底物浓度和酶浓度都比较低的条件下，环化产率仍接近90％。综合实施例21-26，我们可以看出对于相同的目的环化产物，在不同的位置设置断开位点时，只要存在弱结合作用，环化反应都能高效进行。
实施例19
1)原料
成环链15(5’→3’)：GACAUUGUGUGUCGAAACCGGUCCAGAGUUUUCUAGGCUGACUCUGCUGAUGA
(5’-磷酸化，长度为53nt，SEQ ID NO：15)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图21A(当模拟温度为50℃时，模拟结果属于类型①(凸环长度为9nt)；当模拟温度为80℃时，模拟结果属于类型②(环部大小为30nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM成环链，0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2 buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图21B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 15的实验结果，这里在原始序列的A19和G20之间设计了断开位点。结果表明，当在连接位点两侧(或一侧)存在稳定二级结构(≥5bp的碱基互补配对)时，有利于维持待环化底物链在连接体系中的整体稳定性，从而有利于连接酶的结合和连接。
实施例20
1)原料
成环链16(5’→3’)：GAAACGGUGAAAGCCGUCGGUCGCCCGGGCGACCCUGAUGAGGCCGAAAGGCC
(5’-磷酸化，长度为53nt，SEQ ID NO：16)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图22A(属于类型①(凸环长度为25nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM成环链，0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2 buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图22B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 16的实验结果，这里在原始序列的C27和G28之间设计了断开位点。结果表明，当在两个稳定“stem”(较长的碱基互补配对)中间存在的凸环(尺寸为1-50nt)中设计断开位点(该断开位点距离稳定结构3-10nt)得到的待环化链能实现高效环化。
实施例21
1)原料
成环链17(5’→3’)：ACGAAACCGGUCGUGAGCUGUCAGGAUCGUGCCUACCUGAUGAGCCCGAAGGAGG(5’-磷酸化，长度为55nt，SEQ ID NO：17)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图23A(属于类型②(环部大小为21nt)。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM成环链，0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2 buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图23B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 17的实验结果，这里在原始序列的G32和A33之间设计了断开位点。结果表明，经过2h反应，线性RNA几乎被全部环化。
实施例22
1)原料
成环链18(5’→3’)：AAAAGUACUAAAAAAGGCGCAUUUGAACUGUAUUGUACGCCUUGCGC(5’-磷酸化，长度为47nt，SEQ ID NO：18)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图24A(属于类型②(环部大小为16nt)。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM成环链，0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2 buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图24B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 18的实验结果，这里在原始序列的C33和A34之间设计了断开位点。结果表明，对于较长的成环底物链，其大多含有复杂二级结构，因此“自身二级结构辅助成环法”具有良好通用性。
实施例23
1)原料
成环链19(5’→3’)：GAGUCCGCCCCG(5’-磷酸化，长度为12nt，SEQ ID NO：19)。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图25A(属于类型③(长度为12nt)。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM成环链，0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2 buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h。
1×T4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDTT,400μM ATP。
3)电泳检测
图25B为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 19的实验结果。结果表明，对于很短的成环底物链，自身二级结构辅助成环法仍适用，但由于底物链的刚性过强，使得分子间连接反应总是伴随着分子内环化，从而使得产物选择性下降。
实施例24
1)原料
成环链20(5’→3’)：CUACUGAUGCCAUUGUCAAAGAAUUCCUAGAUAUCUGUGAAAAUGCUGAGGGUGCCAUUGCAGUACAUUGCAAAGAAAGCAGAAAAUGGAGAUUUAAAUUGGAUAAUACCAGACCGAUUUAUUGCCUUCUGUGGACCUCAUUCAAGAGCCAGACUUGAAAGUGGUUACCACCAACAUUCUCCUGAGACUUAUAUUCAAUAUUUUAAGAAUCACAAUGUUACUACCAUUAUUCGUCUGAAUAAAAGGAUGUAUGAUGCCAAACGCUUUACGGAUGCUGGCUUCGAUCACCAUGAUCUUUUCUUUGCGGAUGGCAGCACCC(5’-磷酸化，长度为319nt，SEQ ID NO：20)。来源：由转录制备得到。成环链序列是根据Mfold软件模拟成环后的二级结构确定的，模拟结构参考图26A-E(当模拟温度为50℃时，模拟结果属于类型①(凸环长度为11nt)；当模拟温度为80℃时，模拟结果属于类型②(环部大小为13nt))。
2)连接成环
参考实施例1的自身二级结构辅助成环法，将成环反应所需的成环链、连接酶、RNA酶抑制剂及缓冲液等混合，该体系含2μM成环链，0.2U T4 RNA Ligase 2/μL反应液，2URiboLock RNase Inhibitor/μL反应液，1×Rnl2 buffer，总体积为10μL；25℃条件下连接2h。
1×U4 RNA Ligase 2Buffer组成：50mM Uris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mMDUU,400μM AUP。
3)电泳检测
图26F为采用自身二级结构辅助成环法环化SEQ 20的实验结果(4％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果表明，对于较长的成环底物链(如几百nt的circRNA)，自身二级结构辅助成环法仍适用，进一步说明了该方法适用的序列范围较广。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种制备环状RNA的方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaacacuuu gauucccucc ugaugagucg ugagac 36
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
augccguucu uguucaccuu g 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ugccguucuu guucaccuug a 21
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaucagucu gauaagcuau ca 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacaucaguc ugauaagcua uc 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caacaucagu cugauaagcu au 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ucaacaucag ucugauaagc ua 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcaacaagg augaagucua u 21
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ugccguucuu guucaccuug aa 22
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccguucuug uucaccuuga u 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccguucuugu ucaccuugau g 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
guucaccuug augccguucu u 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
uguucaccuu gaugccguuc u 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaugccguuc uuguucaccu u 21
<210> 15
<211> 53
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacauugugu gucgaaaccg guccagaguu uucuaggcug acucugcuga uga 53
<210> 16
<211> 53
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaacgguga aagccgucgg ucgcccgggc gacccugaug aggccgaaag gcc 53
<210> 17
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgaaaccgg ucgugagcug ucaggaucgu gccuaccuga ugagcccgaa ggagg 55
<210> 18
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaaaguacua aaaaaggcgc auuugaacug uauuguacgc cuugcgc 47
<210> 19
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaguccgccc cg 12
<210> 20
<211> 319
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cuacugaugc cauugucaaa gaauuccuag auaucuguga aaaugcugag ggugccauug 60
caguacauug caaagaaagc agaaaaugga gauuuaaauu ggauaauacc agaccgauuu 120
auugccuucu guggaccuca uucaagagcc agacuugaaa gugguuacca ccaacauucu 180
ccugagacuu auauucaaua uuuuaagaau cacaauguua cuaccauuau ucgucugaau 240
aaaaggaugu augaugccaa acgcuuuacg gaugcuggcu ucgaucacca ugaucuuuuc 300
uuugcggaug gcagcaccc 319

Claims (10)

1.一种制备环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，设计对T4 RNA连接酶2具有适当反应性的线性RNA底物，采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状RNA的二级结构，ΔG值＜0，模拟结果为结构①或结构②，所述结构①中间为凸环，凸环的两侧各有一个稳定的二级结构，凸环的长度为1-50nt；中间凸环两侧的稳定二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对，其余部分为任意长度的RNA或者任意的二级结构；所述结构②环状部位的一侧有一个稳定的二级结构，其环状部位的长度应为6-50nt，一侧的二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对；ΔG值＞0，模拟结果为结构③：结构③为环状结构，其长度为12-50nt；
步骤二，设计断开位点：1)当模拟结构符合结构①时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；2)当模拟得到的结构符合结构②时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；当模拟得到的结构符合结构③时，断开位点在该环状结构中的任一位置；
步骤三，按步骤二所设计的断开位点，合成新的线性RNA作为连接成环的底物，并进行5′端磷酸化修饰；
步骤四，将步骤三得到的线性RNA、T4 RNA连接酶2、连接酶缓冲液和RNA酶抑制剂混合，0-37℃下恒温反应2-12h。
2.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四成环反应中线性RNA链不存在干扰T4 RNA连接酶2识别和结合的复杂二级结构。
3.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四成环反应中线性RNA链3’端的倒数第一个和倒数第二个碱基均为核糖核苷酸，其余位置为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
4.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述结构①凸环的长度为12-30nt；所述结构②环状部位的长度为12-30nt；所述结构③环状结构的长度应为15-30nt。
5.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四中线性RNA的长度大于12nt。
6.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四中线性RNA的长度为12-3000nt。
7.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四中线性RNA的浓度为0.5-100μM。
8.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四中线性RNA的浓度为1-50μM。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四连接酶缓冲液浓度为标准浓度的0.05～2倍。
10.根据权利要求9所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，当反应体系中连接酶缓冲液终浓度为1×时，其组成为50mM Tris-HCl(pH7.5@25℃),2mM MgCl2,1mM DTT,400μMATP。
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