CN105628835A

CN105628835A - 羊耳菊药材的多成分含量测定方法

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Publication number: CN105628835A
Application number: CN201510576659.6A
Authority: CN
Inventors: 兰燕宇; 黄勇; 李勇军; 王永林; 郑林; 王爱民; 廖尚高; 孙佳; 李月婷; 陈思颖; 陆苑; 巩仔鹏
Original assignee: Guizhou Medical University
Current assignee: Guizhou Medical University
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2035-09-11
Also published as: CN105628835B

Abstract

本发明公开了一种羊耳菊药材的多成分含量测定方法，所述方法包括采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定羊耳菊药材中东莨菪苷、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸6个成分的含量的步骤，在超高效液相色谱串联质谱分析中以葛根素为内标。本发明首次建立了羊耳菊药材的多指标成分含量测定方法，且采用UPLC-MS/MS法，在6min内即可同时准确测定羊耳菊中6个成分的含量，为羊耳菊的质量控制提供了一种快速灵敏、稳定可靠的新方法。

Description

羊耳菊药材的多成分含量测定方法

技术领域

本发明涉及药物成份鉴别和质量检测技术领域，具体涉及一种测定羊耳菊药材中多种成分含量的方法。

背景技术

羊耳菊为菊科植物羊耳菊Inulacappa（Buch.-Ham.exD.Don）DC.的干燥全草，具有疏风散热，解毒消肿功效，是贵州苗族常用药材，苗语药名为“Bexniouxdant”（近似汉译音为“白牛胆”），在《苗族医药学》、《中华本草·苗药卷》、2003版《贵州省中药、民族药质量标准》中均有收载，贵州省以羊耳菊为原料研制的“七神喉痹通颗粒”、“鼻康片”、“羊甘滴丸”等各种苗药制剂相继上市销售，疗效显著，创造了良好的社会经济效益。在傣族，羊耳菊又名“纳罕”，为傣医名方“雅叫哈顿散”（收载于2010年版中国药典一部）的主药。《中国民族药志》记载：除苗族、傣族外，羊耳菊在我国壮、侗、景颇、拉祜、傈僳、苗、彝、佤等少数民族地区均有丰富的药用经验，常用于感冒发热，咽喉肿痛，风湿疼痛，痈疮疔毒，乳痈等症，有独特疗效。但羊耳菊基础研究薄弱一直是亟待解决的技术问题，特别是羊耳菊的质量控制水平低，很难保证羊耳菊及其相关产品的质量和疗效。

近年来对羊耳菊的化学成分研究报道较多，其主要成分有酚类、倍半萜类、有机酸类、黄酮类和挥发油类等，但目前关于羊耳菊的质量研究却较少。《贵州省中药、民族药质量标准》中尚未收载羊耳菊的含量测定项目，经文献查阅，也仅有羊耳菊单一成分及总黄酮测定，不能全面反映其内在质量。现有技术表明，羊耳菊中东莨菪苷、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷，3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸等六种成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化及抗病毒等药理作用，因此，建立羊耳菊中上述6个成分的含量测定方法能够为有效控制羊耳菊的内在质量提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是为了更加全面的鉴别和控制羊耳菊药材的质量，提供一种采用UPLC-MS/MS法测定羊耳菊药材中六种成分的方法，以测定出羊耳菊中羊耳菊中东莨菪苷、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷，3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸等六种成分含量。

基于上述目的，本发明是这样一种羊耳菊药材的多成分含量测定方法，该方法包括采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定羊耳菊药材中东莨菪苷、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸6个成分的含量的步骤，在超高效液相色谱串联质谱分析中包括以葛根素为内标。

在超高效液相色谱串联质谱分析中采用WatersBEHC18（2.1mm×100mm，1.7μm）色谱柱。

在超高效液相色谱串联质谱分析中采用0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相进行梯度洗脱。该梯度洗脱的程序如下：0~1.0min，5%~15%(A)；1.0~3.8min，15%~18%(A)；3.8~4.0min，18%~90%(A)；4.0~5.0min，90%~5%(A)。

在超高效液相色谱串联质谱分析中包括还包括电喷雾电离源（ESI），以多反应离子监测(MRM)检测的步骤。它的质谱条件是：采用电喷雾电离源(ESI)，毛细管电离电压3kV，离子源温度120℃；去溶剂气N₂，流速650L/h，去溶剂气温度350℃，离子源温度120℃；碰撞气Ar，流速0.16mL/min；扫描方式为多反应离子监测(MRM)。

该方法中，内标溶液的制备方法如下：精密称取葛根素，用甲醇定容，获得葛根素的储备液；取内标储备液适量至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20μg/mL的内标溶液，冷冻保存备用。

供试品溶液制备方法如下：取羊耳菊细粉约1.0000g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入25%乙醇25mL，称定重量（精确至0.01g），加热回流提取2h，放冷，再称定重量，用提取液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5mL于蒸发皿，挥干溶剂；残余物转移至25mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液制备方法如下：：分别精密称取东莨菪苷等6种对照品，各置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度处，摇匀；得东莨菪苷（0.504mg/mL）、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.037mg/mL）、木犀草苷（0.856mg/mL）、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.007mg/mL）、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（0.502mg/mL）、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.073mg/mL）的储备液。

UPLC-MS/MS专属性强，灵敏度高，快速准确，越来越多地应用于中药材质量控制等各方面的研究中，因此本发明应用UPLC-MS/MS，以葛根素为内标，建立羊耳菊中6个成分的含量测定方法，国内外未见相关文献报道，为有效控制羊耳菊的内在质量提供了科学依据。

本发明中，UPLC使用1.7μm颗粒度的色谱柱填料，能显著提高分离的效率，UPLC-MS/MS法在不影响分离效果的情况下大大提高了样品中各成分的分析速度。本发明首次建立了羊耳菊药材的多指标成分含量测定方法，且采用UPLC-MS/MS法，在6min内即可同时准确测定羊耳菊中6个成分的含量，为羊耳菊的质量控制提供了一种快速灵敏、稳定可靠的新方法。

本发明实验中考察了以甲醇、无水乙醇、25%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水为提取溶剂，分别用索氏提取、回流提取和超声处理，以及不同时间对羊耳菊进行提取，对测定结果综合分析后，最后采用25%乙醇加热回流提取2h，6种成分的提取效率较好。

附图说明

图1是混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的UPLC-MS/MS图谱；其中：1.东莨菪苷，2.葛根素，3.1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸，4.木犀草苷，5.3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸，6.3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸，7.4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸。

具体实施方式

为了更加清楚的对本发明进行说明，以下通过具体实施实例对本发明的具体实施方式进行更为详细的说明。但是应该理解，以下所述具体实施实例仅用于本发明进行示例性说明，而非用于本发明进行任何性质限定，其中所用材料、试剂、仪器及操作条件仅为代表性的，其并不限于所列举的情况。所属技术领域的技术人员通过阅读以下说明可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。

1仪器与试药

1.1仪器

ACQUITY***超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质量分析器和Masslynx4.1质谱工作站（美国waters公司）。

1.2试药

东莨菪苷对照品（批号13061442，纯度≥98%）由上海同田生物技术有限公司提供；1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸对照品（均由中药固体制剂制造技术国家工程研究中心提供，批号分别为1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215、纯度≥98%）；葛根素和木犀草苷对照品（均由中国食品药品检定研究院提供，批号分别为111-090623、111720-200602纯度≥98%）；甲醇（天津科密欧化学试剂有限公司）、乙腈（德国Merck公司）、甲酸（美国TEDIA有限公司）为色谱纯；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。羊耳菊药材：共6批样品，来源于贵州高坡、龙里及罗甸等地，由贵阳医学院龙庆德副教授鉴定为菊科植物羊耳菊Inulacappa(Buch.-Ham.exD.Don)DC.的干燥全草。

2方法与结果

2.1溶液配制

对照品溶液：分别精密称取东莨菪苷等6种对照品，各置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度处，摇匀。得东莨菪苷（0.504mg/mL）、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.037mg/mL）、木犀草苷（0.856mg/mL）、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.007mg/mL）、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（0.502mg/mL）、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.073mg/mL）的储备液。

内标溶液：精密称取葛根素（1.148mg），用甲醇定容至10mL。获得葛根素（0.1148mg/mL）的储备液。取内标储备液适量至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20μg/mL的内标溶液，置冰箱（-20℃）保存，备用。

供试品溶液：取羊耳菊细粉约1.0000g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入25%乙醇25mL，称定重量（精确至0.01g），加热回流提取2h，放冷，再称定重量，用提取液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5mL于蒸发皿，挥干溶剂；残余物转移至25mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

2.2色谱条件

色谱柱：WatersBEHC₁₈(2.1mm×100mm，1.7μm)柱，保护柱：WatersVanGuardBEHC₁₈(2.1m×5mm，1.7μm)；柱温：45℃；流速：0.35mL/min；进样体积为1μL；流动相：0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱，洗脱程序如下：0~1.0min，5%~15%(A)；1.0~3.8min，15%~18%(A)；3.8~4.0min，18%~90%(A)；4.0~5.0min，90%~5%(A)。

2.3质谱条件

采用电喷雾电离源(ESI)，毛细管电离电压3kV，离子源温度120℃；去溶剂气N₂，流速650L/h，去溶剂气温度350℃，离子源温度120℃；碰撞气Ar，流速0.16mL/min。扫描方式为多反应离子监测(MRM)，监测离子见表1。

表1质谱条件

表1注：分析物1-7分别为东莨菪苷、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸及葛根素。

2.4专属性试验

精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液适量并加入内标（葛根素）溶液，15000rpm，离心5min取上清液1μL进样，结果见图1。由图可见，被测定成分间分离良好，未有杂质干扰，比较供试品溶液和对照品的母离子、子离子质谱图，两者一致，表明本法专属性良好。

2.5线性试验

精密吸取“2.4”项下制备的混合对照品溶液适量，依次稀释，制得6个浓度的系列浓度线性工作液，分别进样测定。以对照品浓度（c）为横坐标X，色谱峰面积与内标峰面积比值（A/Ai）为纵坐标Y，进行线性回归，得回归方程见表2。

表26种成分的线性关系

化合物Group	回归方程Regression equation	r	线性范围Liner range ( μg/mL)
				1	Y=1.6460X+0.0839	0.9998	0.058～42.000
2	Y=0.3294X-0.1302	0.9998	0.178～129.630
				3	Y=0.9855X-0.1096	0.9997	0.087～63.400
4	Y=0.2931X+0.0542	0.9994	0.288~69.930
				5	Y=3.6463X+1.4049	0.9993	0.172～125.500
6	Y=0.5351X-0.4644	0.9997	0.184～134.130

表2注：分析物1-6分别为东莨菪苷、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸

22.6重复性试验

取同批次羊耳菊药材，按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，处理后分别进样测定，根据内标法计算得1~6平均含量分别为0.211、2.083，0.036，2.573、0.087和0.233mg/g，RSD分别为5.27%、4.24%、3.16%、1.51%、1.53%和2.96%，表明本方法重复性良好。

2.7精密度试验

取与重复性一致的同一批号的供试品溶液，连续测定3d，每天进样6次，依据内标法计算含量，结果1~6的日内及日间精密度（n=6）RSD分别为1.02%~3.31%和1.35%~3.11%，表明仪器精密度良好。

2.8稳定性试验

取同一供试品溶液，分别处理后于0、2、4、8、12h进样分析，1~6含量的RSD分别为1.94%、1.54%、3.49%、1.87%、2.83%，5.79%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.9加样回收率试验

精密称取6份已知含量的羊耳菊样品适量，平均分为3组，分别精密加入0.5、1.0、2.0mL混合对照品溶液（1~6浓度分别为0.042、0.130、0.063、0.210、0.126、0.134mg/mL），制成低、中、高浓度的质控样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述条件进样测定，计算加样回收率，结果表3。

表3回收率实验结果（%,n=3）

2.10样品测定

按“2.1”项下方法制备6批样品的供试品溶液，处理后分别进样测定，根据内标法计算样品中各成分的含量，结果见表4。

表46批样品中6个成分的含量（mg/g,n=3）

3讨论

UPLC使用1.7μm颗粒度的色谱柱填料，能显著提高分离的效率，UPLC-MS/MS法在不影响分离效果的情况下大大提高了样品中各成分的分析速度。本研究首次建立了羊耳菊药材的多指标成分含量测定方法，且采用UPLC-MS/MS法，在6min内即可同时准确测定羊耳菊中6个成分的含量，为羊耳菊的质量控制提供了一种快速灵敏、稳定可靠的新方法。

实验中考察了以甲醇、无水乙醇、25%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水为提取溶剂，分别用索氏提取、回流提取和超声处理，以及不同时间对羊耳菊进行提取，对测定结果综合分析后，最后采用25%乙醇加热回流提取2h，6种成分的提取效率较好。

通过贵州不同产地的6批羊耳菊药材含量测定结果可以看出，羊耳菊中6种成分的含量存在明显差异，其中贵州龙里产的药材含量较高，说明生态环境、采收时间和储存条件等可能对含量产生影响。上述结果提示，为保证羊耳菊相关制剂批次间质量的一致性，应加强羊耳菊的质量控制，必要时固定药材的来源。

Claims

1.一种羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于：所述方法包括采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定羊耳菊药材中东莨菪苷、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸6个成分的含量的步骤，在超高效液相色谱串联质谱分析中包括以葛根素为内标。

2.根据权利要求1所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于：在超高效液相色谱串联质谱分析中采用WatersBEHC18（2.1mm×100mm，1.7μm）色谱柱。

3.根据权利要求1所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于：在超高效液相色谱串联质谱分析中采用0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相进行梯度洗脱。

4.根据权利要求3所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于：所述梯度洗脱的程序如下：0~1.0min，5%~15%(A)；1.0~3.8min，15%~18%(A)；3.8~4.0min，18%~90%(A)；4.0~5.0min，90%~5%(A)。

5.根据权利要求1所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于：在超高效液相色谱串联质谱分析中包括还包括电喷雾电离源（ESI），以多反应离子监测(MRM)检测的步骤。

6.根据权利要求1所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于：

所述内标溶液的制备方法如下：精密称取葛根素，用甲醇定容，获得葛根素的储备液；取内标储备液适量至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20μg/mL的内标溶液，冷冻保存备用。

7.根据权利要求5所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于：

所述电喷雾电离源（ESI），以多反应离子监测(MRM)检测的步骤的质谱条件是：采用电喷雾电离源(ESI)，毛细管电离电压3kV，离子源温度120℃；去溶剂气N₂，流速650L/h，去溶剂气温度350℃，离子源温度120℃；碰撞气Ar，流速0.16mL/min；扫描方式为多反应离子监测(MRM)。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于：该方法还包括供试品溶液和对照品溶液的制备的步骤；

供试品溶液制备：取羊耳菊细粉约1.0000g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入25%乙醇25mL，称定重量（精确至0.01g），加热回流提取2h，放冷，再称定重量，用提取液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5mL于蒸发皿，挥干溶剂；残余物转移至25mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液制备：分别精密称取东莨菪苷等6种对照品，各置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度处，摇匀；得东莨菪苷（0.504mg/mL）、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.037mg/mL）、木犀草苷（0.856mg/mL）、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.007mg/mL）、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（0.502mg/mL）、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（1.073mg/mL）的储备液。