CN111304325B - 一种口腔癌标志物-stoml1基因表达及其应用 - Google Patents

一种口腔癌标志物-stoml1基因表达及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种口腔癌新分子靶标及其应用，所述标志物包括STOML1基因及其表达产物在口腔癌研究领域中的应用。本发明通过免疫组化、Western blot和qPCR技术，发现并证实了STOML1基因在口腔癌组织中异常高表达；利用siRNA干扰技术，敲降STOML1基因在口腔癌细胞中的转录和翻译，发现并证实了siRNA‑STOML1可以抑制口腔癌细胞的迁移能力；以STOML1表达量作为输入变量构建了口腔癌预测模型，有助于大幅提高口腔癌早期诊断的准确率；另外，运用STOML1基因表达敲降技术，可能可以有助于遏制口腔癌的恶化与转移。本发明提供了该基因或其表达产物在口腔癌基础研究与临床领域中的应用。

Description

一种口腔癌标志物-STOML1基因表达及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种口腔癌标志物STOML1基因及其表达在口腔癌的诊断和治疗中的应用。
背景技术
口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有大于30万的新增病例，其中约2/3的患者来自我国和东南亚国家。近年来，我国与西方发达国家的口腔癌发病率均呈上升趋势，虽然外科手术结合化疗、生物治疗等治疗方案已成熟，很大程度提高了治疗效果，但是患者5年生存率并没有明显提高，仍在50％～55％范围内波动。因此，有效诊治口腔癌已经成为医学科学家们迫切需要解决的问题。
随着高通量测序等高精尖生物技术的迅猛发展，肿瘤的分子病理获得了革命性进步，特别是用于精准诊疗的生物标志物的研发正风起云涌。近年来，通过口腔学研究者们的不懈努力，已发现多种与口腔鳞癌发生发展相关的生物标记物。例如，HPV16、CDKN2A已被证实可以结合其他诊断技术作为有效的口腔鳞癌诊断标志物；另外，研究报道Cyclin D1、P8、CK19对口腔鳞癌的诊断和预后也具有很大的潜能。但是，由于口腔癌是一个多因素、多阶段、多机制的复杂病变过程，目前，尚无特异性针对口腔癌的单一分子诊疗的商品化产品上市，多依赖于多因子的联合诊疗。
发明内容
针对现有临床诊疗应用技术的不足，本发明提供了一种口腔癌的标志物及其应用，所述标志物为STOML1基因，有利于辅助口腔癌的早期诊疗。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种口腔癌标志物，所述标志物包括STOML1。
发明人在前期研究中已通过RNA-Seq技术，对两例口腔癌组织标本及其配对正常组织mRNA标本进行了测序和生物信息分析，结果提示：STOML1基因在口腔癌组织和正常组织的比对中可能存在表达差异。在本发明中，发明人运用免疫组化、Western blot和qPCR技术，通过扩大样本量检测，发现并证实了STOML1基因在口腔癌组织中确实存在着早期的异常高表达，并随着病变恶化其表达量有增高趋势。另外，通过siRNA技术敲降STOML1基因在癌细胞中的表达，能够明显抑制口腔癌细胞的迁移能力。因而，本发明的分子标志物STOML1基因，其在口腔癌病变组织细胞的异常表达出现早，信号强，灵敏度高，具有潜在的临床诊疗应用价值，即可在口腔癌早期发生时辅助诊断癌变程度及范围，又可以评估治疗效果和警示预后。
根据本发明，所述标志物还包括STOML1基因结构和表达异常，包括：SNP、Indel、CNV、mRNA和/或蛋白质等其它随之产生的异常结构状态或/和病理生理功能。当STOML1基因异常时，其转录的mRNA和翻译的蛋白质也会随之发生表达异常。通过检测STOML1本身或其表达的mRNA和蛋白质均有助于对早期口腔癌的辅助诊断与鉴别诊断，以及对口腔癌治疗疗效的评估。
根据本发明，所述标志物在口腔原位癌细胞和/或口腔癌组织中高表达。
第二方面，本发明提供了一种STOML1基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括STOML1引物。
优选地，所述STOML1引物的核酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；
SEQ ID NO:1：GACACCGTGGAGATGGTGAG；
SEQ ID NO:2：ATTGAACTGGTAGCAGGCCC。
优选地，所述基因检测试剂盒还包括qPCR预混液。
优选地，所述qPCR预混液包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料或Taq DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的标志物和/或如第二方面所述的基因检测试剂盒在制备口腔癌诊断与疗效评估试剂中的应用。
第四方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括STOML1基因和/或其表达产物的抑制剂，所述抑制剂包括抑制STOML1基因表达的产物，抑制STOML1基因表达稳定性的产物，或抑制STOML1基因表达产物活性的物质，进一步所述抑制剂是针对STOML1基因的siRNA。
优选地，所述STOML1-siRNA的核酸序如SEQ ID NO:3～4所示；
SEQ ID NO:3：GGAGAUGGUGAGUGAAGUUTT；
SEQ ID NO:4：AACUUCACUCACCAUCUCCTT。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的标志物和/或如第四方面所述的药物组合物在制备口腔癌治疗药物中的应用。
第六方面，本发明提供了一种口腔癌预测模型，所述预测模型为logistic回归模型；
所述预测模型的输入变量为如第一方面所述的标志物的表达量。
本发明中，logistic回归分析是一种广义的线性回归分析模型，利用logistic回归分析将临床样本与STOML1标志物建立联系，建立预测模型，进行数据挖掘，实现了口腔癌的早期自动诊断，根据标志物STOML1预测口腔癌的发生概率；通过logistic回归分析，可以得到自变量的权重，从而可以大致了解疾病的危险因素，同时根据危险因素的权重值预测个体患病的可能性。
本发明中，通过logistic回归模型和ROC曲线分析，获得AUC值预测口腔癌的患病风险，AUC值为ROC曲线下覆盖的区域面积，AUC值越大，分类器的分类效果越好，AUC＝1是理想的分类器，但实际情况下AUC的值介于0.5到1之间时，通过设定合适的阈值，可用于预测。
优选地，所述标志物的表达量的计算公式为：
＝PI×I；
其中，PI为免疫组织化学染色后样本中肿瘤细胞的百分数，I为免疫组织化学染色强度。
根据本发明，临床上肿瘤的确诊依据主要为病理学检查，因此，从严瑾的医学角度来说，相比于分子标志物的基因诊断结果，免疫组化结果具有更高的准确性，但是，常规的免疫组化分析具有又无法实现肿瘤的快速早期诊断；
因此，为解决这一问题，实现对口腔癌的早期快速准确性诊断，本发明中采用组织化学评分(histochemistry score，H-score)处理免疫组化结果，将组织芯片中肿瘤细胞的数量及其染色强度转化为相应的数值，实现了对组织染色半定量的目的，采用H-score作为标志物的表达量输入logistic回归模型，实现了基于免疫组化结果构建高精准性口腔癌早期预测模型的目的。
第七方面，本发明提供了一种如第六方面所述的预测模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
(1)在已知临床信息的样本中采用STOML1的抗体和酶标二抗进行染色；
(2)加入AEC显色后，将样本进行苏木素染色和甘油明胶封片，统计样本中肿瘤细胞的百分数，根据标志物表达量的计算公式计算样本中STOML1的表达量；
(3)采用logistic回归模型对STOML1的表达量进行差异性分析，构建得到所述预测模型。
优选地，步骤(1)所述样本包括石蜡包埋口腔癌组织芯片和/或健康样本。
优选地，步骤(2)所述标志物的表达量的计算公式为：
H-score＝PI×I；
其中，PI为免疫组织化学染色后样本中肿瘤细胞的百分数，I为免疫组织化学染色强度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用STOML1基因作为口腔癌的分子标志物，在癌灶局部组织中阳性信号强，并在癌变组织细胞早期可以检出，有利于辅助进行口腔癌早期癌变病理的判断；
(2)本发明以STOML1作为分子标志物构建的试剂盒，通过检测STOML1基因、mRNA与蛋白质的表达差异，与其他检测手段相互配合，提高了口腔癌检测的敏感性和准确性，有利于口腔癌的早期诊断、疗效评估与预后判定；
(3)本发明以STOML1作为输入变量构建的logistic回归模型对口腔原位癌或早期***进行早期预测，有助于大幅度地提高口腔癌早期诊断的准确率、口腔癌患者的5年存活率和生存质量，对治疗策略具有指导作用；
(4)本发明对口腔鳞癌发生发展的分子调控机制研究提供了新思路和新策略。
附图说明
图1.qPCR分析STOML1 mRNA在口腔癌组织中的表达情况；
图2.免疫组化分析STOML1蛋白质在口腔癌组织中的表达情况；
图3.Western blot检测siRNA对STOML1蛋白质表达的影响；
图4.Transwell法检测STOML1基因表达对口腔鳞癌细胞迁移活性的影响；
图5.STOML1在口腔鳞状细胞癌组织和正常口腔上皮组织中的表达情况；
图6.STOML1对预测模型的AUC曲线，AUC面积为0.9184。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
样本：
口腔癌组织样本来自于口腔癌微阵列组织芯片(OR208，OR601b，US Biomax)，选购于西安艾丽娜生物科技有限公司，共包括口腔癌组织110例和癌旁口腔组织19例。
实施例1实时荧光定量PCR检测样本中的STOML1 mRNA的差异表达
(1)每份组织进行液氮研磨后，加入1mL Trizol试剂，室温放置5min，收集混合液至无RNA酶的1.5mL离心管中；
(2)加入200μL三氯甲烷，充分混匀后用手剧烈震荡20s，充***解后室温静置2min，4℃、12000rpm离心15min；
(3)小心吸取出上清至新的无RNA酶1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min，4℃、12000rpm离心10min；
(4)75％乙醇洗涤两次，操作台风干后加入40μL无酶水溶解，采用Nanodrop 2000测量RNA浓度，分装保存；
(5)以1μg总RNA为模板，进行反转录获得cDNA，体系(10μL)包括2×TransStartTip Green qPCR SuperMix 2μL，正、反向引物SEQ ID NO:1～2(10μM)各0.5μL，cDNA模板1μL，双蒸水定容至10μL；反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃45s，40个循环，循环结束后从55℃开始每10s上升0.5℃，取荧光值绘制曲线，确定扩增产物的特异性；
(6)以GAPDH为内参计算口腔鳞癌组织与正常组织荧光定量RT-PCR的实验结果，两者之间差异采用t检验，以p<0.05具有统计学差异。
结果如图1所示，与周围正常组织相比，STOML1基因在口腔鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例2免疫组化检测样本中的STOML1蛋白质表达差异
将石蜡包埋的组织芯片置于60℃烘箱1h，TO透明剂脱蜡3次，每次10min；依次采用100％、95％和75％酒精梯度浸泡样本各5分钟，双蒸水清洗3次，PBS缓冲液清洗3次，每次5min；
将芯片置于抗原修复液中，置于蒸锅上加热30min，自然冷却至室温，PBS清洗3次，每次5min，3％过氧化氢液浸泡玻片30min，PBS清洗3次，每次5min；
STOML1抗体孵育过夜，PBS清洗3次，滴加PV9000反应增强液，室温孵育20min，PBS清洗3次，每次5min；
滴加PV9000增强酶标抗兔IgG聚合物，室温孵育20min，PBS清洗3次，每次5min；
AEC检测试剂盒显色，显色后，PBS清洗3次，每次5min，将组织芯片置于苏木素染液中染色10-20s后，在自来水流缓冲10min，甘油明胶封片，显微镜进行扫描拍照，呈像软件统计阳性信号。
结果如图2所示，与周围正常组织相比，STOML1蛋白质在口腔鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例3蛋白质免疫印迹检测口腔鳞癌细胞系样本中STOML1蛋白质的表达差异
(1)细胞培养
口腔鳞状癌细胞系Ca9-22和Tca-8113的培养基为RPMI-1640，发育不良的口腔角质形成细胞系DOK和正常口腔上皮细胞系HOEC的培养基为DMEM；以含有10％胎牛血清的培养基在含有5％CO2的37℃培养箱中培养。
(2)细胞中总蛋白质提取
采用4℃预冷的PBS洗涤组织三次后，加入适量RIPA裂解液，4℃旋转摇床孵育30min，充***解后移入离心管中，4℃，12000rpm，离心10min，上清即为总蛋白质，CBB法测定浓度后备用。
(3)蛋白质免疫印迹检测检测STOML1蛋白质含量
蛋白质样品按照50-100μg蛋白质/孔上样，电泳SDS-PAGE胶，120V恒压电泳；电泳结束后转膜，4℃，300mA恒流转膜3h；
转膜后添加特异性STOML1的一抗，4℃摇床孵育过夜，添加二抗后室温孵育1h，ELC化学曝光利用化学发光型凝胶成像***拍照。
结果发现，与口腔角质形成细胞系DOK和正常口腔上皮细胞HOEC相比，STOML1在口腔鳞癌细胞系中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例4STOML1基因的表达敲降
(1)细胞培养
口腔鳞状癌细胞系Tca-8113以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在含有5％CO2的37℃培养箱中培养，2-3天换液，以含有0.25％EDTA的胰酶消化传代。
(2)siRNA设计
针对沉默STOML1基因，设计siRNA序列，如SEQ ID NO:3～4所示；
SEQ ID NO:3：5’-GGAGAUGGUGAGUGAAGUUTT-3’；
SEQ ID NO:4：5’-AACUUCACUCACCAUCUCCTT-3’。
同时设置STOML1基因阴性对照组的siRNA序列(siRNA-NC)，如SEQ ID NO:5～6所示；
SEQ ID NO:5：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
SEQ ID NO:6：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
将4-5×104细胞接种在24孔细胞培养板上，每孔加0.5mL含10％FBS无抗生素的RPMI1640细胞培养基培养24小时，转染按照转染试剂lipofectamine2000的说明书进行。
将实验分为三组：空白组(Tca8113)，对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA-STOML1)，同时分别进行转染。
(3)蛋白质免疫印迹检测STOML1蛋白质表达差异
具体步骤同实施例3。
结果如图3所示，相比空白组(Tca8113)和对照组(siRNA-NC)，实验组(siRNA-STOML1)能够显著降低STOML1基因的表达，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例5Transwell法检测细胞迁移能力的差异
应用Transwell法检测STOML1基因沉默对Tca8113细胞增殖活性的影响。
(1)细胞培养
将Tca-8113细胞按1×103/孔接种入96孔板中，以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在含有5％CO2的37℃培养箱中培养。
(2)细胞转染步骤同实施例4。
(3)Transwell检测
细胞接种：向小室中加入200μL细胞悬液(含1×104个细胞)，用枪轻轻打匀成单个细胞；下室中加入500μL含15％FBS的RPMI1640完全培养基，置37℃5％CO2细胞培养箱培养24小时；
细胞染色和拍照：弃孔内培养基，将小室取出，用PBS漂洗3次，每次1min，将小室内PBS吸取干净后，置于加入500μL甲醇的24孔细胞培养板中；在上室中加入200μL甲醇，固定10min；弃去固定液，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸取干净，置于加入500μL 0.01％结晶紫染液的24孔细胞培养板中，染色15min；将小室转移至新的24孔细胞培养板中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去除小室内未穿过上室膜面的细胞；自然干燥，用倒置显微镜观察迁移到下室膜面的细胞，200×光镜下随机计数，以迁移到下室膜面的细胞相对数目表示Tca-8113细胞的迁移穿透能力。
如图4所示，与对照组相比，转染siRNA-STOML1组的细胞迁移能力显著下降。
实施例6模型建立和预测分析
对实施例2的免疫组化分析结果采用半自动计算机图像分析***进行分析，计算标志物的H-score，H-score＝PI×I，其中，PI为肿瘤细胞的百分数，I为染色强度，图5为STOML1在口腔鳞状细胞癌组织和正常口腔上皮组织中的H-score，可以看出，与癌旁组织相比，口腔鳞状细胞癌组织中的STOM1呈现显著性差异表达，STOM1在口腔鳞状细胞癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达。
采用logistic回归模型对STOML1的H-score进行差异性分析，建立预测模型，纳入ROC曲线分析中，进行预测，如图6所示，STOML1的AUC曲线下面积为0.9184，即预测效率为91.84％。
综上所述，本发明首次发现了STOML1与口腔癌的发生发展相关，并验证了STOML1在口腔癌中异常高表达，STOML1可作为口腔癌的独立相关因子，也可以和其他标志物联合应用；STOML1作为独立相关因子构建的logistic预测模型可以对口腔原位癌或早期***进行早期预测；运用STOML1基因表达敲降技术，再联合其他治疗方法，可以有助于遏制口腔癌的恶化与转移。总之，此发明的认知与实践将有助于大幅提高口腔癌早期诊断的准确率、口腔癌患者的5年存活率和生存质量，对治疗策略具有指导作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种口腔癌标志物 - STOML1基因表达及其应用
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
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Claims (2)

1.一种药物组合物在制备口腔鳞状癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括STOML1-siRNA；
所述STOML1-siRNA的核酸序列如SEQ ID NO: 3~4所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
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