CN111278469A - 用于治疗三阴性乳腺癌的方法 - Google Patents

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Leland Stanford Junior University
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Abstract

本发明涉及通过向患者施用抑制周期素依赖性激酶19(CDK19)的表达或活性的药剂来治疗患者的TNBC的方法。在一些实施方案中，药剂可以是小分子抑制剂、多核苷酸(例如，shRNA.siRNA)或蛋白质(例如，抗体)。在一些实施方案中，药剂不抑制CDK8的活性或表达。

Description

用于治疗三阴性乳腺癌的方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求享有2017年9月18日提交的美国临时专利申请号：62/560,140的优先权的权益，通过引用将其全文并入本文以用于所有目的。
联邦赞助的研发
本说明书中描述的工作得到了NIH/NCI 5R01 CA100225,国防部拨款W81XWH-11-1-0287,国防部/乳腺癌研究计划(BCRP)创新奖W81XWH-13-1-0281和NIH S10共享设备拨款(1S10RR02933801)的支持。
技术领域
本发明涉及生物医学领域，例如肿瘤学。
背景技术
三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性乳腺癌亚型，其不成比例地影响了年轻女性并且与不良预后相关联。参见Bauer等人.“Descriptive analysis of estrogen receptor(ER)-negative,progesterone receptor(PR)-negative,and HER2-negative invasivebreast cancer,the so-called triple-negative phenotype:a population-basedstudy from the California cancer Registry”Cancer 109,1721-1728,doi:10.1002/cncr.22618(2007)。尽管影响了所有乳腺癌患者的20％，但目前尚无针对这些患者的临床批准的靶向疗法。在本领域中需要治疗TNBC的有效方法。
发明内容
本发明涉及通过向患者施用抑制周期素依赖性激酶19(CDK19)的表达或活性的药剂(agent)来治疗患者的TNBC的方法。
一方面，本发明的特征在于一种通过施用治疗有效剂量的药剂来治疗诊断患有三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，所述药剂抑制周期素依赖性激酶19(CDK19)的表达或活性以及实现以下至少一种：减少恶病质、增加生存时间、延长肿瘤进展时间、减小肿瘤块、减小肿瘤负荷和/或延长肿瘤转移时间、肿瘤复发时间、肿瘤响应、完全响应、部分响应、稳定疾病、进行性疾病或无进展生存期。
另一方面，本发明的特征在于一种治疗诊断患有三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，其中所述癌的特征在于包含EpCAMmed/high/CD10-/low上皮细胞的肿瘤。所述方法包括施用治疗有效剂量的抑制周期素依赖性激酶19(CDK19)表达或活性的药剂，其中所述治疗减少了所述肿瘤中EpCAMmed/high/CD10-/low细胞的数量，减少了每单位体积肿瘤的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞的数量，或导致所述肿瘤中EpCAMmed/high/CD10-/low上皮细胞与正常(EpCamHi/CD10-)上皮细胞的比率降低。
又一方面，本发明的特征在于一种通过施用治疗有效剂量的抑制CDK19表达或活性的药剂来减少患者中TNBC转移的方法。
在本文描述的本发明的所有方面的一些实施方案中，用联合疗法治疗患者，所述联合疗法包括(a)抑制CDK19表达或活性的药剂和(b)放射疗法和/或化学疗法。
在一些实施方案中，所述方法包括在开始疗法之前或之后检测来自所述患者的组织样本中的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞。
在一些实施方案中，在本文所述的方法中施用于所述患者的所述药剂不显著抑制CDK8的表达或活性。在一些实施方案中，所述药剂抑制CDK19的表达或活性的程度大于其抑制CDK8的表达或活性的程度。
在本文所述的方法的一些实施方案中，所述药剂是核酸。在一些实施方案中，所述药剂是蛋白质。在一些实施方案中，所述药剂是CRISPR/Cas9***。
在本文所述的方法的一些实施方案中，所述药剂是靶向CDK19的shRNA。
在本文所述的方法的一些实施方案中，所述药剂是靶向CDK19的siRNA。
在本文所述的方法的一些实施方案中，所述药剂是靶向CDK19或与CDK19的3’UTR互补或基本互补，但与CDK8的3'UTR不互补的shRNA或siRNA。
在本文所述的方法的一些实施方案中，所述药剂是靶向CDK19或与CDK19的编码区互补或基本互补，但与CDK8的编码区不互补的shRNA或siRNA。
在本文所述的方法的一些实施方案中，所述药剂是靶向CDK19的shRNA或siRNA，选自以下：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中，所述药剂结合乳腺上皮细胞的细胞质中的CDK19。
另一方面，本发明的特征还在于一种预测患有TNBC的受试者对CDK19靶向药剂的可能的治疗响应性的方法。所述方法包括(a)将从所述受试者获得的肿瘤样本中的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞定量；(b)将(a)中的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞的数量与对CDK19靶向疗法有响应的肿瘤特有的参考值进行比较，以及如果EpCAMmed/high/CD10-/low细胞的数量等于或超过所述参考值，则用所述CDK19靶向药剂治疗所述患者。在一些实施方案中，所述CDK19靶向药剂是CDK19表达或活性的抑制剂。
附图说明
图1A是RNAi缺失活力筛选的示意图。在TNBC PDX(PDX-T1)中进行了两个单独的筛选。一个实验中的细胞在体外作为类器官集落生长，而另一实验中的细胞则在NSG小鼠中体内作为PDX生长。
图1B至图1D是示出以下的图：据用对照shRNA或CDK19靶向shRNA(shCDK19-1，shCDK19-2)转导(transduction)后4天评估，CDK19敲低显著降低了TNBC细胞(图1B：MDA-MB231细胞；图1C：MDA-MB468细胞；以及图1D：HS578T细胞)的活力。
图1E是示出CDK19敲低显著降低了PDX-T1中类器官集落形成的图。
图1F是示出CDK19敲低不会降低未转化的人乳腺上皮细胞(HMEC)的活力的图。
图1G至图1J是示出以下的图：CDK19敲低显著抑制在NSG小鼠中生长的PDX肿瘤的增殖(图1G：PDX-T1；图1H：PDX-T2；图1I：PDX-T3；以及图1J：PDX-T4)。
图1K和图1L是柱状图，其示出了CDK19敲低防止了转导的(RFP阳性)TNBC细胞(图1K：PDX-T1和图1L PDX-T4)转移到小鼠的肺中。
图1M示出了，在用CDK19 shRNA转导的PDX肿瘤中(第二排和第三排图像)，几乎看不到RFP(最后一列图像)。这些肿瘤主要由未转导的GFP阳性肿瘤细胞组成(中间列图像)。首先用绿色荧光蛋白(GFP)标记PDX肿瘤细胞(中间列)，随后用CDK19 shRNA或对照shRNA感染的细胞还用红色荧光蛋白(RFP)标记(右列)。
图1N示出了具有PDX-T1转移的小鼠肺的代表性图像。示出了来自带有用对照shRNA(上排)、shCDK19-1(中排)或shCDK19-2(下排)转导的PDX的小鼠的肺。在通常转移至肺的PDX-T1中，CDK19敲低消除了那些细胞的任何肺转移的检测。明场(bright field)图像(左列)示出总体肺部形态，FITC图像(中列)确认(identify)用GFP标记的转移性肿瘤细胞，随后用CDK19 shRNA或对照shRNA感染的转移性肿瘤细胞还用红色荧光蛋白(RFP)标记(右列)。
图2A示出了使用EpCAM和CD49f(左)或EpCAM和CD10(右)作为细胞表面标志物对TNBC(PDX-T1)进行代表性流式细胞术分析的数据。
图2B是比较EpCAMmed/high/CD10-/low和EPCAMlow/med/CD10low/+细胞亚群的类器官集落形成能力的图。
图2C是示出形成的肿瘤数量和针对六组PDX肿瘤细胞进行的注射数量的表。形成肿瘤的人群和注射用粗体表示。基于EpCAM和CD10的表达，通过流式细胞术分离PDX肿瘤细胞(如图2A，右)
图2D至图2G是柱状图，其示出了在PDX-T1、PDX-T2和PDX-T8中，在EpCAMmed/high/CD10-/low细胞中的CDK19表达比在EPCAMlow/med/CD10low/+细胞中的高。
图3A包括维恩图，其示出了通过CDK19敲低、CDK8敲低或通过CDK19和CDK8两者(重叠区域)上调(上图)和下调(下图)的基因数目。
图3B是标志性基因集(Hallmark gene set)的维恩图，如通过GSEA确定的，所述标志性基因集在通过CDK19敲低、CDK8敲低或通过CDK19和CDK8敲低两者(重叠区域)上调(上图)或下调(下图)的基因范围内富集。
图3C和3D是示出以下的图：与对照相比，在CDK19敲低样本中CDK19KD-H3K27AcUP和CDK19KD-H3K27AcDOWN区域内的CHIP-Seq信号显著不同。
图3E和3F是示出使用平均CDK19敲低对比对照表达数据的CDK19KD-EnhancerUP和CDK19KD-EnhancerDOWN基因的基因集富集分析(GSEA)的图。
图3G是示出标志性基因集的图，所述标志性基因集在CDK19KD-EnhancerUP“核心”基因(顶部和中间条)和CDK19KD-EnhancerDOWN“核心”(底部条)基因的Metascape分析中被确认为是富集的。每个条形的右侧示出了有助于每个标志性基因集的富集的各个基因。
图4A和4B是示出以下的图：在inducCDK19KD-PDX-T1细胞中，与对照相比，通过加入多西环素(Dox)而对CDK19 shRNA的诱导显著降低了多西环素治疗组中类器官集落的数目。示出了在开始多西环素治疗后第0天(图4A)和第16天(图4B)的类器官集落的数目。
图4C和4D是示出以下的图：在预先建立(pre-established)的肿瘤中CDK19 shRNA的诱导妨害了肿瘤生长。对于inducCDK19KD-PDX-T1(图4C)和inducCDK19KD-PDX-T3(图4D)，示出了多西环素喂养的NSG小鼠和对照NSG小鼠中预先建立的肿瘤的生长。
图4E是示出CDK19敲低延长了具有PDX-T1肿瘤的NSG小鼠的存活的图。
图4F示出了作为一种可口服生物利用的CDK19和CDK8选择性抑制剂的CCT251921的化学结构。
图4G是示出以下的图：通过每日口服强饲法用CCT251921对小鼠的治疗显著妨害了预先建立的PDX-T1异种移植肿瘤的生长。
图5A和5B是示出以下的图：体内生长实验样本中的shRNA计数对比基线样本中的shRNA计数(图5A)，以及体外生长实验样本中的shRNA计数对比基线样本中的shRNA计数(图5B)。
图5C是用于将来自体外和体内筛选的命中的初始列表缩小至46个候选基因的标准的示意图。
图5D是在用图5C所示的标准过滤后从体外和体内筛选确定的46个候选基因的列表。框出CDK19。
图6A是柱状图，其示出与其他亚型相比，来自TNBC亚型患者的TCGA乳腺癌样本富集有CDK19拷贝数扩增或CDK19 mRNA上调。
图6B包括用细胞角蛋白8(CK8)抗体(从左数第一个图像)、CDK19抗体(第二个图像)和DAPI(第三个图像)染色的PDX-T1的共聚焦免疫荧光图像。由所有上述三个图像组成的合成图像(compsite image)示出在最右边(图像代表三个独立的实验)。
图7A和7B是柱状图，其示出了靶向CDK19的shRNA有效地使TNBC细胞系中的CDK19沉默。对于用对照shRNA、shCDK19-1和shCDK19-2转导的细胞，通过RT-qPCR确定在MDA-MB231(图7A)或MDA-MB468(图7B)中的CDK19表达。
图7C是柱状图，其示出了靶向CDK19的shRNA有效地使TNBC PDX中的CDK19沉默。用对照shRNA、shCDK19-1和shCDK19-2转导的细胞，通过RT-qPCR确定在PDX-T1中的CDK19表达。
图7D包括组织样本的图像和带有PDX-T4转移的小鼠肺的代表性图像。示出了来自带有用对照shRNA(上排)、shCDK19-1(中排)或shCDK19-2(下排)转导的PDX的小鼠的肺。明场图像(左列)示出总体肺部形态，FITC图像(中列)确认用GFP标记的转移性肿瘤细胞，以及德克萨斯红图像(右列)确认用RFS标记的shRNA转导的转移性细胞。
图8A是示出使用EpCAM和CD49f以及EpCAMmed/high/CD10-/low(1)、EPCAMlow/med/CD10low/+(3)和EpCAM-/CD10-((2))子群的重叠对TNBC(PDX-T1)进行流式细胞术分析的图。
图8B是柱状图，其示出了用多西环素对CDK19 shRNA的诱导有效地使inducCDK19KD-PDX-T1细胞中的CDK19沉默。通过RT-qPCR确定对照inducCDK19KD-PDX-T1细胞(黑柱)和多西环素处理的inducCDK19KD-PDX-T1细胞(灰柱)中的CDK19表达。
图8C示出了在有限稀释测定中，CDK19敲低有效地阻止了异种移植肿瘤的生长。
图8D是示出对来自图8C的数据进行ELDA(Hu等人,Journal of Immunol.Methods347:70-78,2009)分析以确定多西环素组(+Dox组)和对照组(无Dox组)中的肿瘤起始频率的图。通过ELDA软件确定P值。
图9示出了，氨基酸序列比对显示CDK19和CDK8之间84％的序列同源性。氨基酸位置示出在序列上方。使用利用MegAlign(DNAStar)的Clustal W方法进行比对。
图10是示出标志性基因集的表，通过对由CDK19敲低或CDK8敲低上调或下调的基因的GSEA发现所述标志性基因集是富集的。
图11是示出以下的图：在CDK19敲低、CDK8敲低和对照样本之间，在所有确认的H3K27Ac峰区域上的全基因组H3K27Ac CHIP-Seq信号没有显著差异。汇总在CDK19敲低(1)、CDK8敲低(2)和对照(3)样本中所有H3K27Ac峰区域的归一化H3K27Ac CHIP-Seq信号的曲线图(ns为P>0.05，所有样本n＝3，实验进行3次)。
图12A和12B示出了CDK19KD-EnhancerUP“核心”基因(图12A)和CDK19KD-EnhancerDOWN“核心”基因(图12B)的表达的热图。示出了在CDK19敲低和对照样本的每个生物学复制物中每个基因的归一化表达。
图13A至图13D是示出代表性基因的图，其中CDK19敲低导致H3K27Ac信号的改变和基因表达的相应改变。代表性基因轨迹描绘了在精选的CDK19KD-EnhancerUP“核心”(图13A和13B)和CDK19KD-EnhancerDOWN“核心”基因(图13C和13D)的基因座处H3K27Ac信号。
图13E是在对照和CDK19敲低样本中的三个生物学复制物的每一个范围内的ELF3、ETV7、CHI3L2和CRTAM的归一化基因表达的热图。
图14A和14B是示出以下的图：在inducCDK19KD-PDX-T1(平均值±s.d.，n＝5，进行两次实验)(图14A)和inducCDK19KD-PDX-T3(平均值±s.d.，n＝5，进行一次实验)(图14B)肿瘤实验中，喂食多西环素啮齿动物饲料的小鼠(多西环素组)与喂食标准啮齿动物饲料的小鼠(对照组)相比，小鼠的总体重没有显著差异。
图14C是示出以下的图：与溶媒(平均值±s.d.，n＝5，进行一次实验)相比，接受CCT251921口服强饲的小鼠之间小鼠的总体重没有显著差异。
图15是示出用于实验中的患者来源的异种移植肿瘤的病理特征和患者信息的表。
图16A至图16D示出了CDK8和CDK19的3’UTR的核酸比对。下划线和加粗的文本表示重叠区域。
图17示出了CDK8和CDK19的5’UTR的核酸比对。下划线和加粗的文本表示重叠区域。
具体实施方案
1.简介—CDK19为三阴性乳腺癌(TNBC)生长所必需
我们已经发现，降低小鼠中TNBC细胞系或乳腺癌患者来源的异种移植物中CDK19的表达或活性会抑制三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤的生长和转移。参见下面的§4(实施例)。我们还表明，CDK19的生物学功能与其旁系同源物CDK8不同，并且CDK19介导的对TNBC肿瘤的作用不受CDK8活性的影响。这些数据证实，TNBC可以通过抑制CDK19但不抑制CDK8的药剂或与CDK8相比优先抑制CDK19的药剂进行治疗。抑制CDK19对于抑制TNBC生长和转移是必要和充分的，这一发现意义重大，部分原因在于CDK19作为治疗靶具有潜在的优势。与其他普遍存在的转录辅助因子(例如CDK8、CDK9和BRD4)相比，CDK19的组织分布更为有限，这表明CDK19抑制剂的毒性降低且治疗窗(therapeutic window)更广。
除了证实CDK19敲低具有肿瘤生长抑制作用外，还示出了CDK19表达在肿瘤起始细胞中富集，该肿瘤起始细胞例如与较不致瘤的细胞(例如，具有EPCAMlow/med/CD10low/+表达的细胞)相比，具有EpCAMmed/high/CD10-/low表达的致瘤细胞(参见例如实施例4)。进一步的研究还示出了，CDK19敲低显著降低了肿瘤起始频率(图8D)。这项发现表明，与其他药剂相比，靶向CDK19将对高度致瘤性(例如，肿瘤引发)的细胞产生更明显且显著的作用。这些发现还使得能够开发用于确认可能对CDK19靶向疗法有响应的某些TNBC患者的诊断方法。
2.定义
2.1三阴性乳腺癌(TNBC)
三阴性乳腺癌(TNBC)是一种乳腺癌亚型，其特征在于缺乏***受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her2)的表达。受体表达可以通过免疫组织化学染色或其他方法来测量。TNBC通常通过排除进行诊断。靶向这些受体的广泛使用的乳腺癌疗法对TNBC无效，这使得TNBC治疗特别具有挑战性。
2.2循环依赖性激酶19(CDK19)
循环依赖性激酶19(CDK19)被描述于Broude等人,Curr.Cancer Drug Targets15:739,2015and Sato等人.,Molecular Cell 14:685-691,2004。CDK19属于CDK家族的一个子集，据报道，与细胞周期进程相比，它与RNA聚合酶II(RNAPII)转录的调节更相关联(参见例如，等人,Transcription 1:4-12,2010)。参见UniProt条目NP_055891.1；Genbank条目AY028424&AL603914。CDK19的mRNA序列也在本文中公开(例如，SEQ ID NO：12-15)。
2.3循环依赖性激酶8(CDK8)
CDK8是CDK19的旁系同源物，与CDK19具有84％的氨基酸序列同源性。参见图9。CDK8被描述于Broude等人,Curr.Cancer Drug Targets 15:739,2015；以及Sato等人,Molecular Cell 14:685-691,2004。参见UniProt条目CAA59754.1；Genbank条目X85753&AL590108。CDK8的mRNA序列也在本文中公开(例如，SEQ ID NO：16-18)。
2.4药剂
如本文所用，术语“药剂”是指可以降低或抑制CDK19表达或活性的生物分子(例如，核酸、蛋白质、肽、抗体)或小的有机分子(例如，具有小于1000的分子量，通常小于500的分子量)。
2.5抑制剂
如本文所用，在CDK19的语境中使用的术语“抑制剂”是指降低CDK19表达或活性的化合物、组合物或***。相比对CDK8表达或活性，药剂还可以选择性地抑制CDK19表达或活性。
2.6敲低
如本文所用，术语“敲低”是指降低CDK19基因的表达水平。敲低CDK19基因表达水平可以通过减少与该基因相对应的mRNA转录物的量，从而导致CDK19蛋白表达水平的降低来实现。敲低CDK19基因表达水平也可以通过减少CDK19蛋白的量来实现。敲低药剂是抑制剂的一种示例。
2.7敲除
如本文所用，术语“敲除”是指以干扰CDK19基因功能的方式删除细胞中全部或部分CDK19基因。例如，可以通过改变CDK19序列来实现敲除。本领域技术人员将容易理解如何使用各种遗传方法(例如CRISPR/Cas***)来敲除CDK19基因或其一部分。敲除剂是抑制剂的一种示例。
2.8相对于参考水平的降低
如本文所用，术语“降低”、“减少”以及“减小”在本文中全部用于指与参考水平相比降低了至少10％，例如降低了至少约5％，至少约10％，至少约20％或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少降低了约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至多100％(包含100％的降低；即与参考样本相比不存在水平)，或与参考样本相比降低了10％至100％。
2.9核酸
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，或者可以通过本领域已知的方法进行修饰，以使多核苷酸对核酸酶具有抗性，改善多核苷酸向靶细胞或组织的递送，提高稳定性，减少降解，改善组织分布或赋予其他有利属性。例如，DNA或RNA多核苷酸可以在寡核苷酸主链上包含一个或多个修饰(例如，硫代磷酸修饰)、糖(例如，锁糖)或核碱基。如果存在的话，可以在寡核苷酸组装之前或之后赋予核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。寡核苷酸可以在聚合(例如通过与标记组分、靶向组分或其他组分结合)后进一步修饰。多核苷酸可以是双链或单链分子。此外，为了改善寡核苷酸递送，可以将DNA或RNA寡核苷酸包入(packaged into)脂质分子(例如，脂质纳米颗粒)中或与细胞穿透性肽结合。
2.10处理
如本文所用，术语“治疗”、“处理”等是指获得所需的药理和/或生理效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言，效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”可以包含导致抑制疾病(即阻止其进展)；和减轻疾病(即引起疾病消退)的治疗。例如，在癌症的情况下，对治疗的响应可以包括恶病质减少、存活时间增加、肿瘤进展时间延长、肿瘤块减小、肿瘤负荷减小和/或延长肿瘤转移时间、肿瘤复发时间、肿瘤响应、完全响应、部分响应、稳定疾病、进行性疾病、无进展生存期、总体生存期，各自均通过由美国国家癌症研究所和美国食品药品管理局为批准新药而设定的标准进行衡量和/或描述于Eisenhauer,EA1,等人"Newresponse evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline(version 1.1)"。European journal of cancer 45.2(2009):228-247。
2.11给药
如本文所用，术语“施用”或“给药”包括将抑制CDK19表达或活性的药剂引入或递送至诊断患有TNBC的受试者的任何途径。可以通过适合于药剂递送的任何途径给药。因此，递送途径可以包含例如静脉内、肌内、腹膜内或皮下递送。在一些实施方案中，例如通过注射到肿瘤中将药剂直接施用到肿瘤。
2.12治疗有效剂量
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者或患者中有效诱导所需的生物学效果或有效治疗本文所述的TNBC患者的量，例如药剂剂量。术语“治疗有效量”是指将在某种程度上治疗疾病、紊乱或病症(例如TNBC)，减轻所治疗疾病的一种或多种症状的施用的活性剂的量，和/或将在某种程度上预防被治疗的对象具有或有罹患风险的疾病的一种或多种症状的量。例如，对于给定的参数(例如，肿瘤体积，肿瘤直径，转移等)，治疗有效量将显示出治疗效果的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或至少1倍、2倍或3倍的增加或减少。通常在可能会持续数天、数周或数月的疗程中递送治疗有效剂量。治疗有效剂量的药剂可以单独服用或与其他治疗剂组合服用。在某些情况下，CDK19抑制剂的治疗有效量是足以在TNBC患者中产生部分响应(例如，病变的可测量直径减少大于20％，有时减少大于30％)的量。
2.13患者或受试者
如本文所用，“患者”或“受试者”旨在包含人类或非人类动物，优选哺乳动物，例如非人类灵长类动物。最优选地，受试者或患者是人类。
2.14反义链
“反义链”是指双链RNAi剂(siRNA或shRNA)的包含与靶序列[例如，包含5’UTR、开放阅读框(ORF)的外显子或3’UTR的人CDK8或CDK19 mRNA]互补或基本互补的区域的链。然而，“互补”或“基本互补”的区域不需要与靶序列完全互补，并且可以具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性％或相似度％。
2.15有义链
如本文所用，“有义链”是指RNAi剂(siRNA或shRNA)的包含与反义链的区域互补或基本互补的区域的链。
3.治疗方法
在一种方式中，本发明提供了一种治疗被诊断患有三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，该方法包括施用治疗有效剂量的抑制周期素依赖性激酶19(CDK19)表达或活性的药剂。在一些实施方案中，该治疗导致在开始疗法的6个月内肿瘤体积减少至少10％。
在一种方式中，本发明提供了一种治疗诊断患有三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，其中该癌的特征在于包括EpCAMmed/high/CD10-/low上皮细胞的肿瘤，该方法包括施用治疗有效剂量的抑制周期素依赖性激酶19(CDK19)表达或活性的药剂，其中该治疗导致肿瘤中具有中等至高表达水平的EpCAM和低表达水平的CD10的细胞与正常细胞的比率降低。在一些实施方案中，该方法包括在开始疗法之前或之后检测来自患者的组织样本中的EpCAMmed /high/CD10-/low上皮细胞的步骤。
为了确定肿瘤的表型或评估治疗预后，可以从诊断患有TNBC的患者中获得活检。活检可以是针头活检，或者可以是从供应***的血管和/或***(例如，内部乳腺动脉、胸廓侧动脉、胸膜顶动脉、腋窝***)获得的液体活检。
如下文§4中所述，CD10和EpCAM生物标志物确认TNBC中肿瘤起始细胞(TIC)的三个不同亚群：EpCAMmed/high/CD10-/low、EPCAMlow/med/CD10low/+和EpCAM-/CD10。TNBC患者中癌细胞的表型可以使用本领域已知的方法来确定。在一种方式中，从患者获得组织，并使用免疫组织化学、质谱分析、荧光激活细胞分选(FACS)或其他方法确定细胞表型。可以根据健康或癌组织特有的标准值来分配细胞表型。在一种方式中，在开始治疗之前确定EpCAMmed/high/CD10-/low细胞与正常乳腺上皮细胞的比率，以评估患者对CDK19靶向疗法的可能响应。在一种方式中，在开始治疗后，检测到EpCAMmed/high/CD10-/low细胞与正常细胞的比率的变化，或每体积组织的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞的数量的变化。
在一种方式中，本发明提供了一种用于减少患者中TNBC转移的方法，该方法包括施用治疗有效剂量的抑制CDK19表达或活性的药剂。
在一些实施方案中，本发明的方法可以用于治疗炎症性TNBC或化学耐药性(chemo-resistant)TNBC。在其他实施方案中，本发明的方法可以用于减慢或预防TNBC的转移。在进一步的实施方案中，靶向CDK19基因或其相应蛋白的本文所述的方法可以进一步调制由CDK19调节的临床相关的TNBC途径，例如P53信号转导、KRAS信号转导、雄激素响应、NOTCH信号转导、TGF BETA信号转导和IL6-JAK-STAT3信号转导(图3B)，并使它们对癌症治疗更具治疗敏感性。
3.1治疗剂(抑制剂)
3.1.1.多核苷酸
如实施例证实，CDK19基因对于TNBC的生长是必不可少的。如本文所述的治疗受试者中的TNBC的方法可以通过向受试者施用多核苷酸(例如，寡核苷酸)以减少或抑制CDK19基因的表达来完成。在一些实施方案中，多核苷酸可以是例如DNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸。在其他实施方案中，寡核苷酸可以用于CRISPR/Cas***。抑制或降低CDK19基因表达的寡核苷酸可以敲除或敲低受试者中的CDK19基因(例如，TNBC细胞中的CDK19基因)。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以是shRNA或miRNA。在一些实施方案中，寡核苷酸可以介导CDK19基因的mRNA转录物的RNase H依赖性切割。在其他实施方案中，寡核苷酸可以用于CRISPR/Cas***。
在一些实施方案中，可以靶向CDK19基因的mRNA转录物以进行切割和降解。可以靶向mRNA转录物的不同部分以减少或抑制CDK19基因的表达。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸可以用于靶向mRNA转录物并与mRNA转录物一起形成DNA：RNA双链体。然后可以识别双链体，并用细胞中的特定蛋白质切割mRNA。在其他实施方案中，RNA寡核苷酸可以用于靶向CDK19基因的mRNA转录物。
3.1.1.1.shRNA
短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)是具有发夹环的人造RNA分子，其可以用于经由其在细胞中产生的小干扰RNA(siRNA)使靶基因表达沉默。参见，例如，Fire等人,Nature 391:806-811,1998；Elbashir等人,Nature 411:494-498,2001；Chakraborty等人Mol TherNucleic Acids 8:132-143,2017；Bouard等人,Br.J.Pharmacol.157:153-165,2009。shRNA在细胞中的表达通常通过递送质粒或通过病毒或细菌载体来完成。合适的细菌载体包含但不限于腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。一旦载体整合到宿主基因组中，就根据启动子选择，通过聚合酶II或聚合酶III将shRNA转录到细胞核中。所得的pre-shRNA从细胞核中输出，然后由Dicer处理并加载到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。有义链通过RISC降解，以及反义链将RISC导向具有互补序列的mRNA。然后，RISC中的一种称为Ago2的蛋白质切割mRNA，或者在某些情况下，抑制mRNA的翻译，从而导致其被破坏，并最终减少由mRNA编码的蛋白质。因此，shRNA导致靶向基因沉默。shRNA是siRNA的有利介体，因为它具有相对低的降解和转换(turnover)率。
在一些实施方案中，本文所述的方法包含使用shRNA治疗受试者中的TNBC。该方法可以包括向受试者施用治疗有效量的载体，其中载体包含编码能够与CDK19基因的mRNA转录物的一部分杂交的shRNA的多核苷酸。在一些实施方案中，载体还可包含本领域已知的合适的表达控制元件，包含例如启动子(例如组织特异性启动子)、增强子和转录终止子。一旦载体被递送至TNBC细胞，shRNA就可以整合到细胞的基因组中，并通过Dicer和RISC进行下游加工(在本文中有进一步详细的描述)以最终与CDK19基因的mRNA转录物杂交，从而导致mRNA切割和降解。在一些实施方案中，shRNA可以包含与序列GCGAGAATTGAAGTACCTTAA(SEQID NO:1)或序列ACCAGCAAATATCCTAGTAAT(SEQ ID NO:2)具有至少85％的序列同一性的核酸序列。在特定的实施方案中，shRNA可以靶向在CDK19基因的mRNA转录物的N末端处的氨基酸。在其他实施方案中，shRNA可以靶向在CDK19基因的mRNA转录物的内部区域处的氨基酸。
如实施例证实，例如，图1G至图1J，靶向CDK19基因的shRNA[GCGAGAATTGAAGTACCTTAA(SEQ ID NO:1)和ACCAGCAAATATCCTAGTAAT(SEQ ID NO:2)]均能够敲低该基因，这导致了来自所有三个TNBC PDX的肿瘤中RFP阳性细胞百分比显著降低。此外，CDK19敲低还抑制了因患有化疗耐药性(chemotherapy-resistant)炎性乳腺癌的患者的脑转移获得的侵袭性PDX的生长(图1J)，已知该侵袭性PDX具有侵袭性，难以治疗并且与极差的预后相关联。除了抑制肿瘤生长，shRNA还抑制了小鼠中这些肿瘤的肺转移(图1L)。
在一些实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与GCGAGAATTGAAGTACCTTAA(SEQID NO:1)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与ACCAGCAAATATCCTAGTAAT(SEQ ID NO:2)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与GCTTGTAGAGAGATTGTACTT(SEQ ID NO:3)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。在一些实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与GAGGACTGATAGTTCTTCTTT(SEQ ID NO:4)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与GATATTAGAAAGATGCCAGAA(SEQ ID NO:5)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与GCCAACAGTAGCCTCATAAAG(SEQ ID NO:6)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与CGTTCGTATTTATCTAGTTTC(SEQ ID NO:7)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性。在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与GCATGACTTGTGGCATATTAT(SEQ ID NO:8)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与GCTTGTAGAGAGATTGCACTT(SEQ ID NO:9)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与AGGACTGATAGCTCTTCTTTA(SEQ ID NO:10)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。仍在其他实施方案中，靶向CDK19基因的shRNA可以与GTATGGCTGCTGTTTGATTAT(SEQ ID NO:11)具有至少85％的序列同一性(例如，87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％的序列同一性)。本领域技术人员具有设计shRNA的知识和能力，该shRNA靶向CDK19基因的不同部分(例如5’UTR区域或3’UTR区域)，以实现所需的基因表达降低。例如，用于设计shRNA的可用工具包含例如Project Insilico,Genomics and Bioinformatics Group,LMP,CCR,NIH。在一些实施方案中，shRNA可以设计成敲除CDK19基因。
CDK8和CDK19 shRNA
有许多结构元件可以影响shRNA功效。对于期望的靶基因的特异性RNAi敲低，可以考虑其多个结构元件来设计shRNA。通常，shRNA在长度上应为约80个核苷酸，并设计(从5’到3’)成包括以下结构元件以构成shRNA的发夹结构：(1)有义链(例如上茎)；(2)随后是发夹环；(3)与靶mRNA具有完美或接近完美的互补并且与靶mRNA反义的反义链(例如，下茎或引导链)；(4-5)两个切割基序，例如在引导链的第一位置的“U”或“UH”，以及在引导链的尾部区域处的“UUC”或“CUUC”；以及(6)在长度上约为两个核苷酸的任意间隔核苷酸，该间隔核苷酸在引导链“U”基序的第一个核苷酸与发夹环之间，以及在有义链的最后一个核苷酸与发夹环之间。构成茎的有义链和反义链可以设计成由长度范围约为19至29个的核苷酸组成，这将形成茎。环结构可以设计成由长度范围约为2至15个的核苷酸组成，优选不含任何内部二级结构。可以用于制造发夹环的序列的一些示例包含但不限于包括序列(TTCAAGAGA)的九个核苷酸环，以及包括序列(TCAAGAG)的七个核苷酸环。其他设计策略可以在Ros XB-D,Gu S.Guidelines for the optimal design of miRNA-based shRNAs的相关公开中找到。Methods(San Diego,Calif)2016；103:157-166，通过引用将其全部内容并入本文以用于所有目的。也有几种设计程序可用，例如来自The Broad Institute的TheRNAi Consortium software，其可通过Sigma-Aldrich和Thermo-Fisher Scientific获得。
还应该考虑靶序列的特异性，因为许多mRNA可以共享相似的序列。在选择与基因组中其他基因具有低序列同源性的靶序列时应格外小心，以便进行基因特异性敲低。当基因具有多种形式时，要实现基因表达的完全敲低，shRNA应该靶向靶mRNA的所有同工型之间共享的序列。
CDK19和CDK8 mRNA序列的比对可以确认没有同一性或同一性或相似性百分比低的核苷酸序列区域，该核苷酸序列区域可以用于设计优先靶向CDK19 mRNA而不靶向CDK8的shRNA，参见例如图16和图17中的3’UTR和5’UTR比对。
在一些实施方案中，可以设计靶向CDK19 mRNA转录物而不靶向CDK8 mRNA转录物的shRNA。在一种方式中，针对人CDK19和CDK8的mRNA序列来自美国国家生物技术信息中心(NCBI，可在Pubmed.gov找到)，并进行比对(例如，使用成对比对程序，例如LALIGN)。在长度上约为19至29(例如19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-27、19-28或19-29)个毗连(contiguous)核苷酸的区域是基于低序列同一性(例如，小于75％的同一性，有时小于70％的同一性，有时小于60％的同一性)进行选择的。在一些实施方案中，19至29个核苷酸区域具有非常低的(例如，小于40％、小于30％或小于20％)序列同一性。毗连序列可以位于蛋白质编码区域5’-UTR、3’-UTR或跨两个区域。
在一个实施方案中，可以通过设计具有引导链的shRNA来完成CDK19的靶特异性敲低，该引导链与CDK19的3’UTR区域(SEQ ID NO:42)互补并且与CDK8的3’UTR(SEQ ID NO:44)具有低同源性或没有同源性。引导链在长度上可以是19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。可以用于设计CDK19 shRNA的一些示例性序列区域包含但不限于CTCCAGCTCCCGTTGGGCCAGGCCAGCCC(SEQ ID NO:20)，AGCCCAGAGCACA
GGCTCCAGCAATATGT(SEQ ID NO:21)，CTGCATTGAAAAGAACCAAAAAAATGCAA(SEQ ID NO:22)，ACTATGATGCCATTTCTATCTAAAACTCA(SEQ ID NO:23)，TACACATGGGAG
GAAAACCTTATATACTG(SEQ ID NO:24)，AGCATTGTGCAGGACTGATAGCTCTTCTT(SEQ ID NO:25)，TATTGACTTAAAGAAGATTCTTGTGAAGT(SEQ ID NO:26)，TTCCCCTATCTCAGCA
CCCCTTCCCTGCA(SEQ ID NO:27)，TGTGTTCCATTGTGACTTCTCTGATAAAG(SEQ ID NO:28)，
CGTCTGATCTAATCCCAGCACTTCTGTAA(SEQ ID NO:29)，或CCTTCAGCATTTCTTTGAAGGATTCTATC(SEQ ID NO:30)。由本公开指导的普通技术人员理解，也可以使用‘3UTR中的其他低同源性序列区域。参见例如图16A至16D，来自(1-1186)和(2418-4570)的低同源性序列区域。在一个实施方案中，可以将shRNA设计成靶向CDK19的上游、CDK19的下游或CDK19的外显子。在某些情况下，CDK19 shRNA的表达导致至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CDK19敲低。在另一个实施方案中，与CDK8相比，CDK19 shRNA的表达可以优先敲低CDK19。
为了制备优先靶向CDK19的shRNA，将确认CDK19的独特区域，该区域与基因组中的其他CDK(例如，CDK8)或其他mRNA不具有显著同源性。将使用该序列来制备与该靶反义并且长度为19至29个核苷酸的引导链。为了制备表达盒，将在该盒的开始处添加适当的启动子，例如pol II或pol III启动子，随后是互补有义链(例如，与靶向引导链互补)，随后是长度约为2至15个核苷酸的环结构。另外，在引导链的第一个位置处应包含两个Ago切割基序“U”或“UH”，以及在引导链的尾部区域处应包含“UUC”或“CUUC”，连同在环结构末端处的1-2个间隔核苷酸。参见例如美国申请号US2008/0293142和Ros XB-D,Gu S.Guidelines for theoptimal design of miRNA-based shRNAs。Methods(San Diego,Calif)2016；103:157-166，通过引用将其全部内容并入本文以用于所有目的。
在另一个实施方案中，可以通过使用具有引导链的shRNA来进行CDK8的靶特异性敲低，该引导链包括与CDK8的5’UTR(SEQ ID NO:43)互补的区域并且与CDK19的5’UTR(SEQID NO:41)具有低同源性或不具有同源性。引导链的长度可以是19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。可以用于设计CDK8 shRNA的一些示例性序列包含但不限于TGGCCGCCCCGCCGCTCCCGCCGCAGCAG(SEQ ID NO:31)，GAGCAGAACGCGCGGCCGGAGA
GAGCGGC(SEQ ID NO:32)，GGAGCCGGCGCCCAGGGAGCCCGCGGGGA(SEQ ID NO:33)，CAAGGGCAGAGACACCGCTCCCCACCCCC(SEQ ID NO:34)，AGCCCTCGTCCCTCGGCTCTCCTTCGCCG(SEQID NO:35)，GGGGATCCTCCCCGTTCCTCCACCCCCGG(SEQ ID NO:36)，CCGGCCTCTG
CCCCGCCGTCCCCCTGGAT(SEQ ID NO:37)，GTCCCTGGCGCTTTCGCGGGGCCTCCTCC(SEQ IDNO:38)，TGCTCTTGCCGCATCAGTCGGGCTGGTGC(SEQ ID NO:39)，或TGCGGCCGGCGGGCGTAGAGC
GGGCGGGT(SEQ ID NO:40)。本领域普通技术人员将理解，也可以使用‘5UTR中的其他低同源性序列区域。参见例如图17，来自(1-33)或(223-504)的低同源性序列区域。在另一个实施方案中，可以将shRNA设计成靶向CDK8的上游、CDK8的下游或CDK8的外显子。在某些情况下，CDK8 shRNA的表达可以导致至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CDK8敲低。
为了制备优先靶向CDK8的shRNA，将确认CDK8的独特区域，该区域与基因组中的其他CDK(例如，CDK19)或其他mRNA不具有显著同源性。将使用该序列来制备与该靶反义并且长度为19至29个核苷酸的引导链。为了制备表达盒，将在该盒的开始处添加适当的启动子，例如pol II或pol III启动子，随后是互补有义链(例如，与靶向引导链互补)，随后是长度约为2至15个核苷酸的环结构。另外，在引导链的第一个位置处应包含两个Ago切割基序“U”或“UH”，以及在引导链的尾部区域处应包含“UUC”或“CUUC”，连同在环结构末端处的1-2个间隔核苷酸。参见例如美国申请号US2008/0293142和Ros XB-D,Gu S.Guidelines for theoptimal design of miRNA-based shRNAs。Methods(San Diego,Calif)2016；103:157-166，通过引用将其全部内容并入本文以用于所有目的。
可以使用针对mRNA水平的实时PCR分析或针对蛋白水平的ELISA测定来确认shRNA或siRNA的特异性或敲低水平。实验对照可以并行运行以评估敲低。可以使用的实验对照的一些示例包含但不限于模拟感染或模拟转染的样本、空载体、编码杂乱靶(scrambledtarget)或种子区的shRNA、完全靶向另一种基因的shRNA，例如，管家基因GAPDH或肌动蛋白，或GFP阳性对照。
为了确定siRNA或shRNA(例如RNAi剂)是否优先靶向CDK19而不是CDK8，可以在细胞系或其他表达***中转染或转导以诸如GFP等标志物标记的shRNA或siRNA，选择GFP阳性细胞(例如转化的细胞)，并确定细胞***中相对于CDK19表达的CDK19敲低水平，而不用RNAi药剂进行转染或转导。在一些实施方案中，测量RNA的表达。在其他实施方案中，测量蛋白质的表达。在一个示例中，可以通过本领域已知的任何基于PCR的测定法(例如，RT-PCR或qRT-PCR等)来测量mRNA。在一个示例中，蛋白质水平可以通过免疫测定法(例如，ELISA测定法或本领域已知的任何基于抗体的方法)测量。
在一些实施方案中，相对于没有转染或转导的***，靶向CDK19 shRNA或siRNA导致小于约30％的CDK19表达和大于约70％的CDK8表达。在一些其他实施方案中，靶向CDK19shRNA或siRNA导致小于约50％的CDK19表达和大于约95％的CDK8。在一些实施方案中，靶向CDK19 shRNA或siRNA导致小于约5％的CDK19表达和大于约80％的CDK8表达。在一些实施方案中，靶向CDK19shRNA或siRNA导致小于约1％的CDK19表达和大于约60％的CDK8表达。在一些实施方案中，靶向CDK19 shRNA或siRNA导致小于约0.5％的CDK19表达和大于约90％的CDK8。在一些实施方案中，相对于没有转染或转导的***，靶向CDK19 shRNA导致约为0％的CDK19表达和约为100％的CDK8表达。在一些实施方案中，测量RNA的表达。在其他实施方案中，测量蛋白质的表达。
CDK8和CDK19 siRNA
本公开还提供了基于siRNA的治疗剂，其用于抑制三阴性乳腺癌患者中CDK8和CDK19的表达。双链RNAi治疗剂包含与反义链互补的有义链。siRNA的有义链或反义链在长度上可以是约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。基于siRNA的治疗剂的反义链包含与编码CDK8或CDK19的mRNA的一部分互补的区域。可以在美国专利号US9399775中找到制备治疗性siRNA的其他方法，该专利通过引用整体并入本文以用于所有目的。
在某些情况下，CDK19 siRNA的表达可以导致至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CDK19敲低。在另一个实施方案中，与CDK8相比，CDK19 siRNA的表达可以优选地敲低CDK19。在某些情况下，CDK8 siRNA的表达可以导致至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CDK8敲低。
在优选的实施方案中，CDK19 siRNA可以导致至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CDK19敲低，以及至少约10％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的CDK8敲低。
shRNA和siRNA递送
取决于是否需要瞬时或稳定表达，可以选择合适的递送载体。可以与本公开一起使用的递送载体的示例是病毒载体、质粒、外来体、脂质体、细菌载体或纳米颗粒。本公开还提供了通过本领域已知的任何方式的递送。
为了靶向递送至三阴性乳腺癌细胞，本领域技术人员将理解，可以对递送载体进行遗传修饰以靶向特定的细胞类型或组织类型。为了制备靶向的递送载体或质粒，可以确认三阴性乳腺癌表达或与三阴性乳腺癌相关联的独特分子(例如受体、蛋白质、糖蛋白或其组合)，然后创建携带(harbor)或表达这些标志物的递送载体或质粒，优选在该递送载体或质粒的外部(例如，面向细胞溶质)携带或表达这些标志物的递送载体或质粒。另外，根据所需的治疗持续时间，可以将病毒递送载体遗传修饰为连续复制、复制缺陷或有条件复制，如Sliva K,Schnierle BS.Selective gene silencing by viral delivery of shorthairpin RNA.Virology Journal.2010中所描述。
在一个实施方案中，CDK8或CDK19 shRNA或siRNA可以通过腺病毒载体递送。腺病毒是带有核衣壳和线性dsDNA基因组的无包膜病毒。尽管它们能够在哺乳动物的细胞核中复制，但是它们不能有效地整合到宿主的基因组中，因此***诱变的风险极小，但不足以用于长期治疗。
在另一个实施方案中，CDK8或CDK19 shRNA或siRNA可以通过腺相关病毒载体(AAV)递送。AAV是最小的病毒之一，属于依赖性病毒(Dependovirus)属。它具有一个小的单链DNA基因组，可以容纳约八个单独的shRNA。AAV允许进入重新靶向，从而允许将shRNA递送至特定细胞或组织类型。在进一步的实施方案中，本公开提供了修饰的AAV，其经靶向以递送至三阴性乳腺癌细胞或组织类型的。
在另一个实施方案中，CDK8或CDK19 shRNA或siRNA可以由逆转录病毒载体递送。逆转录病毒是属于逆转录病毒科并通过双链DNA中间体复制的单链RNA病毒。它们可以整合到宿主的基因组中，从而允许长期表达shRNA。Env蛋白在将逆转录病毒靶向靶细胞中起着核心作用。在进一步的实施方案中，本公开提供了逆转录病毒载体，其具有修饰的env基因或其蛋白产物以递送至三阴性乳腺癌细胞或组织类型。在进一步的实施方案中，本公开提供了使用具有蛋白酶激活的Env蛋白的逆转录病毒载体来递送CDK8或CDK19 siRNA或shRNA。
在另一个实施方案中，CDK8或CDK19 shRNA或siRNA可以通过慢病毒载体递送。慢病毒是慢病毒属中逆转录病毒的一个亚类，其能够容纳大量DNA。对于某些应用，可能更优选使用被工程化为“自我灭活”的慢病毒载体，称为“SIN”载体。在进一步的实施方案中，本公开提供了通过慢病毒载体递送CDK8或CDK19 shRNA，该慢病毒载体具有修饰的env基因或其蛋白产物以递送至三阴性乳腺癌细胞或组织类型。
在另一个实施方案中，shRNA或siRNA可以由纳米颗粒递送。可以与本公开一起使用的纳米颗粒的示例包含但不限于外泌体、脂质体、有机纳米颗粒或无机纳米颗粒。纳米颗粒的其他非限制性示例包含但不限于例如Hong,Cheol Am和Yoon Sung Nam.“FunctionalNanostructures for Effective Delivery of Small Interfering RNA Therapeutics.”Theranostics 4.12(2014):1211–1232.PMC.Web.13Sept.2018(通过引用将其全部内容并入本文以用于所有目的)中提供的那些。在一些实施方案中，shRNA或siRNA的递送由三阴性乳腺癌细胞存在或特异的受体、蛋白质、糖蛋白或其组合介导。
在一些实施方案中，施用含于溶液的siRNA CDK19治疗剂。可以施用含于无缓冲溶液的siRNA。在一个实施方案中，施用含于水的siRNA。在其他实施方案中，将siRNA与缓冲溶液(例如乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、谷醇溶蛋白缓冲液、碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液或其任何组合)一起施用。在一些实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水。
3.1.1.2.RNASE H介导的MRNA降解/反义
RNase H依赖性反义寡核苷酸(ASO)是经化学修饰的单链寡核苷酸，其与靶mRNA中的互补序列结合，并且通过RNase H介导的对靶RNA的切割以及通过核糖体的空间封闭抑制翻译来降低基因表达。
RNase H是内切核酸酶，其催化RNA：DNA双链体(duplex)中RNA的切割。对该酶最深入研究的内源功能是去除冈崎片段(小RNA)，该片段用于在细胞***过程中引发DNA复制。在一些实施方案中，为了靶向CDK19基因的mRNA转录物以进行降解，可以将能够与mRNA的一部分杂交的核酸(例如，DNA寡核苷酸)施用给受试者。一旦进入细胞(例如TNBC细胞)，DNA寡核苷酸碱基就与其靶向的mRNA转录物配对。RNase H可以与所得的双链体结合，并在一个或多个位置处切割mRNA转录物。DNA寡核苷酸可以进一步与其他mRNA转录物结合，以靶向它们进行RNase H降解。因此，可以大大降低患有TNBC的受试者中CDK19基因的表达。
能够与CDK19基因的mRNA转录物杂交的DNA寡核苷酸可以含有例如10至30个核苷酸(例如10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个核苷酸)。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸可以与其结合的mRNA转录物的部分具有100％的互补性。在其他实施方案中，DNA寡核苷酸可以与其结合的mRNA转录物的部分具有小于100％的互补性(例如95％、90％、85％、80％、75％或70％的互补性)，但是仍然可以形成稳定的RNA：DNA双链体，以使RNase H切割mRNA转录物。DNA寡核苷酸可以与CDK19基因的mRNA转录物的5’UTR或3’UTR结合。
此外，能够与CDK19基因的mRNA转录物杂交的DNA寡核苷酸可以在5’端和3’端包括修饰的核苷酸。在末端修饰的核苷酸可以起到保护DNA寡核苷酸内部不被核酸酶降解并增加对靶mRNA转录本的结合亲和力的作用。在一些实施方案中，在末端处修饰的核苷酸可以包含修饰的核碱基(例如5-甲基胞嘧啶)和/或修饰的糖(例如锁定的糖)。在一些实施方案中，可以修饰DNA寡核苷酸的5’和3’端的3-5个核苷酸。
3.1.1.3.miRNA
微小RNA(miRNA)是在基因表达的RNA沉默和转录后调节中起作用的非编码的小RNA分子。miRNA与mRNA转录物中的互补序列碱基配对。结果，可以通过一种或多种机制使mRNA转录沉默，该机制例如切割mRNA链，通过缩短其多(A)尾巴来使mRNA失稳，以及降低通过核糖体的mRNA转录物到蛋白质的翻译效率。在一些实施方案中，miRNA类似于shRNA途径的siRNA，不同的是，miRNA衍生自RNA转录物的区域，该RNA转录物在其自身上折回以形成短发夹，也称为pri-miRNA。一旦转录为pri-miRNA，发夹就会被称为Drosha的酶从细胞核的初级转录物中切割下来。然后将发夹或pre-miRNA从细胞核输出到细胞质中。在细胞质中，发夹环被称为Dicer的酶切开。现在所得的产物是在3’端带有突出(overhang)的双链RNA，然后将其整合到RISC中。一旦进入RISC，第二条链将被丢弃，而现在位于RISC中的miRNA是成熟的miRNA，其与具有互补序列的mRNA结合。
来自shRNA途径的miRNA和siRNA之间的差异是与miRNA的碱基配对来自miRNA的5’端，其也被称为种子序列。由于种子序列短，每个miRNA可能靶向更多的mRNA转录本。在一些实施方案中，靶向CDK19基因的miRNA可以用于本文所述的方法。
3.1.2.CRISPR/CAS***
在一些实施方案中，使用诸如CRISPR/Cas***之类的基因编辑***执行CDK19基因的敲除或敲低。参见Sanders和Joung,Nature Biotechnol 32:347-355,2014,Huang等人,J Cell Physiol 10:1-17,2017以及Mitsunobu等人,Trends Biotechnol 17:30132-30134,2017。CRISPR/Cas***包含Cas蛋白和至少一种或两种核糖核酸，该核糖核酸能够将Cas蛋白导向至CDK19序列中的靶基序并与其杂交。然后，Cas蛋白切割靶基序并导致双链断裂或单链断裂。能够改变细胞中靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas***都可以用于本文所述的方法。在一些实施方案中，CRISPR/Cas***是CRISPR I型***。在一些实施方案中，CRISPR/Cas***是CRISPR II型***。在一些实施方案中，CRISPR/Cas***是CRISPR V型***。
在本文所述的方法中使用的Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白或其功能性衍生物。“功能性衍生物”包含但不限于天然序列的片段和天然序列多肽的衍生物及其片段，只要它们具有与相应的天然序列多肽相同的生物学活性。本文考虑的生物活性是功能性衍生物将DNA底物(例如，CDK19基因)水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、共价修饰及其融合体。Cas蛋白或其片段的合适衍生物包含但不限于Cas蛋白的突变体、融合物或共价修饰。
在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的Cas蛋白是Cas9或其功能性衍生物。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自化脓链球菌。Cas9含有2个核酸内切酶结构域，该结构域包含切割与crRNA不互补的靶DNA的RuvC样结构域，以及切割与crRNA互补的靶DNA的HNH核酸酶结构域。Cas9的双链核酸内切酶活性还需要，称为原间隔子相关基序(PAM)的短保守序列(例如2-5个核苷酸)紧接在靶序列中靶基序的3’端之后。
在一些实施方案中，将Cas蛋白以多肽形式引入TNBC细胞。在某些实施方案中，Cas蛋白可以与细胞穿透性多肽结合。细胞穿透性肽的非限制性示例包含但不限于，例如在Milletti等人,Drug Discov.Today 17:850-860,2012(其相关公开内容通过引用整体并入本文)中提供的那些。在其他实施方案中，可以对TNBC细胞进行基因工程改造以产生Cas蛋白。
在一些实施方案中，由引导RNA将Cas蛋白导向的CDK19基因中的靶基序在长度上可以在15至25个核苷酸之间(例如，在长度上是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸)。在一些实施方案中，靶基序在长度上是至少20个核苷酸。在一些实施方案中，CDK19基因中的靶基序紧随被Cas蛋白识别的被称为原间隔子相关基序(PAM)的短保守序列。在一些实施方案中，PAM基序是NGG基序。在一些实施方案中，CDK19基因的靶基序在第一外显子内。在一些实施方案中，可以选择靶基序以使CRISPR/Cas***的脱靶效应最小化。本领域技术人员将理解，可以使用多种技术(例如，生物信息学分析)来选择合适的靶基序，以使脱靶效应最小化。
能够将Cas蛋白导向至CDK19基因中的靶基序并与其杂交的核糖核酸被称为单链引导RNA(“sgRNA”)。如本领域技术人员将理解的，可以根据所采用的特定CRISPR/Cas***和靶多核苷酸的序列来选择sgRNA。在一些实施方案中，还可以选择一种或两种核糖核酸以尽可能减少与除靶多核苷酸序列以外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，将一种或两种核糖核酸设计成与靶基序杂交，该靶基序紧邻由Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序。引导RNA也可以使用可用的软件进行设计，例如CRISPR设计工具(麻省理工学院)。在一些实施方案中，可以根据本领域已知的方法将一种或多种sgRNA转染到TNBC细胞中。
抗体用于治疗目的的用途已被用于治疗癌症。被动免疫疗法涉及在癌症治疗中使用单克隆抗体(mAb)(例如，参见Devita,Hellman,And Rosenberg's Cancer:Principles&Practice Of Oncology,第八版(2008),DeVita,V.等人编著,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,pp.537-547,2979-2990)。这些抗体可以通过直接抑制肿瘤细胞生长或存活，以及通过吸收人体免疫***对自然细胞的杀伤活性而具有固有的治疗生物学活性。抗体可以单独施用或与放射或化学治疗剂联合施用。经批准用于乳腺癌治疗的曲妥珠单抗是这种治疗剂的示例。替代地，抗体可以用于制备抗体-药物结合物，其中抗体与药物连接，并通过与肿瘤特异性结合而将该药剂引导至肿瘤。Ado-曲妥珠单抗emtansine(T-DM1)是经批准用于治疗乳腺癌的抗体-药物结合物的示例(参见等人,Curr.Med.Chem.,Vol.24(23),2505-2527(2017)。另一类型的免疫疗法是主动免疫疗法或疫苗接种，其利用存在于特定癌症(例如TNBC细胞)上的抗原或引导抗原表达的DNA构建体，然后在受试者中引发免疫响应，即，诱导受试者主动产生针对其自身癌症的抗体。
抗体在靶向疾病中涉及的细胞表面蛋白方面非常有效。尽管通常认为它们的大尺寸、复杂的架构以及对二硫键的结构依赖性妨碍了细胞内应用，但是在文献(参见，例如Biocca等人,Expression and targeting of intracellular antibodies in mammaliancells.EMBO J.(1990)；9(1):101–8以及Steinberger等人,Functional deletion of theCCR5receptor by intracellular immunization produces cells that are refractoryto CCR5-dependent HIV-1infection and cell fusion.Proc Natl Acad Sci U S A.(2000)；97(2):805–10)中存在显示为维持功能性细胞内活性的原位表达(参见，例如Miersch和Sidhu,F1000Res doi:10.12688/f1000research.8915.1,2016)和外源供应两种全抗体(whole antibody)的许多示例。使用较小、较不复杂的结合蛋白，例如抗原结合片段(Fabs)和单链可变片段(scFvs)进行细胞内应用的尝试同样显示出其成功结合和调节细胞质蛋白功能的能力(参见例如Marasco等人,Design,intracellular expression,andactivity of a human anti-human immunodeficiency virus type 1gp120 single-chain antibody.Proc Natl Acad Sci U S A.(1993)；90(16):7889–93)。
如本文所用，术语“抗体”涵盖但不限于任何类别的完整免疫球蛋白(即完整抗体)。天然抗体通常是异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。通常，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥(disulfidebridge)。每条重链的一端具有可变结构域[V(H)]，后接多个恒定结构域。每条轻链的一端具有可变结构域[V(L)]，另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物的抗体的轻链归为两种明显不同的类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归为不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“表位”是指包含能够与所提供的抗体特异性相互作用的任何决定子。表位决定子通常由分子的化学活性表面分组(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。抗体识别的表位的确认如下进行。首先，制备单克隆抗体识别的靶分子的各种部分结构。通过制备分子的部分肽来制备部分结构。通过例如已知的寡肽合成技术或通过将编码所需部分多肽的DNA掺入合适的表达质粒中来制备这种肽。将表达质粒递送至合适的宿主，例如大肠杆菌，以产生肽。例如，可以通过既定的基因工程技术制备从靶分子的C末端或N末端开始起作用的具有适当减小的长度的一系列多肽。通过确立哪些片段与抗体反应，确认表位区域。通过使用既定的寡肽合成技术合成各种较小的肽或肽的突变体来更近地确认表位。较小的肽例如用于竞争性抑制测定中，以确定特定的肽是否干扰抗体与靶分子的结合。如果是，则肽是抗体结合的表位。可以使用市售的试剂盒，例如SPOTs试剂盒(Genosys Biotechnologies,Inc.,The Woodlands,TX)和基于多针合成方法的多针肽合成试剂盒系列(Chiron Corporation,Emeryvile,CA)来获得各种各样的寡肽。
术语抗体或其片段还可以涵盖具有双重或多个抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及诸如F(ab’)2、Fab’、Fab等的片段，包含杂合片段。因此，提供了保留结合其特异性抗原的能力的抗体片段。例如，保持CDK19结合活性的抗体的片段包含在术语抗体或其片段的含义内。这种抗体和片段可以通过本领域已知的技术来制备，并且可以根据用于产生抗体和筛选抗体特异性和活性的通用方法来筛选特异性和活性[参见Harlow和Lane.Antibodies,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications,New York(1988)]。
抗体或其片段的含义中还包含抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的结合物，例如在美国专利号4,704,692(其内容通过引用整体并入本文)中描述的。
在一个实施方案中，可以使用本领域已知的方法制备治疗性抗体(或抗体片段)，其对在乳腺癌中，特别是TNBC细胞中存在而在任何正常(非癌性)组织中不存在或仅以低水平存在的抗原具有特异性。因此，治疗性抗体具有针对TNBC细胞的生物学活性并能够吸收免疫***的响应来治疗疾病。可以将治疗性抗体单独作为治疗剂施用，或与当前的治疗方法(例如化学疗法、放射疗法或基于铂的疗法)组合使用，或用于制备与毒性剂(例如药物)连接的免疫结合物。
通过本领域已知的方法制备的针对CDK19的单克隆抗体(例如，抗CDK19抗体)可以用于确认***组织中癌细胞的存在或不存在，以用于诊断或治疗的目的。抗CDK19抗体还可以用于确认从实体瘤释放后在血液中循环的癌细胞的存在或不存在，或其水平。这样的循环抗原可以包含完整的CDK19抗原或其片段，其保留根据本文教导的方法被检测到的能力。这种检测可以例如通过使用本领域中常用的标准方法的FACS分析来实现。
在一些实施方案中，靶向CDK19的方法可以包含对有需要的受试者施用治疗有效量的抗体(例如，抗CDK19抗体)，该抗体对CDK19具有免疫反应性，以治疗乳腺癌，特别是治疗TNBC。在一个实施方案中，对CDK19具有免疫反应性的抗体靶向与细胞表面分子相反的细胞内信号转导分子，例如激酶，从而通过中和存在于CDK19上而不存在于CDK8上的一种(或多种)表位来提供抗体的特异性。在另一个实施方案中，抗CDK19抗体可以靶向PI3K/mTOR/AKT途径或ERK5[参见，Ocana和Pandiella,Oncotarget,8(13),22218-22234(2017)]。在一个实施方案中，抗CDK19抗体可以靶向多个细胞内信号转导分子，例如PI3K/mTOR和JAK/STAT途径。在又一个实施方案中，抗CDK19抗体可以包括工程蛋白，该工程蛋白与存在于CDK19上而不存在于CDK8上的中和表位结合。
在一个实施方案中，靶向CDK19的方法可以包含向有需要的受试者施用治疗有效量的肿瘤抗原(TA)特异性单克隆抗体以治疗TNBC。在一个实施方案中，TA特异性mAB可以针对与TNBC相关联的细胞内抗原(参见例如，Wang等人,Molecular Oncology,Vol.9(10),(2015)1982-1993以及Just,FEBS letters,2:21(2014),350-355)。
一方面，提供了一种治疗患有乳腺癌的受试者的方法，该方法包含向受试者施用药学有效量的包括CDK19靶向药剂的组合物的步骤。CDK19靶向药剂可以是CDK19靶向抗体、CDK19靶向肽、CDK19靶向小分子、CDK19靶向RNA分子或其组合。在某些情况下，CDK19靶向药剂可以与治疗剂结合。在某些情况下，该方法进一步包含向受试者施用第二形式的癌症疗法(例如，化学疗法或放射疗法)。在一个实施方案中，乳腺癌是TNBC。
另一方面，提供了一种抑制乳腺癌细胞中CDK19基因表达的方法，该方法包含使表达CDK19基因的乳腺癌细胞与合成的CDK19靶向RNA分子接触的步骤。
在另一方面，提供了一种评估患有癌症的受试者对CDK19靶向药剂的响应性的方法，该方法包含以下步骤：(a)测量来自受试者的肿瘤样本中CDK19的量；(b)确定受试者是否患有以具有高水平的CDK19表达为特征的癌症；以及(c)如果受试者的癌症以具有高水平的CDK19表达为特征，则表明受试者更有可能对CDK19靶向药剂作出响应，或者如果受试者的癌症以具有低水平的CDK19表达为特征，则表明受试者不太可能对CDK19靶向药剂作出响应。
一方面，提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包含向患者施用药剂有效量的包括CDK19靶向药剂的组合物。CDK19靶向药剂是与CDK19蛋白或CDK19 mRNA特异性结合的药剂。CDK19靶向药剂包含与CDK19蛋白或CDK19 mRNA特异性结合的抗体或其片段、肽、小分子和多核苷酸(例如RNA分子)。该组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。在某些情况下，与CDK19蛋白结合的CDK19靶向药剂可以直接抑制CDK19活性。在其他情况下，与CDK19 mRNA结合的CDK19靶向药剂可以抑制CDK19表达，从而抑制CDK19活性。
在一种情况下，CDK19靶向药剂可以包括CDK19靶向抗体。CDK19靶向抗体可以是单克隆抗体。在一些情况下，CDK19靶向抗体可以是人源化抗体。在另一个实例中，CDK19靶向药剂可以是CDK19靶向肽。在又一个实例中，CDK19靶向药剂可以是CDK19靶向小分子。CDK19靶向肽和小分子可以通过如下文进一步讨论的多种方式衍生。在某些情况下，该肽衍生自CDK19靶向抗体的序列。
在一些情况下，用本文所述的方法治疗受试者抑制该受试者中的以下至少一种：肿瘤形成、肿瘤细胞的增殖、肿瘤细胞的生长或肿瘤细胞的转移。在另一个实施方案中，用本文所述的方法治疗受试者可以导致肿瘤尺寸减小，并且在某些情况下，可以消除受试者中的一个或多个肿瘤。
3.1.4.小分子抑制剂
在一种方式中，用于治疗TNBC的方法包含使用CDK19活性的小分子抑制剂靶向CDK19蛋白。CDK19的小分子抑制剂的示例描述在美国专利号9,321,737、美国专利公开号US20170071942、Mallinger等人,J.Med.Chem.59:1078,2016,以及Czodrowski等人,J.Med.Chem.59:9337,2016。在一些实施方案中，小分子抑制剂结合CDK19的ATP结合位点以抑制其活性。
CDK19的小分子抑制剂可以共价或非共价结合CDK19的ATP结合位点以抑制其活性。在其他实施方案中，小分子抑制剂可以与ATP结合位点之外的CDK19的其他部分结合。例如，小分子抑制剂可以与ATP结合位点外的氨基酸(例如蛋氨酸、酪氨酸或丝氨酸)形成共价相互作用，以抑制CDK19活性。除了占据ATP结合以抑制激酶活性外，小分子抑制剂还可以与CDK19结合，以引起阻止CDK19发挥功能的CDK19构象变化。在一些实施方案中，小分子抑制剂可以以比CDK8更高的亲和力结合CDK19。如图9所示，CDK19和CDK8之间的绝大多数氨基酸差异在C末端结构域中。在一些实施方案中，不受任何理论的束缚，小分子抑制剂可以结合CDK19的C末端结构域的氨基酸或部分(其不同于CDK8的相应氨基酸或部分)，以实现对CDK19而非对CDK8的选择性抑制。
在一些实施方案中，小分子抑制剂并非美国专利号9,321,737中描述的化合物。在一些实施方案中，小分子抑制剂并非美国专利公开号US 20170071942中描述的化合物。在一些实施方案中，小分子抑制剂并非Mallinger等人,J.Med.Chem.59:1078,2016中描述的化合物。在一些实施方案中，小分子抑制剂并非Czodrowski等人,J.Med.Chem.59:9337,2016中描述的化合物。在一些实施方案中，小分子抑制剂并非选自Cortistatin A、Sorafenib、Linifanib、Ponatinib、Senexin B、CCT251545以及CCT251921的一种或多种化合物。
3.1.5.没有显著抑制CDK8表达或活性的CDK19抑制剂，或者对CDK19表达或活性的抑制程度大于其对CDK8表达或活性的抑制程度的CDK19抑制剂.
可以基于CDK19和CDK8蛋白及其相应的基因和mRNA的序列或结构的差异来设计抑制CDK19表达或活性但不抑制CDK8表达或活性的药剂，或对CDK19表达或活性的抑制程度大于对CDK8表达或活性的抑制程度的药剂。例如，CDK19和CDK8 mRNA序列的比对可以确认非相同或低同一性核苷酸序列，其可以用于设计与CDK19 mRNA而非CDK8序列相关联的shRNA或其他核酸药剂。(参见图16和17)。同样，比对CDK19和CDK8氨基酸序列可以确认不同的区域，并且可以产生抗体或其他结合剂以特异性结合CDK19蛋白。同样，可以确认(通过合理的药物设计或筛选来确认)小分子药剂，该小分子药剂特异性抑制CDK19活性或相对于CDK8活性，以更大的程度抑制CDK19活性。
如本文所用，术语“抑制CDK19活性但不显著抑制CDK8活性的药剂”是指能够特异性结合和抑制CDK19活性从而在体内或体外检测到最小的CDK19活性的药剂；在相同条件下，该药剂不会导致CDK8活性显著降低。例如，抑制CDK19活性的药剂可以特异性结合CDK19并在体内或体外完全或显著抑制CDK19活性。在某些情况下，可以通过其优先结合CDK19基因或CDK19基因产物并完全抑制CDK19的表达或活性的能力来确认CDK19抑制剂。当暴露于药剂时的CDK19活性比存在于对照中或缺乏药剂时的CDK19活性低至少约70％，例如至少约75％、80％、90％或95％时，则发生CDK19抑制。当暴露于药剂时的CDK8活性为缺乏药剂时的CDK8活性的至少约90％，例如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％时，CDK8活性没有发生显著降低。如本文所述，药剂可以包含小分子(即，分子式重量为1000道尔顿或更小的分子)，例如小分子化学抑制剂，或大分子，例如siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或蛋白质。
确定药剂对CDK19和/或CDK8活性的作用可以使用本领域已知的一种或多种方法来测量，包含但不限于最大半抑制浓度(IC50)、解离常数(KD)和抑制剂常数(KI)。例如，IC50是对物质抑制特定生物学或生化功能有效性的量度。该值表示将抑制给定的生物过程(或生物过程的组分)所需的物质的浓度取半。IC50值通常表示为摩尔浓度。根据美国食品药品监督管理局(FDA)的规定，IC50表示体外50％抑制所需的药物的浓度。在一个实施方案中，抑制CDK19活性但不显著抑制CDK8活性的药剂具有的IC50为在相同条件下影响CDK8活性所需的药剂浓度的至少约1/2、1/5、1/10、1/50、1/75或1/100。在另一个实施方案中，抑制CDK19活性的药剂的IC50比抑制CDK8活性的药剂的IC50低至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在另一个实施方案中，可以通过计算药剂与每个CDK的平衡解离常数(KD)来确定药剂对CDK19和CDK8活性的作用。例如，抑制CDK19活性但不显著抑制CDK8活性的药剂具有的KD是在相同条件下抑制CDK8的药剂的KD至少约1/2、1/5、1/10、1/50或1/100。在一个实施方案中，药剂(针对CDK19)的KD比药剂(针对CDK8)的KD低至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个优选的实施方案中，药剂针对CDK19的KD低于药剂针对CDK8的KD。换句话说，药剂(针对CDK8)的平衡解离常数大于药剂(针对CDK19)的平衡解离常数。在一个实施方案中，药剂可以包含KD值在微摩尔(10-6)至纳摩尔(10-7至10-9)范围内的抗体。在另一个实施方案中，药剂可以包含KD在纳摩尔范围(10-9)至皮摩尔(10-12)范围内的抗体。在又一个实施方案中，药剂可以具有针对CDK19的纳摩尔(nM)平衡解离常数和针对CDK8的微摩尔(μM)平衡解离常数。美国专利公开号US20120071477描述了激酶抑制测定法，其中单一浓度(2,000nM)的化合物抑制ATP口袋结合。
在另一个实施方案中，可以通过计算药剂对每个CDK的抑制剂常数(KI)来确定药剂对CDK19和CDK8活性的作用。KI指示抑制剂的效力；它是产生最大半抑制所需的浓度。KI越低，药剂与CDK基因之间的结合亲和力越大。例如，抑制CDK19活性但不显著抑制CDK8活性的药剂具有的KI为在相同条件下药剂(针对CDK8)的KI的至少约1/2、1/5、1/10、1/50、1/75或1/100。在一个实施方案中，药剂针对CDK19的KI比药剂针对CDK8的KI低至少约25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在优选的实施方案中，药剂针对CDK19的KI低于药剂针对CDK8的KI。换句话说，药剂针对CDK8的抑制剂常数大于药剂针对CDK19的抑制剂常数。例如，抑制CDK19活性的药剂可以与CDK19结合并在体内或体外显著抑制CDK19活性。在某些情况下，可以通过其优先结合CDK19并完全抑制CDK19活性的能力来确认CDK19抑制剂。当暴露于本发明药剂时的CDK19活性比存在于对照中或在缺乏药剂时的CDK19活性低至少约70％，例如至少约75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％，99％或完全被抑制时，则发生CDK19的抑制。当与药剂接触时的CDK8活性为缺乏药剂时的CDK8活性的至少约90％，例如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％，则CDK8活性没有显著降低。
如本文所用，术语“对CDK19活性的抑制程度大于对CDK8活性的抑制程度的药剂”是指这样的药剂，其能够结合和显著抑制CDK19活性，效果比该药剂在相同条件下对CDK8活性的抑制效果好。例如，当暴露于本发明药剂时的CDK19活性比在体外或体内的相同条件下的CDK8的活性低至少约10％，例如至少约15％、20％、30％、40％或50％时，则发生药剂对CDK19活性的抑制程度大于对CDK8活性的抑制程度。在优选的实施方案中，当观察到的CDK19的活性比相同条件下的CDK8的活性低至少10％时，药剂对CDK19活性的抑制程度大于对CDK8活性的抑制程度。在另一个实施方案中，当观察到的CDK19活性是相同条件下的CDK8活性的至少1/2、1/5、1/10、1/20、1/50或1/100时，药剂对CDK19活性的抑制程度大于对CDK8活性的抑制程度。抑制程度(即，将CDK19活性与CDK8活性进行比较)可以使用本领域已知的一种或多种方法来确定，包含但不限于本文说明书实施例部分中所述的测定法，例如“对照百分比”。(POC)”或“归一化抑制百分比(NPI)”。POC和NPI是将数据归一化的方法，在将多种药剂(例如各种抗体或小分子)与多个靶(例如CDK19和CDK8)进行比较时经常使用。例如，POC是通过将药剂相对于板中存在的一个或多个对照的测量值归一化来校正板对板差异(例如在高通量药物筛选中)的方法。每种药剂的原始测量值可以除以板内对照的“平均值”。NPI是一种基于对照的方法，其中将药剂测量值与阳性对照的平均值之间的差除以阳性对照和阴性对照的测量平均值之间的差[Malo等人,Nature Biotechnology,Vol.24,167-175(2006)]。通过将观察到的抑制程度归一化，可以得出关于哪种药剂有效抑制所研究的每个靶活性的准确结论。
3.1.6.联合疗法
在一种方式中，用联合疗法治疗患者，该联合疗法包括抑制CDK19表达或活性的药剂；和(a)放射疗法和/或化学疗法。在一种方式中，放射或化学疗法消除了大部分肿瘤块，并且CDK19抑制剂减少了存活的癌症干细胞(例如，EpCAMmed/high/CD10-/low)的细胞数量。在一种方式中，化学疗法包括施用蒽环类(例如阿霉素或表柔比星)、紫杉烷(例如紫杉醇或多西他赛)、抗代谢物(例如卡培他滨或吉西他滨)、铂药剂(例如卡铂或顺铂)、长春瑞滨或艾立布林。
3.2评估或预测治疗效果的方法
使用CDK19抑制剂的治疗过程将对患者具有有益的结果，包含例如肿瘤体积的减小、转移的减少以及具有表型EpCAMmed/high和CD10-/low的肿瘤细胞的减少。
肿瘤体积可以使用本领域已知的方法测量。参见，例如，Wapnir等人,BreastCancer Res Treat 41:15-19,1996；Sapi等人,PLoS One 10:e0142190,2015。在用CDK19抑制剂作为单一疗法或联合其他药剂或治疗的疗程后，肿瘤体积可以减小至少10％，可选地至少20％，有时至少50％。在一些实施方案中，可以在开始治疗的1个月内立即观察到肿瘤体积的减小(例如，肿瘤体积的至少10％、20％或30％减小)。在其他实施方案中，可以在开始治疗2、3、4、5或6个月内观察到肿瘤体积的减小(例如，肿瘤体积的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％减小)。在其他实施方案中，本文所述的治疗TNBC的方法还可以减慢或抑制肿瘤的进一步生长。在一些实施方案中，患者接受联合疗法，并且观察到超过用第二药剂进行的单一疗法的治疗益处。
个体中转移的减少可以如Makela等人.,Sci Rep.7:42109,2017中所述确定，并且可以根据标准方法在人群中观察到。
在一些实施方案中，获自受试者的TNBC肿瘤组织中具有表达谱EpCAMmed/high和CD10-/low的癌细胞的存在或量可以用于预测或评估受试者对靶向CDK19基因或其相应的蛋白质的疗法的治疗响应性。如本文所述和证实的，具有表达谱EpCAMmed/high和CD10-/low的细胞具有高的肿瘤起始能力，并且也富集有CDK19。在一些实施方案中，具有高百分比的EpCAMmed/high和CD10-/low TNBC细胞的受试者可以是特别有响应的。
在一种方式中，患有TNBC的受试者对CDK19靶向药剂的可能的治疗响应性通过以下确定：(a)对获自受试者的肿瘤样本中的EpCAMmed/high和CD10-/low细胞进行定量；(b)将(a)中EpCAMmed/high和CD10-/low细胞的数量与对CDK19靶向疗法有响应的肿瘤特有的参考值进行比较，以及如果EpCAMmed/high和CD10-/low细胞的数量等于或超过参考值，则用CDK19表达或活性抑制剂治疗患者。可以通过对健康和TNBC人群中的EpCAMmed/high和CD10-/low细胞进行定量，以及计算健康和肿瘤组织特有的统计学显著范围来确定参考值。在另一种方式中，可以测试来自同一受试者的肿瘤组织和健康组织，并且可以将相对于健康组织在肿瘤中具有升高的EpCAMmed/high和CD10-/low细胞的受试者确认为可能对CDK19靶向疗法有响应。
3.3药剂的递送
本文所述方法中使用的药剂组合物可以包含活性成分和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，其可以通过本领域技术人员已知的方法进行配制。在一些实施方案中，本发明的药剂组合物包含降低CDK19基因表达水平的治疗有效量的DNA或RNA寡核苷酸。在其他实施方案中，本发明的药剂组合物包含治疗有效量的作为抑制CDK19活性的小分子的DNA或RNA寡核苷酸。药剂组合物中治疗有效量的活性成分足以预防、减轻或改善疾病的症状或延长所治疗的受试者的生存期。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。
在某些实施方案中，本发明的药剂组合物被配制成长效制剂。通常，长效制剂通常比非长效制剂更长效。在一些实施方案中，通过植入(例如皮下)或通过肌内注射来施用这样的制剂。在一些实施方案中，使用合适的聚合或疏水材料(例如含于可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或作为难溶的衍生物，例如作为难溶的盐，制备长效制剂。
在一些实施方案中，药剂组合物可以包含递送***。递送***的示例包含但不限于外泌体、脂质体和乳剂。在一些实施方案中，可以将活性成分装载或包装在特异性靶向要治疗的细胞类型、组织或器官的外泌体中。外泌体是在多囊小体与质膜融合后释放到细胞外环境中的内吞起源的小膜结合囊泡。已经描述了包含B细胞、T细胞和树突细胞在内的许多免疫细胞的外泌体产生。用于将治疗性化合物装载到外泌体中的技术是本领域已知的，并且描述在例如美国专利公开号US 20130053426和US 20140348904以及国际专利公开号WO 2015002956中，这些专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，可通过电穿孔或使用转染试剂(即，阳离子脂质体)将治疗性化合物装载到外泌体中。在一些实施方案中，可以改造产生外泌体的细胞以产生外泌体并装载治疗性化合物。例如，可以通过用表达活性成分(即DNA或RNA寡核苷酸)的遗传构建体转化或转染产生外泌体的宿主细胞，使得活性成分随着宿主细胞产生外泌体而被吸收到外泌体中来装载外泌体。可以将各种靶向部分引入外泌体，使得可以将外泌体靶向所选的细胞类型、组织或器官。靶向部分可以结合细胞表面受体或其他对靶向的细胞类型、组织或器官具有特异性的细胞表面蛋白质或肽。在一些实施方案中，外泌体具有在其表面上表达的靶向部分。在一些实施方案中，在外泌体的表面上表达的靶向部分与外泌体跨膜蛋白融合。将靶向部分引入外泌体的技术是本领域已知的，并且描述于例如美国专利公开号US 20130053426和US 20140348904以及国际专利公开号WO2015002956中，这些专利通过引用并入本文。
4.实施例
4.1实施例1-材料和实验方法
化学试剂
以下是用于本研究的化合物的化学名称。CCT152921是4-[(2-烯乙基)氨基]-6-喹唑啉腈(NIH NCAT)。将该化合物重悬于溶媒[PBS+0.5％Methocel(w/v)+0.25％Tween 20(v/v)]中至3mg/mL的浓度，并以30mg/kg的剂量对小鼠给药。经由每日口服强饲施用CCT251921或溶媒。
shRNA表达慢病毒质粒
合成了包含有义靶序列、15-mer环序列(5′-GTTAATATTCATAGC-3′SEQ ID NO:19)和有义序列的反向互补序列的互补ssDNA寡核苷酸对(Elim Biopharmaceuticals)。将寡核苷酸在50μM退火缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0,50mM NaCl,1mM EDTA)中退火。随后将双链DNA寡核苷酸模板克隆到用BbsI消化的pRSI12-U6-(sh)-HTS4-UbiC-TagRFP-2A-PuroshRNA表达载体(Cellecta)中，以得到组成型活性shRNA载体构建体，以及克隆到用BbsI消化的pRSITUR-U6Tet-(sh)-UbiC-TetRep-2A-TagRFP中，以得到诱导型shRNA载体构建体。本研究中使用的shRNA载体中的有义链为：5′-GCG AGA ATT GAA GTA CCT TAA-3′[shCDK19-1(SEQ ID NO:1)]，5′-ACC AGC AAA TAT CCT AGT AAT-3′[shCDK19-2(SEQ ID NO:2)]，以及5’-GCA GGG TAA TAA CCA CAT TAA-3’[shCDK8-2(SEQ ID NO:3)]。上面未修饰的pRSI12-U6-(sh)-HTS4-UbiC-TagRFP-2A-Puro shRNA表达载体被用作“空”对照shRNA。pHIV-ZsGreen表达载体(Addgene)用于产生GFP阳性肿瘤细胞。DECIPHER 27K汇集的shRNA慢病毒库—用于RNAi筛选的人类模块1(Cellecta)在同一pRSI12 shRNA表达载体中包含靶向5,043个人类基因的27,500个独特shRNA构建体(每个基因大约五个或六个冗余shRNA)。
细胞系
MDA-MB231、MDA-MB468、HS578T和293T细胞获自ATCC。HMEC细胞获自ThermoFisherScientific。这些细胞已被供应商证实不含支原体。所使用的细胞系均未列入由ICLAC维护的常见错误确认的细胞系数据库中。自来自供应商的原始细胞解冻以来，使用的所有细胞系传代不到10次。所有MDA-MB231、MDA-MB468、293T和HS578T细胞均在补充有PSA(LifeTechnologies)、10％FBS(Hyclone)、Glutamax(ThermoFisher Scientific)和丙酮酸钠(Life Technologies)的DMEM(Invitrogen)中培育。HMEC细胞在HuMEC Ready培养基(ThermoFisher Scientific)中培育。
小鼠
Nod scidγ(NSG)小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid IL2Rgtm1Wjl/SzJ)购自JacksonLaboratory。用于PDX实验的小鼠是8至10周大的成年雌性小鼠。根据斯坦福大学APLAC委员会批准的方案，将所有用于本研究的小鼠圈(maintain)在斯坦福动物设施(StanfordAnimal Facility)中。在无菌条件下将小鼠圈在室内。给予小鼠高压灭菌的食物和水。对于使用多西环素诱导型构建体的PDX实验，向小鼠提供了含有625mg盐酸多西环素/kg饲料(Envigo)的啮齿动物饲料，以代替其正常的啮齿动物饲料。
PDX肿瘤及其病理和临床特征
对于人类样本，在方案得到斯坦福大学和希望之城机构审查委员会(Institutional Review Boards of Stanford University and The City of Hope)批准后获得知情同意。关于本研究中使用的所有PDX肿瘤的完整描述，参见图15。
PDX肿瘤细胞的单细胞悬浮液
用剃刀刀片将异种移植物机械切成大约1mm的碎片，然后在具有120μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素-B(PSA)(Life Technologies)的Advanced DMEM/F12(Invitrogen)中用胶原酶和透明质酸酶(Stem Cell Technologies)于37℃孵育3至4个小时。然后用ACK裂解缓冲液(Gibco)处理细胞以裂解红细胞，接着用预热的分散酶(StemCell Technologies)加DNAseI(Sigma)处理5分钟，并通过40μm尼龙网式过滤器过滤。最后用流式细胞术缓冲液(HBBS,2％FCS,PSA)洗涤细胞。
PDX肿瘤细胞的富集
将PDX肿瘤解离为单细胞后，用台盼蓝染色确定活细胞的数目，并用血细胞计数器手动计数。用流式细胞术缓冲液将细胞重悬至106个活细胞/mL的浓度，并于4℃用Biotin抗人CD326(EpCAM)抗体(Biolegend)以1:50(v/v)孵育20分钟。用流式细胞术缓冲液洗涤细胞，然后将其重悬至80μL，并于4℃用20μL抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)孵育20分钟。然后用流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并重悬于500μL缓冲液中。按照制造商的方案，将细胞应用于磁化LS柱(Miltenyi Biotec)、洗涤并从磁体上洗脱下来。
慢病毒产生
按照制造商的指示，通过使用Lipofectamine 2000(Thermofisher Scientific)以包装质粒混合物(Cellecta)和亚克隆的pRSI12shRNA表达质粒在293T细胞中产生慢病毒。按照制造商的指示，在48小时和72小时收集上清液，用0.45μm过滤器过滤，并用慢病毒沉淀溶液(Alstem LLC)沉淀。病毒以原始体积的1/100重悬。通过对感染了连续稀释的浓缩病毒的293T细胞进行流式细胞术分析，确定病毒滴度。
慢病毒感染
对于体外细胞系实验，在接种时将浓缩的慢病毒上清液(达到MOI为3)与细胞混合。通过在荧光显微镜下观察RFP来监测细胞。感染至少72小时后进行所有流式细胞术分析。
对于体内PDX肿瘤生长和类器官集落形成实验，将浓缩的慢病毒上清液(达到MOI为10)与含于具有4μg/mL Polybrene(Sigma-Aldrich)的类器官培养基中的PDX肿瘤细胞的单细胞悬浮液混合。类器官培养基的组成如下：Advanced DMEM/F12(Invitrogen)、10％FBS(Hyclone)、2.5％生长因子降低的基质胶(BD)、10ng/mL小鼠EGF(R&D)、100ng/mL Noggin(R&D)、250ng/mL RSPO-1(R&D)、1X B27(Invitrogen)、1X N2(Invitrogen)和PSA(LifeTechnologies)。然后通过于15℃以1200xg离心2小时来对细胞进行旋转接种。通过移液将细胞重悬，并在48孔超低附着细胞培养板(Corning)中放置过夜。
对于类器官集落形成测定，第二天将细胞转移至基质胶。对于体内PDX分析，如PDX肿瘤植入部分所述，将大约75％的细胞注射到NSG小鼠中。将剩余的25％细胞铺设在基质胶上，并在类器官培养基中培育72小时，直到细胞变为RFP阳性。在那时，除去培养基并更换成分散酶，并孵育2-3小时，直到基质胶溶解。将解离的细胞重悬在流式细胞术缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析，以确定注射入小鼠的细胞的“基线”RFP百分比。
类器官集落形成测定
将辐照过的L1-Wnt3a饲养细胞(Roel Nusse博士的慷慨礼物)与生长因子降低的基质胶(BD Biosciences)混合，并允许于37℃固化。将PDX肿瘤细胞的单细胞悬浮液转移到固化的基质胶/饲养细胞混合物底物上，并在类器官培养基中培育。细胞在具有5％CO2的37℃孵化器中培育大约2周。每3-4天将50％培养基更换为新鲜的培养基。在荧光显微镜下对菌落计数。仅对RFP阳性菌落(其代表转导的细胞)计数。对于我们诱导CDK19 shRNA表达的实验，向培养基中加入盐酸多西环素至终浓度为100ng/mL。
细胞活力测定
对于用化学品处理或用慢病毒感染的细胞系，按照制造商的指示将WST-1细胞增殖试剂(Roche)以1:10(v/v)的最终稀释度添加到每个孔中。随后将细胞于37℃和5％CO2下孵育。加入试剂后的1至4小时，在SpectraMax M3生物分析仪(Molecular Devices)上分析板。在450nm(信号波长)和650nm(参考波长)下测量每个孔的吸光度。因此，每个实验样本的信号是吸光度实验(A450nm-A650nm)。为了校正培养基的影响，通过测量空白孔中的吸光度来获得吸光度背景(A450nm-A650nm)。因此，每个样本的背景校正信号A校正＝吸光度实验-吸光度背景。将敲低的所有A校正值归一化为对照样本的A校正值，以获得“相对活力”。
定量PCR RNA表达分析
用Trizol(Life Technologies)裂解细胞，并按照制造商的指示提取RNA。然后用DNAseI处理RNA以除去污染的基因组DNA。按照制造商的指示，使用SuperScript III第一链合成试剂盒(Life Technologies)将RNA反转录为cDNA。遵照制造商的指示使用TaqMan基因表达预混物(Applied Biosystems)和以下TaqMan基因表达测定法(Applied Biosystems)：ACTB,Hs00357333_g1；CDK19,Hs01039931_m1；CDK8,Hs00993274_m1。在7900HT快速实时PCR***(Applied Biosystems)上收集数据，并使用SDS 2.4软件(Applied Biosystems)分析数据。针对β-肌动蛋白的表达将每个样本中的基因表达数据归一化。
PDX肿瘤细胞植入和有限稀释测定
将PDX细胞的单细胞悬浮液重悬于总体积为50-100μL的正常基质胶(BDBiosciences)和流式细胞术缓冲液的50％(v/v)混合物中。使用胰岛素注射器，将细胞皮下注射到雌性NSG小鼠的第四腹部脂肪垫处的***中。为了进行有限的稀释测定，通过流式细胞术确定注射到小鼠中的细胞的具体数量，其次通过血细胞计数器手动计数。
PDX肿瘤生长和总体重
通过触诊检测PDX肿瘤。通过测量长度(l)和宽度(w)并使用椭球公式1/6xlxw2xπ计算体积来确定肿瘤体积。每周两次确定肿瘤体积和小鼠体重。
小鼠PDX肿瘤和肺解剖
将小鼠安乐死后，通过外科手术切除异种移植肿瘤和小鼠肺。从每个肿瘤切出3至4mm的切片，并保存在冰冷的PBS中以进行成像。在M205FA荧光立体显微镜(Leica)上对小鼠肺和肿瘤成像，并用DFC310FX相机(Leica)捕获图像。
流式细胞术确定RFP百分比
使用100μm喷嘴在具有Diva软件(BD Biosciences)的流式细胞术Aria II(BDBiosciences)上进行流式细胞术。使用Flowjo软件(Flowjo)进行数据分析。对于所有实验，均使用侧向散射和前向散射轮廓(面积和宽度)来消除碎片和细胞双峰。通过排除4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)-阳性细胞(Molecular Probes)消除死细胞。对于PDX肿瘤细胞，它们的分选门(gate)为GFP阳性，然后为RFP阳性。RFP百分比是GFP阳性和RFP阳性的细胞的百分比。对于每个样本，我们获得的RFP分数为：肿瘤中的RFP％除以基线RFP％(参见“慢病毒感染”部分)。然后将每个样本的RFP分数归一化为shRNA对照样本的RFP分数，将其设置为100％，以获得“归一化％RFP”。
使用EpCAM、CD10和CD49f细胞表面标志物来进行分析和细胞分选的流式细胞术
如前所述进行用于分析和细胞分选的流式细胞术。使用的人类抗体包含：EpCAM–Alexa Fluor 488(克隆9C4,Biolegend)；1μg mL-1,CD49f–APC(克隆GoH3,Biolegend)；CD10PeCy7/Apc–Cy7(克隆H110a,Biolegend)；1μg mL-1and H-2Kd生物素/太平洋蓝(克隆SF1-1.1,Biolegend)；1μg mL-1。
RNAi缺失活力筛选
如前所述，将在NSG小鼠中生长的GFP阳性PDX-T1肿瘤解剖，加工成单细胞，并用EpCAM富集。此时的细胞分析表明，它们大约是98％-100％GFP阳性的。
为了进行体外RNAi缺失活力筛选，如前所述，在存在聚丙烯的情况下，以MOI为1，用DECIPHER 27K汇集的shRNA慢病毒文库-人类模块1(Cellecta)转导6000万个解离的PDX-T1细胞，然后旋转接种2小时。第二天，将一半的细胞旋转减慢并冷冻作为体外基线参考样本。在类器官集落形成条件下将少量细胞分别铺设，以确定72小时后的慢病毒感染百分比(发现细胞大约是80％RFP阳性的)。将其余的细胞铺设到用12mL基质胶制成的十二个150mm培养皿中，该基质胶以250,000个细胞/mL基质胶含有辐照的L1-Wnt3a饲养细胞。将细胞培育19天，每3-4天更换新鲜培养基。在最后一天，将所有培养基更换成分散酶，以便溶解基质胶并回收细胞。将来自所有板的细胞汇集、洗涤并冷冻作为体外类器官生长实验样本。
为了进行体内RNAi缺失活力筛选，如前所述，在存在聚丙烯的情况下，以MOI为1.25，用DECIPHER 27K汇集的shRNA慢病毒文库-人类模块1(Cellecta)转导3000万个解离的PDX-T1细胞，然后旋转接种2小时。第二天，将一半的细胞旋转减慢并冷冻作为体内基线参考样本。在类器官集落形成条件下将少量细胞分别铺设，以确定72小时后的慢病毒感染百分比(发现细胞大约为70％RFP阳性的)。将其余的细胞重悬于总体积为1.8mL的正常基质胶(BD Biosciences)和流式细胞术缓冲液的50％(v/v)混合物中。将这些细胞均匀地注射到17只NSG小鼠的左右乳腺脂肪垫中。当肿瘤直径达到大约10mm时，对小鼠实施安乐死并如前所述解剖肿瘤。然后将这些肿瘤加工成单细胞，汇集、洗涤和冷冻作为体内生长实验样本。
将两对样本(体外基线参考样本和体外类器官生长实验样本；以及体内基线参考样本和体内生长实验样本)提交给Cellecta,Inc.进行基因组DNA提取、条形码扩增、高通量测序和反卷积。每个样本进行了2,000万条条形码读取。
用于体内和体外RNAi缺失活力筛选的“命中”选择算法
请参见图5C中的示意图。我们应用了一种算法将我们的命中范围缩小到更易于管理的数量以进行验证。1)对于每个单独的shRNA，我们确定了“缺失率”，即生长实验样本中的shRNA条形码计数除以基准参考样本中的shRNA条形码计数。在每次筛选中，这些排名从最低到最高。2)我们检查了每个实验中最低缺失率的前5％，并确认了≥2个shRNA靶向的基因。3)我们将体内筛选中的shRNA基因靶(208个基因)与体外筛选中的shRNA基因靶(150个基因)进行交叉引用，以确认两个实验之间重叠的基因。这46个重叠的“命中”基因在图5A中示出。
PDX肿瘤的免疫荧光
将PDX肿瘤的切片在***中固定过夜，然后转移至70％乙醇中。然后将样本包埋在石蜡中并切片以进行组织学检查。将***固定的石蜡包埋的切片在二甲苯中脱脂，并在乙醇梯度中再水化。通过在微波中加热20分钟，在Tris-EDTA缓冲液中进行抗原修复。将一抗，即多克隆兔抗CDK19(Sigma)和多克隆鸡抗CDK8(Novus Biologicals)，在TBS+1％BSA中分别按1:50和1:100稀释，然后应用于样本过夜。过夜孵育后，将二抗，即Cy3驴抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch)和Alexa 488山羊抗鸡抗体(Life Technologies)在TBS+1％BSA中按1:500稀释，并在室温下与样本一起孵育。DAPI染色后，将切片用
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Gold抗褪色剂(Cell Signaling)封固。使用Zeiss LSM710共聚焦显微镜(Carl Zeiss)拍摄免疫荧光图像。用Fiji软件处理要发布的图像。
微阵列实验
用shCDK19-2、shCDK8-2或对照shRNA感染富集有EpCAM的PDX-T1细胞，并在类器官培养条件下培育72小时。随后用分散酶从基质胶中回收它们，将其重悬在流式细胞术缓冲液中，并通过流式细胞术进行分选，以获得GFP和RFP均为阳性的细胞。根据制造商的指示，通过RNeasy加微型试剂盒(Qiagen)从这些细胞中提取RNA，并在Agilent 2100生物分析仪上进行定量。每个样本使用50ng总RNA。体外转录、片段化、标记、与微阵列的杂交和扫描是由斯坦福蛋白质和核酸设施(PAN设施)进行的。将样本在PrimeView人基因表达阵列(Affymetrix)上杂交。使用转录组分析控制台(Affymetrix)进行基因水平差异表达分析。下调的基因定义为log2(样本/对照)<-1.5的基因，而上调的基因定义为log2(样本/对照)>1.5。
H3K27Ac染色质免疫沉淀
如在例如，Zarnegar等人,Nucleic Acids Research,gkx648,2017年7月中所述进行ChIP测定。每个ChIP使用大约250,000至500,000个MDA-MB231细胞。每个ChIP使用1μg抗H3K27ac(Active Motif#39133)。
文库构建
使用Qubit 3.0和dsDNA HS测定法定量富集ChIP的DNA。使用基于换位的NEXTERAXT，使用了1ng DNA进行文库构建(遵照制造商的将～14个PCR循环用于标引的方案)。将标引的样本汇集并提交以在NextSeq500上进行测序，以获得75bp单端读数，其中读取深度为～6000万个读数。
序列分析.
原始序列读数被上传到Galaxy(usegalaxy.org)，并使用Bowtie 2(-非常快速-本地)与人类基因组(hg19)进行比对。仅保留唯一映射的读数用于进一步分析。为了使数据可视化，将比对文件用于使用DeepTools[100bp仓，具有200bp读取扩展名和RPKM归一化)产生信号轨迹，并将BigWig文件装载到Broad的集成基因组浏览器(Integrated GenomeBrowser)中。针对每个复制品，使用MACS2调用峰(-无模型，p＝0.01，-broad，截断值0.1，副本＝自动，扩展200)。使用Bedtools生成仅包含所有复制品中出现的那些峰的共有峰列表。我们使用DiffBind对共有峰进行了差分峰分析。通过从UCSC获取人RefSeq表的最接近的非重叠特征，对DiffBind输出峰列表进行注释。使用DeepTools的computeMatrix(标度区：1000；50bp仓)和plotProfile生成了跨各个峰集的ChIP信号的聚合图数据。然后用GraphPad Prism软件绘制数据。
GSEA分析
使用javaGSEA桌面应用程序(GSEA3.0)进行基因集富集分析(GSEA)，其中CDK19敲低相比对照的log2倍变化值作为排名指标和标志，CDK19KD-EnhancerUp和CDK19KD-EnhancerDOWN作为进行富集测试的基因集。
Metascape分析
使用CDK19KD-EnhancerUP“核心”基因和CDK19KD-EnhancerDOWN“核心”基因(使用以下参数：智人作为输入种类，p-值截断值为0.01，以及最小富集度1.5)在线(www.metascape.org)进行标志性基因集的Metascape自定义富集分析。
统计分析
结果示出为平均值±s.d。用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc)进行统计计算。使用F检验分析方差。为了确定P值，对同方差群体进行t检验，并对具有不同方差的样本进行带有Welch校正的t检验。对于动物研究，没有预先确定样本量以确保有足够的能力检测预先指定的效应量，没有动物被排除在分析之外，实验没有随机分组，并且研究人员在实验过程中也没有盲目地进行组分配。
4.2实施例2-确认TNBC生长必需的基因
为了确认对于TNBC的生长必不可少的基因，使用靶向PDX-T1(TNBC PDX)中的5000个基因的27,500个shRNA文库进行了两个汇集的RNAi缺失活力筛选(图15)。筛选以两种不同的形式进行：体外作为类器官培养物，而在nod scid伽玛(NSG)小鼠体内作为PDX(图1A)。通过shRNA条形码的高通量测序确定每个实验样本和基线参考样本中单个shRNA的丰度。目的是确认基因，shRNA对这些基因的敲低抑制了在不同实验条件下的PDX肿瘤细胞生长。与其他肿瘤的筛选一致，与体外筛选(图5B)相比，体内筛选具有更显著的shRNA缺失率(图5A)。图5A和5B是示出体内生长实验样本(图5A)和体外生长实验样本(图5B)中shRNA计数相对于基线样本中shRNA计数的图。突出示出了靶向荧光素酶的对照shRNA(浅灰色点)和靶向CDK19的shRNA(深灰色点)。所有其他shRNA均示出为黑点(每个实验执行一次)。最终的候选物名单仅限于每个筛选中具有shRNA比率最低的5％的基因，这些基因被两个以上的shRNA靶向，并且在体外和体内均得到了确认(图5C)。这导致确认出46个候选基因(图5D)。
选择CDK19是因为来自癌症基因组图谱(TCGA)的数据示出，与来自其他乳腺癌亚型的样本相比，TNBC患者样本中CDK19拷贝数扩增和mRNA上调更为普遍(23％)(参见，例如Cancer Genome Atlas Research,N.等人The Cancer Genome Atlas Pan-Canceranalysis project.Nat Genet 45:1113-1120,2013；图6A)。另外，据报道，高CDK19表达与乳腺癌患者中不良的无复发生存相关(参见，例如Broude等人,Current cancer drugtargets 15,739-749,2015以及Porter等人,Proc Natl Acad Sci U S A 109:13799-13804,2012)。CDK19属于CDK家族的一个子集，据报道与细胞周期进程相比，它与RNA聚合酶II(RNAPII)转录的调节更相关联。CDK19及其旁系同源物CDK8均可以通过与其他三种蛋白质(MED12、MED13和Cyclin C)结合而形成CDK模块(CKM)。通过免疫荧光法证实了我们的PDX细胞中CDK19的存在和核定位(图6B))。在图6A和6B中，百分比示出在三阴性、HER2阳性、***受体阳性和所有乳腺癌中具有CDK19拷贝数扩增或CDK19 mRNA上调的样本的百分比。分数示出每组中阳性样本和总样本的数量。从cBioPortal获得数据(参见，例如Gao等人,Sci Signal 6,pl1,2013)。
4.3实施例3-CDK19敲低的生长抑制作用
为了验证CDK19敲低的生长抑制作用，使用了三种常用的TNBC细胞系：MDA-MB231、MDA-MB468和HS578T。使用独立地靶向CDK19的两个不同的shRNA[shCDK19-1(SEQ ID NO：1)和shCDK19-2(SEQ ID NO：2)]，确实了CDK19的敲低(图7A和7B)。对于图7A和7B两幅图，将CDK19敲低细胞中CDK19的相对表达归一化为用对照shRNA转导的细胞中CDK19的平均表达。将每种条件下的基因表达归一化为作为管家基因的β-肌动蛋白(**P<0.01；****P<0.0001，平均值±s.d.，(图7A和7B)n＝3(图7C)n＝2，实验进行两次)。CDK19的敲低还显示，它在所有三种TNBC细胞系中引起增殖减少(图1B至图1D)。图1B至图1D证实CDK19敲低显著降低了TNBC细胞的活力[MDA-MB231细胞的活力，****P<0.0001(图1B)，MDA-MB468细胞，***P<0.001；****P<0.0001(图1C)或HS578T细胞，*P<0.05；****P<0.0001(图1D)，用对照shRNA或靶向CDK19的shRNA(shCDK19-1、shCDK19-2)转导4天后评估]。将图1B至图1D中的所有值归一化为对照shRNA样本(平均值±s.d.，n＝3，实验进行了两次，P值通过不配对t检验确定)。
在最初的缺失筛选中使用的同一TNBC PDX(PDX-T1)中，CDK19敲低(图7C)也抑制了类器官集落的形成(图1E)。在图1E中，在用对照shRNA或靶向CDK19的shRNA(shCDK19-1、shCDK19-2)转导后2周对菌落计数，***P<0.001(未配对t检验)(平均值±s.d.，n＝6，实验进行了两次)。为了确定CDK19敲低在未转化的乳腺细胞中的作用，用靶向CDK19的shRNA感染人乳腺上皮细胞(HMEC)。在HMEC中，两个CDK19敲低均不影响细胞的活力(图1F)。在图1F中，在用对照shRNA或靶向CDK19的shRNA(shCDK19-1、shCDK19-2)转导后4天，评估HMEC细胞的活力。所有值均归一化为对照shRNA样本，ns为P>0.05(平均值±s.d.，n＝6，实验进行了两次，P值通过不成对的t检验确定)。总体而言，研究显示，在体外，CDK19敲低抑制多种TNBC细胞系的增殖和PDX类器官集落的形成，但不会对未转化的乳腺上皮细胞的生长产生不利影响。
通过敲低在NSG小鼠中生长的三种不同的TNBC PDX中的CDK19，我们将研究扩展到了更生理相关的体内***。PDX-T1、PDX-T2和PDX-T3这些PDX源自未接受过化学疗法的患者(图15)。在这些研究中，所有PDX肿瘤细胞都首先用绿色荧光蛋白(GFP)标记，随后感染CDK19 shRNA或对照shRNA的细胞再用红色荧光蛋白(RFP)标记。测量也是RFP阳性的GFP标记的肿瘤细胞的百分比，这使我们能够确定shRNA对PDX肿瘤细胞的作用。在对两个CDK19shRNA的每一个进行测试时，CDK19敲低导致来自所有三个TNBC PDX的肿瘤中RFP阳性细胞的百分比显著降低(图1G至图1I和图1M)。监测肿瘤生长并在肿瘤超过17mm时进行分析。PDX-T1，***P<0.001；****P<0.0001(图1G)，PDX-T2，****P<0.0001(图1H)，PDX-T3，**P<0.01(图1I)或PDX-T4，**P<0.01(图1J)中RFP阳性细胞的百分比通过流式细胞术测定，并归一化为对照shRNA样本的设置为100％的平均RFP百分比。每个数据点代表一只小鼠。对于图1H和1H，平均值±s.d.，n＝9，实验进行了3次。对于图1I和1J，平均值±s.d.，n＝3，实验进行了一次。总体而言，P值由未配对的t检验确定。
图1M示出了用对照shRNA(上排)、shCDK19-1(中排)或shCDK19-2(下排)转导的PDX-T1肿瘤的代表性图像。明场图像(左列)示出了总体肿瘤形态，FITC图像(中列)确认用GFP标记的肿瘤细胞，以及德克萨斯红图像(右列)确认用RFP标记的shRNA转导的细胞。
这些结果确实了CDK19对于体内肿瘤生长至关重要。CDK19基因敲低防止了转导的(RFP阳性)TNBC细胞转移到小鼠的肺中。示出了具有来自携带PDX-T1(图1K)或PDX-T4(图1L)肿瘤异种移植物的小鼠的RFP阳性肺转移的小鼠的百分比。具有RFP阳性肺转移的小鼠数量和每个治疗组的小鼠总数被示出为每种情况的分数。用对照shRNA或靶向CDK19的shRNA(shCDK19-1、shCDK19-2)转导PDX肿瘤细胞(对于图1K，n＝9，实验进行了3次；对于图1I，n＝3，实验进行了一次)。此外，在通常转移至肺的PDX-T1中，CDK19敲低消除了那些细胞的任何肺转移的检测(图1K和图1N)。在图1N中，明场图像(左列)示出总体肺部形态，FITC图像(中列)确认用GFP标记的转移性肿瘤细胞，以及德克萨斯红图像(右列)确认用RFS标记的shRNA转导的转移性细胞。我们还测试了CDK19敲低对PDX-T4的作用，PDX-T4是从患有化疗耐药性的炎症性乳腺癌患者的脑转移中获得的侵袭性PDX。由于已知炎症性乳腺癌是侵袭性的，难以治疗的并且与极差的预后相关联，所以值得注意的是，CDK19敲低抑制了这些小鼠中PDX的生长(图1J)和肺转移(图1L和图7D)。这些数据显示，在体内，CDK19敲低不仅影响了原发性肿瘤的生长，而且还抑制了肿瘤的转移。
4.4实施例4-TNBC PDX内的肿瘤起始细胞(TIC)的确认
鉴于在通常用于评估致瘤性的两种独立测定中CDK19敲低抑制了生长(体内PDX生长和体外类器官集落形成)，并且对于癌症起始至关重要的基因在癌症子集中经常被扩增或过表达，推测肿瘤起始细胞(TIC)可能对CDK19抑制敏感。因此，我们试图确认TNBC PDX中的TIC。以前，EpCAM和CD49f用于分离正常乳腺组织和乳腺癌中的细胞亚群。然而，在许多TNBC PDX中，EpCAM和CD49f通常不能清楚地将细胞分为不同的亚群(图2A，左)。因此，我们将基础细胞标志物CD10与EpCAM一起用于FACS分选乳腺癌PDX。我们发现CD10和EpCAM可以将PDX细胞分为三个不同的亚群，EpCAMmed/High/CD10-/low、EPCAMlow/med/CD10low/+和EpCAM-/CD10-(图2A，右)。在图2A中，使用EpCAM和CD49f看到的大的不可分割的细胞群(左)变成使用EpCAM和CD10的三个不同的亚群(右)：EpCAMmed/high/CD10-/low[分选门(1)]，EPCAMlow/med/CD10low/+[分选门(2)]和EpCAM-/CD10-[分选门(3)]。还示出了使用EpCAM和CD49f的这三个亚群的重叠(图8A)。
为了测试三个EpCAM/CD10分离的亚群的肿瘤起始能力，我们在体外进行了类器官集落形成测定，并在体内进行了移植极限稀释测定(LDA)。在类器官集落形成测定中，与EpCAMlow/medCD10low/+细胞相比，EpCAMmed/high/CD10-/low细胞形成的类器官集落明显更多(图2B)。在图2B中，与EPCAMlow/med/CD10low/+细胞相比，EpCAMmed/high/CD10-/low细胞形成的类器官集落明显更多，*P<0.05(未配对t检验)(平均值±s.d.，n＝3，实验进行了两次)。在NSG小鼠中进行的移植测定中，注射来自所有六个PDX的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞始终形成肿瘤(图2C)，有时仅移植100个细胞(PDX-T1和PDX-T2)。相反，EPCAMlow/med/CD10low/+细胞的移植仅在两个PDX(PDX-T1和PDX-T2)中形成肿瘤，并且仅在移植高细胞数(即2500个细胞)时形成肿瘤(图2C)。此外，从任何PDX移植EpCAM-/CD10-细胞均未形成肿瘤。因此，我们检查的所有PDX乳腺肿瘤的EpCAMmed/high/CD10-/low亚群中都富集有TIC。
已经确认了这些不同的亚群，我们接下来研究了与致瘤性较低的EPCAMlow/med/CD10low/+细胞相比，CDK19表达是否富集在致瘤性较高的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞中。在检查的四个PDX中的三个中，与致瘤性较低的EPCAMlow/med/CD10low/+细胞相比，致瘤性较高的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞中的CDK19表达较高(图2D至图2G)。为了生成图2D至图2G中的数据，通过RT-qPCR确定在EPCAMlow/med/CD10low/+和EpCAMmed/high/CD10-/low细胞中的CDK19相对表达。每种情况下的基因表达均归一化为作为管家基因的β-肌动蛋白。将CDK19的相对表达归一化为EPCAMlow/med/CD10low/+细胞中CDK19的平均表达。*P<0.05(未配对t检验)(PDX-T1：平均值+s.d.，n＝2；PDX-T2：平均值+s.d.，n＝6(EpCAMlow/med/CD10low/+)和n＝3(EpCAMmed /high/CD10-/low)；PDX-T3：平均值+s.d.，n＝6(EpCAMlow/med/CD10low/+)和n＝3(EpCAMmed/high/CD10-/low)；PDX-T8：平均值+s.d.，n＝3。所有实验至少进行两次)。因此，尽管在我们检查的所有PDX肿瘤中都有CDK19表达，但在我们研究的四个肿瘤中的三个中，在更具致瘤性的EpCAMmed/high/CD10-/low亚群中其表达水平更高。
为了确定CDK19敲低情况下的肿瘤起始频率，我们使用用多西环素诱导的CDK19敲低构建体转导的PDX-T1细胞进行LDA，以产生inducCDK19KD-PDX-T1细胞，我们可以控制该细胞中的CDK19表达(图8B)。在图8B中，将多西环素处理的inducCDK19KD-PDX-T1细胞中CDK19的相对表达归一化为对照inducCDK19KD-PDX-T1细胞中CDK19的平均表达。将每种条件下的基因表达均归一化为作为管家基因β-肌动蛋白(*P<0.05，平均值±s.d.，n＝2，实验进行了两次)。通过比较在存在多西环素(+Dox)的情况下inducCDK19KD-PDX-T1细胞与不具有多西环素(无Dox)的inducCDK19KD-PDX-T1细胞的体内移植，我们发现CDK19敲低消除所检查的所有细胞移植条件下的肿瘤形成(图8C)。将inducCDK19KD-PDX-T1细胞分别以50、250和1250细胞的浓度注入NSG小鼠的乳腺脂肪垫中。给多西环素组的小鼠喂食含有多西环素的啮齿动物饲料以诱导CDK19 shRNA，而给对照组的小鼠喂食正常的啮齿动物饮食。通过触诊肿瘤来检测肿瘤。针对每个群体指示形成的肿瘤数量和进行的注射数量。在图8C中，形成肿瘤的群体和注射用粗体表示(每组n＝5)。使用ELDA，我们发现肿瘤起始频率从对照(无Dox)组的342个细胞中有1个(95％CI：828中有1个到142个中有1个)降低到CDK19敲低(+Dox)组中∞细胞中有1个(95％CI：∞个中有1个到2587中有1个)(图8D)。由CDK19敲低引起的肿瘤起始频率的显著下降和TIC亚群中CDK19的较高表达均表明TIC抑制很可能是用CDK19敲低观察到的肿瘤生长受损的原因。
4.5实施例5-通过CDK19调节的基因和途径的确认
CDK19与其充分描述的旁系同源物CDK8之间具有84％的氨基酸序列同源性(图9)。已显示CDK8在多种恶性肿瘤中起作用，包含结肠癌、急性髓细胞性白血病和黑色素瘤。CDK8的较高表达与结肠癌的较差预后相关联(Firestein等人,Nature 455:547-551,2008)。由于CDK8在多能干细胞表型中有重要作用，在胚胎干细胞中的CDK8敲低显示出可阻止胚胎发育(Porter等人,Proc Natl Acad Sci USA,109:13799-13804,2012)。CDK8的与癌症相关的已知活性可以包含Wnt/β-连环素途径、生长因子诱导的转录和TGFP信号转导的正调节。根据上下文，CDK8还显示出负调节或正调节转录。然而，最近的证据已经表明CDK19的功能可能不同于CDK8。体外研究显示，CDK19和CDK8彼此相互排斥地参与与其他CKM组分的结合，而在***和结肠癌细胞系中的基因敲低研究显示，CDK19和CDK8调节不同的基因。我们的目标是在TNBC中通过检查由CDK19或CDK8的靶向敲低导致的整体基因表达变化而研究CDK19和CDK8是否具有独特的生物学功能。
为了了解TNBC中CDK19的分子靶是否不同于CDK8，我们敲低了MDA-MB231中的每个基因，并检查了相对于对照的各个基因表达变化。总体而言，CDK19敲低影响了3909个基因，而CDK8敲低影响了4233个基因(图3A)。然而，在CDK19敲低实验中，只有12％的上调基因和5％的下调基因也受CDK8敲低的影响。这表明CDK19和CDK8主要调节不同的基因(图3A)。
CDK19和CDK8敲低基因的基因集富集分析(GSEA)使我们能够在最上调或下调的基因中确认富集的标志性基因集(图3B和图10)。在图10中，以黑色示出在CDK19或CDK8的敲低中独特富集的标志性基因集，通过“*”标记在CDK19和CDK8的敲低中均富集的标志性基因集，并且通过“**”标记在CDK19和CDK8的敲低之间以相反方向表达的标志性基因集。通过GSEA软件确定归一化的富集得分和FDR q值。<0.25的FDR截断值用于选择重要的标志。这些标志性基因集由特定参与某些生物学状态或途径的基因组成。与已知的与乳腺癌相关的标志[例如有丝***(E2F靶、G2M检查点、有丝***纺锤体)、PI3K-AKT-MTOR信号转导、MYC途径(Myc靶v1)、糖酵解、细胞凋亡和氧化磷酸化]相关联的基因均通过CDK19和CDK8敲低发生了相同方向的改变(图3B，中间重叠区域)，从而证实了CDK19和CDK8之间的共调节关系。此外，与CDK8敲低相比，与早期***响应、上皮间质转化(EMT)、胆固醇稳态、MYC途径(Myc靶v2)、干扰素α响应和脂肪酸代谢相关联的基因响应于CDK19敲低而在相反的方向发生了变化(图3B，方框)，这表明在CDK19和CDK8之间存在反调节关系。与CDK8敲低相比，通过CDK19敲低在相反方向上的基因表达富集的标志性基因集被框出。许多标志性基因集仅富集在因CDK19敲低而唯一改变的基因中(图3B，左侧区域)。这些基因集反映的标志包含P53信号转导、KRAS信号转导、雄激素响应、NOTCH信号转导、TGF BETA信号转导和IL6-JAK-STAT3信号转导，这可能是TNBC靶向疗法的潜在生物学途径。所有这些生物学途径均代表TNBC靶向疗法评估中临床研究的活跃领域。与我们的发现一致，在我们的CDK19敲低实验中发现富集的许多途径，例如胆固醇稳态、P53信号转导、有丝***和NFκB途径，之前在其他细胞类型中已显示也通过CDK19调节。
总之，这些分析显示CDK19和CDK8具有共同调节某些途径而反调节其他途径的潜力。此外，CDK19与CDK8一样，能够正调节或负调节生物途径。通过CDK19调节的许多临床相关TNBC途径表明，靶向CDK19可以提供同时调节多个途径，同时避免由于CDK19有利的局限性组织分布而引起的潜在毒性的机会。这种方式可以克服TNBC中常见的对单一药剂疗法的耐药性，还可以潜在地实现“无药”过程的靶向(targeting of‘undruggable’processes)，例如涉及P53或MYC的过程。
4.6实施例6-CDK19和CDK8对表观遗传修饰的影响
最近的研究强调了CDK19和CDK8以及其他转录CDK(CDK7、CDK12/CDK13)通过作用于通过组蛋白3赖氨酸27乙酰化(H3K27Ac)标记的大的增强子簇(也称为“超级增强子”)在调节关键致癌基因的转录中的作用。该基因调节的确切机制尚不清楚，但据信一部分是通过CKM与介体的相互作用来调节RNAPII-介体的相互作用，一部分是通过使RNAPII的C末端结构域中的丝氨酸残基磷酸化而发生的。鉴于转录的CDK在增强子处起作用的特性，我们想研究CDK19和CDK8是否也可以调节增强子位点处的表观遗传修饰，作为控制基因表达的机制。尽管已经确认了通过其他信号传导途径进行的增强子修饰，但尚未报道CDK的这种基因控制机制。
为了探索CDK19在表观遗传调节中的作用，在三种不同条件下对MDA-MB231细胞进行了针对H3K27Ac修饰的染色质免疫沉淀和测序(CHIP-Seq)：对照(空载体转导)、CDK19敲低和CDK8敲低。对所有H3K27Ac修饰区域的全基因组分析显示，与对照相比，CDK19敲低和CDK8敲低均具有相似的总体H3K27Ac水平(图11)。在图11中，将所有已确认的H3K27Ac峰区域中的H3K27Ac CHIP-Seq信号归一化为1-Kb，并以这些区域的中间为中心。还示出了侧翼2-Kb区域的信号。为了比较相对信号变化，通过将每个区域中心周围每个50个碱基的窗口1-Kb的信号相加，确定每个生物复制品的总信号。通过不成对的t检验确定每个样本的总CHIP-Seq信号之间的P值。通过对照与CDK19敲低的H3K27Ac水平的比较分析，我们确认了H34K27Ac信号增加(All-H3K27UP)的3034个峰区域和H3K27Ac信号减少(All-H3K27DOWN)的502个峰区域。通过排除CDK8敲低也不同于对照的的峰区域，我们确认了H3K27Ac信号增加(CDK19KD-H3K27UP)的2309个峰区域和H3K27Ac信号减少(CDK19KD-H3K27DOWN)的432个区域，这些区域是CDK19敲低所特有的。通过比较CDK19敲低、CDK8敲低和对照中这些区域的H3K27Ac水平，研究了这些区域对CDK19的特异性。与对照相比，整个CDK19KD-H3K27UP区域中H3K27Ac水平的富集(图3C)和整个CDK19KD-H3K27DOWN区域中H3K27Ac水平的耗竭(图3D)仅对于CDK19敲低来说显著，而对于CDK8敲低来说不显著。在图3C和3D中，***P<0.001；ns为P>0.05(所有样本n＝3，实验进行了3次)。CDK19KD-H3K27AcUP或CDK19KD-H3K27AcDOWN区域的H3K27Ac CHIP-Seq信号被归一化为1-Kb，并以这些区域的中间为中心。还示出了侧翼2-Kb区域的信号。为了比较相对信号变化，通过将每个区域中心周围每个50个碱基的窗口1-Kb的信号相加，确定每个生物复制品的总信号。通过不成对的t检验确定每个样本的总CHIP-Seq信号之间的P值。因此，CDK19KD-H3K27UP和CDK19KD-H3K27DOWN定义了峰值区域，在这些峰值区域中，与CDK8的敲低相比，H3K27Ac信号对CDK19的敲低更特异并且最敏感。
我们接下来评估了由于CDK19敲低导致的H3K27Ac水平的升高或降低是否与基因输出的变化相对应。为此，通过与最近的基因邻近来注释先前定义的All-H3K27UP和All-H3K27DOWN峰区域，以建立两个基因集：CDK19KD-EnhancerUP(1593个基因)和CDK19KD-EnhancerDOWN(341个基因)，以进行进一步分析(表1和表2)。这些具有我们的CDK19敲低基因表达数据的基因集的GSEA表明，对于CDK19KD-EnhancerUP基因来说，富集有通过CDK19敲低最多上调的基因(NES 1.68，FDR q值＝0.000)(图3E)，而对于CDK19KD-EnhancerDOWN基因来说，富集有通过CDK19敲低最多下调的基因(NES-1.84，FDR q值＝0.000)(图3F)。因此，由于CDK19敲低，基因的推定增强子元件处的对H3K27Ac信号的扰动与基因表达的变化在预期方向上很好地相关。
表1
Figure BDA0002416175450000641
Figure BDA0002416175450000651
表2
Figure BDA0002416175450000661
Figure BDA0002416175450000671
Figure BDA0002416175450000681
Figure BDA0002416175450000691
Figure BDA0002416175450000701
Figure BDA0002416175450000711
前述的GSEA还使我们能够确认对每种富集贡献最大的前沿“核心”基因(图12A和12B)。在这些“核心”基因处，由于CDK19敲低而导致的H3K27Ac增强子信号的差异(图13A至图13D)导致基因表达发生较大的相应变化(图13E)。ELF3(图13A)和ETV7(图13B)位点的基因轨迹示出CDK19敲低样本中H3K27Ac信号的富集，而CHI3L2(图13C)和CRTAM(图13D)位点的基因轨迹示出对照样本中H3K27Ac信号的富集。上轨迹表示对照样本，而下轨迹表示CDK19敲低样本。灰色条表示通过DiffBind确认的对照和CDK19敲低样本之间不同的区域(FDR<0.05)。然后，使用Metascape分析来评估在CDK19KD-EnhancerUP“核心”和CDK19KD-EnhancerDOWN“核心”基因中富集的标志性基因集。在CDK19KD-EnhancerUP“核心”基因中，早期***响应(p值＝8.72e-5)和上皮间质转化(p值＝1.08e-3)是被确认为富集的标志(图3G，深灰色条)。类似地，在CDK19KD-EnhancerDOWN“核心”基因中，雄激素响应(p值＝1.89e-3)是被发现富集的标志(图3G，浅灰色条)。因此，早期***响应、上皮到间充质转化和雄激素响应基因集内的基因的子集(图3G)具有H3K27Ac增强子信号的变化和强烈对应的基因表达变化。这些基因仅占每个标志性基因集中总基因的一小部分(5-10％)，但属于其中CDK19可以表观遗传地调节基因转录的这些生物学过程内的关键基因。
4.7实施例7-CDK19敲低对预先建立的类器官的生长的影响
我们探索了CDK19敲低对体外预先建立的类器官的生长以及体内预先建立的PDX肿瘤的生长的影响。目的是为患者原有肿瘤的治疗建立模型。在体外，与对照(无多西环素)相比，向治疗组中添加多西环素(以诱导CDK19 shRNA)显著减少了预先建立的类器官的数量(图4A和4B)。在图4A和4B中，示出了在开始多西环素治疗后第0天(图4A)和第16天(图4B)的类器官集落的数量，****P＜0.0001；ns为P>0.05(平均值±s.d.，n＝6，实验进行了两次，P值通过不成对的t检验确定)。在体内，向具有预先建立的inducCDK19KD-PDX-T1或inducCDK19KD-PDX-T3(用多西环素诱导的CDK19敲低构建体转导的PDX-T3细胞)肿瘤的小鼠饲喂多西环素显著影响了这些肿瘤的生长(图4C和4D)。在图4C和4D中，示出对于inducCDK19KD-PDX-T1，****P<0.0001；***P＜0.001(平均值±s.d.，n＝5，实验进行两次，P值通过未配对t检验确定)(图4C)和inducCDK19KD-PDX-T3，****P＜0.0001；***P＜0.001(平均值±s.d.，n＝5，实验进行一次，通过不成对的t检验确定P值)(图4D)的多西环素喂养的NSG小鼠和对照NSG小鼠中预先建立的肿瘤的生长。与对照肿瘤相比，在inducCDK19KD-PDX-T1肿瘤中，CDK19 shRNA诱导的肿瘤最终小82％，在inducCDK19KD-PDX-T3肿瘤中，小38％(图4C和4D)。在inducCDK19KD-PDX-T1和inducCDK19KD-PDX-T3实验中，治疗组和对照组之间的小鼠总体重均没有显著差异(图14A和14B)。最后，存活研究表明，与用对照shRNA转导的小鼠相比，用CDK19 shRNA转导PDX-T1肿瘤的小鼠的总存活时间显著更长(图4E)。图4E示出了移植有用对照shRNA(黑线)、shCDK19-1(灰色实线)或shCDK19-2(灰色虚线)转导的PDX-T1异种移植物的小鼠的Kaplan-Meir存活曲线。随访小鼠，每周进行肿瘤直径的测量。当小鼠肿瘤的最长直径超过17mm时，处死小鼠。shCDK19-2组中的两只小鼠没有患得PDX肿瘤，在实验结束时被处死。当构建shCDK19-2组的生存曲线时，对这些小鼠进行检验，***P<0.001[n＝9，实验进行了3次，对数秩(Mantel-Cox)测试用于确定P值]。总而言之，这些实验显示，即使在预先建立的肿瘤中，特异性地敲低CDK19也可以显著减慢肿瘤生长，而CDK19敲低可以延长小鼠的生存期。
4.8实施例8-CCT251921对预先建立的PDX肿瘤的影响
为了在临床上模拟CDK19靶向疗法的用途，我们用CCT251921(图4F)治疗了具有预先建立的PDX肿瘤的小鼠，该CCT251921是CDK19和紧密相关的旁系同源物CDK8的口服生物可利用抑制剂。在开始每天口服CCT251921或溶媒(30mg/kg)之前，在小鼠中预先建立了PDX-T1肿瘤。用CCT251921治疗导致到第14天肿瘤生长显著减少(图4G)。在用CCT251921治疗的小鼠中，肿瘤的最终体积比用溶媒治疗的小鼠的肿瘤小30％以上(图4G)。将具有预先建立的PDX-T1异种移植肿瘤的NSG小鼠每天经口强饲CCT251921或溶媒进行治疗。随访小鼠，每周两次进行肿瘤体积测定，****P<0.0001；***P<0.001(平均值±s.d.，n＝5，实验进行一次，P值通过不成对的t检验确定)。CCT251921和溶媒队列中的小鼠都经受了总体体重减轻，但这在两组之间没有显著差异，并且很可能是由于每天经口强饲法对其进食习惯的影响(图14C)。众所周知，基因敲低与化学抑制相比可以产生不同的生物学结果。我们这里在预先建立的肿瘤中示出，对CDK19激酶活性的化学抑制可以概括在我们的基因敲低研究中示出的CDK19总体缺失的影响。
从数据中，我们得出结论，CDK19调节多种癌症相关途径，并且它是TIC的潜在治疗靶。因此，CDK19抑制对于靶向转录辅助因子(例如CDK8、CDK9和BRD4)的治疗策略以及靶向TIC及其自我更新途径(例如Hedgehog、Wnt/β-连环素和Notch)的治疗策略都是有用的。然而，某些治疗方式可能受到对正常细胞产生的毒性的限制。这可以归因于正常组织中转录辅因子的普遍表达以及正常干细胞中自我更新途径的重要性。例如，BRD4抑制导致了对小鼠多个器官中的组织稳态的破坏。类似地，由于狭窄的治疗指数的挑战，迄今为止，Hedgehog、Notch和Wnt途径抑制剂在临床上的成功有限。CDK19的生物学指向作为治疗靶的潜在优势。与其他普遍存在的转录辅助因子(如其旁系同源物CDK8、CDK9和BRD4)相比，CDK19的组织分布更为有限(参见，例如Tsutsui等人,Genes to cells:devoted tomolecular&cellular mechanisms 16:1208-1218,2011)，从而潜在地限制了CDK19抑制的毒性，而CDK8、CDK9和BRD4敲除具有致命性(参见，例如Brown等人,Mamm Genome 23:632-640,2012；Westerling,Molecular and Cellular Biology 27:6177-6182,2007；以及Houzelstein等人,Molecular and Cellular Biology 22,3794-3802,2002)。此外，CDK19在组织中的有限表达可以扩大治疗窗口，从而实现对干细胞途径(如NOTCH)或关键过程(如G2/M检查点)的其他毒性抑制。我们的研究显示，CDK19的小分子抑制妨害PDX生长,肯定了在TNBC中治疗靶向CDK19的潜力。
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尽管出于清楚和理解的目的已经详细描述了前述发明，但是相关领域的技术人员将理解，一旦使他们熟悉本公开，就可以在不脱离所附权利要求书中的本发明的真实范围的情况下在形式和细节上进行各种改变。因此，本发明不限于以上阐述的方法或构造的确切组成或细节。除了在过程本身中必要或固有的程度之外，没有意图或隐含本公开内容中所描述的方法或过程(包括附图)的步骤或阶段的特定顺序。在许多情况下，可以在不改变所述方法的目的、效果或重要性的情况下更改过程步骤的顺序。
本文引用的所有出版物和专利文件都通过引用并入本文，就好像每个这样的出版物或文件都被具体地和单独地指出通过引用并入本文。对出版物和专利文件(专利、已公开的专利申请和未公开的专利申请)的引用并不意味着承认任何这种文件都是相关的现有技术，也不构成对其内容或日期的承认。
CDK19转录变体1(NM_015076.4)(SEQ ID NO:12)
Figure BDA0002416175450000781
Figure BDA0002416175450000791
Figure BDA0002416175450000801
Figure BDA0002416175450000811
CDK19转录变体2(NM_001300960.1)(SEQ ID NO:13)
Figure BDA0002416175450000812
Figure BDA0002416175450000821
Figure BDA0002416175450000831
CDK19转录变体3(NM_001300963.1)(SEQ ID NO:14)
Figure BDA0002416175450000832
Figure BDA0002416175450000841
Figure BDA0002416175450000851
Figure BDA0002416175450000861
CDK19转录变体4(NM_001300964.1)(SEQ ID NO:15)
Figure BDA0002416175450000862
Figure BDA0002416175450000871
Figure BDA0002416175450000881
周期素依赖性激酶8(CDK8),转录变体1(NM_001260.2)
(SEQ ID NO:16)
Figure BDA0002416175450000891
周期素依赖性激酶8(CDK8),转录变体2(NM_001318368.1)
(SEQ ID NO:17)
Figure BDA0002416175450000901
周期素依赖性激酶8(CDK8),转录变体3(NM_001346501.1)
(SEQ ID NO:18)
Figure BDA0002416175450000911
序列表
<110> 陈扎克伯格生物中心公司
斯坦福大学托管董事会
<120> 用于治疗三阴性乳腺癌的方法
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tgtggccgcc gaggagtccc ttgctgaagg cggaccgcgg agcggcgggc ggcgggcggc 60
gcgcgcgcgc gcgcgagagg cggctgttgg agaagtggag cggcggtcgc ggggggagga 120
ggaggaggga ctgagcggcg gcggcccccg cgtcccgtgc ctctatgggg gaagcagaca 180
atggattatg atttcaaggc gaagctggcg gcggagcggg agcgggtgga ggatttgttt 240
gagtacgaag ggtgcaaagt gggacgcggc acctacggtc acgtctacaa ggcgaggcgg 300
aaagatggaa aagatgaaaa ggaatatgca ttgaagcaaa ttgaaggcac aggaatatcc 360
atgtcggctt gtagagagat tgcacttttg cgagaattga agcaccctaa tgtgattgca 420
ttgcagaagg tgttcctttc tcacagtgac aggaaggtat ggctgctgtt tgattatgca 480
gagcatgact tgtggcatat tattaagttt caccgtgcat caaaagcaaa taaaaagccc 540
atgcagttgc caagatctat ggttaaatcc ttactttacc agattcttga tggtatccat 600
tacctccatg caaattgggt gcttcacaga gacttgaaac cagcaaatat cctagtaatg 660
ggagaaggtc ctgagagggg gagagtcaaa atagctgaca tgggttttgc cagattattc 720
aattctcctc taaagccact agcagatttg gatccagtag ttgtgacatt ttggtatcgg 780
gctccagaac ttttgcttgg tgcaaggcat tatacaaagg ccattgatat atgggcaata 840
ggttgtatat ttgctgaatt gttgacttcg gaacctattt ttcactgtcg tcaggaagat 900
ataaaaacaa gcaatccctt tcatcatgat caactggatc ggatatttag tgtcatgggg 960
tttcctgcag ataaagactg ggaagatatt agaaagatgc cagaatatcc cacacttcaa 1020
aaagacttta gaagaacaac gtatgccaac agtagcctca taaagtacat ggagaaacac 1080
aaggtcaagc ctgacagcaa agtgttcctc ttgcttcaga aactcctgac catggatcca 1140
accaagagaa ttacctcgga gcaagctctg caggatccct attttcagga ggaccctttg 1200
ccaacattag atgtatttgc cggctgccag attccatacc ccaaacgaga attccttaat 1260
gaagatgatc ctgaagaaaa aggtgacaag aatcagcaac agcagcagaa ccagcatcag 1320
cagcccacag cccctccaca gcaggcagca gcccctccac aggcgccccc accacagcag 1380
aacagcaccc agaccaacgg gaccgcaggt ggggctgggg ccggggtcgg gggcaccgga 1440
gcagggttgc agcacagcca ggactccagc ctgaaccagg tgcctccaaa caagaagcca 1500
cggctagggc cttcaggcgc aaactcaggt ggacctgtga tgccctcgga ttatcagcac 1560
tccagttctc gcctgaatta ccaaagcagc gttcagggat cctctcagtc ccagagcaca 1620
cttggctact cttcctcgtc tcagcagagc tcacagtacc acccatctca ccaggcccac 1680
cggtactgac cagctcccgt tgggccaggc cagcccagcc cagagcacag gctccagcaa 1740
tatgtctgca ttgaaaagaa ccaaaaaaat gcaaactatg atgccattta aaactcatac 1800
acatgggagg aaaaccttat atactgagca ttgtgcagga ctgatagctc ttctttattg 1860
acttaaagaa gattcttgtg aagtttcccc agcacccctt ccctgcatgt gttccattgt 1920
gacttctctg ataaagcgtc tgatctaatc ccagcacttc tgtaaccttc agcatttctt 1980
tgaaggattt cctggtgcac ctttctcatg ctgtagcaat cactatggtt tatcttttca 2040
aagctctttt aataggattt taatgtttta gaaacaggat tccagtggtg tatagtttta 2100
tacttcatga actgatttag caacacaggt aaaaatgcac cttttaaagc actacgtttt 2160
cacagacaat aactgttctg ctcatggaag tcttaaacag aaactgttac tgtcccaaag 2220
tactttacta ttacgttcgt atttatctag tttcagggaa ggtctaataa aaagacaagc 2280
ggtgggacag agggaaccta caaccaaaaa ctgcctagat ctttgcagtt atgtgcttta 2340
tgccacgaag aactgaagta tgtggtaatt tttatagaat cattcatatg gaactgagtt 2400
cccagcatca tcttattctg aatagcattc agtaattaag aattacaatt ttaaccttca 2460
tgtagctaag tctaccttaa aaagggtttc aagagctttg tacagtctcg atggcccaca 2520
ccaaaacgct gaagagagta acaactgcac taggatttct gtaaggagta attttgatca 2580
aaagacgtgt tacttccctt tgaaggaaaa gtttttagtg tgtattgtac ataaagtcgg 2640
cttctctaaa gaaccattgg tttcttcaca tctgggtctg cgtgagtaac tttcttgcat 2700
aatcaaggtt actcaagtag aagcctgaaa attaatctgc ttttaaaata aagagcagtg 2760
ttctccattc gtatttgtat tagatataga gtgactattt ttaaagcatg ttaaaaattt 2820
aggttttatt catgtttaaa gtatgtatta tgtatgcata attttgctgt tgttactgaa 2880
acttaattct atcaagaatc tttttcattg cactgaatga tttcttttgc ccctaggaga 2940
aaacttaata attgtgccta aaaactatgg gcggatagta taagactata ctagacaaag 3000
tgaatatttg catttccatt atctatgaat tagtggctga gttctttctt agctgcttta 3060
aggagcccct cactccccag agtcaaaagg aaatgtaaaa acttagagct cccattgtaa 3120
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aatgttttct tgagctagaa gaaatagctg attattgtat atgcaaatta catgcatttt 3240
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gtaataattt tggatcattt tctttccttt aaaggggaac aaagcctttt ttttttttga 4440
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<210> 13
<211> 6114
<212> DNA
<213> 智人()
<400> 13
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gcgcgcgcgc gcgcgagagg cggctgttgg agaagtggag cggcggtcgc ggggggagga 120
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gagtacgaag ggtgcaaagt gggacgcggc acctacggtc acgtctacaa ggcgaggcgg 300
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gagcatgact tgtggcatat tattaagttt caccgtgcat caaaagcaaa taaaaagccc 540
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gataaagcgt ctgatctaat cccagcactt ctgtaacctt cagcatttct ttgaaggatt 300
tcctggtgca cctttctcat gctgtagcaa tcactatggt ttatcttttc aaagctcttt 360
taataggatt ttaatgtttt agaaacagga ttccagtggt gtatagtttt atacttcatg 420
aactgattta gcaacacagg taaaaatgca ccttttaaag cactacgttt tcacagacaa 480
taactgttct gctcatggaa gtcttaaaca gaaactgtta ctgtcccaaa gtactttact 540
attacgttcg tatttatcta gtttcaggga aggtctaata aaaagacaag cggtgggaca 600
gagggaacct acaaccaaaa actgcctaga tctttgcagt tatgtgcttt atgccacgaa 660
gaactgaagt atgtggtaat ttttatagaa tcattcatat ggaactgagt tcccagcatc 720
atcttattct gaatagcatt cagtaattaa gaattacaat tttaaccttc atgtagctaa 780
gtctacctta aaaagggttt caagagcttt gtacagtctc gatggcccac accaaaacgc 840
tgaagagagt aacaactgca ctaggatttc tgtaaggagt aattttgatc aaaagacgtg 900
ttacttccct ttgaaggaaa agtttttagt gtgtattgta cataaagtcg gcttctctaa 960
agaaccattg gtttcttcac atctgggtct gcgtgagtaa ctttcttgca taatcaaggt 1020
tactcaagta gaagcctgaa aattaatctg cttttaaaat aaagagcagt gttctccatt 1080
cgtatttgta ttagatatag agtgactatt tttaaagcat gttaaaaatt taggttttat 1140
tcatgtttaa agtatgtatt atgtatgcat aattttgctg ttgttactga aacttaattc 1200
tatcaagaat ctttttcatt gcactgaatg atttcttttg cccctaggag aaaacttaat 1260
aattgtgcct aaaaactatg ggcggatagt ataagactat actagacaaa gtgaatattt 1320
gcatttccat tatctatgaa ttagtggctg agttctttct tagctgcttt aaggagcccc 1380
tcactcccca gagtcaaaag gaaatgtaaa aacttagagc tcccattgta atgtaagggg 1440
caagaaattt gtgttcttct gaatgctact agcagcacca gccttgtttt aaatgttttc 1500
ttgagctaga agaaatagct gattattgta tatgcaaatt acatgcattt ttaaaaacta 1560
ttctttctga acttatctac ctggttatga tactgtgggt ccatacacaa gtaaaataag 1620
attagacaga agccagtata cattttgcac tattgatgtg atactgtagc cagccaggac 1680
cttactgatc tcagcataat aatgctcact aataatgaag tctgcatagt gacactcatc 1740
aagactgaag atgaagcagg ttacgtgctc cattggaagg agtttctgat agtctcctgc 1800
tgttttaccc cttccatttt ttaaaataag aaattagcag ccctctgcat aatgtagctg 1860
cctatatgca gttttatcct gtgccctaaa gcctcactgt ccagagctgt tggtcatcag 1920
atgcttattg caccctcacc atgtgcctgg tgccctgctg ggtagagaac acagaggaca 1980
gggcatactt cttgtcctta aggagcttgt gatctgtgac agtaagccct cctgggatgt 2040
ctgtgccatg tgattgactt acaagtgaaa ctgtcttata atatgaaggt ctttttgttt 2100
acttctaaac ccacttgggt agttactatc cccaaatctg ttctgtaaat aatattatgg 2160
aagggtttct atgtcagtct accttagaga aagccagtga ttcaatatca caaaaggcat 2220
tgacgtatct ttgaaatgtt cacagcagcc ttttaacaac aactgggtgg tccttgtagg 2280
cagaacatac tctcctaagt ggttgtagga aattgcaagg aaaatagaag gtctgttctt 2340
gctctcaagg aggttacctt taataaaaga agacaaaccc agatagatat gtaaaccaaa 2400
atactatgcc ccttaatact ttataagcag cattgttaaa tagttcttac gcttatacat 2460
tcacagaact accctgtttt ccttgtatat aatgactttt gctggcagaa ctgaaatata 2520
aactgtaagg ggatttcgtc agttgctccc agtatacaat atcctccagg acatagccag 2580
aaatctccat tccacacatg actgagttcc tatccctgca ctggtactgg ctcttttctc 2640
ctctttcctt gcctcagggt tcgtgctacc cactgattcc ctttaccctt agtaataatt 2700
ttggatcatt ttctttcctt taaaggggaa caaagccttt tttttttttg agacggagtg 2760
ttgctctgtc acccaagctg gagtgcagtg gcacgatctt ggctcactcc aacctccacc 2820
ttccaggttc aagtgattct cctgcctcag cctcccgagt agctgggact acgggcacgc 2880
accaccacgt ctggctaatt tttgtatttt tagtagagat ggggtttcac cctattggtc 2940
aggctggtct tgaattcctc acctcaggtc atccgcctgt ctcggcctcc cgaagtgctg 3000
ggattatagg tgtgagccac cgcacccagt tgggaacaaa gcctttttaa cacacgtaag 3060
ggccctcaaa ccgtgggacc tctaaggaga cctttgaagc tttttgaggg caaactttac 3120
ctttgtggtc cccaaatgat ggcatttctc tttgaaattt attagatact gttatgtccc 3180
ccaagggtac aggaggggca tccctcagcc tatgggaaca cccaaactag gaggggttat 3240
tgacaggaag gaatgaatcc aagtgaaggc tttctgctct tcgtgttaca aaccagtttc 3300
agagttagct ttctggggag gtgtgtgttt gtgaaaggaa ttcaagtgtt gcaggacaga 3360
tgagctcaag gtaaggtagc tttggcagca gggctgatac tatgaggctg aaacaatcct 3420
tgtgatgaag tagatcatgc agtgacatac aaagaccaag gattatgtat atttttatat 3480
ctctgtggtt ttgaaacttt agtacttaga attttggcct tctgcactac tcttttgctc 3540
ttacgaacat aatggactct taagaatgga aagggatgac atttacctat gtgtgctgcc 3600
tcattcctgg tgaagcaact gctacttgtt ctctatgcct ctaaaatgat gctgttttct 3660
ctgctaaagg taaaagaaaa gaaaaaaata gttggaaaat aagacatgca acttgatgtg 3720
cttttgagta aatttatgca gcagaaacta tacaatgaag gaagaattct atggaaatta 3780
caaatccaaa actctatgat gatgtcttcc tagggagtag agaaaggcag tgaaatggca 3840
gttagaccaa cagaggcttg aaggattcaa gtacaagtaa tattttgtat aaaacatagc 3900
agtttaggtc cccataatcc tcaaaaatag tcacaaatat aacaaagttc attgttttag 3960
ggtttttaaa aaacgtgttg tacctaaggc catacttact cttctatgct atcactgcaa 4020
aggggtgata tgtatgtatt atataaaaaa aaaaaccctt aatgcactgt tatctcctaa 4080
atatttagta aattaatact atttaatttt tttaaagatt tgtctgtgta gacactaaaa 4140
gtattacaca aaatctggac tgaaggtgtc ctttttaaca acaatttaaa gtacttttta 4200
tatatgttat gtagtatatc ctttctaaac tgcctagttt gtatattcct ataattccta 4260
tttgtgaagt gtacctgttc ttgtctcttt tttcagtcat tttctgcacg catccccctt 4320
tatatggtta tagagatgac tgtagctttt cgtgctccac tgcgaggttt gtgctcagag 4380
ccgctgcacc ccagcgaggc ctgctccatg gagtgcagga cgagctactg ctttggagcg 4440
agggtttcct gcttttgagt tgacctgact tccttcttga aatgactgtt aaaactaaaa 4500
taaattacat tgcatttatt ttatattctt ggttgaaata aaatttaatt gactttg 4557
<210> 43
<211> 503
<212> DNA
<213> 智人()
<400> 43
cggctgttgt gcggctctgc ccttctgttt gagtgtatgg gagagtgagt gagtgagtga 60
gtgtgagcgt gtgtgtgaga gcgtgaggcg tgagtgcgcg tgtgagagga cgagagcccg 120
cctggccgcc ccgccgctcc cgccgcagca ggagcagaac gcgcggccgg agagagcggc 180
ggagccggcg cccagggagc ccgcggggac aagggcagag acaccgctcc ccacccccag 240
ccctcgtccc tcggctctcc ttcgccgggg gatcctcccc gttcctccac ccccggccgg 300
cctctgcccc gccgtccccc tggatgtccc tggcgctttc gcggggcctc ctcctgctct 360
tgccgcatca gtcgggctgg tgctgcggcc ggcgggcgta gagcgggcgg gttcccgggg 420
gctgcggctg cccgtgcttc cccggtcccc acccctgccc cccggccccc cgacccagct 480
ctccggcctc agaggctgtg aca 503
<210> 44
<211> 1157
<212> DNA
<213> 智人()
<400> 44
gctgcatcgg aatcttgtcc atgcactgtt gcgaatgctg cagggctgac tgtgcagctc 60
tctgcgggaa cctggtatgg gccatgagaa tgtactgtac aaccacatct tcaaaatgtc 120
cagtagccaa gttccaccac ttttcacaga ttggggtagt ggcttccaag ttgtacctat 180
tttggagtta gacttgaaaa gaaagtgcta gcacagtttg tgttgtggat ttgctacttc 240
catagtttac ttgacatggt tcagactgac caatgcattt ttttcagtga cagtctgtag 300
cagttgaagc tgtgaatgtg ctaggggcaa gcatttgtct ttgtatgtgg tgaatttttt 360
cagtgtaaca acattatctg accaatagta cacacacaga cacaaagttt aactggtact 420
tgaaacatac agtatatgtt aacgaaataa ccaagactcg aaatgagatt attttggtac 480
acctttcttt ttagtgtctt atcagtgggc tgattcattt tctacattaa tcagtgtttt 540
ctgaccaaga atattgcttg gatttttttg aaagtacaaa aagccacata gtttttccag 600
aaaggtttca aaactcccaa agattaactt ccaacttata agtttgtttt tattttcaat 660
ctatgacttg actggtatta aagctgctat ttgatagtaa ttaaatatgt tgtcattgat 720
ataaacctgt ttggttcagc aaacaaacta aaatgattgt catagacagt gttttatttt 780
tcctgttggt gttgctgatt tgtgagcatg ctttaagatg aaaaaagcat gaatgataac 840
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gtttagggtg cccttacttc agcaaaggag aaggagtagg agagccttag aatttttgag 1020
gaaaaaaaaa cctataacat acaatgtact gtatcaaact attttacatg aatgacacaa 1080
gtattctgaa taaaaaataa ttgaacattg ttaaaaacaa ggtgttatgt aataaattta 1140
tttttcataa atcaaaa 1157
<210> 45
<211> 502
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 45
Met Asp Tyr Asp Phe Lys Ala Lys Leu Ala Ala Glu Arg Glu Arg Val
1 5 10 15
Glu Asp Leu Phe Glu Tyr Glu Gly Cys Lys Val Gly Arg Gly Thr Tyr
20 25 30
Gly His Val Tyr Lys Ala Arg Arg Lys Asp Gly Lys Asp Glu Lys Glu
35 40 45
Tyr Ala Leu Lys Gln Ile Glu Gly Thr Gly Ile Ser Met Ser Ala Cys
50 55 60
Arg Glu Ile Ala Leu Leu Arg Glu Leu Lys His Pro Asn Val Ile Ala
65 70 75 80
Leu Gln Lys Val Phe Leu Ser His Ser Asp Arg Lys Val Trp Leu Leu
85 90 95
Phe Asp Tyr Ala Glu His Asp Leu Trp His Ile Ile Lys Phe His Arg
100 105 110
Ala Ser Lys Ala Asn Lys Lys Pro Met Gln Leu Pro Arg Ser Met Val
115 120 125
Lys Ser Leu Leu Tyr Gln Ile Leu Asp Gly Ile His Tyr Leu His Ala
130 135 140
Asn Trp Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ala Asn Ile Leu Val Met
145 150 155 160
Gly Glu Gly Pro Glu Arg Gly Arg Val Lys Ile Ala Asp Met Gly Phe
165 170 175
Ala Arg Leu Phe Asn Ser Pro Leu Lys Pro Leu Ala Asp Leu Asp Pro
180 185 190
Val Val Val Thr Phe Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Gly Ala
195 200 205
Arg His Tyr Thr Lys Ala Ile Asp Ile Trp Ala Ile Gly Cys Ile Phe
210 215 220
Ala Glu Leu Leu Thr Ser Glu Pro Ile Phe His Cys Arg Gln Glu Asp
225 230 235 240
Ile Lys Thr Ser Asn Pro Phe His His Asp Gln Leu Asp Arg Ile Phe
245 250 255
Ser Val Met Gly Phe Pro Ala Asp Lys Asp Trp Glu Asp Ile Arg Lys
260 265 270
Met Pro Glu Tyr Pro Thr Leu Gln Lys Asp Phe Arg Arg Thr Thr Tyr
275 280 285
Ala Asn Ser Ser Leu Ile Lys Tyr Met Glu Lys His Lys Val Lys Pro
290 295 300
Asp Ser Lys Val Phe Leu Leu Leu Gln Lys Leu Leu Thr Met Asp Pro
305 310 315 320
Thr Lys Arg Ile Thr Ser Glu Gln Ala Leu Gln Asp Pro Tyr Phe Gln
325 330 335
Glu Asp Pro Leu Pro Thr Leu Asp Val Phe Ala Gly Cys Gln Ile Pro
340 345 350
Tyr Pro Lys Arg Glu Phe Leu Asn Glu Asp Asp Pro Glu Glu Lys Gly
355 360 365
Asp Lys Asn Gln Gln Gln Gln Gln Asn Gln His Gln Gln Pro Thr Ala
370 375 380
Pro Pro Gln Gln Ala Ala Ala Pro Pro Gln Ala Pro Pro Pro Gln Gln
385 390 395 400
Asn Ser Thr Gln Thr Asn Gly Thr Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Val
405 410 415
Gly Gly Thr Gly Ala Gly Leu Gln His Ser Gln Asp Ser Ser Leu Asn
420 425 430
Gln Val Pro Pro Asn Lys Lys Pro Arg Leu Gly Pro Ser Gly Ala Asn
435 440 445
Ser Gly Gly Pro Val Met Pro Ser Asp Tyr Gln His Ser Ser Ser Arg
450 455 460
Leu Asn Tyr Gln Ser Ser Val Gln Gly Ser Ser Gln Ser Gln Ser Thr
465 470 475 480
Leu Gly Tyr Ser Ser Ser Ser Gln Gln Ser Ser Gln Tyr His Pro Ser
485 490 495
His Gln Ala His Arg Tyr
500
<210> 46
<211> 464
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 46
Met Asp Tyr Asp Phe Lys Val Lys Leu Ser Ser Glu Arg Glu Arg Val
1 5 10 15
Glu Asp Leu Phe Glu Tyr Glu Gly Cys Lys Val Gly Arg Gly Thr Tyr
20 25 30
Gly His Val Tyr Lys Ala Lys Arg Lys Asp Gly Lys Asp Asp Lys Asp
35 40 45
Tyr Ala Leu Lys Gln Ile Glu Gly Thr Gly Ile Ser Met Ser Ala Cys
50 55 60
Arg Glu Ile Ala Leu Leu Arg Glu Leu Lys His Pro Asn Val Ile Ser
65 70 75 80
Leu Gln Lys Val Phe Leu Ser His Ala Asp Arg Lys Val Trp Leu Leu
85 90 95
Phe Asp Tyr Ala Glu His Asp Leu Trp His Ile Ile Lys Phe His Arg
100 105 110
Ala Ser Lys Ala Asn Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Arg Gly Met Val
115 120 125
Lys Ser Leu Leu Tyr Gln Ile Leu Asp Gly Ile His Tyr Leu His Ala
130 135 140
Asn Trp Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ala Asn Ile Leu Val Met
145 150 155 160
Gly Glu Gly Pro Glu Arg Gly Arg Val Lys Ile Ala Asp Met Gly Phe
165 170 175
Ala Arg Leu Phe Asn Ser Pro Leu Lys Pro Leu Ala Asp Leu Asp Pro
180 185 190
Val Val Val Thr Phe Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Gly Ala
195 200 205
Arg His Tyr Thr Lys Ala Ile Asp Ile Trp Ala Ile Gly Cys Ile Phe
210 215 220
Ala Glu Leu Leu Thr Ser Glu Pro Ile Phe His Cys Arg Gln Glu Asp
225 230 235 240
Ile Lys Thr Ser Asn Pro Tyr His His Asp Gln Leu Asp Arg Ile Phe
245 250 255
Asn Val Met Gly Phe Pro Ala Asp Lys Asp Trp Glu Asp Ile Lys Lys
260 265 270
Met Pro Glu His Ser Thr Leu Met Lys Asp Phe Arg Arg Asn Thr Tyr
275 280 285
Thr Asn Cys Ser Leu Ile Lys Tyr Met Glu Lys His Lys Val Lys Pro
290 295 300
Asp Ser Lys Ala Phe His Leu Leu Gln Lys Leu Leu Thr Met Asp Pro
305 310 315 320
Ile Lys Arg Ile Thr Ser Glu Gln Ala Met Gln Asp Pro Tyr Phe Leu
325 330 335
Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ser Asp Val Phe Ala Gly Cys Gln Ile Pro
340 345 350
Tyr Pro Lys Arg Glu Phe Leu Thr Glu Glu Glu Pro Asp Asp Lys Gly
355 360 365
Asp Lys Lys Asn Gln Gln Gln Gln Gln Gly Asn Asn His Thr Asn Gly
370 375 380
Thr Gly His Pro Gly Asn Gln Asp Ser Ser His Thr Gln Gly Pro Pro
385 390 395 400
Leu Lys Lys Val Arg Val Val Pro Pro Thr Thr Thr Ser Gly Gly Leu
405 410 415
Ile Met Thr Ser Asp Tyr Gln Arg Ser Asn Pro His Ala Ala Tyr Pro
420 425 430
Asn Pro Gly Pro Ser Thr Ser Gln Pro Gln Ser Ser Met Gly Tyr Ser
435 440 445
Ala Thr Ser Gln Gln Pro Pro Gln Tyr Ser His Gln Thr His Arg Tyr
450 455 460

Claims (17)

1.一种治疗被诊断患有三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的药剂，所述药剂抑制周期素依赖性激酶19(CDK19)的表达或活性以及实现以下至少一种：减少恶病质、增加生存时间、延长肿瘤进展时间、减小肿瘤块、减小肿瘤负荷和/或延长肿瘤转移时间、肿瘤复发时间、肿瘤响应、完全响应、部分响应、稳定疾病、进行性疾病或无进展生存期。
2.一种治疗被诊断患有三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，其中所述癌的特征在于包含EpCAMmed/high和CD10-/low上皮细胞的肿瘤，所述方法包括施用治疗有效剂量的抑制周期素依赖性激酶19(CDK19)表达或活性的药剂，其中所述治疗减少所述肿瘤中EpCAMmed/high和CD10-/low细胞的数量，减少每单位体积肿瘤的EpCAMmed/high和CD10-/low细胞的数量，或导致所述肿瘤中EpCAMmed/high和CD10-/low上皮细胞与正常细胞的比率降低。
3.一种减少患者中TNBC转移的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的抑制CDK19表达或活性的药剂。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用联合疗法治疗所述患者，所述联合疗法包括(a)抑制CDK19表达或活性的药剂和(b)放射疗法和/或化学疗法。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，包括在开始疗法之前或之后，检测来自所述患者的组织样本中的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述药剂抑制CDK19的表达或活性，但不显著抑制CDK8的表达或活性。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制CDK19的表达或活性的程度大于其抑制CDK8的表达或活性的程度。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述药剂是核酸。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述药剂是蛋白质。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述药剂是CRISPR/Cas9***。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述药剂是靶向CDK19的shRNA或靶向CDK19的siRNA。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述药剂是靶向CDK19的shRNA或siRNA，选自以下：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述药剂是靶向CDK19或与CDK19的5’UTR互补或基本互补，但与CDK8的5’UTR不互补的shRNA或siRNA。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述药剂是靶向CDK19或与CDK19的3’UTR互补或基本互补，但与CDK8的3’UTR不互补的shRNA或siRNA。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述药剂是靶向CDK19或与CDK19的编码区互补或基本互补，但与CDK8的编码区不互补的shRNA或siRNA。
16.根据权利要求9所述的方法，其中所述药剂结合乳腺上皮细胞的细胞质中的CDK19。
17.一种预测患有TNBC的受试者对CDK19靶向药剂的可能的治疗响应性的方法，所述方法包括：
(a)将从所述受试者获得的肿瘤样本中的EpCAMmed/high/CD10-/low细胞定量；
(b)将(a)中EpCAMmed/high/CD10-/low细胞的数量与对CDK19靶向疗法有响应的肿瘤特有的参考值进行比较，以及
(c)如果EpCAMmed/high/CD10-/low细胞的数量等于或超过所述参考值，则用CDK19表达或活性抑制剂治疗患者。
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