CN111304372B - 检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒 - Google Patents

检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及2019新型冠状病毒的检测领域，能够检测2019新型冠状病毒的两个碱基突变（8782C→T和28144T→C）。本发明提供了一种用于检测2019新型冠状病毒突变的组合物；同时，还提供了含该组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测2019新型冠状病毒突变的方法。使用本发明的组合物，为细化新冠肺炎诊断提供了依据，确定患者病毒的型别，对临床特征和病情发展进行预判，据此更新并改进治疗方案。

Description

检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域；具体地，属于2019新型冠状病毒的检测领域；更具体地，能够检测2019新型冠状病毒的两个碱基突变（8782C→T和28144T→C）。
背景技术
2019新型冠状病毒（2019-nCoV）是引发新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎，COVID-19）的病原体。世界卫生组织于2020年3月11日宣布全球大流行。截至2020年4月1日，全球累计确诊新冠肺炎病例已超过80万例，且有进一步恶化趋势。
新冠肺炎常见体征有发热、咳嗽、气促和呼吸困难等呼吸道症状。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，进一步导致死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，但许多症状可以对症进行辅助护理和支持性治疗。
Xiaolu Tang等人通过病毒全基因分析，发现在第8782位碱基和第28144位碱基存在连锁现象（101/103，98%）。例如，根据这两个碱基的类型，新冠病毒存在两种单倍型：L型（C8782和T28144）和S型（T8782和C28144）。其中L型和S型的命名来自于28144位碱基变化后编码的不同氨基酸，其中L型的T28144所在密码子编码亮氨酸（Leucine），S型的C28144所在密码子编码丝氨酸（Serine）。
通过数据对比分析，L型和S型在重症率和传染能力上存在差异。这为细化新冠肺炎诊断提供了依据，意味着临床上可通过基因分型检测，确定患者体内病毒的型别，对临床特征和病情发展进行预判，据此制定更具针对性的治疗方案。
因此，检测识别2019新型冠状病毒这两个位点的碱基，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。但目前尚未有相应检测试剂。
本领域需要一种能够将2019新型冠状病毒8782和28144两个位点的碱基进行检测并识别的相关产品。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测2019新型冠状病毒突变的组合物，所述组合物包括：
第一核酸组合物：
8782 C型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTCATC-3’（SEQ ID NO:1）；
28144 T型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCAGATT-3’（SEQ ID NO:2）；和
第二核酸组合物：
8782 T型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTATCGT-3’（SEQ ID NO:3）；
28144 C型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTTTGC-3’（SEQ ID NO:4）；
其中，所述每个核酸组合物中还包括：
8782反向引物：5’-CCATTAGTTGTGCGTAATATCGT-3’（SEQ ID NO:5）；
8782探针：5’-CTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAA-3’（SEQ ID NO:6）；
28144反向引物：5’-CAACACGAACGTCATGATACTCTA-3’（SEQ ID NO:7）；
28144探针：5’-ATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGT-3’（SEQ ID NO:8）。
使用该组合物，可以分辨2019新型冠状病毒的8782位为C型或T型，并且可以分辨28144为T或C型）。通过检测两处碱基类型，可以例如区分新冠病毒的S型和L型，为细化新冠肺炎诊断提供了依据，确定患者病毒型别，对临床特征和病情发展进行预判，据此更新并改进治疗方案，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。
使用本发明的组合物，引物检测扩增特异性靶标的Ct值小，扩增效率高；引物检测特异性模板的Ct值和非特异性模板的Ct值差值大，特异性好。而使用本发明的组合物的对比例，引物检测扩增特异性靶标的Ct值大于本发明组合物，其扩增效率较低，同时，特异性模板的Ct值和非特异性模板的Ct值差值也较本发明组合物小，其特异性也相对较差。
本发明的组合物可用于荧光定量PCR检测。
进一步地，所述组合物中，8782探针与28144探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。
在本文中，“彼此不互相干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光报告基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:6所示的8782探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:8所示的28144探针的荧光报告基团为FAM。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
进一步地，所述组合物中引物的用量为25~800nM；所述组合物中探针的用量为10~500nM。
在一个具体的实施方案中，本发明组合的两种核酸组合物分别存在于单独包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测2019新型冠状病毒突变的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测2019新型冠状病毒突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20-200µl。
在一个具体的实施方案中，本发明第一核酸组合物的具体成分如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
在一个具体的实施方案中，本发明第二核酸组合物的具体成分如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
进一步地，所述组合物中检测引物的25~800nM；所述组合物中探针的用量为10~500nM。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/μL~15U/μL，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶（MMLV）或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/μL~15U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照。所述阳性对照含有2019新型冠状病毒基因组第8782位附近的序列以及第28144位附近的序列，并且其中，第8782位为C或T，且第28144位为C或T。例如，第8782位为C且第28144位为T，8782位为T且第28144位为C，第8782位为C且第28144位为C，第8782位为T且第28144位为T。
在本文中，术语“第8782位”和“第28144位”是指Genebank登录号为：NC_045512.2的新型冠状病毒基因组序列的第8782位和28144位碱基。
在本发明中，术语“第8782位附近的序列”和“第28144位附近的序列”是指包含8782或28144位点，并包括其上下游各100~300bp碱基的序列。
进一步地，将这两个位点附近的序列进行组合，就能得到阳性对照的突变***序列。例如，所述的2019新型冠状病毒C8782和T28144突变***序列（SEQ ID NO:9）为：
TTAATTAAAGTTACACTTGTGTTCCTTTTTGTTGCTGCTATTTTCTATTTAATAACACCTGTTCATGTCATGTCTAAACATACTGACTTTTCAAGTGAAATCATAGGATACAAGGCTATTGATGGTGGTGTCACTCGTGACATAGCATCTACAGATACTTGTTTTGCTAACAAACATGCTGATTTTGACACATGGTTTAGCCAGCGTGGTGGTAGTTATACTAATGACAAAGCTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAACAAGAGAAGTGGGTTTTGTCGTGCCTGGTTTGCCTGGCACGATATTACGCACAACTAATGGTGACTTTTTGCATTTCTTACCTAGAGTTTTTAGTGCAGTTGGTAACATCTGTTACACACCATCAAAACTTATAGAGTACACCAAGAATGTAGTTTACAGTCATGTACTCAACATCAACCATATGTAGTTGATGACCCGTGTCCTATTCACTTCTATTCTAAATGGTATATTAGAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCACCTTTAATTGAATTGTGCGTGGATGAGGCTGGTTCTAAATCACCCATTCAGTACATCGATATCGGTAATTATACAGTTTCCTGTTTACCTTTTACAATTAATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGTCTTGTAGTGCGTTGTTCGTTCTATGAAGACTTTTTAGAGTATCATGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACGAACAAACTAAAATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAA
所述2019新型冠状病毒T8782和C28144突变***序列（SEQ ID NO:10）为：
TTAATTAAAGTTACACTTGTGTTCCTTTTTGTTGCTGCTATTTTCTATTTAATAACACCTGTTCATGTCATGTCTAAACATACTGACTTTTCAAGTGAAATCATAGGATACAAGGCTATTGATGGTGGTGTCACTCGTGACATAGCATCTACAGATACTTGTTTTGCTAACAAACATGCTGATTTTGACACATGGTTTAGTCAGCGTGGTGGTAGTTATACTAATGACAAAGCTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAACAAGAGAAGTGGGTTTTGTCGTGCCTGGTTTGCCTGGCACGATATTACGCACAACTAATGGTGACTTTTTGCATTTCTTACCTAGAGTTTTTAGTGCAGTTGGTAACATCTGTTACACACCATCAAAACTTATAGAGTACACCAAGAATGTAGTTTACAGTCATGTACTCAACATCAACCATATGTAGTTGATGACCCGTGTCCTATTCACTTCTATTCTAAATGGTATATTAGAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCACCTTTAATTGAATTGTGCGTGGATGAGGCTGGTTCTAAATCACCCATTCAGTACATCGATATCGGTAATTATACAGTTTCCTGTTCACCTTTTACAATTAATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGTCTTGTAGTGCGTTGTTCGTTCTATGAAGACTTTTTAGAGTATCATGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACGAACAAACTAAAATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAA。
所述阳性对照通过使用慢病毒数字PCR定量检测体系，对两种慢病毒样本进行拷贝数定量。分别将两种定量后的假病毒，使用生理盐水稀释至1.0E+06拷贝/mL而制备。所述假病毒以慢病毒为载体，***两段新型冠状病毒基因组序列（8582-8982，27944-28344）。两段序列的中间位置分别设计为2019新型冠状病毒T8782和C28144突变和2019新型冠状病毒C8782和T28144突变的对应的碱基。
第四方面，提供了一种用于检测2019新型冠状病毒突变的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃，时间25~35分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1~10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，40~50次循环。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测2019新型冠状病毒突变的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃，时间25~35分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1~10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，40~50次循环。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染2019新型冠状病毒并罹患肺炎的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中检测培养物中是否有2019新型冠状病毒以及病毒的突变类型。
附图说明
图1：第一组合物检测临床核酸样本扩增结果；
图2：第二组合物检测临床核酸样本扩增结果；
图3：第一组合物检测2019新型冠状病毒C8782和T28144突变模板（1.0E+08拷贝/mL）结果；
图4：第一组合物检测2019新型冠状病毒T8782和C28144突变2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板（1.0E+08拷贝/mL）结果；
图5：第二组合物检测2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板（1.0E+08拷贝/mL）结果；
图6：第二组合物检测2019新型冠状病毒C8782和T28144突变模板（1.0E+08拷贝/mL）结果；
图7：第一组合物检测梯度浓度2019新型冠状病毒C8782和T28144突变，FAM通道检测结果；
图8：第一组合物检测梯度浓度2019新型冠状病毒C8782和T28144突变，HEX通道检测结果；
图9：第二组合物检测梯度浓度2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板，FAM通道检测结果；
图10：第二组合物检测梯度浓度2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板，HEX通道检测结果；
图11：不同设计的8782 C型引物扩增2019新型冠状病毒C8782和T28144突变模板（实线）和2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板（虚线）的结果，图11A-F分别为本发明引物，和对比例引物8782 C1~5的结果；
图12：不同设计的8782 T型引物扩增2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板（实线）和2019新型冠状病毒C8782和T28144突变模板（虚线）的结果，图12A-F分别为本发明引物，和对比例引物8782 T1~5的结果；
图13：不同设计的28144 T型引物扩增2019新型冠状病毒C8782和T28144突变模板（实线）和2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板（虚线）的结果，图13A-F分别为本发明引物，和对比例引物28144 T1~5的结果；
图14：不同设计的28144 C型引物扩增2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板（实线）和2019新型冠状病毒C8782和T28144突变模板（虚线）的结果，图14A-F分别为本发明引物，和对比例引物28144 C1~5的结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下所示：
8782 C型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTCATC-3’（SEQ ID NO:1）；
28144 T型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCAGATT-3’（SEQ ID NO:2）；
8782 T型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTATCGT-3’（SEQ ID NO:3）；
28144 C型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTTTGC-3’（SEQ ID NO:4）；
8782反向引物：5’-CCATTAGTTGTGCGTAATATCGT-3’（SEQ ID NO:5）；
8782探针：5’-CTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAA-3’（SEQ ID NO:6）；
28144反向引物：5’-CAACACGAACGTCATGATACTCTA-3’（SEQ ID NO:7）；
28144探针：5’-ATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGT-3’（SEQ ID NO:8）。
其中，8782探针的荧光报告基团为HEX，28144探针的荧光报告基团为FAM，探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2淬灭基团。
实施例2、检测2019新型冠状病毒突变的方法
本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。进行如下操作：
（1）使用圣湘生物核酸释放剂S1014，与阳性对照1：1混合，常温裂解10分钟；
（2）按每种反应液26μL和混合酶4μL的比例，取相应量的反应液和混合酶混匀，以每反应30μL的体积分装至各反应管。分别向各反应管中加入待检测的裂解后样本20 μL，然后盖上PCR管盖，瞬时离心后放置于实时荧光PCR仪器中；
（3）按以下循环条件进行反应和检测（荧光采集选取FAM通道和HEX通道）：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
结果分析：
1）目的检测信号为FAM，HEX；
2）Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（Start）避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（End）比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；
3）如果两个组合物中，各通道均无扩增信号，则为样本浓度低于检测下限；
如果在两个组合物中，有且只有一个组合物存在扩增信号：
其中第一组合物FAM和HEX均有扩增曲线，且Ct＜40，表示为2019新型冠状病毒C8782和T28144突变；
其中第二组合物FAM和HEX均有扩增曲线，且Ct＜40，表示为2019新型冠状病毒T8782和C28144突变；
如果在两个组合物中，均存在扩增信号，则比较两个组合物中，对应通道的Ct值差值：
两种组合物各通道Ct值的差值大于10，如第一组合物的Ct值较小则为2019新型冠状病毒C8782和T28144突变，第二组合组的Ct值较小则为2019新型冠状病毒T8782和C28144突变。
两种组合物各通道Ct值的差值小于10，则为两个型别同时存在。
针对第一组合物，当FAM和HEX均有扩增曲线，且Ct＜35，表示为2019新型冠状病毒C8782和T28144突变；
针对第二组合组，当FAM和HEX均有扩增曲线，且Ct＜35，表示为2019新型冠状病毒T8782和C28144突变；
针对第一组合物以及第二组合物，若FAM和HEX仅有一条或无扩增曲线，则不能判断该2019新型冠状病毒的类型。判断结果可以参见如下表1所示。
对两管组合物中扩增的结果进行分析，其中“+”指有扩增曲线或Ct值小于45，“-”指无扩增曲线或Ct值大于45。Ct1和Ct2分别为第一组合物和第二组合物中对应通道的Ct值，ΔCt为这两个Ct值差值的绝对值。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实施例3、本发明组合物用于检测2019新型冠状病毒突变
使用本发明实施例1中所述的组合物，按照实施例2所述的方法进行检测。所述样本为临床阳性样本提取核酸。分别用第一组合物和第二组合物进行检测，其结果如图1-2所示。从图中可以判读出，该样本第8782和第28144碱基分别为C和T，其为2019新型冠状病毒C8782和T28144突变。
实施例4、本发明组合物特异性检测
使用本发明实施例1中所述的组合物，按照实施例2所述的方法进行检测。所述样本为两种高浓度（浓度为1.0E+08拷贝/mL）的假病毒样本。使用第一组合物和第二组合物分别检测2019新型冠状病毒C8782和T28144突变，以及2019新型冠状病毒T8782和C28144突变的假病毒模板，结果如图3-图6所示，各检测结果的Ct值见下表2。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE005
可见，不同组合物对2019新型冠状病毒C8782和T28144突变假病毒和2019新型冠状病毒T8782和C28144突变假病毒的扩增效率存在显著差异，各ΔCt的最小值（13.00）仍远大于实施案例2所述结果判定方法中对ΔCt的要求（10）。
以各组ΔCt中的最小值13.00计算，两个组合物对特异性模板和非特异性模板的扩增效率差异高达8192倍（2^13），特异性优异。
实施例5、本发明组合物灵敏度检测
使用本发明实施例1中所述的组合物，按照实施例2所述的方法进行检测。所述样本为假病毒样本（2019新型冠状病毒C8782和T28144突变假病毒和2019新型冠状病毒T8782和C28144突变假病毒）经生理盐水稀释梯度，各浓度梯度分别为1.0E+06拷贝/mL、1.0E+05拷贝/mL、1.0E+04拷贝/mL、1.0E+03拷贝/mL、1.0E+02拷贝/mL、1.0E+01拷贝/mL。分别使用第一组合物和第二组合物检测不同浓度的特异性模板，结果如图7-10所示。
第一组合物最低检测浓度为1.0E+03拷贝/mL（10拷贝/反应）。
第二组合物最低检测浓度为1.0E+03拷贝/mL（10拷贝/反应）。
对比例1、本发明另外的探针和引物组合物检测2019新型冠状病毒突变
在本发明创造过程中，针对每一个位点碱基，各设计数十条不同的特异性识别引物。这些引物均遵循ARMS引物设计原理，在3’端增加1-2个突变，使其能够有选择性地扩增特异靶标，部分对比引物的序列见下：
8782 C型正向对比引物：
8782 C-1：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTTAGC-3’（SEQ ID NO:11）；
8782 C-2：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTTATC-3’（SEQ ID NO:12）；
8782 C-3：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTTCGC-3’（SEQ ID NO:13）；
8782 C-4：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTTCTC-3’（SEQ ID NO:14）；
8782 C-5：5’-GCTGATTTTGACACATGGTCTCGT-3’（SEQ ID NO:15）；
8782 T型正向对比引物：
8782 T-1：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTTAGT-3’（SEQ ID NO:16）；
8782 T-2：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTTCGT-3’（SEQ ID NO:17）；
8782 T-3：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTTATT-3’（SEQ ID NO:18）；
8782 T-4：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTTCAT-3’（SEQ ID NO:19）；
8782 T-5：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTGATT-3’（SEQ ID NO:20）；
28144 T型正向对比引物：
28144 T-1：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTGTTT-3’（SEQ ID NO:21）；
28144 T-2：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTCTTT-3’（SEQ ID NO:22）；
28144 T-3：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTGGTT-3’（SEQ ID NO:23）；
28144 T-4：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTGGGT-3’（SEQ ID NO:24）；
28144 T-5：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTCTCT-3’（SEQ ID NO:25）；
28144 C型正向对比引物：
28144 C-1：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTGTTC-3’（SEQ ID NO:26）；
28144 C-2：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTCTTC-3’（SEQ ID NO:27）；
28144 C-3：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTGGTC-3’（SEQ ID NO:28）；
28144 C-4：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTGAGC-3’（SEQ ID NO:29）；
28144 C-5：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCAGGTC-3’（SEQ ID NO:30）。
使用这些引物，与实施例1中的其余引物、探针组合成组合物，按照实施例2所述的方法进行检测。所述样本为两种浓度为1.0E+08拷贝/mL的假病毒样本。检测结果见图11-14所示。各结果图中，实线为各引物扩增其特异性模板的结果（如8782C引物检测2019新型冠状病毒C8782和T28144突变模板——该模板中8782位点为C），虚线为该引物扩增非特异性模板的结果（如8782C引物检测2019新型冠状病毒T8782和C28144突变模板——该模板中8782位点为T）。
评价引物优劣的主要指标为引物的扩增效率和特异性。其中引物检测扩增特异性靶标的Ct值越小，其扩增效率越高；引物检测同浓度下特异性模板的Ct值和非特异性模板，二者Ct值的差值的绝对值约大越好，其特异性越好。
从各个结果中可以看出，各对比引物的扩增效率和特异性的综合性能均劣于本发明组合物。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctgattttg acacatggtt catc 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcggtaatt atacagtttc cagatt 26
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgattttg acacatggta tcgt 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcggtaatt atacagtttc ctttgc 26
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccattagttg tgcgtaatat cgt 23
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cttgcccatt gattgctgca gtcataa 27
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caacacgaac gtcatgatac tcta 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attgccagga acctaaattg ggtagt 26
<210> 9
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttaattaaag ttacacttgt gttccttttt gttgctgcta ttttctattt aataacacct 60
gttcatgtca tgtctaaaca tactgacttt tcaagtgaaa tcataggata caaggctatt 120
gatggtggtg tcactcgtga catagcatct acagatactt gttttgctaa caaacatgct 180
gattttgaca catggtttag ccagcgtggt ggtagttata ctaatgacaa agcttgccca 240
ttgattgctg cagtcataac aagagaagtg ggttttgtcg tgcctggttt gcctggcacg 300
atattacgca caactaatgg tgactttttg catttcttac ctagagtttt tagtgcagtt 360
ggtaacatct gttacacacc atcaaaactt atagagtaca ccaagaatgt agtttacagt 420
catgtactca acatcaacca tatgtagttg atgacccgtg tcctattcac ttctattcta 480
aatggtatat tagagtagga gctagaaaat cagcaccttt aattgaattg tgcgtggatg 540
aggctggttc taaatcaccc attcagtaca tcgatatcgg taattataca gtttcctgtt 600
taccttttac aattaattgc caggaaccta aattgggtag tcttgtagtg cgttgttcgt 660
tctatgaaga ctttttagag tatcatgacg ttcgtgttgt tttagatttc atctaaacga 720
acaaactaaa atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt 780
tggtggaccc tcagattcaa 800
<210> 10
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttaattaaag ttacacttgt gttccttttt gttgctgcta ttttctattt aataacacct 60
gttcatgtca tgtctaaaca tactgacttt tcaagtgaaa tcataggata caaggctatt 120
gatggtggtg tcactcgtga catagcatct acagatactt gttttgctaa caaacatgct 180
gattttgaca catggtttag tcagcgtggt ggtagttata ctaatgacaa agcttgccca 240
ttgattgctg cagtcataac aagagaagtg ggttttgtcg tgcctggttt gcctggcacg 300
atattacgca caactaatgg tgactttttg catttcttac ctagagtttt tagtgcagtt 360
ggtaacatct gttacacacc atcaaaactt atagagtaca ccaagaatgt agtttacagt 420
catgtactca acatcaacca tatgtagttg atgacccgtg tcctattcac ttctattcta 480
aatggtatat tagagtagga gctagaaaat cagcaccttt aattgaattg tgcgtggatg 540
aggctggttc taaatcaccc attcagtaca tcgatatcgg taattataca gtttcctgtt 600
caccttttac aattaattgc caggaaccta aattgggtag tcttgtagtg cgttgttcgt 660
tctatgaaga ctttttagag tatcatgacg ttcgtgttgt tttagatttc atctaaacga 720
acaaactaaa atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt 780
tggtggaccc tcagattcaa 800
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctgattttg acacatggtt tagc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gctgattttg acacatggtt tatc 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gctgattttg acacatggtt tcgc 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gctgattttg acacatggtt tctc 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gctgattttg acacatggtc tcgt 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gctgattttg acacatggtt tagt 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gctgattttg acacatggtt tcgt 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gctgattttg acacatggtt tatt 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gctgattttg acacatggtt tcat 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gctgattttg acacatggtt gatt 24
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atcggtaatt atacagtttc ctgttt 26
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atcggtaatt atacagtttc ctcttt 26
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atcggtaatt atacagtttc ctggtt 26
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atcggtaatt atacagtttc ctgggt 26
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
atcggtaatt atacagtttc ctctct 26
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
atcggtaatt atacagtttc ctgttc 26
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
atcggtaatt atacagtttc ctcttc 26
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
atcggtaatt atacagtttc ctggtc 26
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
atcggtaatt atacagtttc ctgagc 26
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
atcggtaatt atacagtttc caggtc 26

Claims (10)

1.一种检测2019新型冠状病毒突变的组合物，所述组合物包括：
第一核酸组合物：
8782 C型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTCATC-3’（SEQ ID NO:1）；
28144 T型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCAGATT-3’（SEQ ID NO:2）；和
第二核酸组合物：
8782 T型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTATCGT-3’（SEQ ID NO:3）；
28144 C型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTTTGC-3’（SEQ ID NO:4）；
其中，所述第一核酸组合物和所述第二核酸组合物分别还包括：
8782反向引物：5’-CCATTAGTTGTGCGTAATATCGT-3’（SEQ ID NO:5）；
8782探针：5’-CTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAA-3’（SEQ ID NO:6）；
28144反向引物：5’-CAACACGAACGTCATGATACTCTA-3’（SEQ ID NO:7）；和
28144探针：5’-ATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGT-3’（SEQ ID NO:8）。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，8782探针与28144探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述8782探针的荧光报告基团为HEX；所述28144探针的荧光报告基团为FAM。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一核酸组合物和第二核酸组合物在不同的包装中。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步含有用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
7.权利要求1~6中任一项所述的组合物在制备检测2019新型冠状病毒突变的试剂盒中的用途。
8.一种检测2019新型冠状病毒突变的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1~6中任一项所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括阳性对照。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述阳性对照含有2019新型冠状病毒基因组第8782位附近的序列以及第28144位附近的序列，并且其中第8782位为C或T，且第28144位为C或T。
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