CN111269922A

CN111269922A - 一种用于提高β-胡萝卜素含量的基因及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN111269922A
Application number: CN202010156593.6A
Authority: CN
Inventors: 周嘉裕; 廖海; 郑乔木; 廖东颖; 邓银
Original assignee: Southwest Jiaotong University
Current assignee: Southwest Jiaotong University
Priority date: 2020-03-09
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2020-06-12

Abstract

本发明公开了一种用于提高β‑胡萝卜素含量的基因及其编码的蛋白和应用。本发明成功获得较高β‑胡萝卜素的转CODXS基因烟草与转CODXR转基因烟草，从而为利用基因工程技术培育具有较高含量的β‑胡萝卜素农作物，为利用合成生物学制备β‑胡萝卜素以用于化妆品和药物的生产提供新的基因源。

Description

一种用于提高β-胡萝卜素含量的基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种用于提高β-胡萝卜素含量的基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

β-胡萝卜素是人体及动物体内维生素A合成的前体物质，但人体和动物体不能合成这些物质，因此只能从食物中摄取。据统计，维生素A缺乏导致全世界有超过2亿儿童的健康受到威胁，其中部分患有夜盲症等眼部疾病。然而，直接补充维生素A会使高维生素A血症与新生儿畸形的风险明显增加，因此含有天然β-胡萝卜素的食品是补充维生素A的最好渠道。另外，由于β-胡萝卜素具有很强的抗氧化特性，也广泛应用于化妆品和药物的生产。随着人们健康意识的提高，培育具有高β-胡萝卜素含量的农作物新品种作为这类天然的食品添加剂必将受到人们的欢迎。与此同时，利用更经济、更绿色环保的合成生物学方法合成β-胡萝卜素也将是未来制备β-胡萝卜素以满足化妆品与制药需求的主流方法。

β-胡萝卜素的生物合成途径主要通过MEP途径。MEP途径是把磷酸甘油醛以及丙酮酸作为底物，在DXS(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶)的作用下生成DXP(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸)，随后在DXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)的作用下，经过异构化和还原反应，生成中间2-甲基赤藓糖-4-磷酸，进一步经过环化、磷酸化生成IPP，这一途径发生在质体中。但目前还未见有决明中DXS和DXR相关基因的报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于提高β-胡萝卜素含量的基因及其编码的蛋白和应用，提供了含有CODXS和CODXR基因的真核表达载体、提供了CODXS/CODXR基因的转基因烟草的真核表达方法及表达产物的检测方法。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于提高β-胡萝卜素含量的基因，该基因为如SEQ ID NO.1所示的决明DXS基因；或如SEQ ID NO.2所示的决明DXR基因。

进一步地，基因为如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个碱基，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

进一步地，蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示；或如SEQID NO.18或SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

进一步地，SEQ ID NO.1所示核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；SEQ ID NO.2所示核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。

一种包含上述基因的质粒。

一种包含上述基因的表达载体。

一种包含上述基因的宿主细胞。

一种用于提高β-胡萝卜素含量的DXS基因的提取方法，包括以下步骤：

(1)提取决明种子总RNA，检测总RNA质量；

(2)反转录合成cDNA；

(3)CODXS的3’端RACE；

(4)CODXS的5’端RACE；

(5)用DNA纯化回收试剂盒逐步回收纯化产物。将纯化的DNA与pMD19-T载体连接；

(6)将连接产物通过热激法转化到E.coli DH5α感受态细胞中，对转化子扩大培养。挑单菌落作为模板，进行菌落PCR鉴定，有条带且条带大小与预计大小一致的菌液送到公司测序；

(7)拼接获得的CODXS序列进行扩增全长序列验证，最终获得CODXS全长序列；

(8)通过对CODXS序列以及质粒PBI121序列中酶切位点的分析，用分别带有BamH I和SnaB I双酶切位点的引物从决明cDNA中通过PCR扩增出CODXS基因序列。

一种用于提高β-胡萝卜素含量的DXR基因的提取方法，包括以下步骤：

(1)提取决明种子总RNA，检测总RNA质量；

(2)cDNA的合成；

(3)利用转录组数据获得的CODXR全长序列；

(4)通过对CODXR序列以及质粒PBI121序列中酶切位点的分析，用分别带有Xba I和Sma I双酶切位点的引物从决明cDNA中通过PCR扩增出CODXR基因序列。

本发明的有益效果为：

本申请从决明种子中克隆获得1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)的cDNA序列，构建含有该基因的真核表达载体并分别成功获得转基因烟草，从而获得具有更高含量β-胡萝卜素的转基因烟草。本申请成功构建了真核表达载体，获得了较高β-胡萝卜素的转CODXS基因烟草与转CODXR转基因烟草，从而利用基因工程技术培育具有较高含量的β-胡萝卜素农作物，为利用合成生物学制备β-胡萝卜素以用于化妆品和药物的生产提供新的基因源。

附图说明

图1为RNA凝胶电泳图；

图2为转基因烟草与野生型烟草DNA凝胶电泳图；

图3为转基因烟草与野生型烟草RNA凝胶电泳图；

图4为转基因烟草与野生型烟草RT-PCR产物凝胶电泳图；

图5为β-胡萝卜素含量HPLC结果；

图6为本申请技术流程图；

图7为重组质粒PBI212-CODXS和PBI121-CODXR的质粒图谱；

图8为β-胡萝卜素标准曲线图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1DXS和DXR基因的获取

1、DXS基因的获取

(1)利用OMEGA公司提供的植物RNA提取试剂盒提取决明种子总RNA，对提取的决明总RNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其提取量和浓度，其结果见图1，图1中条带M为Marker，条带1和条带2均为总RNA的检测结果。

(2)cDNA的合成：将上述提取的总RNA使用PrimeScriptTM RT reagent kit withgDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行反转录获得cDNA。

设计了3’端RACE的2条正向引物(DXS-3GSPW和DXS-3GSPN，2条反向引物为3RP和3RNP，以上述中获得的cDNA为3’端RACE模板，克隆CODXS的3’端的两轮反应体系如下：

第一轮PCR：Template(cDNA)0.5μL；10×LATaq Bufferll(Mg²⁺free)2.5μL；25mMMgCl₂ 1.5μL；dNTP(2.5mM)2μL；DXS-3GSPW(10μM)1μL；LATaq(5units/μL)0.2μL；ddH₂O 16.3μL(Total 25μL)。

第二轮PCR：Template(第一轮产物)1μL；10×LATaq Bufferll(Mg²⁺free)5μL；25mMMgCl₂ 3μL；dNTP(2.5mM)4μL；DXS-3GSPN(10μM)1μL；3RNP(10μM)1μL；LATaq(5units/μL)0.25μL；ddH₂O 34.75μL(Total 50μL)。

加完试剂后，用迷你离心机(北京大龙D10086E)瞬离，使反应液混匀并沉到EP管底部，将其放到

96孔快速PCR仪(Applied Biosystems USA)上扩增，反应条件如下：94℃反应4min，预变性；94℃30s，55℃30s，72℃1min进行扩增，循环30次；72℃7min复性；4℃反应停止。将第二轮产物用1.3％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收，纯化产物。将纯化的DNA与pMD19-T载体连接，体系如下：载体pMD19-T 0.5μL；纯化的DNA 4.5μL；Solution I 5μL。

(3)16℃过夜连接。第二天将连接产物通过热激法转化到50μL的E.coliDH5α感受态细胞中，对转化子扩大培养，即在1mL无抗性的LB液体培养基中37℃，200rpm，摇床培养2h。将培养液用三角玻璃棒均匀涂到有LB培养基(Amp50mg/L)上，倒置，37℃过夜培养，挑单菌落作为模板，进行菌落PCR鉴定，25μL体系，引物为第二轮PCR所用引物，Tm为55℃，其他试剂相同。将产物用1.3％琼脂糖凝胶电泳检测，有条带且条带大小与预计大小一致的菌液送到成都擎科生物技术有限公司测序。

(4)根据已知CODXS序列与3’RACE测序正确的序列拼接结果，设计5’RACE的2条反向引物(DXS-5GSPW和DXS-5GSPN)，正向引物为oligo(dT)11-AP和oligo(dT)7-AP，以CRTP(50μM)为反转录引物，用上述相同的方法获得cDNA并用胶回收试剂盒纯化cDNA，用末端转移酶TdT在5’末端加尾，加尾反应如下：cDNA 10μL；5×TdT Buffer 4μL；0.1％BSA 2μL；dATP(10mM)1μL；dd H₂O 2μL。

表1RACE引物

加完以上试剂后，瞬离混匀，放PCR仪上94℃3min，4℃1min后取出加1μLTdT，瞬离后依次37℃20min，64℃10min，4℃2min以上获得5’端RACE巢式PCR的第一轮反应模板。5’RACE第一轮引物加DXS-5GSPW和oligo(dT)11-AP，Tm设定为55℃，第二轮引物加DXS-5GSPN和oligo(dT)7-AP，Tm设定为54℃，其他反应体系和反应条件/PCR产物的检测与测序与3’端RACE相同。

设计四条引物，分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点表2扩增片段引物

克隆CODXS利用LA Taq酶体系，反应体系如下：10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg²⁺plus)5.0μL；dNTP Mixture(2.5Mm)8.0μL；DXS-F(10μM)1.0μL；DXS-R(10μM)1.0μL；cDNA 1.0μL；LATaq 0.5μL；ddH₂O 33.5μL(Total 50μL)。PCR反应参数为：94℃反应4min，预变性；94℃30s，Tm30s，72℃1.5min进行扩增，循环30次；72℃7min复性；4℃反应停止。

克隆CODXR以反转录得到的cDNA为模板，用设计引物进行PCR反应。反应体系如下：5×primer Star Buffer(Mg ²⁺plus)10μL；dNTP Mixture(2.5Mm)4.0μL；DXR-F(10μM)1.0μL；DXR-R(10μM)1.0μL；cDNA 1.0μL；Primerstar HS DNA Polymease 0.5μL；ddH₂O 32.5μL(Total 50μL)。

PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。并用Gel Extraction Kit纯化、回收PCR产物。

实施例2构建表达载体

1、PBI212-CODXS载体的构建

上述回收的CODXS和pBI121质粒同时用BamH I进行单酶切，酶切体系如下：CODXS/pBI121质粒25μL；10×K Buffer 5μL；BamH I 3μL；ddH₂O 17μL(Total 50μL)。瞬离混匀，于30℃反应4h，直接将反应液回收纯化，各得到30μL的纯化产物，再用SnaB I酶切，酶切体系如下：

CODXS/PBI121(第一次酶切产物)30μL；SnaB I 3μL；10×Basal 5μL；0.1％BSA 5μL；ddH₂O 7μL(Total50μL)。

瞬离混匀后，于37℃反应4h后，用琼脂糖凝胶(1％)电泳切胶回收，纯化CODXS和载体pBI121。

使用T4 DNA连接酶将酶切后纯化的CODXS和PBI121载体连接，瞬离混合后，于16℃过夜连接，获得真核表达载体PBI212-CODXS(见图7)，连接反应体系为：双酶切后的载体PBI121 2.5μL；双酶切纯化的CODXS 6.5μL；10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL；T4 DNALigase 1μL；ddH₂O 12.5μL(Total25μL)。

2、PBI212-CODXR载体的构建

将上述得到的纯化产物CODXR以及质粒PBI121用Xba I和Sma I进行双酶切，获得具有相同粘性末端的CODXR以及PBI121片段，反应体系如下：

纯化的CODXR/PBI121质粒25μL；Xba I(10U/μL)3μL；Sma I(10U/μL)3μL；10×TBuffer 5μL；0.1％BSA 0.5μL；ddH₂O 13.5μL(Total50μL)。

瞬离混匀，于37℃反应4h后用琼脂糖凝胶(1％)电泳检测，并利用GelExtractionKit回收纯化上述酶切后的CODXR以及PBI121片段。

使用T4 DNA连接酶将酶切后纯化的CODXR和PBI121载体连接，瞬离混合后，于16℃过夜连接，获得真核表达载体PBI212-CODXR(见图7)，连接反应体系为：双酶切后的载体PBI121 2.5μL；双酶切纯化的CODXR 6.5μL；10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL；T4DNALigase 1μL；ddH₂O 12.5μL(Total25μL)。

3、将连接好的重组质粒PBI121-CODXS和PBI121-CODXR分别转入到DH5α感受态细胞中，重新形成环状质粒。在含有卡那霉素的LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)上筛选获得阳性重组大肠杆菌，挑取单菌落送至擎科生物技术有限公司测序确定重组质粒拼接的正确性。提取测序成功的阳性转化子DH5α中的重组质粒PBI121-CCDXS和PBI121-CODXR保存备用。

实施例3转基因烟草的获得

1、重组质粒PBI212-CODXS和PBI121-CODXR转化农杆菌

(1)取制备好的GV3101感受态50μL，置于4℃，分别加入20μL重组质粒PBI121-CODXS、PBI121-CODXR，吹打混匀；

(2)将步骤(1)中的混匀菌液置于4℃反应30min，后转入液氮中放置5min，再置于37℃反应5min，之后于4℃放置5min；

(3)于步骤(2)的菌液中加入1mL LB液体培养基，然后放置于28℃，200rpm，振荡培养2-3h；

(4)将步骤(3)的菌液离心，弃上清，收集菌体，加入200μL LB液体培养基重悬菌体，将其涂布于LB固体平板(含Kan 50mg/L和Rfi 50mg/L)上，28℃培养48h；

(5)挑取阳性克隆菌进行扩大培养，进行菌落PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性转化子送公司测序，将鉴定成功的重组菌GV3101于-80℃保存备用。

2、野生型无菌烟草的培养

取野生型的烟草种子于EP管中，75％的乙醇消毒10min，10％的次氯酸钠消毒10min，再用无菌ddH₂O洗涤3次(每次15min)，然后将处理好的种子置于MS固体培养基上，在4℃暗培养2天，随后于16h(25℃)光照/8h(16℃)黑暗交替培养15d，待其长出2-3片真叶，备用。

3、重组GV3101转化野生型烟草

(1)将含重组质粒PBI121-CODXS、PBI121-CODXR的GV3101分别在LB固体平板(含Kan 50mg/L和Rfi 50mg/L)上划线培养，挑取单克隆于50ML LB液体培养基中(含Kan 50mg/L和Rfi 50mg/L)于28℃，200rmp培养至OD600为0.5左右，利用MS液体培养基稀释15倍后备用；

(2)将无菌的烟草苗的叶片，剪成0.5cm x 0.5cm大小的叶片，放入(1)中稀释好的农杆菌菌液中，振荡侵泡8-10min，取出叶片用无菌滤纸，吸干菌液后放于MS1培养基中，于28℃黑暗培养2-3d后，用无菌水洗去叶片上的农杆菌，然后转移至MS2培养基上16h(25℃)光照/8h(16℃)黑暗交替培养，每15天更换一次培养基，直至长出不定芽；

(3)将(2)中的不定芽剪下，转入生根培养基MS3中，进行生根培养，将生根的烟草苗(长出5-7片真叶)开瓶炼苗，3d后转移至土中进行培育。

4、转基因烟草的检测

(1)PCR检测：利用植物DNA提取试剂盒提取转基因烟草和非转基因烟草的DNA，以提取的DNA作为模板，分别用引物进行PCR扩增，以未经过转化的野生型烟草作为对照，PCR产物利用电泳进行检测，其结果见图2和图3；(2)RT-qPCR检测：利用Plant RNA Kit提取转基因烟草与非转基因烟草的总RNA，经检测后反转录为cDNA，利用特异性引物进行RT-qPCR检测，以18S基因为内参基因，每个样品进行三次技术重复，其结果见图4。将CODXR，CODXS基因的RT-PCR产物测序，结果与预期序列一致，成功获得转CODXR/CODXS基因烟草。

实施例4β-胡萝卜素含量的测定

1、溶液的制备

流动相：甲醇-四氢呋喃-BHT(9:1:0.0 1，V/V)；

标准品溶液的制备：准确称取β-胡萝卜素标准品2mg，先用少量四氢呋喃溶解，再用流动相定容至5mL容量瓶中，避光低温保存；

提取剂：甲醇-四氢呋喃-BHT(9:1:0.1，V/V)；

供试品溶液的制备：CODXR转基因植株、CODXS转基因植株及WT各称取0.5g，匀浆，加入20mL甲醇-四氢呋喃-BHT(9:1:0.1，V/V)，旋蒸(30℃)，最后用少量流动相溶解，定容至10mL。

2、色谱条件

色谱柱：依利特Hypersil ODS2反相层析柱(4.6mm×200mm，5μm)；

流动相：甲醇-四氢呋喃-BHT(9:1:0.01，V/V)；

流速：1mL/min；

检测波长：448nm；

进样量：10μL；所有样品进样前都需经0.45μm微孔滤膜过滤。

3、β-胡萝卜素标准工作曲线

精密吸取标准贮备液，加入流动相，摇匀，共得5个不同浓度的对照品溶液(25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、400mg/mL)各进样10μL，测定各组分峰面积，绘制标准曲线。以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。β-胡萝卜素的线性回归方程为：y＝1.4578x+52.555，R²＝0.9969，标准曲线图见图8。

4、β-胡萝卜素的含量测定

分别对CODXR转基因烟草、CODXS转基因烟草和野生型烟草(对照组)进行β-胡萝卜素含量检测，其结果见图5和表4。图5中A为CODXR转基因烟草β-胡萝卜素含量HPLC检测结果；B为CODXS转基因烟草β-胡萝卜素含量HPLC检测结果；C为野生型烟草β-胡萝卜素含量HPLC检测结果。

表4β-胡萝卜素含量测定结果

根据图5和表4的检测结果可知，CODXS和CODXR转基因烟草β-胡萝卜素含量与野生型相比，都有显著提高。其中，转CODXR烟草中的β-胡萝卜素含量要高于转CODXS烟草植株。结果表明CODXS/CODXR过量表达促进了烟草该光合色素的合成，进而也说明CODXS和CODXR是MEP途径的关键酶。

序列表

<110> 西南交通大学

<120> 一种用于提高β-胡萝卜素含量的基因及其编码的蛋白和应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1416

<212> DNA

<213> 决明(Senna tora)

<400> 1

atggctctga atttgccttc tccagctgaa gtcaagtctg tatttttctc cgattccttc 60

aagtctacca gacatgcaaa attcccaggt ggttttgctt tgaagagaaa agattgtgga 120

acaacggttg gaagacaagt ttcctgctcc gtgcagacac cacctccagc ctggccagga 180

agagcggttc ctgagaccag tcgcaagaca tgggaaggcc caaaacccat ctctatcgta 240

ggctctactg gttccattgg aactcagaca ctggatatag tggctgagaa tccagataag 300

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<210> 2

<211> 2127

<212> DNA

<213> 决明(Senna tora)

<400> 2

atggctcttt gcacattctc atttcctcaa aaatctcttc tgggttctca ctctcattgc 60

ggagcagatc tgtacgactg gcaatggcaa tctctacaca cccactctca ggtgaagaag 120

aggacggttc gagtatgtgc atcactatca gaaagaggag agtatgcttc ccggaaacca 180

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tcatcattca tgcaaagggc ttatgaccag gtggtccatg atgtggattt gcagaagctg 1440

ccagtaagat ttgcaatgga cagagctgga ctagttggag cagatggtcc aacacattgt 1500

ggttcttttg atgtcacttt catggcatgc ctccctaaca tggtggtgat ggctccttct 1560

gatgaatctg agcttttcca tatggtcgcc acagctgcag ccattgatga tcgccccagt 1620

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ggctatggat ctgctgttca gaactgtttg gctgcagctt ccttagcgca acgccacggc 1800

ttgcaaataa ccgttgcaga tgcaagattc tgcaagccat tggatcgcgc ccttattcgc 1860

agtctggcaa agtcacatga ggttttgatc accgtggagg aaggatcgat cggaggattt 1920

gggtctcatg ttgctcaatt catggccctt gatggtcttc ttgatggcaa actaaagtgg 1980

aggccaatag ttcttcccga tcgctatatc gaccatggat cgcctgatga ccaattgtct 2040

ctagctggtc tgacaccatc tcacatagca gcaacaatat tcaacattct tggactgaca 2100

agagaggcat tagaggtttt gtcataa 2127

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgactcact atagggcttt tttttttt 28

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgtcaacg atacgctacg taacgg 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catgacagtg tttttttttt tttttttt 28

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcaacgata cgctacgtaa cg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tacgtaacgg catgacagtg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctttgcagag gctttgattg c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacttttgct gctggtctgg 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atcagagcag aagccttcag ta 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaatacatag tggagagcaa ccg 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgatagtga tgcacatact cg 22

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgggatccat ggctctttgc acattctc 28

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccctacgtat tatgactttt cctctaatgc ctc 33

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctctagaat ggctctgaat ttgcc 25

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcccccgggt catgcaggaa tag 23

<210> 18

<211> 471

<212> PRT

<213> 决明(Senna tora)

<400> 18

Met Ala Leu Asn Leu Pro Ser Pro Ala Glu Val Lys Ser Val Phe Phe

1 5 10 15

Ser Asp Ser Phe Lys Ser Thr Arg His Ala Lys Phe Pro Gly Gly Phe

20 25 30

Ala Leu Lys Arg Lys Asp Cys Gly Thr Thr Val Gly Arg Gln Val Ser

35 40 45

Cys Ser Val Gln Thr Pro Pro Pro Ala Trp Pro Gly Arg Ala Val Pro

50 55 60

Glu Thr Ser Arg Lys Thr Trp Glu Gly Pro Lys Pro Ile Ser Ile Val

65 70 75 80

Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr Leu Asp Ile Val Ala Glu

85 90 95

Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu Ala Ala Gly Ser Asn Ile

100 105 110

Lys Leu Leu Ala Asp Gln Val Lys Thr Phe Lys Pro Gln Leu Val Ala

115 120 125

Val Arg Asn Glu Ser Leu Ile Asp Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ala Asp

130 135 140

Val Glu His Lys Pro Glu Ile Ile Pro Gly Glu Gln Gly Val Ile Glu

145 150 155 160

Val Ala Arg His Pro Asp Ala Val Thr Val Val Thr Gly Ile Val Gly

165 170 175

Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala Ile Glu Ala Gly Lys Asp

180 185 190

Ile Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile Ala Gly Gly Pro Phe Val

195 200 205

Leu Pro Leu Ala Gln Lys His Asn Ile Lys Ile Leu Pro Ala Asp Ser

210 215 220

Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln Gly Leu Pro Glu Gly Ala

225 230 235 240

Leu Arg Arg Ile Ile Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ser Phe Arg Asp Trp

245 250 255

Pro Val Glu Lys Leu Lys Asp Val Lys Val Ala Asp Ala Leu Lys His

260 265 270

Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr Val Asp Ser Ala Thr Leu

275 280 285

Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala His Tyr Leu Phe Gly Ala

290 295 300

Glu Tyr Asp Asp Ile Glu Ile Val Ile His Pro Gln Ser Ile Ile His

305 310 315 320

Ser Met Ile Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly Trp

325 330 335

Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr Met Ser Trp Pro Asp Arg

340 345 350

Ile Tyr Cys Ser Glu Val Thr Trp Pro Arg Leu Asp Leu Cys Lys Leu

355 360 365

Gly Ser Leu Thr Phe Lys Val Pro Asp Asn Val Lys Tyr Pro Ser Met

370 375 380

Asn Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly Gly Thr Met Thr Gly Val

385 390 395 400

Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu Met Phe Ile Asp Glu Lys

405 410 415

Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val Glu Leu Thr Cys Glu Gln

420 425 430

His Gln Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser Leu Glu Glu Ile Ile His

435 440 445

Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Lys Tyr Ala Ala Ser Leu Gln Ile Ser Ser

450 455 460

Lys Lys Ala Pro Ile Pro Ala

465 470

<210> 19

<211> 708

<212> PRT

<213> 决明(Senna tora)

<400> 19

Met Ala Leu Cys Thr Phe Ser Phe Pro Gln Lys Ser Leu Leu Gly Ser

1 5 10 15

His Ser His Cys Gly Ala Asp Leu Tyr Asp Trp Gln Trp Gln Ser Leu

20 25 30

His Thr His Ser Gln Val Lys Lys Arg Thr Val Arg Val Cys Ala Ser

35 40 45

Leu Ser Glu Arg Gly Glu Tyr Ala Ser Arg Lys Pro Pro Thr Pro Leu

50 55 60

Leu Asp Thr Ile Asn Tyr Pro Ile His Met Lys Asn Leu Ser Thr Lys

65 70 75 80

Glu Leu Lys Gln Leu Ala Asp Glu Leu Arg Ser Asp Val Ile Phe Asn

85 90 95

Val Ser Lys Thr Gly Gly His Leu Gly Ser Ser Leu Gly Val Val Glu

100 105 110

Leu Thr Val Ala Leu His Tyr Val Phe Asn Ala Pro Gln Asp Lys Ile

115 120 125

Leu Trp Asp Val Gly His Gln Ser Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly

130 135 140

Arg Arg Asp Lys Met His Thr Ile Arg Gln Thr Asn Gly Leu Ser Gly

145 150 155 160

Phe Thr Lys Arg Ser Glu Ser Glu Phe Asp Cys Phe Gly Thr Gly His

165 170 175

Ser Ser Thr Thr Ile Ser Ala Gly Leu Gly Met Ala Val Gly Arg Asp

180 185 190

Leu Lys Gly Gly Lys Asn His Val Val Ala Val Ile Gly Asp Gly Ala

195 200 205

Met Thr Ala Gly Gln Ala Tyr Glu Ala Met Asn Asn Ala Gly Tyr Leu

210 215 220

Asp Ser Asp Met Ile Val Ile Leu Asn Asp Asn Lys Gln Val Ser Leu

225 230 235 240

Pro Thr Ala Asn Leu Asp Gly Pro Ile Pro Pro Val Gly Ala Leu Ser

245 250 255

Ser Ala Leu Ser Arg Leu Gln Ser Asn Arg Pro Leu Arg Glu Leu Arg

260 265 270

Glu Val Ala Lys Gly Val Thr Lys Gln Ile Gly Gly Pro Met His Glu

275 280 285

Leu Ala Ala Lys Val Asp Glu Tyr Ala Arg Gly Met Ile Ser Gly Ser

290 295 300

Arg Ser Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Leu Tyr Tyr Ile Gly Pro Val

305 310 315 320

Asp Gly His Asn Ile Asp Asp Leu Val Ala Ile Leu Asn Glu Val Lys

325 330 335

Ser Thr Lys Thr Thr Gly Pro Val Leu Ile His Val Val Thr Glu Lys

340 345 350

Gly Arg Gly Tyr Pro Tyr Ala Glu Lys Ala Ala Asp Lys Tyr His Gly

355 360 365

Val Thr Lys Phe Asp Pro Ala Thr Gly Lys Gln Phe Lys Gly Lys Ser

370 375 380

Thr Thr Gln Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Ala Glu Ala Leu Ile Ala Glu

385 390 395 400

Ala Glu Ala Asp Lys Asp Ile Val Ala Ile His Ala Ala Met Gly Gly

405 410 415

Gly Thr Gly Met Asn Leu Phe Leu Arg Arg Phe Pro Thr Arg Cys Phe

420 425 430

Asp Val Gly Ile Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu

435 440 445

Ala Cys Glu Gly Pro Lys Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Ser Phe Met

450 455 460

Gln Arg Ala Tyr Asp Gln Val Val His Asp Val Asp Leu Gln Lys Leu

465 470 475 480

Pro Val Arg Phe Ala Met Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly

485 490 495

Pro Thr His Cys Gly Ser Phe Asp Val Thr Phe Met Ala Cys Leu Pro

500 505 510

Asn Met Val Val Met Ala Pro Ser Asp Glu Ser Glu Leu Phe His Met

515 520 525

Val Ala Thr Ala Ala Ala Ile Asp Asp Arg Pro Ser Cys Phe Arg Tyr

530 535 540

Pro Arg Gly Asn Gly Ile Gly Val Glu Leu Pro Pro Gly Asn Lys Gly

545 550 555 560

Ile Pro Leu Glu Ile Gly Lys Gly Arg Ile Leu Ile Glu Gly Glu Arg

565 570 575

Val Ala Leu Leu Gly Tyr Gly Ser Ala Val Gln Asn Cys Leu Ala Ala

580 585 590

Ala Ser Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Gln Ile Thr Val Ala Asp Ala

595 600 605

Arg Phe Cys Lys Pro Leu Asp Arg Ala Leu Ile Arg Ser Leu Ala Lys

610 615 620

Ser His Glu Val Leu Ile Thr Val Glu Glu Gly Ser Ile Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Ser His Val Ala Gln Phe Met Ala Leu Asp Gly Leu Leu Asp Gly

645 650 655

Lys Leu Lys Trp Arg Pro Ile Val Leu Pro Asp Arg Tyr Ile Asp His

660 665 670

Gly Ser Pro Asp Asp Gln Leu Ser Leu Ala Gly Leu Thr Pro Ser His

675 680 685

Ile Ala Ala Thr Ile Phe Asn Ile Leu Gly Leu Thr Arg Glu Ala Leu

690 695 700

Glu Val Leu Ser

705

Claims

1.一种用于提高β-胡萝卜素含量的基因，其特征在于，所述基因为如SEQ ID NO.1所示的决明DXS基因；或如SEQ ID NO.2所示的决明DXR基因。

2.根据权利要求1所述的用于提高β-胡萝卜素含量的基因，其特征在于，所述基因为如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个碱基，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

3.采用权利要求1或2所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示；或如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

4.一种包含权利要求1所述基因的质粒。

5.一种包含权利要求1所述基因的表达载体。

6.一种包含权利要求1所述基因的宿主细胞。

7.权利要求1所述的基因在农作物培育中的应用。

8.一种用于提高β-胡萝卜素含量的试剂，其特征在于，所述试剂以权利要求1或2所述基因，或权利要求3所述蛋白作为活性成分。