CN111269844A - 一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉tw21990及其应用 - Google Patents

一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉tw21990及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990及其应用，哈茨木霉TW21990，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.12864，保藏日期为2016年9月1日。以韭菜灰霉病病原菌灰葡萄孢为靶标，采用平板拮抗方式筛选高效拮抗木霉菌，然后采取田间小区试验复筛，获得高效防治韭菜灰霉病的哈茨木霉菌株TW21990，小区对韭菜灰霉病的防治效果90％以上，并研制了用于冲施和喷雾使用的制剂，大田应用防治韭菜灰霉病效果85％以上。

Description

一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990及其应用
技术领域
本发明涉及生防菌株及其应用技术领域，特别是涉及一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990及其应用。
背景技术
韭菜灰霉病，由半知菌亚门葡萄孢属葱鳞葡萄孢菌引起，在冬季保护地低温高湿的环境条件发生严重，轻则减产10～30％，重则毁棚绝收。根据中国农药信息网，防治韭菜灰霉病合法登记的农药产品只有15％腐霉利烟剂和50％腐霉利可湿性粉剂，规定产品安全间隔期为30天，但是保护地韭菜单茬生长期一般在25～40天不等，达到收获标准若不及时收获，将会影响商品性，降低经济效益，因此很难保障农药安全间隔期，这意味着在设施韭菜生产中一旦施用腐霉利，就面临药残超标风险。
目前现有技术中，利用木霉菌防治黄瓜和番茄灰霉病已得到较好的应用，但在韭菜灰霉病防治中效果不佳，因此选育高效防治韭菜灰霉病的木霉菌株，研制适应性菌剂和应用技术，是解决韭菜药物残留的根本途径。
发明内容
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990及其应用。
本发明的一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990及其应用技术方案为，一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990，分类命名为哈茨木霉Trichoderma harzianum，参据的生物材料：TW21990，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCC No.12864，保藏日期为2016年9月1日。经形态学与ITS序列分析，将其鉴定为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。
哈茨木霉TW21990具有广谱抗性，在PDA平板上对灰霉病、毁灭柱孢、腐皮镰孢、纹枯丝核菌、立枯丝核菌、禾谷镰孢、终极腐霉等供试7种病原真菌较好的拮抗作用。
木霉菌株TW21990对韭菜灰霉病的平板拮抗5天抑制率达到97％，高于对照菌株LTR-2对韭菜灰霉病的平板拮抗5天抑制率。
所述的防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990在制备防治韭菜灰霉病制剂方面的应用。
将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，制备冲施型木霉菌粉剂和喷雾型木霉菌粉剂。
一种喷雾型可湿性粉剂，其特征在于，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加海藻糖、黄原胶、硅藻土制备成喷雾型可湿性粉剂，有效孢子含量为2亿/克。
将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加按母药的重量百分比的海藻糖2％-5％、黄原胶0.1％-0.5％、硅藻土93％-96％制备成喷雾型木霉菌粉剂。
一种冲施型木霉菌粉剂，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加草炭土或麦饭石制备成冲施型木霉菌粉剂，有效孢子含量为2亿/克
将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加按母药的重量百分比的草炭土90％-95％或麦饭石90％-95％制备成冲施型木霉菌粉剂。
本发明的有益效果为：
本发明的哈茨木霉TW21990具有广谱抗性，在PDA平板上对灰霉病、毁灭柱孢、腐皮镰孢、纹枯丝核菌、立枯丝核菌、禾谷镰孢、终极腐霉等供试7种病原真菌较好的拮抗作用。对韭菜灰霉病的平板拮抗5天抑制率达到97％，高于对照菌株LTR-2对韭菜灰霉病的平板拮抗5天抑制率。
利用TW21990制备防治韭菜灰霉病的菌剂防治效果显著，连续2次喷施防治韭菜灰霉病防治效果91.94％，深绿木霉23617菌剂的防治效果86.81％，效果相当；对照菌株LTR-2的防治效果64.14％，差异显著；与其他菌剂处理间也存在显著性差异(p<0.05)。
示范区(山东省沂水县天沐农业专业合作社)，韭菜扣棚前随水冲施哈茨木霉TW21990冲施型菌剂，用量为75kg/公顷，待韭菜长至5cm左右时用智能电动喷粉机喷施喷雾型哈茨木霉TW21990菌剂，扣棚1个月后调查防治韭菜灰霉效果达到86.85％。
附图说明：
图1所示为本发明木霉菌株TW21990的菌落特征照片；
图2所示为本发明木霉菌株TW21990分生孢子梗显微照片；
图3所示为本发明木霉菌株TW21990分生孢子显微照片；
图4所示为本发明木霉菌株TW21990对韭菜灰霉病的的平板抑菌图片。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990，分类命名为哈茨木霉Trichodermaharzianum，参据的生物材料：TW21990，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCCNo.12864，保藏日期为2016年9月1日。经形态学与ITS序列分析，将其鉴定为哈茨木霉(Trichoderma harzianum).
木霉菌株TW21990的菌落特征照片请见说明书附图图1所示，分生孢子梗显微照片请见说明书附图图2所示，分生孢子显微照片请见说明书附图图3所示。
本发明木霉菌株TW21990ITS序列、Tef1序列、Rpb2序列
TW21990(628bp)ITS
GTGATTAGATCTCGTTGGTGACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCGGGAGA
Tef1 TW21990(1291bp)
GAACTGAATTTTCGCTCGATTCTTCCTCCTCCACATTCAATTGTGCCCGACAATTCTGCAGAGAATTTTCGTGTCGACAATTTTTCATCACCCCGCTTTCCATTACCCCTCCTTTGCAGCGACGCAAATTTTTTTTGCTGTCGTTTGGTTTTTAGTGGGGTTCTCTGTGCAACCCCACTAGCTCCCTGCTTTTTCCTGCTTCACCTTCACTTCCTCGTCATCATTCAACGTGCTCTGCGTCTTTGGTCATTCAGCGACGCTAACCACTTTTCCATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCTTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATTGACATTGCTCTGTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTAAGTCTTCACTAAGTTCATGCTGCAATTGCGGACCAGTGCTAACAGGCAATTCACAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACTTCCCAGGCCGATTGCGCTATCCTCATCATTGCCGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCCGTGAGCACGCTCTGCTCGCCTACACCCTGGGTGTTAAGCAGCTCATCGTTGCCATCAACAAGATGGACACTGCCAACTGGGCCGAGGCTCGTTACCAGGAAATCATCAAGGAGACTTCCAACTTCATCAAGAAGGTCGGCTTCAACCCCAAGGCTGTTGCTTTCGTCCCCATCTCCGGTTTCAACGGTGACAACATGCTCCAGCCCTCCACCAACTGCCCCTGGTACAAGGGCTGGGAGAAGGAGACCAAGGCTGGCAAGTTCACCGGCAAGACCCTCCTTGAGGCCATCGACTCCATCGAGCCCCCCAAGCGTCCCACGGACAAGCCCCTCCGTCTTCCCCTCCAGGATGTCTACAAGATCGGTGGTATTGGAACAGTTCCCGTCGGCCGTATCGAGACTGGTGTCCTCAAGCCCGGTATGGTTGTCACTTTCGCTCCCTCCAACGTCACCACTGAAGTCAAGTCCGTCGAGATGCACCACGAGCAGCTCGTCGAGGGTGTTCCCGGTGACAACGTTGGTTTCAACGTCAAGAACGTTTCCGTTAAGGAAATTCGCCGTGGTAACGTTGCCGGTGACTCCAAGAACGACCCCCCCATGGGTGCCGCTTCTTTCACCGCTCAGGTCATCGTCATGAACCACCCTGGCCAGGTCGGTGCCGGCTACGCCCCCGTCTGGTCCCAT
Rpb2(1184bp)：TW21990
AGGGCATTTGAAAACTGGGCGGGTCCTGCTGGCCAGCTGTTCCGTGGTATCATGCGAAGGATGAACACTGAGTTGGCCAACTACCTGAGACGATGCGTTGAGGGCAACCGACACTTCAACCTGGCTGTTGGTATCAAGCCCGGCACGCTTTCAAACGGACTGAAGTATTCGCTTGCCACAGGAAACTGGGGTGATCAGAAGAAGGCCATGAGCTCAACTGCCGGTGTGTCCCAGGTGCTTAACCGTTACACGTTTGCTTCGACCTTGTCACATTTGCGTCGTACCAACACTCCTATCGGGAGAGATGGTAAGCTGGCGAAGCCTCGACAGCTTCACAACACGCATTGGGGCTTGGTCTGCCCAGCCGAGACACCCGAAGGACAGGCCTGTGGTCTGGTCAAGAACTTGTCTTTGATGTGTTACGTCAGTGTCGGTTCTCCCTCCGAGCCTCTGATTGAGTTCATGATCAACAGAGGTATGGAAGTCGTCGAAGAGTACGAGCCGCTGCGGTATCCTCATGCTACAAAGATTTTTGTGAACGGTGTCTGGGTTGGAGTTCACCAAGACCCTAAGCACTTGGTGAACCAGGTTCTGGATACTCGTCGCAAGTCCTATCTGCAATACGAAGTCTCTCTCGTGAGAGAAATTCGAGACCAGGAATTCAAAATCTTTTCCGATGCAGGTCGTGTCATGCGACCAGTCTTTACCGTTCAGCAGGAAGATGATCCGGAAACGGGCATCAACAAGGGCCACCTGGTATTGACCAAGGAGCTCGTCAATAGATTGGCCAAGGAGCAGGCTGAGCCTCCGGAAGACCCCAGCATGAAGATTGGATGGGAGGGATTGATCAGGGCTGGTGCGGTTGAATATCTCGACGCCGAGGAAGAGGAGACGGCCATGATCTGCATGACACCAGAGGATCTCGAGCTGTATCGTCTTCAGAAGGCCGGTATCAACACTGAGGAAGACATGGGAGATGATCCGAACAAGCGACTCAAGACCAAGACGAACCCGACAACTCACATGTACACCCATTGCGAGATTCACCCAAGTATGATCTTAGGTATCTGTGCTAGTATCATTCCTTTCCCCGATCACAACCAGGTATGTTGTCCACGCTTTCAGTCTTATGAACGAAGAAAAAAACTAATGGTGTGCATATCCCCCCTAACATTATAATTTCA
实施例2
防治韭菜灰霉病木霉菌株平板筛选
PDA平板直径两端距中心35mm处分别接种直径5mm的木霉菌株哈茨木霉TW21990和病原真菌，以只接种病原真菌为对照，25℃培养3-5d，记录病原真菌对峙方向生长半径，计算抑制率(％)。
抑制率(％)＝100％×(对照病菌生长半径-处理病菌生长半径)/对照病菌生长半径。
如说明书附图图4所示，结果见表1：
表1哈茨木霉TW21990菌株对灰葡萄孢的平板抑制作用(20℃)
Figure BDA0002437603250000051
从表中可以看出，哈茨木霉TW21990 6天对灰葡萄孢平板抑制率为97.00％，较对照菌株LTR-2(保藏号：CGMCC No.1498,绿色木霉LTR-2)，效果相当，与其他菌株无显著差异。
实施例3
将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，制备冲施型木霉菌粉剂和喷雾型木霉菌粉剂。
一种喷雾型可湿性粉剂，其特征在于，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加按母药的重量百分比的海藻糖2％-5％、黄原胶0.1％-0.5％、硅藻土93％-96％制备成喷雾型木霉菌粉剂，有效孢子含量为2亿/克。
一种冲施型木霉菌粉剂，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加按母药的重量百分比的草炭土90％-95％或麦饭石90％-95％制备成冲施型木霉菌粉剂，有效孢子含量为2亿/克
实施例4
防治韭菜灰霉病田间小区复筛高效木霉菌
试验选在山东省沂水县天沐农业专业合作社大棚进行，大棚为冬暖式简易大棚。种植韭菜品种为“汉中韭王”。
3种木霉：深绿木霉HB20111，保藏号：CGMCC No.16963；绿色木霉LTR-2，保藏号：CGMCC No.1498；、本发明哈茨木霉TW21990(活体孢子≥2亿/克)。
菌剂制备如实施例3所示。
试验共设置3个处理，每处理重复3次，每小区面积为84m2(12m×7m)，采用随机区组设计进行试验，设置空白对照。
3种木霉制剂均用300倍液，用药量为750g/公顷，用水量为450L/公顷，按要求混匀后，使用智能电动喷雾器对茎叶面和地面喷雾，尽量均匀全面。在韭菜刚出土时开始喷药，每隔7天喷药1次，共喷药两次。第一次喷药时间为2019年1月3日。第二次喷药时间为2019年1月10日。
病情基数调查在第一次喷药前进行展开，每隔7d调查一次。第一次调查时间为2019年1月3日(病基数调查)；第2次调查时间为2019年1月10日；第3次调查时间为2019年1月17日。
采用5点取样法进行取样，每点随机调查3～5株，对每株韭菜全部叶片进行调查。韭菜灰霉病病叶分级标准：0级，无病斑；1级，但叶片有病斑1-3个；3级，单叶片有病斑4-6个；5级，单叶片有病斑7-10个；7级，单叶片有病斑11-20个，部分密集成片；9级，单叶片有病斑密集占叶片面积1/4以上。按《农药田间药效试验准则(一)杀菌剂防治蔬菜灰霉病》计算病情指数和防效。
病情指数＝[Σ(各级病株数×相对级值)/(调查总株数×9)]×100
防治效果(％)＝[(空白对照区病指-处理区病指)/空白对照区病指]×100
结果先用Microsoft Office Excel 2010进行数据统计，再用软件SPSS 17.0进行LSD方差分析。
结果见表2.
表2木霉菌剂对韭菜灰霉病田间防效
Figure BDA0002437603250000071
注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05).
从表中看出，哈茨木霉TW21990对韭菜灰霉病防治效果达到91.94％，与深绿木霉TW23617防治效果86.81％，效果相当；与对照菌株哈茨木霉LTR-2防治效果64.14％，差异显著，与其他菌株也存在显著差异。
Figure BDA0002437603250000081
Figure BDA0002437603250000091
Figure BDA0002437603250000101
Figure BDA0002437603250000111
Figure BDA0002437603250000121
Figure BDA0002437603250000131
序列表
<110> 山东省科学院生态研究所
<120> 一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 628
<212> DNA
<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)
<400> 1
gtgattagat ctcgttggtg accagcggag ggatcattac cgagtttaca actcccaaac 60
ccaatgtgaa cgttaccaaa ctgttgcctc ggcgggatct ctgccccggg tgcgtcgcag 120
ccccggacca aggcgcccgc cggaggacca accaaaactc ttattgtata ccccctcgcg 180
ggtttttttt ataatctgag ccttctcggc gcctctcgta ggcgtttcga aaatgaatca 240
aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 300
aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccg 360
ccagtattct ggcgggcatg cctgtccgag cgtcatttca accctcgaac ccctccgggg 420
ggtcggcgtt ggggatcggc cctgccttgg cggtggccgt ctccgaaata cagtggcggt 480
ctcgccgcag cctctcctgc gcagtagttt gcacactcgc atcgggagcg cggcgcgtcc 540
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gaacttaagc atatcaaaag gcgggaga 628
<210> 3
<211> 1291
<212> DNA
<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)
<400> 3
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agggttcctt caagtacgct tgggttcttg acaagctcaa ggccgagcgt gagcgtggta 360
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gtaagtcttc actaagttca tgctgcaatt gcggaccagt gctaacaggc aattcacaga 480
cgctcccggc caccgtgatt tcatcaagaa catgatcact ggtacttccc aggccgattg 540
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ctccatcgag ccccccaagc gtcccacgga caagcccctc cgtcttcccc tccaggatgt 960
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<210> 2
<211> 1184
<212> DNA
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<400> 2
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ctggctgttg gtatcaagcc cggcacgctt tcaaacggac tgaagtattc gcttgccaca 180
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ggattgatca gggctggtgc ggttgaatat ctcgacgccg aggaagagga gacggccatg 900
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cacatgtaca cccattgcga gattcaccca agtatgatct taggtatctg tgctagtatc 1080
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Claims (9)

1.一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990，其特征在于，哈茨木霉TW21990，分类命名为哈茨木霉Trichoderma harzianum，参据的生物材料：TW21990，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.12864，保藏日期为2016年9月1日。
2.根据权利要求1所述的防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990，其特征在于，哈茨木霉TW21990具有广谱抗性，在PDA平板上对灰霉病、毁灭柱孢、腐皮镰孢、纹枯丝核菌、立枯丝核菌、禾谷镰孢、终极腐霉等供试7种病原真菌较好的拮抗作用。
3.根据权利要求1所述的防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990，其特征在于，木霉菌株TW21990对韭菜灰霉病的平板拮抗5天抑制率达到97％。
4.如权利要求1所述的一株防治韭菜灰霉病的哈茨木霉TW21990在制备防治韭菜灰霉病制剂方面的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，制备冲施型木霉菌粉剂和喷雾型木霉菌粉剂。
6.一种喷雾型木霉菌粉剂，其特征在于，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加海藻糖、黄原胶、硅藻土制备成喷雾型木霉菌粉剂，有效孢子含量为2亿/克。
7.根据权利要求6所示的一种喷雾型木霉菌粉剂，其特征在于，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加按母药的重量百分比的海藻糖2％-5％、黄原胶0.1％-0.5％、硅藻土93％-96％制备成喷雾型木霉菌粉剂。
8.一种冲施型木霉菌粉剂，其特征在于，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加草炭土或麦饭石制备成冲施型木霉菌粉剂，有效孢子含量为2亿/克。
9.根据权利要求8所述的一种冲施型木霉菌粉剂，其特征在于，将哈茨木霉TW21990通过发酵制备分生孢子母药，添加按母药的重量百分比的草炭土90％-95％或麦饭石90％-95％制备成冲施型木霉菌粉剂。
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