CN115819548A - 一种检测炎症相关疾病的标志物和方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种检测炎症相关疾病的标志物和方法。本申请的标志物能稳定存在于离体的体液样品中而不会聚集在细胞膜上,因此,检测结果十分准确,能广泛用于炎症相关疾病的医学检测,具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及一种检测炎症相关疾病的标志物和方法,属于生物技术领域。
背景技术
炎症,是机体对于刺激的一种防御反应,表现为红、肿、热、痛和功能障碍,其可以是感染引起的,也可以是非感染引起的。其中,感染引起的炎症如感染性疾病,无论是细菌性的、病毒性的还是其他来源的,均对人类健康造成急性和慢性的挑战。病毒包括DNA病毒和RNA病毒。细菌包括***和革兰氏阴性细菌,并且可包括支原体(缺少细胞壁的细菌)。除了致病细菌外,其他微生物如酵母、真菌和其他小的致病生物也可以引起一些感染性疾病。
目前,在临床上多采用检测标志物来检测炎症相关的疾病(如脓毒症),但这些检测标志物对感染缺乏特异性:例如CRP是在一些病理性情况下在患者血清中出现的一种急性期反应蛋白,由肝脏合成并分泌,但除细菌感染外,病毒感染、急性排异反应、心血管***疾病及手术都可引起CRP的升高,因而CRP对感染缺乏特异性,且CRP浓度的升高与临床预后无关;临床上应用的其他标志物如PCT,IL-6,SAA等也普遍存在类似的缺陷,导致现有的标志物对于包括脓毒症在内的炎症相关疾病的诊断或治疗的作用有限。
发明内容
鉴于上述技术问题,本申请一方面提供了一种炎症相关疾病的标志物,该标志物为GSDMD-CT或其片段、GSDMD-CT或其片段的修饰变体、和/或GSDMD-CT或其片段的衍生物。在一种实施方式中,GSDMD-CT片段的序列如SEQ ID NO.4所示。在一种实施方式中,GSDMD-CT的序列如SEQ ID NO.3所示。第二方面,本申请提供了编码上述标志物的核酸。第三方面,本申请提供了含有上述标志物或其编码核酸的生物材料,该材料为表达盒、重组载体、重组微生物、或转基因细胞系的一种或多种。第四方面,本申请提供了与上述的标志物、上述的核酸、和/或上述的生物材料结合的配偶体。
在一种实施方式中,配偶体包括核酸适配体、肽适配体、肽体、拟似物、噬菌体、抑制剂、化合物、和/或抗体。在一种实施方式中,抗体为包括纳米抗体、单一特异性抗体、和/或多克隆抗体。在一种实施方式中,配偶体带有能被识别的标记;优选的,所述标记可以是染料、表位标签、荧光部分、发光部分、化学发光部分、酶标记、磁标记、顺磁标记、对比剂、纳米颗粒、放射性同位素、生物素、链霉亲和素和猝灭剂。
本申请还提供了一种试剂盒或组合物,其包含前述的标志物、前述的核酸、前述生物材料、和/或前述的配偶体。在一种实施方式中,试剂盒或组合物还包括与其他标志物结合的配偶体、和/或用于定性或定量检测分析的试剂。在一种实施方式中,定性或定量检测为核酸检测、免疫检测、化学检测、和/或细胞计数检测中的一种或多种。在一种实施方式中,其他标志物包括GSDMD-CN、GSDMD-NT、PCT、IL-6、SAA、CRP、或IL-1β中的一种或多种。在一种实施方式中,试剂盒或组合物进一步包含用作标准和用于校准的制剂或药物。在一种实施方式中,用作标准和用于校准的制剂或药物包括GSDMD-CN、GSDMD-NT、GSDMD-CT、或它们的抗体。
本申请还提供了一种用于测定或抑制细胞焦亡程度、预防或诊断炎症相关疾病、治疗炎症相关疾病、评估炎症相关疾病的严重程度或其患者预后状况、或监测炎症相关疾病的进展的***或装置,所述***或装置包括使用前述的标志物、前述的核酸、前述的生物材料、前述的配偶体、和/或前述的试剂盒或组合物。
本申请提供了前述的标志物、前述的核酸、前述生物材料、前述的配偶体、和/或前述的试剂盒或组合物在制备测定或抑制细胞焦亡程度、预防或诊断炎症相关疾病、治疗炎症相关疾病、评估炎症相关疾病的严重程度或其患者预后状况、或监测炎症相关疾病的进展的药物、化合物、组合物或制剂中的用途。
本申请提供了前述的标志物、前述的核酸、前述生物材料、前述的配偶体、和/或前述的试剂盒或组合物在测定或抑制细胞焦亡程度、预防或诊断炎症相关疾病、治疗炎症相关疾病、评估炎症相关疾病的严重程度或其患者预后状况、或监测炎症相关疾病的进展中的用途。
本申请提供了一种测定或抑制细胞焦亡程度、预防或诊断炎症相关疾病、治疗炎症相关疾病、评估炎症相关疾病的严重程度或其患者预后状况、或监测炎症相关疾病进展的方法,该方法包括定性或定量检测样品中的标志物或其编码核酸,所述标志物为GSDMD-CT或其片段、GSDMD-CT或其片段的修饰变体,和/或GSDMD-CT或其片段的衍生物。在一种实施方式中,检测采用前述配偶体、和/或前述的试剂盒。在一种实施方式中,样品选自人或者动物的血清、血浆、尿液、血液或脑脊液,也可以为细胞培养液、细胞裂解液。
本申请还提供了一种筛选药物、化合物、组合物或制剂的方法,所述药物、化合物、组合物或制剂用于检测或抑制细胞焦亡程度、预防或诊断或治疗炎症相关疾病、评估其严重程度或其患者预后状况、或监测炎症相关疾病进展,该方法包括采用所述药物、化合物、组合物或制剂特异识别前述标志物或其编码核酸、和/或前述生物材料。
在一种实施方式中,药物、化合物、组合物或制剂包括与前述的标志物、前述的核酸、和/或前述生物材料结合的配偶体。在一种实施方式中,配偶体包括核酸适配体、肽适配体、肽体、拟似物、噬菌体、抑制剂、和/或抗体。在一种实施方式中,抗体包括纳米抗体、单一特异性抗体、和/或多克隆抗体。
在一种实施方式中,炎症相关疾病包括由细胞焦亡引起的、或与细胞焦亡相关的细胞炎症坏死的病症;优选的,所述炎症相关疾病为:感染引起的炎性疾病,特别是细菌感染引起的炎症、病毒感染引起的炎症,例如常见的肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿***感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等及其感染的并发症、外科手术、创伤、多发伤、灼伤、败血症、脓毒血症和脓毒性休克等;自身免疫性疾病,例如关节炎、痛风、硬皮病等;慢性疾病如糖尿病、慢性阻塞性支气管、白血病、再生障碍型贫血和***等;其他疾病如癌症、糖尿病、肾病、老年痴呆等疾病等中的一种或多种。
本申请还涉及GSDMD-CT、和/或其片段、和/或其修饰变体、和/或其衍生物与其他标志物联合的组合物,以及这些物质在医学中的用途,尤其是在炎症相关疾病诊断或治疗中的用途、或者在筛选预防、诊断或治疗炎症相关疾病中的药物的用途。
在实施方式中,本申请还提供用于测试多个或单个小体积临床样品或其等分试样中多种标志物中的一种或多种的存在的***、方法和装置。在实施方式中,所述***、方法或装置是服务点(POS)***、方法或装置。标志物可指示炎症性疾病;在某些实施方式中,标志物可指示感染性疾病;在某些实施方式中,标志物可指示脓毒症。
在一些实施方案中,本申请的标志物单独或与其他标志物联合使用来(i)检测样品中的一种或更多种蛋白质或核酸,并对其水平进行定量,(ii)将定量的水平与对照群体中蛋白质或核酸的对照水平比较,(iii)作出判断,与对照群体相比,该样品对应的个体是否患有炎症相关疾病、或者患有炎症相关疾病的风险或程度。
附图说明
通过阅读对下文优选实施方式的详细描述,各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的,而并不认为是对本申请的限制。
图1显示的是特异性结合GSDMD-CT的N端氨基酸序列的抗体应用的示意图。
图2显示的是特异性结合GSDMD-CT的N端氨基酸序列的抗体与针对GSDMD-CT其它部分或片段的抗体一起应用的示意图。
图3显示的是针对GSDMD-CT的非N端的氨基酸序列的抗体应用的示意图。
图4显示的是表1中编号为#25,#44,#50的抗体与GSDMD-CT的N端氨基酸序列具有特异性反应。
图5显示的是表1中编号为#25,#44,#50的抗体的竞争抑制实验。
图6显示的是GSDMD-CT化学发光检测体系标准曲线。
图7显示的是GSDMD-CT在HC、non-SIRS和炎症中的表达水平。
图8显示的是GSDMD-CT在HC、non-SIRS、炎症和感染性炎症中的表达水平。
图9显示的是GSDMD-CT、PCT、CRP对炎症(SIRS)的诊断效能ROC。
图10显示的是GSDMD-CT、PCT、CRP对脓毒血症(Sepsis)的诊断效能ROC。
图11显示的是PCT与GSDMD-CT表达呈正相关。
图12显示的是CRP与GSDMD-CT表达弱相关。
图13显示的是采用不同标志物连续监测一个受试者的感染情况。
图14显示的是革兰氏阴性细菌和***感染患者样本中GSDMD-CT浓度含量的比较。
图15显示的是以SEQ ID NO.4的抗原制备获得的特异性单抗。
具体实施方式
以下实施例仅用于更加清楚地说明本申请的技术方案,因此只作为示例,而不能以此来限制本申请的保护范围。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同;本文中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请;本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含。
在本文中提及“实施例”意味着,结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例,也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是,本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
在本申请实施例的描述中,术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B这三种情况。另外,本文中字符“/”,一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本文中提及“一种或多种”或“至少一种”表示存在该要素的至少一个;可以存在多个这样的要素,除非另有明确具体的限定。
如说明书和随附的权利要求书中所使用,除非上下文中明确规定,否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。
如本文所用,术语“细胞焦亡”是GSDMD(GSDMD-CT)蛋白在活化的炎症小体、胞质内脂多糖等刺激下被caspase-1/4/5/11等酶切割产生N端和C端残基,其中N端能够形成寡聚体,在细胞膜上形成穿膜孔道,诱发细胞的炎症性死亡,即为焦亡。
在医学背景下,“诊断”是通过评价一个或多个因素来鉴定一种或多种健康情况(包括疾病和/或损伤)以鉴定或确定疾病性质和/或原因的行为或过程,所述因素可以包括患者病史、身体检查、评述症状和评述来自一项或多项实验室检验的数据。在本申请中,如果不另外定义,则它们不仅包括鉴定特定疾病意义上的诊断,而且还包括筛选那些处于疾病风险之中或怀疑有某种疾病的无症状的或高风险的人群,或者监测那些未治疗的或经治疗的患者,以及监测治疗过程并进行早期预测和/或存活率预测。
如本文所用,术语“治疗”指减少或减轻疾病发作和/或症状的进展、严重程度和/或持续时间。
本文中使用的术语“预防”指的是相对于未治疗的对照样本能降低治疗的样本的失调或病症的发生,或者相对于未治疗的对照样本能延迟失调或病症的一种或多种症候的发生、或者能减轻失调或病症的一种或多种症候的严重程度。
如本文所用,“监测”涉及跟踪那些已经被诊断的疾病、病症、并发症或风险,例如分析疾病的进展、或分析特定治疗对疾病或病症的进展的影响。
如本文所用,“评估”指在疾病的症状或标志物变得明显、或已经显著改变之前,对疾病的病症或并发症进行预判。
如本文所用,“患者”或“个体”或“受试者”指人或动物。
“炎症相关疾病”指炎症性疾病、或具有由细胞焦亡造成的细胞炎症坏死的病症,所述病症包括但不限于:感染引起的炎性疾病,特别是细菌感染引起的炎症、病毒感染引起的炎症、例如常见的肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿***感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等及其感染的并发症、外科手术、多发伤、创伤、灼伤、败血症、脓毒血症和脓毒性休克等;自身免疫性疾病,例如关节炎、痛风、硬皮病等;慢性疾病如糖尿病、慢性阻塞性支气管、白血病、再生障碍型贫血和***等;其他疾病如癌症、糖尿病、肾病、老年痴呆等疾病等中的一种或多种。
本申请范围内的“感染”是指由潜在的病原剂/病原体、生物体和/或微生物侵入正常无菌组织或体液引起的病理过程,例如真菌、细菌、病毒和/或寄生虫的感染。感染可以是局部感染或全身感染。此外,遭受感染的受试者可以同时遭受一种以上的感染源。例如,受试者可以遭受病毒感染和真菌感染;细菌感染和真菌感染,以及细菌感染、真菌感染和病毒感染。
如本文所用,术语“对照群体”或“对照样本”可以是阴性对照群体或阳性对照群体。在一些实施方案中,对照群体是患有与受检个体相同疾病的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是患有与受检个体相同疾病并且对该疾病不出现危象反应和/或威胁生命反应的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是正常个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是这样的个体群体,其中对照群体的大部分成员并不患有与受检个体相同的疾病。在一些实施方案中,上述人群是无偏人群。
“标志物”不限于某种形式,可以为生物标志物或体液标志物,可以为蛋白、多肽或抗体。
“GSDMD-CN”或“全长GSDMD”指同时具有氨基末端和羧基末端的完整的GSDMD(Gasdermin D)蛋白。本申请也涉及完整GSDMD蛋白的修饰变体和/或完整GSDMD蛋白的衍生物。“GSDMD-CN片段”是指包含于“GSDMD-CN”中的一段多肽,但可以不是“GSDMD-NT”或“GSDMD-CT”。本申请也涉及“GSDMD-CN片段”的修饰变体和/或其衍生物。
如本文所用,“GSDMD-NT”指GSDMD的N端,其具有打孔活性,并能在细胞膜上形成聚合体,使细胞随后出现体积膨胀和细胞膜向胞外吐泡的现象,最终导致细胞焦亡。
如本文所用,“GSDMD-CT”是指GSDMD的C端,是GSDMD被caspase-1/4/5/11等酶切割后释放出的C端结构域,例如SEQ IDNO.3所示,或者与SEQ ID NO.3有50%-60%以上同源性、61%-70%以上同源性、或71%-80%以上同源性、或81%-90%以上同源性、或91%-99%以上、或100%同源性的氨基酸序列。优选的,这些序列表征的GSDMD的羧基端与SEQ IDNO.3表征的“GSDMD-CT”具有共同的免疫反应性。本申请的方案也适用于检测“GSDMD-CT”的修饰变体和/或其衍生物。
“GSDMD-CT片段”是指包含于“GSDMD-CT”中的一段多肽。“GSDMD-CT片段”包括自SEQ ID NO.3的第1位氨基酸的相应位置至第N位氨基酸的相应位置的氨基酸,例如SEQ IDNO.4所示的氨基酸片段;或者与本段前述“GSDMD-CT片段”的氨基酸序列有50%-60%以上同源性、61%-70%以上同源性、或71%-80%以上同源性、或81%-90%以上同源性、或91%-99%以上、或100%同源性的氨基酸序列,优选的,这些序列表征的GSDMD的羧基端与前述“GSDMD-CT片段”具有共同的免疫反应性。本申请的方案也适用于检测“GSDMD-CT片段”的修饰变体和/或其衍生物。
如本文所使用,术语“免疫检测”或“免疫分析”是指通过免疫学原理来检测、鉴别、表征、或量化样品中的氨基酸靶标(可以是小肽、多肽、蛋白质或蛋白质大分子)。免疫检测例如包括使用诸如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定等技术的直接或竞争性结合测定。免疫检测通常使用抗体或抗体片段,但还可以使用以高特异性结合靶分子的结合蛋白或载体蛋白。在一种实施方式中,免疫分析法是固相免疫分析法,例如,一种使用固定的第一特异性结合剂和第二溶解的特异性结合剂的异相免疫分析法,所述第二溶解特异性结合剂载有可检测的标志物或可通过与标记过的标志物分子反应而被选择性地标记。优选的,所述免疫分析法是均相免疫分析法。
如本文所使用,“样品”或“生物样品”或“临床样品”是指从受试者获得的流体、组织、分泌物或***物的样品,包括但不限于血液,血清,血浆,唾液,痰液,尿,胃液,消化液,泪液,汗液,粪便,***,***液,间质液,源自肿瘤组织的流体,眼内液,粘液,耳垢,油,腺体分泌物,脊髓液,皮肤,来自颅骨内的脑脊液,来自鼻拭子、咽喉拭子、口拭子(例如,颊拭子)、***拭子或鼻咽洗液的组织、流体或物质,活检流体或材料,胎液,羊水,脐带血,淋巴液,腔液,脓液,从受试者获得的微生物群,胎粪,乳汁或者其他分泌物或***物的样品。
如本文所用,术语“配偶体”是指能选择性地与标志物结合,包括但不限于核酸适配体(aptamer)、肽适配体、肽体(peptibody)、拟似物(mimetic)、噬菌体、抑制剂、化合物、抗体等。
术语“抗体”涵盖单克隆抗体和多克隆抗体并且还涵盖抗体的抗原结合片段。所述“抗体的抗原结合片段”(或简化为“抗体部分”或“抗体片段”)指全长抗体的一种或多种片段,所述片段保留与本申请标志物特异性结合的能力。“抗原结合片段”的例子包括(i)Fab片段,一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,一种包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(v)由VH结构域组成的dAb片段;和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。另外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码,但是使用重组方法,可以将它们通过合成接头连接,所述接头能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生,在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单价分子,称作单链Fv(scFv)。这种单链抗体也意在涵盖于术语“抗体的抗原结合片段”范围内。使用本领域技术人员已知的常规技术,获得这些抗体片段,并且利用与完整抗体相同的方式筛选所述片段。抗体可以是单一特异性的,例如,单克隆抗体或其抗原结合片段。术语“单一特异性”指对特定目标(例如,表位)显示单一结合特异性和亲和力。因此,“单一特异性抗体”包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”,如本文所用,它们指单一分子组成的抗体或其片段的制备物。
在一些实施方式中,本申请的抗体特异性结合GSDMD-CT的N端的氨基酸序列,例如,多肽号#1,即SEQ ID NO.4:GVPAEGAFTEDFQGLR(如图1)。此类抗体可以建立竞争抑制试剂盒,通过免疫学竞争抑制实验可以用于检测GSDMD-CT的浓度。另外,这类抗体也可以与针对GSDMD-CT其它部分或片段的抗体一起(如图2)组成免疫学夹心试剂盒,特异性检测GSDMD-CT,而不与GSDMD-NT及其片段或GSDMD-CN(全长GSDMD)反应。由于GSDMD-CT的浓度与细胞焦亡的程度呈正相关,因而能够用于评估细胞焦亡的程度或炎症程度。
在一些实施方式中,本申请的抗体是针对GSDMD-CT的非N端的氨基酸序列(例如除SEQ ID NO.4:GVPAEGAFTEDFQGLR之外的其他GSDMD-CT部分或片段)的抗体(如图3),这些抗体彼此之间也可以组成抗体配对,来检测GSDMD-CT,以及GSDMD-CN(全长GSDMD)。
术语“特异识别”或“选择性结合”或“特异性结合”当该结合配偶体存在于含有其他分子或生物体的混合物中时,所述抗体也优先结合或识别所述结合配偶体。该结合可经由共价或非共价相互作用或两者的组合来介导。
本发明的优势在于,一方面,GSDMD-CT或其片段可以通过细胞膜上的小孔释放到胞外,例如进入血液中;另一方面,离体的GSDMD-CT或其片段在液体样品中具有超长时间的稳定性——即使在室温下贮存2天以后,血浆和血清中的GSDMD-CT含量依然十分稳定(表3)。因此,GSDMD-CT或其片段非常适于对离体的液体样品进行体外测定,即采用GSDMD-CT或其片段作为标志物来指示细胞焦亡或细胞焦亡的程度不仅准确而且适合在实际应用中检测离体样品。
为了详细展示发明人的技术思路,本申请整体上提供了一种炎症相关疾病的标志物,以及该标志物和与其相关的物质在医学检测和药物筛选中的用途。本申请的标志物为GSDMD-CT或其片段、GSDMD-CT或其片段的修饰变体,和/或GSDMD-CT或其片段的衍生物。本申请的标志物在体外细胞实验、动物实验、人体临床实验等情境下使用。本申请进一步涉及优化的抗GSDMD-CT或抗GSDMD-CT片段的抗体。本申请优选的实施方案中选择人GSDMD-CT或其片段的氨基酸序列的蛋白作为免疫原,也作为校准的目的和作为制备标准溶液。
本申请优选的实施方案中,人GSDMD-CT或其片段的DNA序列通过密码子优化后进行人工合成,然后构建到质粒中,进行人工重组表达、纯化。将它们通过SDS-PAGE进行纯度和分子量控制,冻干成等分试样。在优选的实施方案中,本申请表达的重组抗原蛋白用于生产抗原,将其注入到动物体内以产生针对人GSDMD-CT或其片段的抗体。可采用不同的方法实现这些本领域技术人员所知的该目的。在优选的实施方案中,重组GSDMD-CT或其片段经过大肠杆菌的原核表达,并切掉表达的纯化标签,使最终的表达产物与天然GSDMD-CT或其片段具有相同的氨基酸序列。抗上述重组GSDMD-CT或其片段的抗体在小鼠体内产生。在本申请优选的实施方案中,抗上述重组GSDMD-CT或其片段的小鼠单克隆抗体用传统的单抗制备方法进行融合、筛选、纯化。在优选的实施方案中将抗体带有能够被检测的标记,例如荧光标记,化学发光的标记等。
在优选的实施方案中,通过多肽合成的方法合成的多肽片段(SEQ ID NO.4),在合成时在多肽的C端增加半胱氨酸,用SMCC的方法与KLH,或者OVA,或者BSA偶联,制备成免疫原,免疫动物;或者多肽片段通过EDC的方法KLH,或者OVA,或者BSA偶联,制备成免疫原,免疫动物。抗上述多肽片段(SEQ ID NO.4)以及多肽片段内的表位片段的抗体在小鼠体内产生。在本申请优选的实施方案中,抗上述多肽片段或其片段内的表位片段,优选为:针对多肽片段SEQ ID NO.4而与多肽片段SEQ ID NO.5不反应的抗体。小鼠单克隆抗体用传统的单抗制备方法进行融合、筛选、纯化。在优选的实施方案中将抗体带有能够被检测的标记,例如荧光标记,化学发光的标记等。
在优选的实施方案中,本申请涉及所产生的抗体用于在体液和或细胞培养液样品中检测本申请的标志物,尤其是GSDMD-CT或其片段,以及运用本领域技术人员已知的不同分析法,采用包含一种或多种抗体的试剂盒来检测本申请的标志物。检测抗体与各个分子的结合的方法也为本领域技术人员所已知。所有这类已知的测定形式在本申请标志物如GSDMD-CT或其片段测定的范围内都可使用。例如在本申请的范围内通过快速试验装置例如免疫层析的快速试验装置,所谓的POCT试验来测定。在优选的实施方案中用ELISA、免疫比浊的实验装置。在更优选的实施方案中用化学发光的实验装置,可以实现快速、精确的检测。本申请优选的实施方案公开了所产生的抗上述重组GSDMD-CT或其片段的抗体的免疫检测或分析的用途。本申请的另一优选实施方案公开了这类抗体用于在多种体液及其它生物材料中检测本申请的标志物,尤其是GSDMD-CT或其片段的浓度。在优选的实施方案中重组GSDMD-CT或其片段可在体液中10pg/ml以上的浓度时进行检测。
本申请的优选实施方案公开了所产生抗GSDMD-CT或其片段的抗体用于检测健康个体、感染炎症的个体、和/或有脓毒症的个体的体内的GSDMD-CT或其片段的含量、和用于测定这些个体的细胞焦亡的严重程度,以及用于表征炎症严重程度与细胞焦亡的的正相关关系。优选实施方案还可以检测体液中本申请的标志物,尤其是检测GSDMD-C或其片段的存在和稳定性、以及比较健康对照个体与患有一种或多种炎症相关疾病的患者体内GSDMD-CT或其片段浓度的差别。本申请进一步公开了在炎症相关的疾病状态下体液标志物,尤其是GSDMD-CT或其片段在体液中浓度的显著变化。本申请对至少一个患者样本进行测定。在一些实施方案中,使用自动分析设备或诊断测定法进行测定。在一些实施方案中,通过快速检验来进行测定,尤其是利用单参数或多参数测定。
实施例1重组GSDMD-CT或其片段的表达与合成
按照本领域常规的方法对人GSDMD-CT或其多个片段的DNA序列(如SEQ ID NO.3等)通过密码子优化后进行人工合成,然后构建到质粒中,进行人工重组表达、纯化,切去纯化标签后,使最终表达产物和天然GSDMD-CT或其片段的序列完全相同。将它们通过SDS-PAGE进行纯度和分子量控制、测定浓度、冻干成等分试样,是为免疫原和标准品。或者按照本领域常规的方法,通过多肽合成的方法合成的多肽片段(如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5等),在合成时在多肽的C端增加半胱氨酸,用SMCC的方法与KLH,或者OVA,或者BSA偶联,制备成免疫原,免疫动物;或者多肽片段(SEQ IDNO.4)通过EDC的方法与KLH,或者OVA,或者BSA偶联,制备成免疫原。
实施例2动物免疫
按照本领域常规方法对小鼠进行免疫,初次免疫用完全佐剂和适量抗原免疫小鼠,然后每隔一周用不完全佐剂和适量抗原免疫小鼠。本申请中第3次、第4次免疫后,小鼠眼眶取血,并通过离心得到抗血清,测定小鼠血清的抗体滴度,选择最优滴度小鼠进行细胞融合实验,制备单克隆抗体。
实施例3单克隆抗体的筛选
1、制备过程
细胞融合前3天用免疫原冲击免疫小鼠腹腔,50ug/小鼠的剂量。冲击免疫后,取脾脏与Sp2/0细胞融合,筛选单克隆杂交瘤。具体为将培养中的小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0收集到50ml离心管中。将融合小鼠摘眼球放血处死后,将小鼠浸泡在75%乙醇的烧杯中对小鼠全身进行消毒。然后用高压过的眼科剪子将小鼠左侧肋骨下缘剪开取出小鼠的脾脏。然后使用组织研磨器将脾脏碾碎,使用离心机离心10min,离心机转速为1500rpm。然后用眼科剪子取下小鼠的胸腺同样用组织研磨器将小鼠胸腺组织碾碎,用加样枪将碾碎的小鼠胸腺组织加入15ml离心管中,再加入2ml HAT、1ml HT混匀。脾脏细胞与Sp2/0细胞按照1比3到10的比例混合,然后将离心管放入37℃的水浴锅中,并在在1min内缓慢加入1ml聚乙二醇(PEG),在水浴锅中静置1min缓慢补充无血清IMDM培养基至10ml,混匀后1000rpm/min离心10min。然后加入10ml的小牛血清,重悬细胞,倒入5ml的Clone Easy培养基,5ml胸腺细胞混合物(2ml胸腺,2ml HAT,1ml HT),和25ml的半固体培养基,充分混匀。混匀后将悬液倒入约30个3cm细胞培养皿中,放入37℃,5% CO2培养箱中培养。长出单克隆细胞群落后,将克隆转移到96孔板中扩增培养。96孔细胞培养板内加入含有20%小牛血清,1×HT,10% Clone Easy培养基的IMDM细胞培养基200ul,然后挑取上述单个细胞群落加入到孔中,放入37℃,5% CO2培养箱中培养,最终获得了102株单克隆抗体(见表1-2)。
表1:MD2106-#5(78株单克隆抗体)
#1 | #11 | #19 | #27 | #35 | #43 | #51 | #59 | #67 | #75 |
#2 | #12 | #20 | #28 | #36 | #44 | #52 | #60 | #68 | #76 |
#3 | #13 | #21 | #29 | #37 | #45 | #53 | #61 | #69 | #77 |
#4 | #14 | #22 | #30 | #38 | #46 | #54 | #62 | #70 | #78 |
#5 | #15 | #23 | #31 | #39 | #47 | #55 | #63 | #71 | #80 |
#7 | #16 | #24 | #32 | #40 | #48 | #56 | #64 | #72 | #81 |
#9 | #17 | #25 | #33 | #41 | #49 | #57 | #65 | #73 | |
#10 | #18 | #26 | #34 | #42 | #50 | #58 | #66 | #74 |
表2:MD2025-#4(34株单克隆抗体)
#1 | #10 | #17 | #24 | #31 |
#2 | #11 | #18 | #25 | #32 |
#4 | #12 | #19 | #26 | #33 |
#5 | #13 | #20 | #27 | #34 |
#6 | #14 | #21 | #28 | #35 |
#8 | #15 | #22 | #29 | #36 |
#9 | #16 | #23 | #30 |
将GSDMD-CT或其片段(化学合成的20个多肽表位序列,多肽号#1到多肽号#20)用PBS稀释至2ug/ml,用加样枪吸取100ul加到96孔板中,4℃过夜孵育。孵育结束后弃掉96孔板中多余的PBS,向96孔板中加入100ul含有1%酪蛋白的PBS,37℃孵育2h。用加样枪吸取100ul杂交瘤细胞株(与表1-2中单克隆抗体编号一致,已保藏)培养上清、Sp2/0细胞培养上清、(PBS)、稀释1000倍阳性血清,分别加入到包被有TSP1-BSA的96孔板中,37℃孵育2h。洗涤三次后加入二抗,37℃孵育1h。洗涤三次,拍干ELISA板,加入100ul TMB显色液室温下孵育15min,然后加入终止液终止显色,酶标仪读取450nm处吸光度值。
2、抗体特异性检测
通过Specific Peptide(SEQ ID NO.4:GVPAEGAFTEDFQGLR)和Elongated Peptide(SEQ ID NO.5:TDGVPAEGAFTEDFQGLR)与抗体的反应性,从而证明前述抗体的特异性,实验步骤如下:
①包被抗原:用包被液分别稀释Specific Peptide和Elongated Peptide,按照2ug/ml,100ul/孔,4℃过夜包被;洗涤液洗3次,350ul/孔,拍干。②封闭:200ul/孔封闭液,37℃孵育2h;洗涤液洗3次,350ul/孔,拍干。③将表1中的抗体(如#25,#44,或#50)上清培养液用抗体稀释液100倍稀释,100ul/孔,空白为100ul的抗体稀释液,37℃孵育1h;洗涤液洗3次,350ul/孔,拍干。④将二抗按照1:10000比例用抗体稀释液稀释,100ul/孔,37℃孵育1h;洗涤液洗3次,350ul/孔,拍干。⑤显色:100ul/孔显色液,室温孵育10min。⑥终止、读数:100ul/孔终止液,OD450nm读数。
结果:三株抗体(#25,#44,或#50)与Specific Peptide具有较高的反应OD值,与Elongated Peptide具有较低的OD值,可以认为不与Elongated Peptide反应,而与Specific Peptide具有特异性反应(如图4)。可见,三株抗体针对GSDMD-CT的特异性均很强,即在SEQ ID NO.4的N端增加与其相邻的GSDMD-NT末尾的仅2个氨基酸T和D,前述抗体就不再识别。
另外,还采用类似的方法检测其他抗体对多个GSDMD-CT片段(多肽号#1到多肽号#20)的特异性,部分结果如图15。可以看出,对于GSDMD-CT片段SEQ ID NO.4(多肽号#1)而言,多个单克隆抗体的特异性都很好,例如MD2106#50。同时也表明,GSDMD-CT片段SEQ IDNO.4(多肽号#1)是非常好的目标或抗原,能制备出多种高质量的单抗,而且能稳定结合多种抗体,可广泛适用于多种检测方案。
其中,产生MD2106#50的杂交瘤细胞株,命名为MD2106-50#,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.45333,保藏日期:2022年11月10日,分类命名:小鼠抗人单克隆抗体细胞株。
MD2106#50序列如下:
重链(类型:IgG1)可变区氨基酸序列:
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWIHWVKQRP GQGLEWIGNTKPSNGDIHYNEKFRSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLT SEDSAVYFCAVGYYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO.1)。
HCDR1:GYTFTNYW(SEQ ID NO.6);HCDR2:TKPSNGDI(SEQ ID NO.7);HCDR3:AVGYY(SEQ ID NO.8)。
轻链(类型:kapa)可变区氨基酸序列:
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTW YQQKPGQPPKMLIYWAYNRDSGVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQA EDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEL(SEQ ID NO.2)。
LCDR1:QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO.9);LCDR2:WAY;LCDR3:QNDYSYPLT(SEQ IDNO.10)。
3、抗体竞争抑制实验
通过棋盘滴定法初步确定蛋白包被量和抗体稀释浓度,实验步骤如下:
①包被抗原:用包被液稀释GSDMD-CT表达蛋白,按照2ug/ml,1ug/ml,0.5ug/ml,0.25ug/ml,100ul/孔,4℃过夜包被;洗涤液洗3次,350ul/孔,拍干。②封闭:200ul/孔封闭液,37℃孵育2h;洗涤液洗3次,350ul/孔,拍干。③将1ug/mL的#25,#44,#50抗体用抗体稀释液1000倍稀释,再以2倍梯度稀释,100ul/孔,空白为100ul的抗体稀释液,37℃孵育1h;洗涤液洗3次,350ul/孔,拍干。④将二抗按照1:10000比例用抗体稀释液稀释,100ul/孔,37℃孵育1h;洗涤液洗3次,350ul/孔,拍干。⑤显色:100ul/孔显色液,室温孵育10min。⑥终止、读数:100ul/孔终止液,OD450nm读数。⑦确定包被蛋白相对于抗体的剂量曲线,选择0.25ug/ml的包被量,2倍梯度稀释抗体进行全曲线拟合,选择EC80的抗体稀释浓度作为竞争法的抗体反应浓度。⑧将GSDMD-CT表达蛋白按照1000ng/ml的浓度2倍稀释进行曲线拟合,计算IC50确定最佳抗体。⑨制备100ug/ml的GSDMD-CT蛋白标准溶液,通过逐级稀释法分别配置1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.813ng/ml、3.906ng/ml、1.953ng/ml、0.977ng/ml、0.488ng/ml以及0ng/ml的GSDMD-CT样品溶液。⑩将50ul不同浓度的样品溶液加入到50ul稀释抗体中,然后将100ul混合物加入到酶标板中37℃孵育1h。
结果参见图5,表明:针对GSDMD-CT的N端特异性抗体例如#25,#44,#50,可以制备成免疫抑制试剂盒,特异性的检测GSDMD-CT,如用于实施例8-12的检测或可用于检测炎症相关的疾病。
实施例4亚类鉴定
使用PBS将Ig捕获抗体稀释至0.5ug/ml,用加样枪吸取100ul加到96孔板中,4℃过夜孵育。孵育结束后弃掉96孔板中多余的PBS,向96孔板中加入100ul含有1%酪蛋白的PBS,37℃孵育2h。用加样枪吸取100ul的杂交瘤培养上清在37℃恒温箱中孵育2h。反应结束后用洗板机洗96孔板三次,加入用PBS稀释10000倍的κ,/λ链或者稀释20000的HRP标记的抗体100ul,37℃孵育1h。洗三次,用加样枪加入100ul TMB显色液室温下孵育15min,加入50ul终止液终止显色,用酶标仪读取450nm处吸光度值。
实施例5配对检测抗体的筛选(ELISA初筛)
将所有的抗GSDMD-CT或其片段的单克隆抗体用PBS稀释成2ug/ml,用加样枪吸取100ul加到96孔板中,然后将96孔板放到4℃冷室中过夜孵育。孵育结束后弃掉96孔板中多余的PBS,向96孔板中加入100ul含有1%酪蛋白的PBS,将96孔板放到37℃恒温箱中孵育2h。然后加入不同浓度GSDMD-CT或其片段的抗原在37℃孵育1h,反应结束后洗三次,加入抗GSDMD-CT或其片段的HRP(或者ALP)标记的抗体(用Label Easy快速HRP或者ALP偶联试剂盒进行标记)100ul 37℃孵育1h,洗三次,加入TMB室温孵育15min后加入终止液,在450-630纳米波长下比色,选取最佳的抗体配对组合。将筛选到的最佳配对应用于ELISA试剂盒。
实施例6配对检测抗体的筛选(磁微粒化学发光法优化筛选)
按照本领域技术人员已知的方法将羧基磁珠和抗FITC的单克隆抗体进行EDC偶联,用上述的ELISA初筛的包被抗体标记FITC,去除游离FITC后,测定抗体标记率以及标记抗体的浓度。或者按照本领域技术人员已知的方法将羧基磁珠和用上述的ELISA初筛的包被抗体进行EDC偶联。将筛选到的最佳配对应用于磁微粒化学发光试剂盒。按照本领域技术人员已知的方法将检测抗体与吖啶酯或者碱性磷酸酶进行偶联。
实施例7免疫分析
按照科斯迈SMART500H或者SMART500S化学发光仪的设置要求,将碱性磷酸酶偶联或者吖啶酯偶联检测抗体、50ul血浆或者标准品、偶联了抗体的磁珠加入反应杯孵育10min,洗2min,重复一次,加入底物反应1min。用软件(样条拟合)确定样品的浓度。
实施例8GSDMD-CT或其片段浓度的测定
夹心免疫分析法使用抗GSDMD-CT或其片段的抗体用于底物的检测。使用所述分析法可定量测定血浆或血清中GSDMD-CT或其片段的免疫反应性在10pg/m以上的浓度。
实施例9健康个体和某些疾病状态中GSDMD-CT或其片段的免疫反应性的浓度
分析健康个体和遭受各种疾病包括感染炎症、脓毒症等患者的血清和血浆测定GSDMD-CT或其片段的免疫反应性。与健康个体相比,疾病状态中GSDMD-CT或其片段的免疫反应性令人惊奇地增加。具体而言,脓毒症(中值150,5pg/m)和心肌梗塞(中值129,5pg/ml)患者的血浆中GSDMD-CT浓度变化非常显著即约10倍增加,在动脉血压升高患者中约35倍增加(中值459,5pg/ml)。在CHF患者中所测GSDMD-CT或其片段的含量与疾病严重程度的相关性较好。
实施例10GSDMD-CT或其片段免疫反应性的稳定性
将表达的GSDMD-CT或其片段中加入蛋白稳定缓冲液,制备成校准品和质控品。对校准品和质控品中GSDMD-CT或其片段的免疫反应性的稳定性进行测验,表3显示的是校准品和质控品GSDMD-CT或其片段的稳定性。结果发现,GSDMD-CT或其片段的免疫反应性非常稳定。
表3校准品和质控品GSDMD-CT或其片段的稳定性
样品 | 贮存(天/温度) | 回收率 |
质控品I(n=3) | 1d/4℃ | 98.0% |
质控品I(n=3) | 180d/4℃ | 99.3% |
质控品I(n=3) | 1d/37℃ | 96.1% |
质控品I(n=3) | 14d/37℃ | 103.4% |
质控品II(n=3) | 1d/4℃ | 102.6% |
质控品II(n=3) | 180d/4℃ | 101.6% |
质控品II(n=3) | 1d/37℃ | 98.9% |
质控品II(n=3) | 14d/37℃ | 97.3% |
实施例11临床应用
一、材料
血浆:实验所用血浆样本取自健康人员和住院患者。本实验共收集血浆136例包括24例健康对照样本(Healthy control,HC)和31例非全身炎症反应综合症(Non SystemicInflammatory Response Syndrome,non-SIRS)样本,21例全身炎症反应综合症(SystemicInflammatory Response Syndrome,SIRS)样本和60例全身性感染(Sepsis)样本。
入组标准:根据美国胸科医师协会和危重病医学会共识会议诊断标准诊断[1]:SIRS:具备以下两项及以上,①体温<36℃或>38℃;②呼吸>20次/min或PCO 2<32mmHg;③心率>90次/min;④WBC>12×109/L或<4×109/L。non-SIRS不符合SIRS的诊断标准。Sepsis:细菌培养阳性。健康对照组(HC)为在健康检查中全面健康评估的个体。血浆取材以后在冰上运送、分装,并置于-80℃冰箱保存备用。
二、统计处理
数据用SPSS 22.0软件进行处理,计量资料采用Student t或Mann-Whitney秩和检验比较两组数据间的差异。实验重复三次,结果用均数±标准误(SEM)以P<0.05表示差异具有统计学意义。
三、结果
3.1标准曲线的建立:GSDM-CT标准品用PBS稀释成0、62.5、125、250、500和1000pg/ml,使用GSDMD-CT化学发光检测体系检测,每个浓度测试3次,绘制标准曲线,经过曲线拟合得到公式y=0.00483x–69.177(R2=0.99),根据公式计算血浆中GSDMD-CT的浓度(如图6)。
3.2炎症患者血浆GSDMD-CT表达水平明显增高:通过采用本申请的抗体(例如#25,#44,#50抗体)对24例健康对照,21例非炎症患者和91例炎症性患者血浆GSDMD-CT水平进行检测分析发现,健康组GSDMD-CT浓度为71.0±8.3pg/ml,非炎症GSDMD-CT浓度为72.3±9.5pg/ml,炎症组为596.8±109.7pg/ml。非炎症组血浆GSDMD-CT水平与健康对照组相比无明显差别,差异无统计学意义(P>0.05)。炎症组血浆GSDMD-CT水平与健康和非炎症组相比,其表达水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),结果如图7所示。
进一步分析,将炎症分为全身性炎症反应综合症(SIRS)和感染性炎症(Sepsis)两组,并分别进行两两比较。SIRS组血浆GSDMD-CT浓度为186.3±27.6pg/ml,Sepsis组血浆GSDMD-CT浓度为740.5±152.6pg/ml。SIRS组和Sepsis组血浆GSDMD-CT水平相比于健康组(HC)和非炎症组(non-SIRS)明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),而且Sepsis组血浆GSDMD-CT表达水平明显高于SIRS组,差异有统计学意义(P<0.05),结果如图8所示。
3.3GSDMD-CT表达水平与患者一般临床特征:进一步我们分析了112例临床病例一般特征与GSDMD-CT的关系,发现血浆GSDMD-CT表达水平与患者年龄、性别无关(P>0.05),结果如表4所示。
表4.GSDMD-CT与non-SIRS、SIRS和Sepsis病例一般特征
3.4血浆GSDMD-CT是SIRS潜在的生物标志物:采用ROC曲线分析了血浆GSDMD-CT对SIRS的诊断效能。发现血浆GSDMD-CT对SIRS诊断ROC曲线下面积分别为0.824,优于降钙素原(PCT)0.811和C-反应蛋白(CRP)0.723对SIRS诊断效能。联合GSDMD-CT、PCT和CRP对SIRS的诊断效能ROC曲线下面积为0.875,优于联合GSDMD-CT、PCT(0.861)、联合GSDMD-CT、CRP(0.841)和联合PCT、CRP(0.833)对SIRS的诊断效能,上述结果表明,血浆GSDMD-CT是一种新的预测SIRS的标志物,结果如图9和表5所示。
表5曲线下的面积
The test result variable(s):GSDMD-CT,PCT has at least one tie betweenthe positive actual state group and the negative actual stategroup.Statistics may be biased.
a.Under the nonparametric assumption
b.Null hypothesis:true area=0.5
其中:
3.5血浆GSDMD-CT是Sepsis潜在的生物标志物:采用ROC曲线分析了血浆GSDMD-CT对SIRS的诊断效能。发现血浆GSDMD-CT对Sepsis诊断ROC曲线下面积分别为0.928,优于降钙素原(PCT)
0.820和C-反应蛋白(CRP)0.860对Sepsis诊断效能。联合GSDMD-CT、PCT和CRP对Sepsis的诊断效能ROC曲线下面积为0.946,优于联合GSDMD-CT、PCT(0.940)、联合GSDMD-CT、CRP(0.944)和联合PCT、CRP(0.889)对Sepsis的诊断效能,上述结果表明,血浆GSDMD-CT是一种新的预测Sepsis的标志物,结果如图10和表6所示。
表6曲线下的面积
The test result variable(s):PCT has at least one tie between thepositive actual state group and the negative actual state group.Statisticsmay be biased.
a.Under the nonparametric assumption
b.Null hypothesis:true area=0.5
3.6血浆GSDMD-CT或其片段与PCT的表达显著正相关:我们采用二元回归方法分析了患者血浆GSDMD-CT与PCT、CRP表达水平的相关性,发现GSDMD-CT与PCT的表达显著正相关(r=0.65),而与CRP的表达呈弱相关(r=0.32),结果如图11-图12所示。我们进一步选取了一个病例进行连续监测发现,GSDMD-CT与CRP、PCT的变化一致,而且病情严重时,其浓度变化幅度比CRP和PCT更为显著(见图13)。
综上所述,GSDMD-CT是一个新的判别患者炎症状态的标志物。
实施例12革兰氏阴性细菌和***感染患者样本中GSDMD-CT浓度含量的比较
发明人对革兰氏阴性细菌和***感染患者样本中GSDMD-CT浓度含量进行了测试,结果发现,GSDMD-CT既可以检测革兰氏阴性细菌感染,也可以检测***感染患者,两类细菌感染均可以引起GSDMD-CT升高(见图14)。因此,GSDMD-CT可以作为细菌感染的标志物。
Claims (20)
1.一种标志物,其特征在于,所述标志物为GSDMD-CT或其片段,GSDMD-CT或其片段的修饰变体,和/或GSDMD-CT或其片段的衍生物。
2.如权利要求1所述的标志物,所述GSDMD-CT的序列如SEQ ID NO.3所示;或所述片段的序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种编码权利要求1或2所述标志物的核酸。
4.含有权利要求1-3之一所述标志物或权利要求4所述核酸的生物材料,其特征在于,所述材料为表达盒、重组载体、重组微生物、或转基因细胞系的一种或多种。
5.与权利要求1或2所述的标志物、权利要求3所述的核酸、和/或权利要求4所述生物材料结合的配偶体。
6.如权利要求5所述的配偶体,所述配偶体包括核酸适配体、肽适配体、肽体、拟似物、噬菌体、抑制剂、化合物、和/或抗体。
7.如权利要求6所述的配偶体,所述抗体包括纳米抗体、单一特异性抗体、多克隆抗体、和/或抗体的抗原结合片段;例如以SEQ ID NO.4所示的多肽免疫小鼠后制备的单克隆抗体。
8.如权利要求5-8之一所述的配偶体,其特征在于,所述配偶体带有能被识别的标记;优选的,所述标记包括染料、表位标签、荧光部分、发光部分、化学发光部分、酶标记、磁标记、顺磁标记、对比剂、纳米颗粒、放射性同位素、生物素、链霉亲和素、和/或猝灭剂。
9.一种杂交瘤细胞株,其特征在于:命名为MD2106-50#,保藏编号为CGMCC No.45333。
10.一种单克隆抗体#50或其抗原结合片段,其特征在于,其含有重链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3,以及轻链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3;
其中,重链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO.6:GYTFTNYW、SEQ ID NO.7:TKPSNGDI、SEQ ID NO.8:AVGYY;
轻链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9:QSLLNSGNQKNY、WAY、SEQ ID NO.10:QNDYSYPLT。
11.根据权利要求10所述的单克隆抗体#50或其抗原结合片段,其特征在于,其中所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’、F(ab’)2片段、Fd片段;Fv片段、dAb片段、单链scFv、单链scFv-Fc片段或单链抗体ScAb。
12.一种产生根据权利要求10或11所述的单克隆抗体#50或其抗原结合片段的细胞系。
13.一种核酸分子,其特征在于,其编码根据权利要求10或11任一项所述的单克隆抗体#50或其抗原结合片段。
14.一种表达盒、重组载体、或重组微生物,其特征在于,其包含权利要求13所述的核酸分子。
15.一种试剂盒,或一种组合物,或一种***,或一种装置,其特征在于,包含权利要求1或2所述的标志物、或权利要求3所述的核酸、或权利要求4所述生物材料、或权利要求5-8之一所述的配偶体、或权利要求9所述的细胞株、或权利要求10或11所述的单克隆抗体#50或其抗原结合片段、或权利要求12所述的细胞系、或权利要求13所述的核酸分子、或权利要求14所述的表达盒、重组载体、或重组微生物。
16.一种“物质或***”的用途,其特征在于,所述“物质或***”包括:权利要求1或2所述的标志物、或权利要求3所述的核酸、或权利要求4所述生物材料、或权利要求5-8之一所述的配偶体、或权利要求9所述的细胞株、或权利要求10或11所述的单克隆抗体#50或其抗原结合片段、或权利要求12所述的细胞系、或权利要求13所述的核酸分子、或权利要求14所述的表达盒、重组载体、或重组微生物、和/或权利要求15所述的试剂盒、组合物、***、或装置;
所述用途为如下之一:
(a)用于测定细胞焦亡程度,或用于制备测定细胞焦亡程度的制剂中的用途;
(b)抑制细胞焦亡,或用于制备抑制细胞焦亡的制剂中的用途;
(c)预防或诊断炎症相关疾病,或用于制备预防或诊断炎症相关疾病制剂中的用途;
(d)治疗炎症相关疾病,或用于制备治疗炎症相关疾病药物中的用途;
(e)评估炎症相关疾病的严重程度或其患者预后状况、或用于制备评估炎症相关疾病的严重程度或炎症相关疾病的患者预后状况制剂中的用途;
(f)监测炎症相关疾病的进展、或用于制备监测炎症相关疾病的进展的制剂中的用途。
17.一种筛选药物、化合物、组合物或制剂的方法,所述药物、化合物、组合物或制剂用于检测或抑制细胞焦亡程度、预防或诊断炎症相关疾病、治疗炎症相关疾病、评估炎症相关疾病的严重程度或其患者预后状况、或监测炎症相关疾病进展,其特征在于,包括利用权利要求1或2所述的标志物、或权利要求3所述的核酸、或权利要求4所述生物材料、或权利要求5-8之一所述的配偶体、或权利要求9所述的细胞株、或权利要求10或11所述的单克隆抗体#50或其抗原结合片段、或权利要求12所述的细胞系、或权利要求13所述的核酸分子、或权利要求14所述的表达盒、重组载体、或重组微生物、和/或权利要求15所述的试剂盒、组合物、***、或装置。
18.一种方法,其特征在于,包括利用权利要求1或2所述的标志物、或权利要求3所述的核酸、或权利要求4所述生物材料、或权利要求5-8之一所述的配偶体、或权利要求9所述的细胞株、或权利要求10或11所述的单克隆抗体#50或其抗原结合片段、或权利要求12所述的细胞系、或权利要求13所述的核酸分子、或权利要求14所述的表达盒、重组载体、或重组微生物、和/或权利要求15所述的试剂盒、组合物、***、或装置;所述方法为如下之一:
(a)测定细胞焦亡程度,或制备测定细胞焦亡程度的制剂;
(b)抑制细胞焦亡,或制备抑制细胞焦亡的制剂;
(c)预防或诊断炎症相关疾病,或制备预防或诊断炎症相关疾病的制剂;
(d)治疗炎症相关疾病,或用于制备治疗炎症相关疾病药物;
(e)评估炎症相关疾病的严重程度或其患者预后状况、或制备评估炎症相关疾病的严重程度的制剂或制备评估炎症相关疾病的患者预后状况的制剂;
(f)监测炎症相关疾病的进展、或制备监测炎症相关疾病的进展的制剂。
19.如权利要求16所述的用途、或权利要求17所述的方法、或权利要求18所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:(i)检测样品中的一种或多种蛋白或核酸,并对其水平进行定量,(ii)将定量的水平与对照群体中相应蛋白或核酸的水平进行比较;所述蛋白包括权利要求1-2所述的标志物或权利要求3所述的核酸。
20.如前述权利要求任一项,所述的炎症相关疾病包括由细胞焦亡引起的、或与细胞焦亡相关的细胞炎症坏死的病症;优选的,所述炎症相关疾病为:感染引起的炎性疾病,特别是细菌感染引起的炎症、病毒感染引起的炎症,例如常见的肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿***感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等及其感染的并发症、外科手术、创伤、多发伤、灼伤、败血症、脓毒血症和脓毒性休克等;自身免疫性疾病,例如关节炎、痛风、硬皮病等;慢性疾病如糖尿病、慢性阻塞性支气管、白血病、再生障碍型贫血和***等;其他疾病如癌症、糖尿病、肾病、老年痴呆等疾病等中的一种或多种。
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