CN111298128B - 一种高效靶向纳米疫苗载体及其制备方法、靶向纳米疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效靶向纳米疫苗载体,包括线性聚α‑赖氨酸,所述线性聚α‑赖氨酸上接枝有甘露糖和对甲苯磺酰基保护的精氨酸;所述线性聚α‑赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10~100);所述线性聚α‑赖氨酸与甘露糖的摩尔比为1:(1~30)。本发明将正电性Man‑PLL‑RT分子作为靶向疫苗载体,去担载负电性抗原和佐剂,在BMDC细胞中能够有效提高抗原和佐剂的内吞效率,同时能够高效活化BMDC细胞,提高抗原交叉呈递作用,激活体内免疫反应。本发明还提供了一种高效靶向纳米疫苗载体的制备方法、靶向纳米疫苗和靶向纳米疫苗的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,尤其涉及一种高效靶向纳米疫苗载体、其制备方法、靶向纳米疫苗及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要杀手之一,其发病率、死亡率和年轻化呈现逐年走高的趋势。目前,癌症的临床治疗手段主要是手术、放射治疗和化学药物治疗。但是,这些传统的治疗方式均无法彻底清除肿瘤细胞并有效控制肿瘤细胞的转移和复发。近年来,肿瘤的免疫治疗被评为【Science】2013年度十大科学突破之首,开启了肿瘤免疫治疗的新篇章。
诱导产生特异性的抗肿瘤免疫应答是肿瘤免疫治疗的关键。[参见Mellman I,Coukos G,Dranoff G.Cancer immunotherapy comes of age,Nature.2011,480:480-489.]。而肿瘤疫苗可诱导机体产生特异性肿瘤免疫应答,利用机体自身的免疫***诱导产生持续性抗肿瘤免疫力,激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL),从而对肿瘤细胞的特异性杀伤,被认为是最有临床前景的肿瘤免疫疗法。肿瘤疫苗能够特异性地攻击和破坏肿瘤细胞而不损伤正常细胞。因此,肿瘤疫苗有望彻底清除肿瘤细胞并有效控制肿瘤细胞的转移和复发。肿瘤疫苗发挥作用的过程如下:肿瘤抗原被抗原提呈细胞摄取后,被加工成短肽并呈递给初始T细胞,初始T细胞活化产生识别并杀伤肿瘤的效应T细胞,效应T细胞随后血液循环至肿瘤部位,识别并杀伤肿瘤。肿瘤疫苗发挥作用的关键在于引发肿瘤特异性的细胞免疫应答。[参见Chen DS,Mellman I.Oncology meets immunology:thecancer-immunity cycle.Immunity.2013;39:1-10.]。
然而,肿瘤抗原通常是以外源性抗原的形式通过细胞内吞作用被抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APC)摄入,并进一步在内涵体或溶酶体的酸性环境中被降解加工,提呈给CD4+T细胞,主要诱导体液免疫反应,不能够产生有效的细胞免疫应答。[参见Rock KL,Chen I.Cross-presentation:underlying mechanisms and role in immunesurveillance.Immunol Rev.2005,207:166-183.]。疫苗载体可将肿瘤抗原蛋白递送到APC细胞中,通过内涵体逃逸和抗原的交叉呈递作用,引发细胞免疫应答,实现肿瘤细胞特异性杀伤。[参见Guan XW,Chen J,Hu YY,Lin L,Sun PJ,Tian HY,Chen XS.Highly enhancedcancer immunotherapy by combining nanovaccine withhyaluronidase.Biomaterials.2018,171:198-206.]。如何实现肿瘤抗原在APC细胞内的高效递送是肿瘤疫苗成功实施的前提。通过设计合适的疫苗递送载体,选择性地将肿瘤抗原递送到APC细胞可有效增强免疫反应。另一方面,纳米疫苗可与佐剂协同传递抗原,显著增强免疫原性,诱导机体产生强大的先天免疫和适应性免疫,增强抗原特异性免疫反应。[参见Ahmed KK,Geary SM,SalemAK.Surface engineering tumor cells with adjuvant-loaded particles for use as cancer vaccines.J Control Release.2017,248:1-9.]。因此,亟需开发智能性肿瘤疫苗载体,实现抗原蛋白在APC细胞内高效内吞、内涵体逃逸和交叉呈递作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效靶向纳米疫苗载体及其制备方法靶向纳米疫苗及其制备方法,本发明中的高效靶向纳米疫苗载体够提高抗原和佐剂的内吞效率,同时能够高效活化树突状细胞,激活机体的免疫反应。
本发明提供一种高效靶向纳米疫苗载体,包括线性聚α-赖氨酸,所述线性聚α-赖氨酸上接枝有甘露糖和对甲苯磺酰基保护的精氨酸;
所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10~100);
所述线性聚α-赖氨酸与甘露糖的摩尔比为1:(1~30)。
优选的,所述线性聚α-赖氨酸的数均分子量为3000~30000。
本发明提供一种高效靶向纳米疫苗载体的制备方法,包括以下步骤:
A)将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化,再加入线性聚α-赖氨酸的水溶液进行反应,将反应后的溶液进行透析和冻干,得到冻干产物;
所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1:(10~100);
B)将所述步骤A)中的冻干产物与三氟乙酸进行反应,加入无水***沉降,真空干燥和透析后,得到阳离子聚合物;
C)将N,N'-二异丙基乙胺、活化后的甘露糖和所述步骤B)中的阳离子聚合物混合,进行反应,反应后的产物透析和冻干,得到高效靶向纳米疫苗载体;
所述甘露糖按照以下步骤进行活化:
将甘露糖加入氢氧化钠溶液中,搅拌均匀后加入氯乙酸水溶液进行反应,然后加入盐酸,使反应后的甘露糖羧基化,最后加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并***,进行活化,得到活化的甘露糖。
优选的,所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸按照以下步骤进行活化:
将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中,加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并***,进行活化;
得到的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液的质量浓度为0.02~0.5mg/mL。
优选的,所述步骤A)反应的温度为20~37℃;所述步骤A)反应的时间为24~96小时;
所述步骤A)中透析的时间为2~5天;所述步骤A)中冻干的温度为-30~-80℃。
优选的,所述步骤B)中冻干产物的质量与三氟乙酸的物质的量之比为1g:(1~5)mL;
所述步骤B)中的反应的温度为20~35℃,所述步骤B)中反应的时间为0.5~24小时。
优选的,所述步骤C)反应的温度为20~37℃;所述步骤C)反应的时间为12~96小时;
所述步骤C)中透析的时间为2~5天;所述步骤C)中冻干的温度为-30~-80℃。
优选的,所述甘露糖的活化步骤具体为:
将甘露糖加入氢氧化钠溶液中,搅拌均匀后加入氯乙酸水溶液,在20~90℃下反应2~48小时,然后加入盐酸,调整pH值为1.5~4,使反应后的甘露糖羧基化,最后加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并***,活化10~60min,得到活化的甘露糖。
本发明提供一种靶向纳米疫苗,包括载体和担载在所述载体上的抗原和佐剂;
所述载体为上文所述的高效靶向纳米疫苗载体;所述抗原和佐剂均带负电;
所述抗原为蛋白抗原或多肽抗原;所述佐剂核酸类佐剂和/或STING信号通路激动剂,
所述载体、抗原和佐剂的质量比为(1~100):(0.5~10):1。
本发明提供上文所述的靶向纳米疫苗的制备方法,包括以下步骤:
将载体、抗原和佐剂在水溶液中进行复合,得到靶向纳米疫苗;
所述载体的质量浓度为0.5~5mg/mL,所述抗原的质量浓度为0.2~5mg/mL,所述佐剂的质量浓度为0.05~2.5mg/mL;
所述复合的温度为15~30℃,所述复合的时间为10~30min。
本发明提供了一种高效靶向纳米疫苗载体,包括线性聚α-赖氨酸,所述线性聚α-赖氨酸上接枝有甘露糖和对甲苯磺酰基保护的精氨酸;所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10~100);所述线性聚α-赖氨酸与甘露糖的摩尔比为1:(1~30)。本发明将正电性Man-PLL-RT分子作为靶向疫苗载体,去担载负电性抗原和佐剂,在BMDC细胞中能够有效提高抗原和佐剂的内吞效率,同时能够高效活化BMDC细胞,提高抗原交叉呈递作用,激活体内免疫反应。
靶向纳米疫苗的内吞实验表明,本发明的靶向纳米疫苗载体担载抗原和佐剂后,与水溶性抗原和佐剂相比,其内吞量均显著增加,所述靶向纳米疫苗,有利于促进抗原及佐剂的内吞;
BMDC细胞的成熟研究表明,相比PBS和OVA/CpG组,本发明中的靶向纳米疫苗组能够有效上调BMDC细胞表面成熟分子的表达,即活化激活树突细胞,提高疫苗的效率;
BMDC细胞活化因子分泌实验表明,细胞因子分泌的结果与BMDC细胞成熟实验结果一致。相比PBS组,本发明那种的靶向纳米疫苗组明显促进BMDC细胞分泌免疫活化细胞因子TNF-α和IL-12,说明本发明所述的靶向纳米疫苗能够高效活化树突细胞;
抗原交叉呈递作用检测表明,相对于PBS组,靶向纳米疫苗组明显促进BMDC细胞的抗原交叉呈递作用,说明本发明所述的靶向纳米疫苗能够高效活化CD8+T细胞,从而激活机体的细胞免疫。
具体实施方式
本发明提供了一种高效靶向纳米疫苗载体,包括线性聚α-赖氨酸,所述线性聚α-赖氨酸上接枝有甘露糖和对甲苯磺酰基保护的精氨酸;
所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10~100);
所述线性聚α-赖氨酸与甘露糖的摩尔比为1:(1~30)。
在本发明中,所述线性聚α-赖氨酸的数均分子量优选为3000~30000,更优选为5000~25000,最优选为10000~20000,具体的,在本发明的实施例中,可以是15000Da。
在本发明中,所述线性聚α-赖氨酸(PLL)与甘露糖(Mannose)的摩尔比优选为1:(1~30),更优选为1:(5~25),最优选为1:(10~15),具体的,在本发明的实施例中,可以是1:5、1:10或1:15。所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos))的摩尔比优选为1:(10~100),更优选为1:(40~80),最优选为1:(50~70),具体的,在本发明的实施例中,可以是1:90。
本发明还提供了一种高效靶向纳米疫苗载体的制备方法,包括以下步骤:
A)将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化,再加入线性聚α赖氨酸的水溶液进行反应,将反应后的溶液进行透析和冻干,得到冻干产物;
所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1:(10~100);
B)将所述步骤A)中的冻干产物与三氟乙酸进行反应,加入无水***沉降,真空抽干和透析后,得到阳离子聚合物;
C)将N,N'-二异丙基乙胺、活化后的甘露糖和所述步骤B)中的阳离子聚合物混合,进行反应,反应后的产物透析和冻干,得到高效靶向纳米疫苗载体;
所述甘露糖按照以下步骤进行活化:
将甘露糖加入氢氧化钠溶液中,搅拌均匀后加入氯乙酸水溶液进行反应,然后加入盐酸,使反应后的甘露糖羧基化,最后加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并***,进行活化,得到活化的甘露糖。
本发明先将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化,然后在活化后的溶液中加入线性聚α-赖氨酸,进行反应,最后将反应后的溶液进行透析和冻干,得到冻干产物。
本发明优选按照以下步骤对对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化:
将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中(DMF),加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和1-羟基苯并***(HOBT),进行活化。
在本发明中,得到的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液的质量浓度优选为0.02~0.5mg/mL,更优选为0.05~0.4mg/mL,最优选为0.1~0.3mg/mL,具体的,在本发明的实施例中,可以是0.2mg/mL。
在本发明中,所述1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐与甘露糖的摩尔比优选为(1~5):1,更优选为(2~4):1;所述1-羟基苯丙***与甘露糖的摩尔比优选为(1~5):1,更优选为(2~4):1。
在本发明中,所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的活化温度优选为室温,活化的时间优选为0.5~2小时,更优选为1~1.5小时。
活化完成后,本发明将线性聚α-赖氨酸的水溶液加入上述活化溶液中,在室温下进行反应。
在本发明中,所述线性聚α-赖氨酸水溶液的浓度优选为0.05~0.5mg/mL,更优选为0.1~0.4mg/mL,最优选为0.2~0.3mg/mL。
所述线性聚α-赖氨酸(PLL)与精氨酸接枝反应的温度优选为20~37℃,更优选为25~30℃,所述接枝反应的时间优选为24~96小时,更优选为48~84小时,最优选为68~72小时。
完成上述反应后,本发明将得到的反应溶液进行透析和冻干,得到冻干产物。
在本发明中,所述透析所使用的透析袋的分子量优选为3500,适用于数均分子量为15000的线性聚-α-赖氨酸。每隔6小时换一次透析水,优选透析48~96小时,更优选为70~75小时。
所述冻干优选采用冷冻干燥机进行,所述冷阱的温度设定为-50~-80℃,优选为-60~-70℃。
得到冻干产物后,本发明将冻干产物与溶剂三氟乙酸进行反应,加入无水***沉降,真空干燥和透析后,得到阳离子聚合物PLL-RT。
在本发明中,所述冻干产物的质量与三氟乙酸的物质的量之比为1g:(1~5)mL,优选为1g:(2~4)mL;与所述三氟乙酸反应的时间优选为0.5~24小时,更优选为2~12小时,最优选为4~5小时;与所述三氟乙酸反应的温度优选为20~35℃,更优选为25~30℃。
本发明对所述无水***的用量没有特殊的限制,能够将**沉降完全即可。
沉降完全之后,本发明反应溶液进行真空干燥和透析,得到阳离子聚合物PLL-RT。
在本发明中,所述真空干燥的温度优选为20~35℃,更优选为25~30℃;所述真空干燥的时间优选为1~10小时,更优选为3~8小时,最优选为5~6小时;所述透析所使用的透析袋的分子量优选为3500,每隔6小时换一次透析水,优选透析48~96小时,更优选为70~75小时。
得到阳离子聚合物之后,本发明将活化后的甘露糖(Mannose)与所述阳离子聚合物PLL-RT进行反应,得到高效靶向纳米疫苗载体Man-PLL-RT。
在本发明中,按照以下步骤对甘露糖活化:
将甘露糖加入氢氧化钠溶液中,搅拌均匀后加入氯乙酸水溶液进行反应,然后加入盐酸,使反应后的甘露糖羧基化,最后加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并***,进行活化,得到活化的甘露糖。
在本发明中,所述氢氧化钠溶液的浓度优选为0.5~2mol/L,更优选为0.8~1.2mol/L;所述氯乙酸与阳离子聚合物PLL-RT的摩尔比优选为(10~100):1,更优选为(40~60):1;所述加入氯乙酸后的反应温度优选为20~90℃,更优选为40~80℃,最优选为50~70℃;加入所述氯乙酸后的反应时间优选为2~24小时,更优选为6~18小时,最优选为10~14小时。
上述反应完毕之后,本发明在上述反应溶液中加入盐酸,调节pH值,是反应后的甘露糖羧基化。
本发明优选将pH值调节至1~4,更优选为2~3;本发明所使用的盐酸的浓度优选为0.5~2mol/L,更优选为0.8~1.2mol/L。
将所述甘露糖羧基化后,本发明将1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和1-羟基苯并***(HOBT)水溶液加入上述羧基化的体系中,进行活化。
在本发明中,所述EDC·HCl与PLL-RT的摩尔比为(0.5~5):1,更优选为(1~3):1;所述HOBT与PLL-RT的摩尔比为(0.5~5):1,更优选为(1~3):1。在本发明中,所述活化的温度优选为20~37℃,更优选为25~30℃;所述活化的时间优选为10~60min,更优选为20~40min,最优选为25~35min。
活化完成之后,本发明在所述活化的甘露糖溶液中加入PLL-RT和N,N'-二异丙基乙胺(DIPEA),搅拌,进行甘露糖的接枝反应,反应后的产物透析、冻干,得到高效靶向纳米疫苗载体Man-PLL-RT。
在本发明中,所述PLL-RT与活化后的甘露糖的摩尔比优选为(0.1~0.5):1,更优选为(0.2~0.3):1,最优选为0.4:1;所述N,N'-二异丙基乙胺与甘露糖的摩尔比优选为(1~5):1,更优选为(2~4):1,最优选为(2~3):1。所述甘露糖的接枝反应的温度优选为20~37℃,更优选为25~30℃;所述甘露糖的接枝反应的时间优选为12~96小时,更优选为24~72小时,最优选为36~60小时。
在本发明中,完成甘露糖接枝后的透析使用的透析袋的分子量优选为3500,每隔6小时换一次透析水,优选透析48~96小时,更优选为70~75小时。
所述冻干优选采用冷冻干燥机进行,所述冷阱的温度设定为-50~-80℃,优选为-60~-70℃。
本发明还提供了一种靶向纳米疫苗,包括载体和担载在所述载体上的抗原和佐剂;
所述载体为上文所述的高效靶向纳米疫苗载体Man-PLL-RT;所述抗原和佐剂均带负电;
所述抗原为蛋白抗原或多肽抗原;所述佐剂核酸类佐剂和/或STING信号通路激动剂,
所述载体、抗原和佐剂的质量比为(1~100):(0.5~10):1。
本发明那种的靶向纳米疫苗中的载体为上文所述的高效靶向纳米疫苗载体Man-PLL-RT,其成分和制备方法与上文所述一致,在此不再赘述。
本发明对所述抗原的种类没有特殊的要求,可以通过担载多种类型的抗原和佐剂,对不同类型的疾病进行免疫。在本发明中,所述抗原优选为带负电的抗原,更优选为蛋白抗原、多肽抗原和其他带有负电性的抗原中的一种或几种;所述佐剂优选为带负电的佐剂,更优选为核酸类佐剂和/或STING信号通路激动剂。
在本发明中,所述载体、抗原和佐剂的质量比为(1~100):(0.5~10):1,更优选为(10~90):(1~8):1,最优选为(10~50):(2~5):1。
在本发明中,所述靶向纳米疫苗的粒度优选为50~500nm,更优选为60~200nm。
本发明还提供了一种靶向纳米疫苗的制备方法,包括以下步骤:
将载体、抗原和佐剂在水溶液中进行复合,得到靶向纳米疫苗;
所述载体的质量浓度为0.5~5mg/mL,所述抗原的质量浓度为0.2~5mg/mL,所述佐剂的质量浓度为0.05~2.5mg/mL;
所述复合的温度为15~30℃,所述复合的时间为10~30min。
在本发明中,所述载体的质量浓度优选为0.5~5mg/mL,更优选为1~2mg/mL;所述抗原的质量浓度为0.2~5mg/mL,更优选为0.5~2mg/mL;所述佐剂的质量浓度为0.05~2.5mg/mL,更优选为0.25~1.5mg/mL。
在本发明中,所述复合的温度优选为15~30℃,更优选为20~25℃;所述复合的时间优选为10~30min,更优选为15~25min。
本发明提供了一种高效靶向纳米疫苗载体,包括线性聚α-赖氨酸(PLL)、接枝在PLL上的甘露糖(Mannose)和对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos));所述PLL与Arg(Tos)的摩尔比为1:(10~100);所述PLL与Mannose的摩尔比为1:(1~30)。本发明将正电性Man-PLL-RT分子作为疫苗载体,去负载负电性抗原和佐剂,能够有效提高抗原和佐剂的内吞效率,同时能够高效活化树突状细胞,提高抗原交叉呈递作用,激活体内免疫反应。本发明还提供一种高效靶向纳米疫苗载体的制备方法。
实验结果表明,采用本发明的高效靶向纳米疫苗载体,担载抗原和佐剂后,在BMDC细胞中内吞量与水溶性抗原和佐剂相比均有显著增加。本发明的纳米疫苗能够促进BMDC细胞的成熟并分泌免疫活化因子TNF-α和IL-12。同时,该纳米疫苗具有抗原交叉呈递能力,有效激活免疫***的功能。
为了进一步说明本发明,以下结合实施例对本发明提供的一种高效靶向纳米疫苗载体、其制备方法、靶向纳米疫苗及其制备方法进行详细描述,但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 PLL-RT的制备
将线性聚-α-赖氨酸(分子量15000Da)溶解于去离子水中,对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶解于DMF中。然后,加入EDC·HCl和HOBT,室温下活化反应1小时,再缓慢加入PLL的水溶液,室温反应72小时。透析和冻干后,将产物在三氟乙酸的条件下反应4小时,加无水***沉降,真空抽干,透析,冻干得到白色固体产物PLL-RT。
聚-α-赖氨酸接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos))的接枝摩尔比为1:90。
实施例2靶向疫苗载体Man-PLL-RT的制备
将甘露糖溶解在1mL的NaOH(1M)中,搅拌30分钟,然后加入1mL氯乙酸水溶液,在60℃C条件下反应12小时。加入250μL盐酸(1M),调pH值至2.5,使得反应后的甘露糖羧基化。将加入的EDC·HCl和HOBT水溶液,对产物进行活化30分钟。再加入PLL-RT和DIPEA,30℃下搅拌反应48小时,透析和冻干后得到Man-PLL-RT。
PLL-RT对甘露糖的接枝摩尔比分别为1:5、1:10和1:15。
实施例3靶向纳米疫苗的制备
将靶向疫苗载体Man-PLL-RT、卵清白蛋白OVA抗原和寡聚核苷酸CpG佐剂分别溶于超纯水中,形成水溶液,浓度分别为5mg/mL、1mg/mL和0.5mg/mL。再将载体与抗原和佐剂等体积复合,复合比例为载体:抗原:佐剂的质量比为10:2:1。涡旋30s混匀后,室温下孵育20分钟,得到靶向纳米疫苗。
实施例4靶向纳米疫苗的表征
对上述纳米疫苗进行粒径和电位测试,结果参见表1。
表1实施例3的电位粒径测试结果
平均直径(nm) | 电位(mV) | |
OVA/CpG | 1462.2 | -12.5 |
PLL-RT/OVA/CpG | 77.7 | 25.4 |
Man-PLL-RT/OVA/CpG | 80.1 | 15.4 |
由以上测试结果可知,纳米疫苗载体能够有效压缩水溶性抗原和佐剂的粒径,且由于纳米疫苗载体带正电,使得最终形成的纳米疫苗表面带正电性,有利于抗原提呈细胞的内吞作用。
实施例5靶向纳米疫苗的内吞
BMDC细胞诱导成功后,按照5×105细胞/孔的密度接种于24孔培养板中,继续培养24小时。加入荧光标记材料(样品分别为:PBS、OVA-FITC/CpG-Cy5,PLL-RT/OVA-FITC/CpG-Cy5和Man-PLL-RT/OVA-FITC/CpG-Cy5),继续培养4小时后,用流式细胞仪检测抗原和佐剂的内吞。
表2实施例5的抗原和佐剂内吞结果
OVA内吞效率(%) | CpG内吞效率(%) | |
PBS | 0.97 | 0.93 |
OVA/CpG | 15.2 | 12.5 |
PLL-RT/OVA/CpG | 21.3 | 23.9 |
Man-PLL-RT/OVA/CpG | 65.2 | 62.8 |
结果表明,本发明的靶向纳米疫苗佐剂担载抗原和佐剂后,与水溶性抗原和佐剂相比,其内吞量均显著增加,所述靶向纳米疫苗,有利于促进抗原及佐剂的内吞。
实施例6靶向纳米疫苗活化BMDC细胞
BMDC细胞诱导成功后,按照5×105细胞/孔的密度接种于24孔培养板中,继续培养24小时。分别加入PBS、LPS、OVA/CpG、PLL-RT/OVA/CpG和Man-PLL-RT/OVA/CpG),继续培养24小时后,用流式细胞仪检测BMDC细胞的标签(CD11c)以及表面成熟分子表达(CD80和CD86)。
表3实施例6的BMDC细胞成熟结果
BMDC细胞成熟(%) | |
PBS | 35.2 |
LPS | 62.5 |
OVA/CpG | 37.2 |
PLL-RT/OVA/CpG | 40.3 |
Man-PLL-RT/OVA/CpG | 55.6 |
实验结果表明,相比PBS和OVA/CpG组,纳米疫苗组能够有效上调BMDC细胞表面成熟分子CD80和CD86的表达,且靶向疫苗组能够更有效促进BMDC细胞的成熟,活化激活树突细胞,提高疫苗的效率。
实施例7靶向纳米疫苗促进BMDC细胞分泌免疫活化细胞因子
BMDC细胞诱导成功后,按照5×105细胞/孔的密度接种于24孔培养板中,继续培养24小时。加入不同组分材料(分别为:PBS,LPS,OVA/CpG,PLL-RT/OVA/CpG和Man-PLL-RT/OVA/CpG),继续培养24小时。取细胞悬液并离心,优选1500rpm离心10min,上清液用ELISA方法进行细胞因子检测。
表4实施例7中细胞因子分泌结果
TNF-α分泌(pg/mL) | IL-12p70分泌(pg/mL) | |
PBS | 13.9 | 30.8 |
LPS | 524.6 | 222.4 |
OVA/CpG | 43.5 | 48.6 |
PLL-RT/OVA/CpG | 108.3 | 76.1 |
Man-PLL-RT/OVA/CpG | 443.8 | 176.9 |
测试结果参见表4,细胞因子分泌的结果与BMDC细胞成熟实验结果一致。相比PBS组,靶向纳米疫苗组明显促进BMDC细胞分泌免疫活化细胞因子TNF-α和IL-12,说明本发明所述的靶向纳米疫苗能够高效活化树突细胞。
实施例8靶向纳米疫苗促进抗原交叉呈递作用
BMDC细胞诱导成功后,按照5×105细胞/孔的密度接种于24孔培养板中,继续培养24小时。加入不同组分材料(分别为:PBS,OVA/CpG,PLL-RT/OVA/CpG和Man-PLL-RT/OVA/CpG),继续培养48小时。用流式细胞仪检测BMDC细胞的抗原交叉呈递作用。
测试结果参加表5,相对于PBS组,靶向纳米疫苗组明显促进BMDC细胞的抗原交叉呈递作用,说明本发明所述的靶向纳米疫苗能够高效活化CD8+T细胞,从而激活机体的细胞免疫。
表5实施例8中抗原交叉呈递结果
抗原交叉呈递作用(%) | |
PBS | 1.2 |
OVA/CpG | 3.5 |
PLL-RT/OVA/CpG | 7.3 |
Man-PLL-RT/OVA/CpG | 12.8 |
由以上实施例的测试结果可知,本发明提供的靶向纳米疫苗载体能够有效提高抗原及佐剂的内吞效率,同时能够高效活化树突状细胞,激活体内免疫反应,在疫苗领域具有光明的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种高效靶向纳米疫苗载体,按照以下步骤制备得到:
A)将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化,再加入线性聚α-赖氨酸的水溶液进行反应,将反应后的溶液进行透析和冻干,得到冻干产物;
所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1:(10~100);
B)将所述步骤A)中的冻干产物与三氟乙酸进行反应,加入无水***沉降,真空干燥和透析后,得到阳离子聚合物;
C)将N,N'-二异丙基乙胺、活化后的甘露糖和所述步骤B)中的阳离子聚合物混合,进行反应,反应后的产物透析和冻干,得到高效靶向纳米疫苗载体;
所述甘露糖按照以下步骤进行活化:
将甘露糖加入氢氧化钠溶液中,搅拌均匀后加入氯乙酸水溶液进行反应,然后加入盐酸,使反应后的甘露糖羧基化,最后加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并***,进行活化,得到活化的甘露糖;
所述高效靶向纳米疫苗载体包括线性聚α-赖氨酸,所述线性聚α-赖氨酸上接枝有甘露糖和对甲苯磺酰基保护的精氨酸;
所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10~100);
所述线性聚α-赖氨酸与甘露糖的摩尔比为1:(1~30)。
2.根据权利要求1所述的高效靶向纳米疫苗载体,其特征在于,所述线性聚α-赖氨酸的数均分子量为3000~30000。
3.根据权利要求1所述的高效靶向纳米疫苗载体,其特征在于,所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸按照以下步骤进行活化:
将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中,加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并***,进行活化;
得到的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液的质量浓度为0.02~0.5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的高效靶向纳米疫苗载体,其特征在于,所述步骤A)反应的温度为20~37℃;所述步骤A)反应的时间为24~96小时;
所述步骤A)中透析的时间为2~5天;所述步骤A)中冻干的温度为-30~-80℃。
5.根据权利要求1所述的高效靶向纳米疫苗载体,其特征在于,所述步骤B)中冻干产物的质量与三氟乙酸的物质的量之比为1g:(1~5)mL;
所述步骤B)中的反应的温度为20~35℃,所述步骤B)中反应的时间为0.5~24小时。
6.根据权利要求1所述的高效靶向纳米疫苗载体,其特征在于,所述步骤C)反应的温度为20~37℃;所述步骤C)反应的时间为12~96小时;
所述步骤C)中透析的时间为2~5天;所述步骤C)中冻干的温度为-30~-80℃。
7.根据权利要求1所述的高效靶向纳米疫苗载体,其特征在于,所述甘露糖的活化步骤具体为:
将甘露糖加入氢氧化钠溶液中,搅拌均匀后加入氯乙酸水溶液,在20~90℃下反应2~48小时,然后加入盐酸,调整pH值为1.5~4,使反应后的甘露糖羧基化,最后加入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并***,活化10~60min,得到活化的甘露糖。
8.一种靶向纳米疫苗,包括载体和担载在所述载体上的抗原和佐剂;
所述载体为权利要求1~7任意一项所述的高效靶向纳米疫苗载体;所述抗原和佐剂均带负电;
所述抗原为蛋白抗原或多肽抗原;所述佐剂核酸类佐剂和/或STING信号通路激动剂,
所述载体、抗原和佐剂的质量比为(1~100):(0.5~10):1。
9.如权利要求8所述的靶向纳米疫苗的制备方法,包括以下步骤:
将载体、抗原和佐剂在水溶液中进行复合,得到靶向纳米疫苗;
所述载体的质量浓度为0.5~5mg/mL,所述抗原的质量浓度为0.2~5mg/mL,所述佐剂的质量浓度为0.05~2.5mg/mL;
所述复合的温度为15~30℃,所述复合的时间为10~30min。
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