CN111235058B - 一种具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌及其制备方法和应用，涉及微生物技术领域，本发明的具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌，所述短双歧杆菌命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve，保藏编号为：CGMCC No.12915。试验结果显示本发明的短双歧杆菌具有修复紫外线引发的皮肤损伤及炎症的作用，能改善紫外线长期反复照射下造成的皮肤光老化现象。

Description

一种具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短 双歧杆菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是机体与外界接触的第一道生理屏障，长期太阳紫外线辐射可引发皮肤脆弱、起皱、粗糙、干燥、松弛和色素沉着过度等症状，即为光老化。根据波长，紫外线可分为UVA、UVB、UVC，其中UVC被大气臭氧层吸收和分散，无法到达地球表面。UVA对皮肤穿透能力较强，可影响真皮及皮下组织区域，造成细胞损伤，如成纤维细胞、血管内皮细胞和朗格汉斯细胞等，使真皮结构发生改变，导致皮肤松弛、起皱；UVB能量较高，但穿透能力相对较弱，主要影响皮肤角质形成细胞和黑色素细胞，可使角质层加厚，表皮增生，炎症反应加剧。
皮肤I、Ⅲ型胶原蛋白是构成皮肤真皮细胞外基质最主要的蛋白成分，具有保持皮肤水分、支撑皮肤正常结构及维持皮肤韧性的功能，主要分布于真皮层，仅由成纤维细胞合成和分泌。目前研究表明，UV辐射后诱导细胞表达基质金属蛋白酶(MMPs)，催化胶原蛋白及弹性蛋白的降解，其中MMP-1(间质胶原酶)和MMP-3(基质溶解素)为主要作用蛋白酶。UV照射后皮肤中产生的高浓度ROS(活性氧簇)，包括超氧阴离子、单线态氧、过氧化氢、羟自由基等，正常皮肤具有相对完善的抗氧化防御***，酶性抗氧化物质包括：谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化歧化酶及过氧化氢酶等，若ROS不能及时清除则会对组织中核酸、脂质、蛋白质造成损害，并影响相关细胞信号转导和基因表达，从而导致皮肤光老化发生。随着环境污染的不断加重，臭氧层破坏日益严重，辐射到地球表面的紫外线逐渐增加，皮肤受到紫外线损伤的现象越来越严重，影响人们的身心健康。
目前临床上多采用化学剥脱术、光电修复(强脉冲光、点阵激光、近红外光等)和注射塑形(肉毒素、玻尿酸注射，自体脂肪填充)来缓解皮肤光老化的问题。化学剥脱术和注射塑型会导致皮肤出现肿胀、瘙痒等症状，且存在风险，光电修复虽副作用较小，但价格昂贵，限制了广泛应用。益生菌近年来被医学界和科学界认定有助人体健康，且无副作用，故有必要提供一种可修复皮肤紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化的益生菌。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌及其制备方法和应用，解决现有缓解皮肤光老化的问题存在的具有副作用或者价格昂贵的问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌，所述短双歧杆菌命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve，保藏编号为：CGMCC No.12915。
一种所述的具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌的制备方法，包括如下步骤：
(1)采集粪便样品，用无菌水溶解，梯度稀释，加入到灭菌的平板中；
(2)向50-50℃的MRS培养基加入过氧化氢溶液，使培养基中起始的过氧化氢浓度为0.5mmol/L，得到样品培养基；
(3)向步骤(1)的所述平板中倾入所述样品培养基并混匀，挑选平板上菌落长势较好的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出具有过氧化氢耐受性的乳杆菌；
(4)在筛选出的具有过氧化氢耐受性的乳杆菌中以抗氧化性能即对DPPH自由基、ABTS自由基及羟基自由基的清除率作为复筛指标，再筛选出其中具有较高抗氧化活性的菌株，经分离得到所需的短双歧杆菌。
优选的，步骤(2)中MRS培养基为：如下重量份原料：蛋白胨10.0份，牛肉膏8.0份，酵母膏4.0份，乳糖20.0份，磷酸氢二钾2.0份，乙酸钠5.0份，硫酸镁0.2份，硫酸锰0.05份，L-半胱氨酸盐酸盐1.0份，柠檬酸三铵2.0份，吐温801.0份和琼脂20.0份，调节pH为6.0～6.5，加蒸馏水至1000mL，120-125℃灭菌15-25min制备得到。
一种所述的具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌的应用，将所述短双歧杆菌添加到用于修复皮肤紫外损伤和预防皮肤光老化的化妆品、护肤品或医药品中。
优选的，将所述短双歧杆菌添加到用于修复皮肤紫外损伤和预防皮肤光老化的化妆水、乳液、膏霜、面膜、精华液、粉底、粉底液、遮瑕霜、防晒霜、口服液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂或滴丸剂中。
优选的，所述化妆品、护肤品或医药品中还可添加辅料。
优选的，所述辅料为油脂、表面活性剂、多元醇类、保湿剂、消泡剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、润滑剂、乳化剂或粘合剂中的至少一种。
采用上述技术方案，试验结果显示本发明的短双歧杆菌具有修复紫外线引发的皮肤损伤及炎症的作用，能改善紫外线长期反复照射下造成的皮肤光老化现象。
附图说明
图1为不同乳酸菌抗氧化能力检测结果图；
图2为短双歧杆菌Bifidobacterium breve对细胞毒性的检测结果图；
图3为短双歧杆菌Bifidobacterium breve作用细胞ROS检测结果图；其中，图3-1为作用于人真皮成纤维细胞；图3-2为作用于角质形成细胞；
图4为短双歧杆菌Bifidobacterium breve作用人真皮成纤维细胞基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-3检测结果图；
图5为短双歧杆菌Bifidobacterium breve作用人真皮成纤维细胞胶原合成及交联程度检测结果图；其中，图5-1为I型、III型胶原蛋白含量的检测结果图；图5-2为羟脯氨酸含量的检测结果图；图5-3为透明质酸含量的检测结果图；
图6短双歧杆菌Bifidobacterium breve对紫外照射后小鼠炎症反应和脂质过氧化损伤影响的检测结果图；其中，图6-1为IL-1β、IL-6和TNF-α的含量检测结果图；图6-2为MDA、SOD和CAT含量检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
采集粪便样品，用无菌水溶解，梯度稀释，加入到灭菌的平板中，向55℃左右的MRS培养基加入过氧化氢溶液，使培养基中起始的过氧化氢浓度为0.5mmol/L，在平板上倾入培养基并混匀，MRS培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏8.0g，酵母膏4.0g，乳糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，L-半胱氨酸盐酸盐1.0g，柠檬酸三铵2.0g，吐温801.0g，琼脂20.0g，pH6.0～6.5之间，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌20min。挑选平板上菌落长势较好的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出具有过氧化氢耐受性的乳杆菌，以抗氧化性能即对DPPH自由基、ABTS自由基及羟基自由基的清除率作为复筛指标，实验结果如图1所示，筛选出具有较高抗氧化活性的菌株，经分离得到的菌株的在显微镜下观察呈棒槌状，锥型状，短小，较细，能发酵乳糖、葡萄糖等，产生乳酸和乙酸，将该菌16S rDNA序列与模式菌株进行比对，鉴定为短双歧杆菌，命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve，保藏单位代码：CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；检测结果为：存活；保藏日期为：2016年08月29日；保藏编号为：CGMCC No.12915。
实施例2
检测短双歧杆菌Bifidobacterium breve(简称为BBr60)对人真皮成纤维细胞及角质形成细胞增值活性的影响：
2.1菌液制备
自冻管接种BBr60到10mL的MRS培养基，并于37℃厌氧下静置培养20h。次日，取200μl培养菌液接种至10mL的MRS培养基(2％二次活化)，37℃厌氧下静置培养20h。取出2ml培养的菌液进行离心(13000rmp、1min)，PBS缓冲液细菌两次后，移除上清液，取1mL PBS对菌块进行悬浮，混合均匀后，测量OD600，调整菌数为1x1011cfu/mL，在95℃水浴10min，以备用。
2.2细胞培养
人真皮成纤维细胞或角质形成细胞37℃水浴复苏，置于含有20％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素DMEM培养基中，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
2.3细胞毒性评价
取对数生长期的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞，0.25％胰蛋白酶消化，充分吹打成单细胞悬液，以1×104/孔的浓度转接于无血清培养基接中。在37℃、5％CO2恒温培养箱中贴壁生长24h后，分别加入100μL含有1x1011cfu/mL、5x1010cfu/mL、1x1010cfu/mL、8x109cfu/mL、4x109cfu/mL、2x109cfu/mL、8x108cfu/mL、4x108cfu/mL的短双歧杆菌Bifidobacterium breve菌液，以不含药培养基作空白对照(每个浓度组设5个复孔)，置于CO2恒温培养箱中孵育24h，然后向每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡5min，确保完全混合。用酶联免疫检测仪在490nm处吸光值，重复测量三次，记录数据，以三次平均值计算结果。根据细胞活性检测结果选择出三组合适的药物浓度用于后续实验。
如图2所示，含有不同浓度BBr60的DMEM培养人真皮成纤维细胞或角质形成细胞24h后，通过MTT实验分析BBr60对人真皮成纤维细胞及角质形成细胞增值活性的影响。结果显示，一定浓度的BBr60会产生细胞毒性，促使细胞凋亡，当BBr60浓度小于等于8x109cfu/mL时，细胞活性随BBr60浓度的增加呈逐渐下降趋势，当浓度大于8x109cfu/mL时，细胞活性显著下降(p＜0.05)，细胞存活率小于80％。故实验选择BBr60浓度为8x109cfu/mL、2x109cfu/mL、8x108cfu/mL。
实施例3
检测BBr60对人皮肤成纤维细胞及角质形成细胞修复或预防作用：
3.1菌液培养
自冻管接种BBr60到10ml的MRS培养基，并于37℃厌氧下静置培养20h。次日，取200μl培养菌液接种至10ml的MRS培养基(2％二次活化)，37℃厌氧下静置培养20h。
3.2细胞培养
人真皮成纤维细胞或角质形成细胞37℃水浴复苏，置于含有20％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素DMEM培养基中，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
3.3实验分组
分为空白组、模型组、给药组。空白组：不经处理的DMEM培养基进行培养。模型组：不经处理的DMEM培养基进行培养，成纤维细胞接受UVA照射，角质形成细胞接受UVB照射。给药组：给予含不同浓度BBr60的DMEM培养基进行培养，成纤维细胞接受UVA照射，角质形成细胞接受UVB照射。以上各组细胞均设5个复孔。
3.4紫外照射
将对数生长期的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞按一定数量接种于6孔板，37℃、5％CO2恒温培养箱培养，生长至80％-90％融合时弃去培养皿内培养液，PBS清洗2遍后换以少量不含胎牛血清的DMEM覆盖细胞，放置在紫外线灯箱内，控制UVA和UVB灯管距离台面15cm，使用UVA和UVB分别对人真皮成纤维细胞或角质形成细胞进行辐射，平均照射功率12.7mW/cm，单次照射时间780S，剂量9.9J/cm，每日照射1次，连续照射7d，照射后换新的DMEM培养基继续培养24h，避光加入10μL WST-8染色液，37℃条件下孵育30min，用酶联免疫检测仪在450nm处吸光值，空白对照以等量的无细胞培养液与WST-8染色液混合，计算细胞存活率。
药物组加入100μL不同浓度的BBr60预处理4h，PBS清洗2遍。模型组及药物组放置在紫外线灯箱内，UVA和UVB灯管距离台面15cm，对照组放置在灯箱外相似环境下，照射完后弃去培养液，三组细胞换以DMEM(无血清)培养基，继续培养24h后检测光损伤指标。
对照组：不进行紫外照射；UVA：UVA照射(模型组)；给药组：8x109cfu/mL、2x109cfu/mL、8x108cfu/mL(不同浓度BBr60处理人真皮成纤维细胞)。
对照组：不进行紫外照射；UVB：UVB照射(模型组)；给药组：8x109cfu/mL、2x109cfu/mL、8x108cfu/mL(不同浓度BBr60处理角质形成细胞)。
3.5检测抗氧化损伤的指标
人真皮成纤维细胞或角质形成细胞通过DCFH-DA法测定细胞内ROS水平。各组细胞在培养24h后，以PBS清洗2遍，加入DCFH-DA孵育30min，用0.25％胰酶消化，离心(1000rmp，10min)，用PBS清洗2遍，离心并收集细胞。用PBS重悬细胞，用荧光显微镜进行观察。荧光最佳激发波长502nm，最佳发射波长530nm，测定荧光强度。
实验结果如图3所示，人真皮成纤维细胞和角质形成细胞在分别接受到UVA和UVB照射后细胞内ROS水平与对照组相比明显增高。在BBr60处理后的成纤维细胞和角质形成细胞内ROS水平与模型组相比明显下降，差异具有统计学意义(p<0.05)。
3.6检测BBr60对人真皮成纤维细胞的保护作用
3.6.1检测人真皮成纤维细胞内基质金属蛋白酶活性
人真皮成纤维细胞内基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-3活性采用ELISA法检测。各组细胞在培养24h后，收集上清液，定量后-80℃保存。参照说明书加入抗人MMP-1和MMP-3一抗、二抗孵育，根据标准曲线方程计算基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-3表达量。
实验结果如图4所示，人真皮成纤维细胞在接受到UVA照射后细胞内基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-3表达量明显增高。但经BBr60处理后再予紫外照射，人真皮成纤维细胞内基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-3表达减弱，当BBr60处理浓度为8x109cfu/mL、2x109cfu/mL时与模型组比对差异显著，具有统计学意义(p<0.05)。
3.6.2检测人真皮成纤维细胞胶原合成及交联程度
人真皮成纤维细胞分泌的I型、III型胶原、羟脯氨酸、透明质酸含量通过ELISA试剂盒进行测定。各组细胞在培养24h后，收集上清液，于-80℃冻存待测，对每组细胞进行0.4％台盼蓝染色计数，根据每孔细胞数换算成1x105个细胞所分泌的水平。按说明书严格操作，于酶标仪450nm处测定吸光值，根据标准曲线方程计算I型、III型胶原、羟脯氨酸、透明质酸含量。
实验结果如图5所示，人真皮成纤维细胞在接受到UVA照射后细胞内I型、III型胶原、羟脯氨酸、透明质酸含量相对于对照组显著性降低(p<0.05)，但经BBr60处理后再予紫外照射，细胞内I型、III型胶原、羟脯氨酸、透明质酸含量有所提高，当BBr60处理浓度为8x109cfu/mL、2x109cfu/mL时与模型组比对差异显著(p<0.05)。
3.7用于对光损伤修复作用的动物试验
3.7.1光老化动物模型建立
48只9周龄雄性ICR小鼠，体重控制为25～30g，于通风良好、卫生清洁的动物房内适应性饲养1周(温度：(22±2)℃，相对湿度：40％—70％，光照度：150～300lx，光照时间12h/天)。1周后随机分组(对照组：不接受紫外线照射，仅涂纯基质(甘油)；模型组：接受紫外线照射；给药组：在甘油中加入BBr60菌液，控制终浓度为8x109cfu/mL、2x109cfu/mL、8x108cfu/mL)。用***麻醉小鼠，暴露出背部1.0cm×1.0cm的无毛皮肤，之后根据生长情况适度修剪鼠毛。将模型组和给药组小鼠分别置于大小为3cm×6cm的长方形实验盒，裸露皮肤分别涂布纯基质和含BBr60的制剂，各药物均取0.1mL，涂布厚度为0.1cm；预处理15min后先后接受UVA和UVB照射(UVA剂量为1.55J/cm2、18min，UVB剂量为0.95J/cm2、11min)，照射高度30cm；小鼠身体其他部位用遮光板遮蔽。每日1次，连续7d。
3.7.2各项生化指标检测
照射结束后以20％尿酯麻醉处死小鼠，分离创面组织行以下操作：取部分组织，剪碎，按1g(组织)：9mL(生理盐水)的比例置入匀浆管中，制作10％组织匀浆，使细胞完全破碎，进行相关生化指标检测。(1)ELISA检测皮肤组织IL-1β、IL-6和TNF-α的含量：分别根据相应的ELISA试剂盒说明书操作说明处理皮肤组织样本，IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均测定450nm波长处的光密度值，根据BCA法所测蛋白浓度，计算每单位蛋白质的IL-1β、IL-6和TNF-α含量。(2)皮肤组织MDA、SOD和CAT含量测定：用改良微量硫代巴比妥酸(TBA)比色法，按小鼠MDA检测试剂盒说明书测定MDA含量。采用SOD和CAT检测试剂盒说明书处理样本，测定450nm波长处的D值，绘制标准曲线，计算标本中SOD和CAT含量。
实验结果如图6所示，长期慢性中长波紫外线照射可导致小鼠被照射皮肤组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量增加，而使用BBr60预处理皮肤能改善紫外线照射引起的皮肤组织中炎症因子含量的异常，当处理浓度为8x109cfu/mL、2x109cfu/mL时，相对于模型组具有统计学意义(p<0.05)。通过BBr60预处理皮肤可减轻紫外线照射引起的脂质过氧化反应，改善紫外线照射所导致的皮肤氧化应激。
实际使用时，可以将本发明的短双歧杆菌添加到用于修复皮肤紫外损伤和预防皮肤光老化的化妆品、护肤品或医药品中，例如：化妆水、乳液、膏霜、面膜、精华液、粉底、粉底液、遮瑕霜、防晒霜、口服液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂或滴丸剂等。在化妆品、护肤品或医药品中还可添加辅料，例如：油脂、表面活性剂、多元醇类、保湿剂、消泡剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、润滑剂、乳化剂或粘合剂等。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌，其特征在于：所述短双歧杆菌命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve，保藏编号为：CGMCCNo.12915。
2.一种如权利要求1所述的具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌的应用，其特征在于：将所述短双歧杆菌添加到用于修复皮肤紫外损伤和预防皮肤光老化的护肤品或医药品中。
3.根据权利要求2所述的具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌的应用，其特征在于：将所述短双歧杆菌添加到用于修复皮肤紫外损伤和预防皮肤光老化的化妆水、乳液、膏霜、面膜、精华液、粉底、遮瑕霜、防晒霜、口服液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂或滴丸剂中。
4.根据权利要求2所述的具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌的应用，其特征在于：所述护肤品或医药品中还添加有辅料。
5.根据权利要求4所述的具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用的短双歧杆菌的应用，其特征在于：所述辅料为油脂、表面活性剂、多元醇类、保湿剂、消泡剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、润滑剂、乳化剂或粘合剂中的至少一种。
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