CN111239282A - 一种测定血液中***的方法、试剂盒及应用 - Google Patents

一种测定血液中***的方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定血液中***的方法、试剂盒及应用，属于血药浓度测定技术领域，该方法采用HPLC‑MS/MS测定血液样品中***含量，具体包括以下步骤：(1)血液样品预处理；(2)标准工作液的配制；(3)HPLC‑MS/MS检测；本发明采用分散固相萃取法，以PSA和PLS为分散固相萃取剂除去血浆中的杂质，无水硫酸镁和无水硫酸钠除去血浆中的水分，降低基质对测定的影响，通过优化分散固相萃取样品预处理条件和LC/MS‑MS检测条件，建立快速、准确、绿色的分散固相萃取‑液相色谱串联质谱法测定血浆样品中***药物的新方法，并取得了较为满意的结果。

Description

一种测定血液中***的方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及血药浓度测定技术领域，特别是涉及一种测定血液中***的方法、试剂盒及应用。
背景技术
镇静类药物是临床常用药物，对中枢神经***有抑制作用，主要用于失眠、焦虑、紧张、恐惧、癫痫病和术前镇静等。镇静类药物通常分为苯二氮卓类(艾司***、咪达***、阿普***、***仑、***、氯硝西泮、劳拉西泮、硝西泮、奥沙西泮、氯氮卓等)、巴比妥类(巴比妥、***、异戊巴比妥等)、吩噻嗪类(氯丙嗪、异丙嗪等)、喹唑酮类(***等)和咪唑并吡啶类(唑吡坦等)等。研究实践显示，巴比妥类药物具有成瘾性，且其治疗剂量与中毒剂量较为接近，因此在临床上已逐渐被苯二氮卓类药物取代。但由于其应用广泛，较易获得，因此易被吸毒人员或犯罪分子不法使用，甚者导致***、他杀、过量服用中毒等刑事案件的发生。因此，巴比妥类药物在涉毒案例的鉴定中有着较高的检出率，尤其是***。生物检材中巴比妥类药物的定性和定量分析在临床毒物分析及法医毒物分析领域中也见有较多的应用与报道。
目前关于镇静类药物的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-高分辨质谱法(LC-HRMS)等，主要研究血液、尿液、毛发等生物样品。HPLC法一般用保留时间定性，该方法虽然方便，但某些物质保留时间相同，故难以用于复杂样品的检测，且分析速度较慢。GC-MS法对药物的热稳定性要求较高，多数须经过衍生化，局限性大，样品预处理费时费力。对于样品预处理而言，目前主要有液液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)、柱切换法和分散固相萃取法(d-SPE)等。其中液液萃取法和固相萃取法较为普及，但液液萃取法有机试剂使用量大，污染环境，固相萃取法所使用的固相萃取小、柱成本高，且选择空间少。柱切换法目前预处理柱填料比较单一，使用有局限性。
目前已见有公开报道的血液中巴比妥类药物的液相色谱-质谱联用测定技术(LC/MS-MS)，然而，经实践证实，所述的报道的方法均存在灵敏度偏低，生物检材用量大，分析时间长等缺点，因此难以满足临床上及司法鉴定中对于此类药物的检测，要求灵敏、简单、快速、准确的分析需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定血液中***的方法、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种测定血液中***的方法，采用HPLC-MS/MS测定血液样品中***含量，具体包括以下步骤：
(1)血液样品预处理：以PSA和/或PLS为分散固相萃取剂除去血浆中的杂质，无水硫酸镁和/或无水硫酸钠除去血浆中的水分；
(2)标准工作液的配制；
(3)HPLC-MS/MS检测：液相色谱采用乙腈-甲酸水溶液作为流动相；质谱采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测。
进一步地，所述血液样品为血浆或血清。
进一步地，所述血液样品预处理的方法为：
取血液，加入2倍血液体积的乙腈振荡提取5min，在离心力3000g下离心5min，取上清液，然后加入重量比为1：1的PSA/PLS的混合物，再加入重量比为4：1的无水硫酸镁/无水硫酸钠混合物，涡旋振荡5min，在离心力3000g下离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后进样分析。
进一步地，所述PSA/PLS的混合物的加入量与血液的比例为5mg：1mL；所述无水硫酸镁/无水硫酸钠混合物的加入量与血液的比例为500mg：1mL。
进一步地，所述标准工作液的配制方法为：
以乙腈配制1.0mg/mL标准品储备液，然后用乙腈溶液制备8个梯度，分别为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L；标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用。
进一步地，所述液相色谱条件为：流动相A：乙腈-0.1％甲酸水溶液(20:80，V/V)；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：300μL/min；进样量：5μL；
所述质谱条件为：采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；定量检测方式：多反应监测模式(MRM)；气帘气压力：20psi；碰撞气压力：7psi；雾化气压力：50psi；辅助气压力：50psi；去簇电压：-60V；入口电压：-10V；碰撞能量：-15eV；碰撞室出口电压：-10V；离子喷雾电压：-4500V；离子源温度：600℃。
进一步地，所述测定血液中***的方法中包括质控品，所述质控品含有三个水平的低、中、高浓度质控血浆，所述质控品由人工血浆添加***标准物质制得，其浓度分别与标准溶液八个梯度中第一、第四和第七个梯度浓度相一致，并通过检测确定靶值。
本发明还提供一种应用上述的方法测定血液中***的试剂盒，包括不同浓度的标准溶液、乙腈、1：1的PSA/PLS的混合物、重量比为4：1的无水硫酸镁/无水硫酸钠混合物、体积比为10:90的甲酸水溶液、乙腈/10％甲酸体积比为4:1溶液、乙腈-0.1％甲酸水溶液(20:80，V/V)以及质控品。
本发明还提供一种上述的方法或上述的试剂盒在检测***含量中的应用。
进一步地，所述应用为上述的方法或上述的试剂盒在检测血浆样品中***含量中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用分散固相萃取法，以PSA和PLS为分散固相萃取剂除去血浆中的杂质，无水硫酸镁和无水硫酸钠除去血浆中的水分，降低基质对测定的影响，通过优化分散固相萃取样品预处理条件和LC/MS-MS检测条件，建立快速、准确、绿色的分散固相萃取-液相色谱串联质谱法测定血浆样品中***药物的新方法，并取得了较为满意的结果。
本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-串联质谱条件的优化，建立了一种检测血液样品中***的方法。本发明中使用前处理方法，用乙腈提取***更加高效，且操作简便，并可较好沉淀蛋白，基本上可完全消除基质效应。超高效液相色谱-串联质谱测定，快速准确，结果客观易于分析，可对中毒病人中***的含量变化进行实时监测，并对镇静类药物中毒的临床诊断治疗提供科学的依据。
本发明的方法分别选择一对定性离子(***：m/z 231.0→m/z 188.2)和一对定量离子(***：m/z 231.0→m/z 85.0)，以其相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。
本发明实现了应用HPLC-MS/MS技术对血浆样本中的***精确检测的目的，用两对离子分别进行定量和定性保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响，该方法操作简便快速，通量高成本低，有效检测临床中毒病人体内的***药物水平，对***药物的中毒的临床诊断治疗具有重要的指导意义，易于临床推广及普及。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为***在5根色谱柱中的响应值色谱图；
图2为***在7种流动相中的响应值色谱图；
图3为***在3种流动相比例下的响应值色谱图；
图4为***的流动相梯度色谱图；
图5为***在不同离子喷雾电压下的响应度变化图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所涉及到的试剂和材料及实验仪器如下：
A.试剂和材料
***标准储备液(1.0mg/L，坛墨质检标准物质中心)、空白血浆(取自宁波市中心血站)、乙腈(LC/MS级，赛默飞世尔科技有限公司)、甲醇(LC/MS级，赛默飞世尔科技有限公司)、乙酸铵(HPLC级，德国默克公司)、氨水(HPLC级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、蒸馏水(屈臣氏集团有限公司)、甲酸(HPLC级，赛默飞世尔科技有限公司)、TiO2(粒径60nm，上海麦克林生化科技有限公司)、PSA(粒径400-500nm，英芮诚生化科技有限公司)、PLS(粒径400-500nm，英芮诚生化科技有限公司)、石墨烯(粒径400-500nm，英芮诚生化科技有限公司)、C18(粒径50μm，北京迪科马科技有限公司)吸附剂材料、无水硫酸镁(AR，国药集团化学试剂有限公司)、无水硫酸钠(AR，国药集团化学试剂有限公司)、氯化钠(AR，国药集团化学试剂有限公司)、滤头(0.22μm，浙江哈迈科技有限公司、上海安谱实验科技股份有限公司、CHROMSPEC)、一次性注射器(常州悦康医疗器材有限公司)、10mL聚丙烯离心管(浙江拱东医疗科技有限公司)。
B.实验仪器
UFLC XR超快速液相色谱仪带有100位自动进样器(日本岛津公司)、AB5500液相色谱串联质谱联用仪(美国AB公司)带有电喷雾电离源、DIGITALVORTEX-涡旋混合器(美国SI公司)、XS205电子分析天平(瑞士梅特勒公司)、3-30K冷冻离心机(德国SIGMA公司)。
实施例1血液样品中***含量的测定
1.1标准储备液的配制
准确吸取***标准储备液(1.0mg/L)100μL于2mL容量瓶中，乙腈定容，配制成50.0μg/L的标准储备液。
1.2标准溶液系列的配制
准确吸取***标准储备液(50.0μg/L)，配制成浓度为0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L的标准溶液系列。
1.3色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：300μL/min；柱温：40℃；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液(20:80，V/V)；进样体积：5μL。
1.4质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；定量检测方式：多反应监测模式(MRM)；气帘气压力：20psi；碰撞气压力：7psi；雾化气压力：50psi；辅助气压力：50psi；去簇电压：-60V；入口电压：-10V；碰撞能量：-15eV；碰撞室出口电压：-10V；离子喷雾电压：-4500V；离子源温度：600℃；定量离子对和定性离子对分别为m/z 231.0→m/z 188.2和m/z 231.0→m/z85.0。
1.5样品测定
取1mL血浆样品至10mL聚丙烯离心管中，加入2mL乙腈振荡提取5min，8000r/min离心5min，取上清加至含5mg PSA/PLS的混合物和500mg无水硫酸镁/无水硫酸钠的混合物的10mL新离心管中，涡旋振荡5min，8000r/min离心5min，取上清，0.22μm滤膜过滤后进样，LC/MS-MS检测。
实施例2色谱条件的选择
2.1色谱柱的选择
本发明试验了5种不同公司生产的C18色谱柱，分别是Waters Acquity UPLC BEHC18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)，Waters Xbridge C18柱(100mm×2.1mm,3.5μm)，PhenomenexKinetex C18柱(50mm×2.1mm,2.6μm)，Shimadzu Shim-pack XR-ODSII柱(150mm×2.0mm,2.2μm)和Shimadzu Shim-pack XR-ODSIII柱(150mm×2.0mm,2.2μm)对***药物的分离影响。结果表明：SHIMADZU Shim-pack XR-ODSII柱(150mm×2.0mm,2.2μm)响应值最高，效果更佳，结合综合情况，选择Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)。***在5根色谱柱中的色谱图如图1所示。
2.2流动相的选择
本发明试验了不同流动相对***药物色谱分离的影响，主要对7种流动相进行了试验(乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸水溶液、乙腈-5mM乙酸铵水溶液、乙腈-5mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液、乙腈-0.2％氨水、甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸水溶液)。结果表明：乙腈-水响应值最高，峰形较好，且出峰时间合适，效果更佳，结合综合情况选择乙腈-0.1％甲酸水溶液，色谱图如图2所示。
2.3流动相比例的选择
本发明对选定的流动相乙腈-0.1％甲酸水溶液进行比例的选择，试验了体积比10:90、20:80、30:70三种流动相比例。结果表明：流动相初始比例为10:90时，总体出峰时间最为合适，效果更佳，结合综合情况选择20:80。图3为3种流动相比例下***药物的色谱图。
2.4流动相梯度的选择
***流动相梯度为：0-3min有机相从10％升至90％，3-6min维持90％，6.01min降至10％，9.5min时停止。色谱图如图4所示。
实施例3质谱条件的选择
3.1离子喷雾电压的选择
本发明试验了不同离子喷雾电压对各目标化合物的响应情况，-1500、-2500、-3500、-4500V。结果显示：离子喷雾电压为-4500V时效果最佳，响应度变化如图5所示。
3.2离子源温度的选择
本发明试验了不同离子源温度对各目标化合物的响应情况，主要对以下5种离子源温度进行选择：300、400、500、600、700℃。结果表明：离子源温度为600℃时总体效果更佳。
实施例4分散固相萃取条件的选择
4.1吸附剂的选择
本发明试验了不同吸附剂对血浆基质的吸附情况，主要对以下5种吸附剂进行选择：TiO2、PSA、PLS、石墨烯、C18。不同类型的吸附剂对***吸附净化回收率的影响如下表所示。结果表明：PLS吸附效果更好，结合综合情况选择等比例的PSA/PLS混合物。
Figure BDA0002383888510000101
Figure BDA0002383888510000111
4.2吸附剂用量的选择
本发明试验了不同用量吸附剂对样品净化效果的影响，主要对以下4种用量进行选择：5、10、20、30mg。不同用量的PSA/PLS对***吸附净化回收率的影响如下表所示。结果选择：PSA/PLS 5mg时回收率较高，故选择5mg PSA/PLS作为其吸附剂。
Figure BDA0002383888510000112
4.3除水剂的选择
本发明试验了不同除水剂的吸水情况，主要对以下3种除水剂进行选择：无水硫酸镁、无水硫酸钠、氯化钠。不同类型的除水剂对10种镇静类药物吸附净化回收率的影响如下表所示。结果显示：无水硫酸钠回收率最高，选择等比例的无水硫酸镁/无水硫酸钠为除水剂。
Figure BDA0002383888510000113
注：氯化钠取上层有机相进样检测。
4.4除水剂用量的选择
本发明试验了不同用量除水剂的吸水情况，主要对以下5种用量的除水剂进行选择：100、200、300、400、500mg。不同用量的除水剂对***吸附净化回收率的影响如下表所示。结果显示：选择500mg除水剂。
Figure BDA0002383888510000121
4.5滤膜的选择
本发明试验了不同厂家或材质的滤膜的过滤情况，主要对以下4种滤膜进行选择：HAMAG Technologies PTFE膜(0.22μm)、ANPEL PTFE膜(0.22μm)、ANPEL Acrodisc GHP膜(0.22μm)、CHROMSPEC NYL膜(0.22μm)。不同滤膜对***吸附净化回收率的影响如下表所示。结果显示：HAMAG Technologies PTFE膜(0.22μm)回收率最高，更适合用于过滤。
Figure BDA0002383888510000122
实施例5方法的线性方法、相关系数和检出限
准确吸取一定量的混合标准储备液(50.0μg/L)，配制成浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L的标准溶液系列，按照优化后的色谱质谱条件进样，LC/MS-MS分析，获得不同质量浓度下各组分的峰面积，以峰面积(y)对质量浓度(x，μg/L)进行线性回归。由下表可知，该方法线性良好，相关系数(r)均大于0.999，以信噪比3：1时相应的浓度为检出限，检出限为0.039μg/L，以信噪比10：1时相应的浓度为定量检出限，定量检出限为0.13μg/L。
Figure BDA0002383888510000131
实施例5方法的回收率和精密度
准确吸取***标准储备液(50.0μg/L)40μL至1mL空白血浆样品中，加2mL乙腈提取，使离心后的上清液中药物终浓度为1.0μg/L，按优化后的条件处理，进样分析，得到其回收率为86.2％。准确吸取***标准储备液(50.0μg/L)20μL，加入980μL乙腈，配制成1.0μg/L标准溶液，平行测定6次，得到其日内精密度为4.8％，如下表所示。
Figure BDA0002383888510000132
至此，本发明建立了血浆中***药物的分散固相萃取-液相色谱串联质谱测定方法。综合上述实验，最终***试样以5mg PSA/PLS的混合物为分散固相萃取剂，500mg无水硫酸镁/无水硫酸钠混合物为除水剂，在Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱上，以乙腈-0.1％甲酸水(20:80，V/V)为流动相分离，电喷雾负离子模式下多反应监测模式(MRM)定量测定。本发明建立的方法快速简便，稳定性好，回收率高，可用于临床***药物的快速检测。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种测定血液中***的方法，其特征在于，采用HPLC-MS/MS测定血液样品中***含量，具体包括以下步骤：
(1)血液样品预处理：以PSA和/或PLS为分散固相萃取剂除去血液样品中的杂质，无水硫酸镁和/或无水硫酸钠除去血液样品中的水分；
(2)标准工作液的配制；
(3)HPLC-MS/MS检测：液相色谱采用乙腈-甲酸水溶液作为流动相；质谱采用负离子电喷雾离子化的多离子反应检测。
2.根据权利要求1所述的测定血液中***的方法，其特征在于，所述血液样品为血浆或血清。
3.根据权利要求1所述的测定血液中***的方法，其特征在于，所述血液样品预处理的方法为：
取血液样品，加入2倍血液体积的乙腈振荡提取5min，在离心力3000g下离心5min，取上清液，然后加入重量比为1：1的PSA/PLS的混合物，再加入重量比为4：1的无水硫酸镁/无水硫酸钠混合物，涡旋振荡5min，在离心力3000g下离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后进样分析。
4.根据权利要求3所述的测定血液中***的方法，其特征在于，所述PSA/PLS的混合物的加入量与血液的比例为5mg：1mL；所述无水硫酸镁/无水硫酸钠混合物的加入量与血液的比例为500mg：1mL。
5.根据权利要求1所述的测定血液中***的方法，其特征在于，所述标准工作液的配制方法为：
以乙腈配制1.0mg/mL标准品储备液，然后用乙腈溶液制备8个梯度，分别为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L；标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用。
6.根据权利要求1所述的测定血液中***的方法，其特征在于，所述液相色谱条件为：流动相A：乙腈-0.1％甲酸水溶液(20:80，V/V)；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：300μL/min；进样量：5μL；
所述质谱条件为：采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；定量检测方式：多反应监测模式；气帘气压力：20psi；碰撞气压力：7psi；雾化气压力：50psi；辅助气压力：50psi；去簇电压：-60V；入口电压：-10V；碰撞能量：-15eV；碰撞室出口电压：-10V；离子喷雾电压：-4500V；离子源温度：600℃。
7.根据权利要求1所述的测定血液中***的方法，其特征在于，所述测定血液中***的方法中包括质控品，所述质控品含有三个水平的低、中、高浓度质控血浆，所述质控品由人工血浆添加***标准物质制得，其浓度分别与标准溶液八个梯度中第一、第四和第七个梯度浓度相一致，并通过检测确定靶值。
8.一种应用权利要求1-7任一项所述的方法测定血液中***的试剂盒，其特征在于，包括不同浓度的标准溶液、乙腈、1：1的PSA/PLS的混合物、重量比为4：1的无水硫酸镁/无水硫酸钠混合物、体积比为10:90的甲酸水溶液、乙腈：10％甲酸体积比为4:1溶液、乙腈-0.1％甲酸水溶液(20:80，V/V)以及质控品。
9.一种权利要求1-7任一项所述的方法或权利要求8所述的试剂盒在检测***含量中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为权利要求1-7任一项所述的方法或权利要求8所述的试剂盒在检测血浆样品中***含量中的应用。
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