CN111308084A - 一种超敏心肌肌钙蛋白i检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超敏心肌肌钙蛋白I检测方法和试剂盒。所述试剂盒包括用于检测来自受试者样品中心肌肌钙蛋白I的第一组抗体和第二组抗体,所述抗体选自特异性结合下述氨基酸片段的抗体:抗体1:第13‑29位;抗体2:第27‑39位;抗体3:第41‑49位;抗体4:第85‑92位。本发明的方法和试剂盒灵敏度高,操作简单,可用于心肌肌钙蛋白I的动态监测。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白检测领域。具体而言,本发明涉及超敏心肌肌钙蛋白I的检测方法和试剂盒。
背景技术
血液心肌肌钙蛋白I(cTnI:cardiac troponin I)的升高对诊断心肌损伤/坏死(myocardial necrosis)具有非常高的敏感性和特异性。目前cTnI已成为心梗的临床诊断,治疗,监测必不可少的标志物。
心肌肌钙蛋白在正常人微量存在,但在心肌梗死发生时,心肌细胞毁损造成cTnI释放入血,无论ST段是否抬高,cTnI都会急剧升高,在24小时左右达到高峰,7-10天后下降至正常水平。cTnI升高的幅度与心肌细胞坏死程度有一定程度的关联。如果病人血中cTnI在下降过程中再次升高,意味着心肌再次损伤/坏死。cTnI浓度的变化与AC(AcuteCoronary Syndrome)危险程度、治疗决策和预后明确相关。
超敏肌钙蛋白I(hs-cTnI)在急性心肌梗死患者诊断中具有着较高的灵敏度与特异性,对于提升急性心肌梗死的临床诊断准确率具有着非常关键的意义。超敏肌钙蛋白I的一般检测标准为:正常人第99百分位点处变异系数(CV)≤10%,临床可接受标准为≤20%,表观正常人检出率≥50%。所以和常规cTnI检测相比,hs-cTnI的灵敏度要求非常高,cTnI灵敏度的增加提高了早期AMI检测的检出率。但是在检验灵敏性提高的同时也增加了AMI和其他一些疾病中引起cTnI升高的阳性率,尤其是对于那些可能存在慢性心肌损伤的结构性心脏病患者。然而在大多数案例中,这种慢性心肌损伤一般不会表现出显著hs-cTnI的动态改变。所以,通过系列cTnI检测来判断随着时间变化的ΔcTnI可以有效鉴别AMI和结构性心脏病患者。
目前市面上也不断地涌入大量的POCT产品。然而,这些产品多采用某一段抗原表位的抗体对抗原进行检测,普遍存在漏检和无法达到正常人检出率≥50%。因此,当前试剂盒性能普遍达不到超敏的要求,比如检出率低、灵敏度特异性不够等,不能监测病情的发展趋势、不能满足检测不同时间患者血液中心肌肌钙蛋白含量变化等要求。
发明内容
发明人经过大量理论研究和实验摸索,充分考虑心肌肌钙蛋白I的结构特性,对各种待测超敏肌钙蛋白抗原区间和捕获抗体进行分析研究,并通过大量交叉实验和筛选,获得了能够用于心肌肌钙蛋白I检测的心肌肌钙蛋白I抗原区域组合。发明人已经证明针对所选抗原表位区域的抗体出乎意料的能够相互组合用于hs-cTnI的高灵敏度和特异性检测。发明人还令人吃惊地发现针对所选抗原表位区域的抗体能够相互补充各自检测的不足,提高检出率,并能够用于动态监测病情的发展趋势,能够随时监测受试者如心肌梗塞患者的cTnI含量,这对基层医院或者病房尤其重要。
在一些实施方案中,本发明可以包括下述一项或多项:
1.一种心肌肌钙蛋白I检测试剂盒,其包括用于检测来自受试者样品中心肌肌钙蛋白I的第一组抗体和第二组抗体,其中第一组抗体包括抗体1至抗体4之中的一种、两种或三种的抗体,第二组抗体包括抗体1至抗体4中除了第一组抗体之外的抗体,其中抗体1至抗体4分别为特异性结合心肌肌钙蛋白I的下述氨基酸片段的抗体:
抗体1:特异性结合心肌肌钙蛋白I的第13-29位氨基酸片段;
抗体2:特异性结合心肌肌钙蛋白I的第27-39位氨基酸片段;
抗体3:特异性结合心肌肌钙蛋白I的第41-49位氨基酸片段;
抗体4:特异性结合心肌肌钙蛋白I的第85-92位氨基酸片段。
2.项目1所述的试剂盒,其中第一组抗体和第二组抗体选自下组:
1)第一组抗体包括抗体1,并且第二组抗体包括抗体2、抗体3和抗体4;
2)第一组抗体包括抗体2,并且第二组抗体包括抗体1、抗体3和抗体4;
3)第一组抗体包括抗体3,并且第二组抗体包括抗体1、抗体2和抗体4;
4)第一组抗体包括抗体4,并且第二组抗体包括抗体1、抗体2和抗体3;
优选地第一组抗体为标记抗体,第二组抗体为包被抗体。
3.项目1或2所述的试剂盒,其中所述抗体的反应效价高于105,包括例如高于106,例如高于107。
4.项目1-3任一项所述的试剂盒,其中所述标记抗体用可检测标记物标记,例如金属粒子,如胶体金,荧光标记,发色团标记,电子致密标记,化学发光标记,放射性标记,酶标记,例如放射性同位素,荧光团,罗丹明,荧光素酶,荧光素,辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖类氧化酶,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,生物素/抗生物素蛋白,生物素/链霉抗生物素蛋白,自旋标记,噬菌体标记,例如吖啶酯标记,例如通过接头如生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白添加荧光标记如吖啶酯标记。
5.项目1-4任一项所述的试剂盒,其中所述包被抗体连接至固相,例如磁性颗粒,胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片,任选地所述试剂盒包括免疫层析试纸条或检测卡。
6.项目1-5任一项所述的试剂盒,其中所述样品包括健康或病理状态的生物组织、细胞或体液,例如血液样品,例如血浆、血清、血制品。
7.针对心肌肌钙蛋白I的第一组抗体和第二组抗体的组合,其中第一组抗体和第二组抗体为根据项目1-6中任一项定义的抗体。
8.项目7所述的第一组抗体和第二组抗体的组合在制备检测心肌肌钙蛋白I的试剂盒中的用途,优选地,其中所述试剂盒用于1)对心肌肌钙蛋白含量进行动态检测,例如用于进行实时监测,和/或2)诊断早期急性心肌损伤,包括例如排除或预测早期急性心肌损伤。
9.一种制备抗体的方法,所述方法包括:
1)使用下述氨基酸片段1-4作为抗原或半抗原免疫动物:
片段1:心肌肌钙蛋白I的第13-29位氨基酸片段;
片段2:心肌肌钙蛋白I的第27-39位氨基酸片段;
片段3:心肌肌钙蛋白I的第41-49位氨基酸片段;
片段4:心肌肌钙蛋白I的第85-92位氨基酸片段;和
2)从所述动物获得分别特异性结合所述片段1-4的抗体。
10.心肌肌钙蛋白I的第13-29位氨基酸片段,心肌肌钙蛋白I的第27-39位氨基酸片段;心肌肌钙蛋白I的第41-49位氨基酸片段和/或心肌肌钙蛋白I的第85-92位氨基酸片段在制备检测心肌肌钙蛋白I的试剂或试剂盒中的应用。
在一些实施方案中,本发明的试剂盒包括心肌肌钙蛋白I(hs-cTnI)检测试剂卡(试纸条)。在一些实施方案中,可以利用免疫荧光技术,将抗体标记在可检测标记如荧光素上,利用双抗夹心法原理检测受试者例如AMI患者中的cTnI。在一些实施方案中,本发明的方法和试剂盒提高检出率,且能够监测不同时间心肌肌钙蛋白含量变化,可用于早期心肌梗塞的排除和预测。
在一些实施方案中,针对现有大部分技术存在着检出率低,不能随时检测患者心肌肌钙蛋白的含量等技术问题,本发明提供一种检测方法和试剂盒,能够实现提供检出率,降低漏检的风险,且能够检测患者心肌肌钙蛋白的含量,早期患者提供排除与预测。
在一些实施方案中,本发明可以通过荧光免疫层析进行或包括进行荧光免疫层析的试剂。在一些实施方案中,免疫层析可以通过试纸条由双抗体夹心法实现。在一些实施方案中,进行双抗体夹心法的试剂和装置没有特别限制,可以采用任何适当的试剂和/或装置。例如,荧光免疫层析试纸条可以包括样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫。在一些实施方案中,结合垫上可以包被有多个表位的荧光基团-抗体复合物;NC膜上可以包被两条线,例如分别是检测线(T线)和对照线(C线);T线上可以混合包被一个表位的抗体,能捕捉来自结合垫上的荧光基团-抗体复合物形成双抗体夹心的复合物,从而将荧光基团固定在T线上;C线上可以包被能够捕捉游离的荧光基团-抗体复合物的抗体。在一些实施方案中,待测样本加入到检测试剂卡的加样口中,在侧向毛细管作用下,待检样本先经过结合垫,与结合垫上的不同荧光基团-抗体复合物分别发生特异的免疫结合,各自结合形成抗原-抗体荧光复合物,从而被固定在T线中。游离的荧光基团-抗体复合物经过C线时,能够与C线抗体发生特异的免疫结合,从而被固定在C线中。对照带(C)与测试带(T)的荧光强度成反比,从而可以校正样本个体差异。荧光免疫分析仪检测出的两条带的荧光强度以峰面积体现,并通过仪器自身的计算软件计算T/C值(T峰面积/C峰面积),拟合至已设定的标准曲线,荧光免疫分析仪自动换算出相应待检样本中cTnI的浓度值。
在一些实施方案中,本发明能够利用多表位抗体识别抗原上的多个表位,降低漏检的风险,提高检出率。
在一些实施方案中,本发明可以通过抗原表位的组合,覆盖范围大,利用多表位抗体配对识别抗原上的多个表位,降低漏检的风险,提高检出率。
在一些实施方案中,采用特异性结合心肌肌钙蛋白I的13-29aa片段的抗体作为标记抗体对抗原进行标记,并用分别特异性结合心肌肌钙蛋白I的27-39aa、41-49aa、85-92aa片段的抗体作为包被抗体对抗原进行包被。
在一些实施方案中,采用特异性结合心肌肌钙蛋白I的27-39aa片段的抗体作为标记抗体对抗原进行标记,并用分别特异性结合心肌肌钙蛋白I的13-29aa、41-49aa、85-92aa片段的抗体作为包被抗体对抗原进行包被。
在一些实施方案中,采用特异性结合心肌肌钙蛋白I的41-49aa片段的抗体作为标记抗体对抗原进行标记,并用分别特异性结合心肌肌钙蛋白I的27-39aa、13-29aa、85-92aa片段的抗体作为包被抗体对抗原进行包被。
在一些实施方案中,采用特异性结合心肌肌钙蛋白I的85-92aa片段的抗体作为标记抗体对抗原进行标记,并用分别特异性结合心肌肌钙蛋白I的27-39aa、41-49aa、13-29aa片段的抗体作为包被抗体对抗原进行包被。
在本文中,如无相反说明,cTnI表位或片段的编号根据SEQ ID NO:1相应位置进行。
在一些实施方案中,本发明提供了一种超敏心肌肌钙蛋白I检测方法、检测试剂盒以及制备方法。本发明的试剂盒具备改善的灵敏度、特异性,能够实时监测,操作简单,适合推广应用。本发明的试剂盒尤其可用于早期心肌梗塞的快速诊断。在一些实施方案中,本发明的第一组抗体和/或第二组抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中,可以采用本领域已知的方法制备本发明的抗体,例如第一组抗体和/或第二组抗体。在一些实施方案中,可以以包含本文描述的氨基酸片段的抗原免疫动物制备本发明的抗体,例如第一组抗体和/或第二组抗体。为了增加免疫原性,可以将较大的抗原化合物(包括但不限于BSA、卵清蛋白、KLH等)与表位肽偶联。免疫原部分可以包括多种蛋白质或多肽,其可以起免疫原载体的作用。这些类型的多肽包括白蛋白、血清蛋白、球蛋白、晶状体蛋白、脂蛋白和/或其片段。在一些实施方案中,可以使用合成多肽。免疫原部分或载体还可以是粒子或微粒。免疫原粒子可以是有机的或无机的,多孔的或无孔的。免疫原粒子可以是生物材料如细胞和微生物,还可以包含有机和无机聚合物、脂质体、胶乳、磷脂囊泡、脂质体、阳离子脂质体、阴离子脂质体、脂蛋白、脂质聚合物等。因此,本发明所述的表位肽可以用于产生具有对cTnI亲和力的抗体。
在一些实施方案中,可以通过当用于本文中时,"特异性结合"可以指抗体选择性地或优先地结合所述氨基酸序列。可以使用标准测定法如表面等离子共振技术(例如)确定结合亲和力。在一些实施方案中,第一组抗体和/或第二组抗体可以是与针对本文描述的心肌肌钙蛋白I表位的抗体竞争结合相同的抗原。在一些实施方案中,与参比抗体“竞争结合抗原的抗体”是指例如在竞争测定中阻断50%以上的所述参比抗体与其抗原的结合;或者参比抗体在竞争测定中阻断50%以上的该抗体与其抗原的结合。
在一些实施方案中,可以使用任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定、动物模型等检测本发明抗体的效果如结合活性和/或交叉反应性。在一些实施方案中,所述测定可以包括例如ELISA,FACS结合测定,Biacore,竞争性结合测定等。在一些实施方案中,例如在ELISA或FACS中本发明的抗体(或其抗原结合片段)与抗原结合的EC50值可以为例如1μM-1pM,例如1nM-1pM,例如100pM-1pM。在一些实施方案中,本发明抗体用于检测血液心肌肌钙蛋白I抗原的反应效价高于105,包括例如高于106,例如高于107。
在一些实施方案中,试剂盒中的第一组抗体和/或第二组抗体可以分别用作包被抗体(或称为捕获抗体)和标记抗体,例如第一组抗体为包被抗体,第二组抗体为标记抗体,或者第一组抗体为标记抗体,第二组抗体为包被抗体。优选地,在一些实施方案中,第一组抗体为标记抗体,第二组抗体为包被抗体(或称为捕获抗体)。在一些实施方案中,还可以使用备选抗体作为包被抗体或标记抗体。
在一些实施方案中,所述包被抗体结合至固相。在一些实施方案中,所述包被抗体可以用于包被固相支持物。在一些实施方案中,固相支持物没有特别限制,其可以是例如磁性颗粒,胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片,任选地所述试剂盒包括或制备成免疫层析试纸条或检测卡。在一些实施方案中,所述标记抗体用可检测标记物标记,例如用荧光标记物标记,例如通过接头如生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白与荧光标记物标记。
在一些实施方案中,本文中的术语“抗体”在最广义上使用,其可以包括全长单克隆抗体,双特异性或多特异性抗体,嵌合抗体,以及抗体的抗原结合片段,只要它们展示所需的生物学活性,如特异性结合hs-cTnI抗原。“抗体片段”包括全长抗体的部分,优选地其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab,Fab',F(ab')2,Fd,Fv,dAb,互补决定区(CDR)片段,单链抗体(例如,scFv),双价抗体或结构域抗体。
在一些实施方案中,本发明中使用的可检测标记没有特别限制。在一些实施方案中,所述标记可以包括但不限于金属粒子,如胶体金,荧光标记,发色团标记,电子致密标记,化学发光标记,和放射性标记,以及间接标记如酶或配体,例如,通过酶促反应或分子相互作用来间接检测。在一些实施方案中,示例性标记包括但不限于放射性同位素,荧光团,罗丹明及其衍生物,荧光素酶,荧光素,辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖类氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,生物素/抗生物素蛋白,生物素/链霉抗生物素蛋白,自旋标记,噬菌体标记等等。
在一些实施方案中,本发明的试剂盒包括适合进行免疫测定的试剂。在一些实施方案中,本发明的试剂盒可以用于进行免疫测定,例如ELISA,间接免疫荧光测定IFA,放射免疫测定RIA以及其它非酶联抗体结合试验或方法。
在一些实施方案中,例如在ELISA实验方案中,可以将cTnI抗体包被固相如磁珠,捕获样品中的cTnI抗原,然后用标记的抗体与结合在反应板上的抗原再次结合,经显色后读取结果。在一些实施方案中,本发明的cTnI抗体可以用于包被固相如磁珠或用作标记的第二组抗体。在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段固定到一个表面上,例如固相支持物上,例如塑料、膜如硝酸纤维素膜、玻璃、磁珠或金属支持物。在一些实施方案中,来自受试者的样品与所述固相支持物接触,然后接触带有可检测标记的抗体指示剂显色。在一些实施方案中,可以采用封闭剂如牛血清白蛋白、奶粉溶液、明胶、PVP、Superblock封闭非特异性位点,因此減少非特异性结合造成的背景。在一些实施方案中,可以采用稀释剂,如应用BSA和磷酸缓冲盐液(PBS)/吐温稀释抗血清,有助于减少非特异性背景。
在本文中,来自受试者的样品可以包括健康或病理状态的生物组织、细胞或体液,例如血液样品,例如血浆、血清、血制品,例如***或***分泌物。
在一些实施方案中,本发明提供用于检测心肌肌钙蛋白I的第一组抗体和第二组抗体的组合,以及提供它们在制备检测心肌肌钙蛋白I的试剂盒中的用途。在一些实施方案中,本发明提供包含本文描述的氨基酸片段表位的免疫原性多肽的组合,以及它们用于制备检测心肌肌钙蛋白I的抗体的用途。在一些实施方案中,本发明提供制备检测心肌肌钙蛋白I的抗体的方法,所述方法包括将包含本文描述的氨基酸片段表位的免疫原性多肽分别免疫动物,从而制备检测心肌肌钙蛋白I的抗体如单克隆抗体。在一些实施方案中,本发明鉴定的表位(可以通过例如化学法人工合成)可以与适当的载体蛋白连接,用于免疫动物制备抗体如单克隆抗体。在一些实施方案中,适当的载体蛋白是本领域技术人员已知的,其可以是例如KLH和BSA等。在一些实施方案中,本发明的试剂盒可以包含上述第一组抗体和第二组抗体。
在一些实施方案中,本发明提供包含本文描述的氨基酸片段表位的免疫原性多肽在制备检测心肌肌钙蛋白I的试剂或试剂盒中的用途。
在一些实施方案中,本发明提供实时监测cTnI的方法、用途以及相关试剂盒。在一些实施方案中,所述方法可以包括将样品与包被于固相上的至少一种cTnI抗体或其片段接触形成免疫复合物;检测复合物的存在,以确定所述样品中cTnI的存在。在一些实施方案中,所述方法可以包括将样品与包被于固相上的至少一种cTnI抗体或其片段接触形成免疫复合物;向产生的复合物中添加与可检测标记连接的第二cTnI抗体;和检测产生的信号,以确定所述样品中cTnI的存在和/或含量。在一些实施方案中,本发明提供用于所述方法的试剂盒,其包含1)包含包被于固相上的至少一种cTnI抗体的容器。在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包含与可检测标记连接的第二cTnI抗体。在一些实施方案中,所述至少一种cTnI抗体为cTnI的单克隆抗体。
在一些实施方案中,本发明提供了一种包含磁珠或试纸条的试剂盒。在一些实施方案中,本发明的试剂盒可以包括适合机械能化学发光检测的试剂。在一些实施方案中,本发明的试剂盒可以利用化学发光全自动仪器高通量、快速准确地检测cTnI,缩短检测时间,快速的出检验结果。
在一些实施方案中,本发明包括标记在磁珠或试纸条上抗体。在一些实施方案中,本发明的试剂盒可以利用磁珠或试纸条为固相,将抗体直接包被在磁珠或试纸条上,采用双抗体夹心法原理检测cTnI,提高检出率。
在一些实施方案中,本发明可以采用磁珠或试纸条为检测载体。在一些实施方案中,本发明可以通过化学发光全自动仪器快速准确地检测cTnI。在一些实施方案中,可以利用双抗夹心原理制备试剂盒。例如,在一些实施方案中,样品中的靶标首先被标记在磁珠上的心肌肌钙蛋白I抗体捕获。在一些实施方案中,可以再加入标记抗体,就可以形成捕获抗体-靶标-标记抗体复合物。在一些实施方案中,洗板加入激发液,用化学发光全自动仪器测量发光值,发光值与样品中的抗靶标总浓度呈正相关,与临界值或标准曲线相比较,从而判断阴阳性和/或含量。
本发明具备下述有益效果:
1.本发明提供了一种超敏心肌肌钙蛋白蛋白(hs-cTnI)检测方法和试剂盒,可以利用多表位抗体配对识别抗原上的多个表位,解决现有技术检出率低,反应时间长,操作繁琐等技术问题。
2.本发明可以采用标记抗体和包被抗体的不同组合,例如标记抗体可以采用13-29aa这个抗体表位进行标记,包被抗体可以采用27-39aa、41-49aa、85-92aa这3个抗体表位进行混包,利用多表位抗体能够对抗原的多个表位进行识别,降低漏检的风险,提高检出率。
具体实施方式
下面主要结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。提供以下实施例以说明本发明的实施方案,并非意在限制本发明。本发明可以任选包括未通过实施例示出的实施方案。
一、心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备
1.免疫动物:取8~12周龄与骨髓瘤细胞同种系的BALB/c小鼠,用与等量弗氏完全佐剂充分混匀的cTnI抗原(SEQ ID NO:1)以100μg抗原蛋白质/只小鼠,注入小鼠腹腔内,每隔2周用与等量弗氏不完全佐剂充分混匀的cTnI抗原以100μg抗原蛋白质/只,多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法),滴度在1∶2000以上者可用于与骨髓瘤细胞融合,融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫,剂量为50μg/只。
cTnI抗原序列:
ADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQELEREAEERRGEKGRALSTRCQPLELAGLGFAELQDLCRQLHARVDKVDEERYDIEAKVTKNITEIADLTQKIFDLRGKFKRPTLRRVRISADAMMQALLGARAKESLDLRAHLKQVKKEDTEKENREVGDWRKNIDALSGMEGRKKKFES(SEQ ID NO:1)。
2.饲养细胞的制备
BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞用作饲养细胞。在融合前1天,将BALB/c小鼠脱颈处死,75%酒精全身浸泡,超净台内,无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤,暴露腹膜,用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL,反复冲洗,回收冲洗液,1000rpm,离心5分钟,留沉淀,用RPMI 1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液)重悬,调整细胞浓度1×105个/mL,加入96孔板,150μL/孔,37℃,5%CO2培养过夜。
3.免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天,在无菌条件下取出脾脏,置于平皿中,RPMI1640基础培养液冲洗一次,放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤,制成细胞悬液。离心,弃上清,RPMI 1640基础培养液重悬,如此重复三次,计数。
4.细胞融合
(1)取40mL HAT培养液,15mL DMEM无血清培养液和1mL 50%PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温;
(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)(2-5×107)、上述免疫脾细胞(108)悬液加入50mL离心管中混匀,并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟,倒尽上清液,混匀;
(3)将离心管置于37℃预温的水中,取0.7mL预温的50%PEG溶液,静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液;
(4)补加DMEM无血清培养液至40mL,离心10分钟,倒尽上清液。加40mL含15%~20%胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀,滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中,每孔2滴,置于37℃、7%CO2的培养箱中培养;
5.杂交瘤细胞的选择培养
免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞,经PEG处理后,形成多种细胞成分的混合体,其中包括未融合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞;骨髓瘤细胞的共核体和免疫脾细胞的共核体,以及骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的导核体。仅后者才能形成杂交瘤细胞。为此,在这多种细胞混合体中必须除去未融合的细胞和同种融合的共核体,并选择出真正的杂交细胞。因此,在细胞融合后第1,3,5,7天用前述的HAT培养液换液培养;
6.特异性抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化
吸取每个培养孔的上清液,用间接ELISA法检测出培养液中含cTnI的特异性抗体的培养孔。采用有限稀释法使杂交瘤细胞克隆化。经过培养后单个细胞可增殖为同源性细胞克隆;通过反应性筛选共得到33株稳定分泌抗cTNI单克隆抗体的细胞株,其效价均在105~107之间。
反应性筛选
在室温下,在搅拌时微量滴定板(Nunc,Maxisorb)用100μl/孔含2.5μg/ml人cTNI(作为抗原)的包被缓冲液(包被缓冲液,产品目录号0726 559,Scil Diagnostics,GmbH)包被1小时。包被后处理在PBS缓冲液和1%单克隆抗体中进行孵育30分钟。随后,用洗涤缓冲液进行洗涤。在室温下,在搅拌时将100μl/孔抗体样品孵育1小时。然后用洗涤溶液再洗涤2次。然后在室温下,在搅拌时再与100μl/孔按1:40000用PBS缓冲液稀释的检测抗体过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG()孵育1小时。用洗涤缓冲液再次洗涤后,用常规方法测定过氧化物酶活性(例如用,室温30分钟,用ELISA读板器读取405nm的消光值的变化,单位为mU),上述33株单克隆细胞株分泌的抗体均有较好的反应性。
二、抗体结合表位鉴定
采用不同种cTNI短肽抗原分别包被微孔,以PBS+20%NBS为稀释液,稀释单抗为一抗浓度到1ug/ml,以羊抗鼠IgG-HRP为二抗,依据各单抗对不同抗原的反应情况来确定单抗表位。经统计,上述33株抗体分别是针对cTNI抗原的如下表位:
抗cTNI抗体表位配对:以针对不同表位抗体效价最高的抗体为配对组合,通过免疫层析试纸卡检测99百分位CV(现有技术普遍为10%以上)。
免疫层析试纸卡的制备方法如下:
1、结合垫的制备
清洗:取50μL荧光微球至1.5mL离心管中,加入1mL 0.01M MES缓冲液中,震荡混匀,15000r/min离心15min,弃上清,加入1mL 0.01M MES缓冲液,超声打散微球;重复此步骤三次,已达到清洗微球的目的,最后得到清洗后的微球液;
(2)活化:向清洗后的1mL微球液中,加入250μL EDC溶液,避光活化2h,15000r/min离心15min,弃上清,加入1mL 0.01M MES缓冲液,超声打散微球,15000r/min离心15min,弃上清;
(3)标记:加入1mL 0.05M硼酸盐缓冲液,超声打散,加入20μL心肌肌钙蛋白I单克隆抗体混匀,避光反应2h;
(4)封闭1:加入100μL 1M甘氨酸溶液,避光反应30min;
(5)封闭2:加入100μL 10%BSA溶液,避光反应30min;
(6)离心复溶:15000r/min离心15min,弃上清,加入100μL稀释液,超声打散微球;
(7)喷涂:将标记好的复合物,按照3μL/cm喷至玻璃纤维素膜上;
(8)干燥:将喷有标记物的玻璃纤维素膜放入37℃鼓风干燥箱中,干燥3-4h;将干燥后的结合垫放入干燥器中。
以上步骤中所述荧光微球为直径200nm的含有高亮稀土染料的羧基聚苯乙烯微球。
所述EDC为(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐),是一种可溶于水的碳二亚胺。
2、样品垫制备
(1)配制pH 7.4的PBS:称取8g NaCl,5.8g Na2HPO4,0.2g KCl,0.2g KH2PO4溶于1L纯化水中,即为pH 7.4的PBS;
(2)配制样品垫处理液:分别称取5g蔗糖,5g PVP-K30,5g PEG-20000,量取20mlTween-20,至1L pH 7.4的PBS中,磁力搅拌器上混匀待用;
样品垫的处理:将玻璃纤维素膜装于自封袋中,80mL/张,加入样品垫处理液,浸泡30min;
样品垫的干燥:将充分浸泡过的玻璃纤维素膜放入37℃鼓风干燥箱中,干燥8-10h;放入干燥器中待用。
3、检测垫的制备
所述检测垫是指包被了一条横向对照线(C线)和一条横向检测线(T线)的硝酸纤维素膜,C线与T线间距是3-4mm。从样品垫到吸水垫方向依次为T线和C线。C线包被能够捕捉游离的荧光微球-抗体复合物的第二抗体,具体实施步骤是将C线第二抗体用包被工作液稀释成1.0mg/ml,倒吸至划膜机管线中,按照2.2μL/cm划出,放入37℃鼓风干燥箱中,干燥过夜;T线包被特异性结合心肌肌钙蛋白I多个不同表位的混合抗体,具体实施步骤是将多个表位的混合抗体用划膜工作液均稀释至1.0mg/mL,倒吸至划膜机管线中,按照2.2μL/cm划出,放入37℃鼓风干燥箱中,干燥过夜;放入干燥器中待用。所述检测垫是样品中有效成份与固定在膜上的活性物质发生特异性结合的区域。
4、组装检测试纸卡
将样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫按从左到右的顺序组装好,然后用切割机切成试纸条,放入塑料卡槽中,组装成品试纸卡。
5、样品的测试
将待测样本加入到检测试纸卡的加样口后,用荧光免疫分析仪进行荧光判断,首先读取的是C线荧光强度,然后是T线荧光强度,检测出的两条线的荧光强度以峰面积体现,并通过仪器自身的计算软件计算T/C值(T峰面积/C峰面积),拟合至已设定的标准曲线,荧光免疫分析仪自动换算出相应待检样本中cTnI的浓度值。
将用本发明的试纸卡测定的cTnI的浓度值与用贝克曼公司(Beckman Accu TnI)的产品测定的cTnI的浓度值进行比较,比较数据如下表。
第99百分位1
第99百分位2
第99百分位3
实验数据汇总如下:
以27-39,13-29,85-92,41-49短肽桥联蛋白后作为免疫原免疫得到相关表位的抗体,在反应效价均在105~107之间的抗体做配对得到的99百分位CV值也在10%以内。
另外,商购获得分别特异性结合心肌肌钙蛋白I的第13-29位氨基酸片段、第27-39位氨基酸片段、第41-49位氨基酸片段、第85-92位氨基酸片段的单克隆抗体(均购自菲鹏生物股份有限公司,内部货号分别为cTnI-Mc132#,cTnI-Mc133#,cTnI-Mc134#和cTnI-Mc139#,这些商购抗体的反应效价均在105~107之间)。以这些商购抗体配对进行上述检测,结果也显示,所述配对得到的99百分位2CV值在10%以内(分别以cTnI-Mc132#,cTnI-Mc133#,cTnI-Mc134#和cTnI-Mc139#之一配其它三种单克隆抗体,得到的99百分位2CV值分别为5.2%,4.8%,3.9%和4.6%)。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种心肌肌钙蛋白I检测试剂盒,其包括用于检测来自受试者样品中心肌肌钙蛋白I的第一组抗体和第二组抗体,其中第一组抗体包括抗体1至抗体4中的至少一种,第二组抗体包括抗体1至抗体4中除了第一组抗体之外的其他抗体,抗体1至抗体4分别为能特异性结合心肌肌钙蛋白I的下述氨基酸片段的抗体:
抗体1:特异性结合心肌肌钙蛋白I的第13-29位氨基酸片段;
抗体2:特异性结合心肌肌钙蛋白I的第27-39位氨基酸片段;
抗体3:特异性结合心肌肌钙蛋白I的第41-49位氨基酸片段;
抗体4:特异性结合心肌肌钙蛋白I的第85-92位氨基酸片段。
2.权利要求1所述的试剂盒,其中第一组抗体和第二组抗体选自下组:
1)第一组抗体包括抗体1,并且第二组抗体包括抗体2、抗体3和抗体4;
2)第一组抗体包括抗体2,并且第二组抗体包括抗体1、抗体3和抗体4;
3)第一组抗体包括抗体3,并且第二组抗体包括抗体1、抗体2和抗体4;
4)第一组抗体包括抗体4,并且第二组抗体包括抗体1、抗体2和抗体3;
优选地第一组抗体为标记抗体,第二组抗体为包被抗体。
3.权利要求1或2所述的试剂盒,其中所述抗体的反应效价高于105,包括例如高于106,例如高于107。
4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒,其中所述标记抗体用可检测标记物标记,例如金属粒子,如胶体金,荧光标记,发色团标记,电子致密标记,化学发光标记,放射性标记,酶标记,例如放射性同位素,荧光团,罗丹明,荧光素酶,荧光素,辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖类氧化酶,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,生物素/抗生物素蛋白,生物素/链霉抗生物素蛋白,自旋标记,噬菌体标记,例如吖啶酯标记,例如通过接头如生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白添加荧光标记如吖啶酯标记。
5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒,其中所述包被抗体连接至固相,例如磁性颗粒,胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片,任选地所述试剂盒包括免疫层析试纸条或检测卡。
6.权利要求1-5任一项所述的试剂盒,其中所述样品包括健康或病理状态的生物组织、细胞或体液,例如血液样品,例如血浆、血清、血制品。
7.针对心肌肌钙蛋白I的第一组抗体和第二组抗体的组合,其中第一组抗体和第二组抗体为根据权利要求1-6中任一项定义的抗体。
8.权利要求7所述的第一组抗体和第二组抗体的组合在制备检测心肌肌钙蛋白I的试剂盒中的用途,优选地其中所述试剂盒用于1)对心肌肌钙蛋白含量进行动态检测,例如用于进行实时监测,和/或2)诊断早期急性心肌损伤,包括例如排除或预测早期急性心肌损伤。
9.一种制备抗体的方法,所述方法包括:
1)使用下述氨基酸片段1-4作为抗原或半抗原免疫动物:
片段1:心肌肌钙蛋白I的第13-29位氨基酸片段;
片段2:心肌肌钙蛋白I的第27-39位氨基酸片段;
片段3:心肌肌钙蛋白I的第41-49位氨基酸片段;
片段4:心肌肌钙蛋白I的第85-92位氨基酸片段;和
2)从所述动物获得分别特异性结合所述片段1-4的抗体。
10.心肌肌钙蛋白I的第13-29位氨基酸片段,心肌肌钙蛋白I的第27-39位氨基酸片段;心肌肌钙蛋白I的第41-49位氨基酸片段和/或心肌肌钙蛋白I的第85-92位氨基酸片段在制备检测心肌肌钙蛋白I的试剂或试剂盒中的应用。
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