CN111269986A - 外泌体中asph基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,属于基因检测技术领域。本发明公开的外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,试剂盒包括检测外泌体中ASPH基因的引物和检测β‑actin的引物。本发明公开的外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,检测灵敏度高,特异性强。

Description

外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,更具体的说是涉及外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用。
背景技术
世界卫生组织日前发布《世界癌症报告》;报告说,中国大陆的癌症发病率几乎占了全球的一半。报告预测,到2030年,全球癌症患者将增加百分之五十。在全球癌症病例中,肺癌增长率最快,达到180万人,肺癌已经上升到第一高发的恶性肿瘤。肺癌是全球范围内发病率及死亡率最高的癌症,仅2012年就有160万人死于肺癌。这种癌症治疗困难,转移的肺癌尤其难治。大约有75%的肺癌患者在确诊时已经为转移性或晚期,其5年生存率仅为6%。过去数十年来,虽然化疗、放疗和手术等治疗措施有了快速的发展,但肺癌的5年生存率仍然较低。主要是因为还没有一种安全的方法可以对其进行筛选,在疾病的早期——治疗的最佳时机,就及时发现患者罹患肺癌的可能性微乎其微,迫切需要一种有效的筛选策略。当CT扫描不清楚,血液测试能帮助医生做出更好的判断。对无症状患者采用CT扫描进行筛选,既昂贵又危险。这种筛选有很高的假阳性,其中一些患者将接受不必要的肺部活组织检查。
外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡,具有脂质双层膜结构,直径大约40-100nm。外泌体于1983年即被发现,但一直被认为是一种细胞废弃物。最近发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸,能作为信号分子传递给其它细胞,从而影响其它细胞的功能。这些发现点燃了人们对细胞分泌膜泡的兴趣。最近的研究发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用,如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。
人类天冬胺酰基β-羟化酶(Human Aspartyl/Asparaginylβ-hydroxylase,ASPH)是胚胎期即存在于细胞内的一种酶,属于依赖α-酮戊二酸双加氧酶家族,可催化特定蛋白中表皮生长因子(EGF)受体样结构域的天冬氨酸或天冬酰胺残基上的β-碳原子羟基化。目前还没有关于检测外泌体中ASPH基因方法的相关报道。因此,提供外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,检测灵敏度高,特异性强。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
外泌体中ASPH基因在肺癌诊断试剂盒中的应用,检测外泌体中ASPH基因的引物序列如下:
ASPH-F:5’-AGCGGTAGCACGAGTGC-3’;SEQ ID NO.1;
ASPH-R:5’-GCCCAGCAATGCAATCAC-3’;SEQ ID NO.2。
进一步,所述试剂盒还包括检测β-actin的引物。
进一步,所述检测β-actin的引物序列如下:
β-actin-F:5’-TGGCATTGCCGACAGGAT-3’;SEQ ID NO.3;
β-actin-R:5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’;SEQ ID NO.4。
进一步,所述肺癌为非小细胞肺癌。
进一步,所述外泌体为肺癌患者血液或肺泡灌洗液提取所得。
进一步,一种利用RT-qPCR检测外泌体中ASPH基因的方法,具体步骤如下:
(1)提取外泌体:收集血液或肺泡灌洗液标本,4℃离心分离上清液,1ml上清液加1ml PBS稀释,再加1ml外泌体提取试剂,获得外泌体;
(2)提取RNA:将获得的外泌体用700μl Qiazol溶解提取RNA,测定RNA的质量和数量;
(3)RT-qPCR:利用SYB Green法进行RT-qPCR分析。
进一步,步骤(3)所述RT-qPCR的反应体系为:终体系为1X的PCR buffer,2mM的MgCl2,0.2mM的dNTP,0.03U/μl的taq聚合酶,ASPH-F 0.2μM,ASPH-R 0.2μM,模板1μl,去离子水补充至20μl。
进一步,步骤(3)所述RT-qPCR的反应程序为:95℃taq酶激活15min,95℃变性15S,58℃退火延伸30S,共50个循环。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明公开提供了外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,肺癌中ASPH的表达明显高于正常肺组织,低分化的肺癌其表达增强、增多,标记指数也高于高分化者,有显著性差异;低分化的肺癌中ASPH表达越高,DNA复制起点也多,细胞着色也就愈深,故细胞核中ASPH阳性表达强度可反映出细胞DNA复制的活跃程度。根据其标记指数及表达特点,能较好地区分不同分化程度的肿瘤组织和正常组织,表明ASPH可作为肺癌可靠的肿瘤标记物,对肺癌的早期筛选有很大帮助,能更好指导临床上肺癌的早期诊断、监测复发等。
本发明首次探索ASPH基因在早期肺癌外泌体中的表达及其应用,为肺癌的早期诊断探索出了一条新路;本发明首次开发既可用于肺癌诊断又可监控术后复发的外泌体新技术,将其用于肺癌诊断试剂盒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明ASPH基因在肺癌细胞株外泌体中的表达情况;
图2附图为本发明利用ROC曲线检测引物的特异性和敏感性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
外泌体提取试剂购自江西惠肽生物科技有限公司。
实施例1
(1)根据ASPH基因设计引物,获得的引物序列如下:
ASPH-F:5’-AGCGGTAGCACGAGTGC-3’;SEQ ID NO.1;
ASPH-R:5’-GCCCAGCAATGCAATCAC-3’;SEQ ID NO.2。
(2)提取肺癌肿瘤细胞(A549、NCI-H1299、NCI-H1650、HCC827)以及正常支气管细胞(NL-20)培养液上清的外泌体;1ml上清液加1ml PBS稀释,再加1ml外泌体提取试剂,获得外泌体。
(3)提取RNA:将获得的外泌体用700μl Qiazol溶解提取RNA,测定RNA的质量和数量。
(4)利用SYB Green法和步骤(1)的引物,在ABI PCR仪上进行进行RT-qPCR分析。
β-actin为内参,引物序列如下:
β-actin-F:5’-TGGCATTGCCGACAGGAT-3’;SEQ ID NO.3;
β-actin-R:5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’;SEQ ID NO.4。
RT-qPCR的反应体系为:终体系为1X的PCR buffer,2mM的MgCl2,0.2mM的dNTP,0.03U/μl的taq聚合酶,ASPH-F 0.2μM,ASPH-R 0.2μM,1μl模板,去离子水补充至20μl。
RT-qPCR的反应程序为:95℃taq酶激活15min,95℃变性15S,58℃退火延伸30S,共50个循环。
结果如图1(△Ct值越低,说明基因表达量越高)所示,结果显示ASPH基因在肿瘤细胞株中高表达,在正常细胞中低表达。
实施例2利用ROC曲线检测引物的特异性和敏感性
血清验证实验:收集28例肺癌病人及191例正常人血清,分别提取外泌体做RT-qPCR检测ASPH的表达水平。实验数据用ROC曲线进行统计学处理,结果见图2。
图2结果显示肺癌病人外泌体ASPH的表达水平明显高于正常人,其灵敏度为78.57%,特异性是94.76%;有诊断意义。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江西惠肽生物科技有限公司 绍兴埃格颂生物科技有限公司 江西三惠生物科技有限公司
<120> 外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agcggtagca cgagtgc 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcccagcaat gcaatcac 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tggcattgcc gacaggat 18
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atactcctgc ttgctgatcc acat 24

Claims (8)

1.外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,其特征在于,检测外泌体中ASPH基因的引物序列如下:
ASPH-F:5’-AGCGGTAGCACGAGTGC-3’;SEQ ID NO.1;
ASPH-R:5’-GCCCAGCAATGCAATCAC-3’;SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述的外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括检测β-actin的引物。
3.根据权利要求2所述的外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述检测β-actin的引物序列如下:
β-actin-F:5’-TGGCATTGCCGACAGGAT-3’;SEQ ID NO.3;
β-actin-R:5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’;SEQ ID NO.4。
4.根据权利要求1所述的外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述肺癌为非小细胞肺癌。
5.根据权利要求1所述的外泌体中ASPH基因在肺癌早期诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述外泌体为肺癌患者血液或肺泡灌洗液提取所得。
6.一种利用RT-qPCR检测外泌体中ASPH基因的方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)提取外泌体:收集血液或肺泡灌洗液标本,4℃离心分离上清液,1ml上清液加1mlPBS稀释,再加1ml外泌体提取试剂,获得外泌体;
(2)提取RNA:将获得的外泌体用700μlQiazol溶解提取RNA,测定RNA的质量和数量;
(3)RT-qPCR:利用SYBGreen法进行RT-qPCR分析。
7.根据权利要求6所述的一种利用RT-qPCR检测外泌体中ASPH基因的方法,其特征在于,步骤(3)所述RT-qPCR的反应体系为:终体系为1X的PCRbuffer,2mM的MgCl2,0.2mM的dNTP,0.03U/μl的taq聚合酶,ASPH-F0.2μM,ASPH-R0.2μM,模板1μl,去离子水补充至20μl。
8.根据权利要求6所述的一种利用RT-qPCR检测外泌体中ASPH基因的方法,其特征在于,步骤(3)所述RT-qPCR的反应程序为:95℃taq酶激活15min,95℃变性15S,58℃退火延伸30S,共50个循环。
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