CN111225974B - 新型肌肉骨骼***干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化而来的新型肌肉骨骼***干细胞。本发明的肌肉骨骼***干细胞可以容易地从人类胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞诱导，并且可以有效地分化成骨以及软骨、肌腱、肌肉，可以有效地用于预防或治疗各种肌肉骨骼***疾病。

Description

新型肌肉骨骼***干细胞
技术领域
本发明涉及具有分化成肌肉骨骼组织的能力的新型肌肉骨骼***干细胞及其制备方法。
背景技术
由肌肉、骨骼、关节等组成的肌肉骨骼***的疾病导致严重的活动受限及身体疼痛等。肌肉、骨骼、关节功能的退化是衰老的必然结果。作为因肌肉骨骼***功能退化而引起的常见疾病包括退行性关节炎、肌腱炎、骨折、扭伤及肌肉减少症等。近年来，由于改善了医疗保健，预期寿命得到延长，因此，患有肌肉骨骼***疾病的患者人数正在增加，并且不能实现由健康的骨骼肌保证的健康的衰老并且使生活质量恶化。
骨化(ossification)是骨形成的过程，已知通过两种方法：膜内骨化或软骨内骨化。膜内骨化作为间充质组织转化为骨骼的直接过程，在颅骨的骨骼内产生。另一方面，软骨内骨化在由聚集的间充质细胞形成软骨组织的过程之后，通过软骨组织转化为骨骼的过程产生。这种骨化过程对于脊椎动物的大多数骨骼形成是必需的。
另一方面，人类胚胎干细胞(hESCs，human embryonic stem cells)作为多能细胞，可以不受限制地生长，并且可以分化成所有细胞类型。人类胚胎干细胞是研究细胞水平上胚胎发育的非常有用的工具，也是细胞替代疗法的有用工具。人类胚胎干细胞可以分化成包括例如，骨骼及软骨的骨骼组织的特异性组织，这可以用于骨骼组织修复。
已知人类诱导性多能干细胞(hiPSCs，human induces pluripotent stem cells)是具有可以分化成任何细胞类型能力的多能干细胞。人类诱导性多能干细胞是可用于在细胞水平研究胚胎发育并作为细胞疗法引起关注的细胞。由于这些细胞的移植可以分化成骨骼组织，例如骨骼及软骨，因此它们可以有效地用于修复和治疗受损的骨骼组织。
间充质干细胞(MSCs，Mesenchymal stem cells)是自我更新的细胞，可以分化成成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞等间充质型细胞。间充质干细胞已在各种条件下用于临床试验，并已尝试用于外伤、骨骼疾病、作为骨髓移植的副作用的植入物抗宿主疾病(graftversus host disease)、心血管疾病、自身免疫性疾病、肝病等。但是，存在一个局限性，即，很难获得治疗应用所需的足够量的间充质干细胞。此外，间充质干细胞本身不会在没有预分化过程(predifferentiation process)的情况下，直接分化成这些组织，该过程不会在试管中预先通过生长因子或维生素将它们分化成骨骼、软骨和脂肪。已经指出，间充质干细胞具有通过刺激内源性干细胞而不是直接分化成包括肌肉骨骼细胞的间质组织来刺激内源性干细胞的间接功能(Stem Cells Transl Med.6(6)：1445-1451，2017)。
因此，在克服间充质干细胞的局限性的同时，对可在体内直接分化成包括软骨内骨化的骨骼、软骨、韧带、肌肉的细胞的研究需求也在增加。
上述被描述为背景技术的内容仅出于改善对本发明背景技术的理解的目的，并且不应被视为承认它们对应于本领域技术人员已知的现有技术。
发明内容
技术问题
本发明人通过确认如下的内容完成了本发明：可以从人类胚胎干细胞(hESC)或人诱导的多能干细胞(hiPSC)诱导人类肌肉骨骼***干细胞(hMSSC)，上述肌肉骨骼***干细胞可以通过软骨内骨化分化成骨骼，不仅可以分化成骨骼，还可以分化成软骨、肌腱、肌肉等肌肉骨骼组织。
因此，本发明的目的在于，提供用于诱导分化成肌肉骨骼***干细胞的分化诱导用培养基组合物。
本发明的再一目的在于，提供包括在上述培养基培养胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的步骤的肌肉骨骼***干细胞的制备方法。
本发明的另一目的在于，提供从胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化的肌肉骨骼***干细胞。
本发明的还有一目的在于，提供包含上述肌肉骨骼***干细胞的用于预防或治疗肌肉骨骼***疾病的药剂学组合物。
本发明的又一目的在于，提供上述肌肉骨骼***干细胞的筛选方法。
本发明的又一目及优点通过以下发明的详细说明、权利要求及附图更清楚。
解决问题的方案
根据本发明的一方面，本发明提供用于诱导分化成肌肉骨骼***干细胞(MSSC，musculoskeletal stem cell)的分化诱导用培养基组合物，上述肌肉骨骼***干细胞包含头蛋白(noggin)、白血病抑制因子(LIF，leukemia inhibitory factor)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，basic Fibroblast growth factor))、Wnt信号激活剂、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase)信号抑制剂以及转化生长因子-β/激活素/结节(TGF-β/activin/nodal)信号转导抑制剂。
本发明人通过确认如下的内容完成了本发明：可以从人类胚胎干细胞(hESC)或人诱导的多能干细胞(hiPSC)诱导肌肉骨骼***干细胞(hMSSC)，上述肌肉骨骼***干细胞可以通过软骨内骨化分化成骨骼，不仅可以分化成骨骼，还可以分化成软骨、肌腱、肌肉等肌肉骨骼组织。
在本发明中，术语“干细胞”是具有能够分化成各种身体组织的能力的未分化细胞，它们可分类成全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stemcell)、多能干细胞(multipotent stem cell)等。上述干细胞可以与前体细胞(precursorcell)、祖细胞(progenitor cells)等术语混用。在本发明中，干细胞可以是胚胎干细胞(ESC，embryonic stem cell)、诱导性多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stemcell)或间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)。因此，使用本发明的培养基组合物，可以使用胚胎干细胞、诱导性多能干细胞等诱导肌肉骨骼***干细胞的分化。
上述胚胎干细胞是指具有多能性的细胞，并且指包含能够发育成源自无转化增殖、无限增殖、自我繁殖及所有三种胚胎层的任何细胞的能力的胚胎干细胞的特性，但不限于此。
在本发明中，术语“肌肉骨骼***干细胞”不受限制地指可以分化成骨骼、软骨、肌腱、韧带及肌肉的细胞。
上述“分化”是指在细胞***增殖的过程中，结构或功能相互专门化的现象，即，为了执行分别赋予生物体的细胞、组织等任务，而其形态或功能改变。通常，是指一个相对简单的***分为两个或多个定性不同的部分***的现象。分化是指，例如，在个体产生中最初是同质的卵部分之间产生头部或躯干等的区分，或产生细胞或肌肉细胞或神经细胞等的区分等的最初几乎同质的某一生物***的部分之间产生质量差异，或作为其结果，分为可根据质量区分的部分或部分***的状态。
在本发明中使用的胚胎干细胞或诱导多能干细胞来源于人、牛、马、山羊、羊、狗、猫、小鼠、大鼠或鸟类等，优选来源于人。
本发明的Wnt信号激活剂优选但不限于SB216763(3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮)、肯帕罗酮(Kenpaullone；9-溴-7，12-二氢吲哚[3，2-d]-[1]苯并嗪-6(5H)-酮)、CHIR99021(9-溴-7，12-二氢-吡啶并[3'，2'：2，3]叠氮基[4，5-b]吲哚-6(5H)-酮)、CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮)、SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、H-89(5-异喹啉磺酰胺)、嘌呤胺(Purmorphamine；2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉代苯胺基)-9-环己基嘌呤)或IQ-1(2-(4-乙酰基-苯偶氮基)-2-[3，3-二甲基-3，4-二氢-2H-异喹啉-(1E)-亚烷基]-乙酰胺)。
本发明的细胞外信号调节激酶信号抑制剂优选但不限于AS703026(N-[(2S)-2，3-二羟丙基]-3-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-异烟碱酰胺)、AZD6244(6-(4-溴-2-氯苯胺基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺)、PD0325901(N-[(2R)-2，3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺)、ARRY-438162(5-[(4-溴-2-氟苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-羧酰胺)、RDEA119((S)-N-(3，4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-6-甲氧基苯基)-1-(2，3-二羟丙基)环丙烷-1-磺酰胺)、GDC0973([3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘阿米林)苯基]3-羟基-3-[(2S)-哌啶-2-基]-氮杂环丁烷-1-基-甲酮)、TAK-733((R)-3-(2，3-二羟丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯氨基)-8-甲基吡啶[2，3-d]嘧啶-4，7(3H，8H)-二酮)、RO5126766(3-[[3-氟-2-(甲基氨磺酰基氨基)-4-吡啶基]甲基]-4-甲基-7-嘧啶-2-单氧铬-2-酮)或XL-518([3，4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]苯基][3-羟基-3-[(2S)-2-哌啶基]-1-氮杂环丁烷基]甲酮)。
本发明的转化生长因子-β/激活素/结节(TGF-β/activin/nodal)信号转导抑制剂优选但不限于E-616452(2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1，5-萘啶)、A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-碳硫酰胺)或SB431542(4-[4-(1，3-苯并二恶唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)。
根据本发明的一实施例，将分别不包含作为上述培养基的组分的头蛋白、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、Wnt信号激活剂、细胞外信号调节激酶信号抑制剂及转化生长因子-β/激活素/结节信号转导抑制剂中的一种的情况下的分化能力与包含全部的情况进行比较，结果确认在缺乏上述成分中的任一种组分的情况下，不能完全分化成软骨(Acian blue)或骨骼(ALP及Alizarin red S)(图7，表3)。
并且，代替上述头蛋白，使用添加了条件培养基(Conditioned Media)(利用在完全培养基中将DMEM/F12置换为Knockout DMEM的培养基(由20％的Knockout SerumReplacement(Invitrogen，美国)、1mM的谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸(Invitrogen，美国)、0.1mM的β-巯基乙醇、0.1％的青霉素-链霉素、5mg/ml的牛血清白蛋白(bovine serumalbumin)补充的Knockout DMEM)培养CF1小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblasts)24小时后获得的培养上清液)的培养基，对分化能力进行比较，其结果确认，与使用上述条件培养基(Conditioned Media)的情况相比，使用头蛋白的本发明的培养基组合物使骨分化的趋势增加了十倍以上，并且分化速度加速了1周～2周。(表1及表2)。
根据本发明的再一方面，本发明提供包括在分化诱导为上述肌肉骨骼***干细胞的培养基组合物中培养胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的步骤的肌肉骨骼***干细胞的制备方法。
上述培养是在不改变培养基组成的情况下，培养5继代以上，优选为培养5继代至25继代，更优选为培养7继代至18继代。
根据本发明的一实施例，已确认由上述方法培养分化的肌肉骨骼***干细胞是通过从人类胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞开始用肌肉骨骼干细胞诱导培养基继代培养7继代以上而获得的具有稳定且相同形态特征的细胞，从7继代至17继代的10继代以上，以相似的形状生长，而在19继代之后染色老化标记β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，其结果呈阳性反应，由此可以确认老化已进行(图1a)。
根据本发明的另一方面，本发明提供使用诱导分化成上述肌肉骨骼***干细胞的培养基组合物制备的肌肉骨骼***干细胞。
根据本发明的还有一方面，本发明提供从胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化的肌肉骨骼***干细胞。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞具有如下的特征：
a)对于作为外胚层标记的巢蛋白(NES，Nestin)呈阳性；
b)对于作为肌源性卫星标记(myogenic satellite marker)的Pax7呈阳性；
c)对于作为中胚层标记的α-SMA呈阳性；
d)对于作为多能性标记的LIN28呈阴性；以及
f)对于作为间充质干细胞标记的CD90呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞还具有如下的特征：
对于作为间充质干细胞标记的CD271呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞还具有如下的特征：
对于作为多能性标记的DPPA4呈阳性。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞还具有如下的特征：
对于作为中胚层标记的T及结节(Nodal)呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞还具有如下的特征：
对于作为神经外胚层(neuroectoderm)标记的Pax6呈阳性。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞还具有如下的特征：
对于作为肠干细胞(intestinal stem cell)标记的LGR5呈阳性。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞还具有如下的特征：
对于作为软骨细胞(chondrocyte)标记的SOX9呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞还具有如下的特征：
对于作为成肌细胞(myoblast)标记的肌分化因子(MyoD)呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼***干细胞对于CD10、CD44、CD105、CD146和/或CD166呈阳性。
根据本发明的一实施例，可以确认，本发明的肌肉骨骼***干细胞没有观察到大部分的多能性标记的表达，但观察到DPPA4表达，且作为外胚层标记的巢蛋白呈阳性。并且，除了DES及作为初期中胚层标记的T及结节之外，大部分的中胚层标记呈阳性，且对大部分的内胚层标记呈阴性(图1c)。并且，为了研究人类肌肉骨骼***干细胞的特性，调查了间充质干细胞特异性细胞表面抗原的表达，其结果显示，在间充质干细胞标记中，CD44、CD51、CD73、CD105、CD146、CD166在人类肌肉骨骼***干细胞表达，另一方面，在间充质干细胞标记中，CD90及CD271不在人类肌肉骨骼***干细胞中表达。并且，作为血统细胞表面标记的CD2、CD3、CD7、CD8、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD31、CD34、CD56未表达，而作为pre-B细胞标记的CD10则表达了(图1d)。此外，作为分析各种***组织特异性标记表达的结果，作为中胚层标记的平滑肌肌动蛋白(α-SMA，alpha smooth muscle actin)、作为神经外胚层标记的Pax6、作为肌原性卫星标记(myogenic satellite marker)的Pax7及作为肠干细胞标记(intestinal stem cell marker)的LGR5等表达，作为软骨细胞标记(chondrocytemarker)的SOX9及作为成肌细胞标记(myoblast marker)的MyoD等未表达(图1f)。
根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼***干细胞分化成中胚层，但不分化成外胚层或内胚层。
根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼***干细胞具有分化成肌肉、骨骼、软骨、肌腱或韧带的特性。
根据本发明的一实施例，确认了在将本发明的肌肉骨骼***干细胞在间充质干细胞培养基(例如，间充质干细胞GM、间充质干细胞GM-CD等)培养并移植到肾脏内(kidneycapsule)或皮下的情况下，在肾脏内或皮下形成了典型的肌肉、脂肪、肌腱、骨骼、软骨(图3)。作为确认了上述分化的肌肉组织的结果，均分化成骨骼肌，且未分化成平滑肌，与体外(in-vitro)试验中未分化成脂肪不同地，在体内(in-vivo)试验中，还分化成脂肪。
根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼***干细胞具有不会分化成神经的特性。
根据本发明的一实施例，在神经分化培养基将上述肌肉骨骼***干细胞分化成神经细胞后，并使用神经细胞标记进行确认的结果，上述肌肉骨骼***干细胞没有分化成神经细胞的潜能(图2f)。
根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼***干细胞具有不会分化成内皮细胞的特性。
根据本发明的一实施例，在EC分化培养基(内皮生长培养基(endothelial growthmedium))中将上述肌肉骨骼***干细胞分化成内皮细胞，并使用内皮细胞标记进行确认的结果，上述肌肉骨骼***干细胞没有分化成内皮细胞的潜能(图2c及图2d)。
上述肌肉骨骼***干细胞于2018年10月10日作为保藏编号第KCLRF-BP-00460号保藏在韩国细胞系库。
根据本发明的又一方面，本发明提供包含上述肌肉骨骼***干细胞的用于预防或治疗肌肉骨骼***疾病的药剂学组合物。
根据本发明的又一方面，本发明提供包含上述肌肉骨骼***干细胞的细胞治疗剂。
根据本发明的又一方面，本发明提供包含上述肌肉骨骼***干细胞的用于预防或治疗肌肉骨骼***疾病的药剂学组合物的用途。
根据本发明的又一方面，本发明提供包括向患者给药上述肌肉骨骼***干细胞的步骤的肌肉骨骼***疾病的预防或治疗方法。
本发明的肌肉骨骼***疾病优选但不限于选自由骨质疏松症、骨软化症、成骨不全症(osteogenesis imperfecta)、骨质石化病(osteopetrosis)、骨硬化症(osteosclerosis)、佩吉特氏病(Paget's disease)、骨癌、关节炎、佝偻病、骨折、牙周疾病、节段性骨缺损、溶骨性疾病、原发性和继发性甲状旁腺功能亢进、骨肥大、退行性关节炎、膝盖骨关节炎、髋部骨关节炎、变形性踝关节病、变形性手关节病、变形性肩关节病、变形性肘关节病、膝盖软骨软化症、单纯性膝关节炎、剥脱性骨软骨炎、肱骨外上髁炎、肱骨内上髁炎、赫巴丁结节、布什尔结节、变形性拇指腕掌关节症、半月板损伤、椎间盘退变、十字韧带肱二头肌弯曲、韧带损伤、五十肩肌腱损伤、肩袖撕裂、钙化肌腱炎、肩膀冲动综合征、复发性脱位、习惯性脱位、衰老性肌病及肌营养不良组成组中的一种或多种。
本发明的药剂学组合物可以包含药学上可接受的载体。上述组合组中包含在药学上可接受的载体可包含通常用于制剂中的乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细定性纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油，但不限于此。除了上述成分以外，上述药剂学组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂等。
本发明的药剂学组合物可以口服或非口服给药。在非口服给药的情况下，可以通过静脉内注射、皮下注射、肌内注射、关节内注射、骨内注射、腹膜内注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺部给药及直肠内给药等来给药。并且上述组合物可以由活性物质可以迁移到靶细胞的任意装置来给药。
本发明的药剂学组合物的合适剂量可以根据配置方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病情、饮食状况、给药时间、给药途径、***速率及对反应响应等因素，以多种方式给药。以成人为基准，上述组合物的优选剂量为102～1010细胞/kg范围内。术语“药学有效量”是指足以预防或治疗肌肉骨骼***疾病的量。
本发明的组合物可由本领域技术人员根据其容易实施的方法使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制，从而以单位剂量形式制备或通过掺入多剂量容器内来制备。在此情况下，剂型可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳剂形式，或者也可以是提取物、散剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且可以进一步包含分散剂或稳定剂。并且，上述组合物可以作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂组合给药，与现有治疗剂依次或同时给药。并且，可以一次给药或在必要时另外给药。
在本发明中，术语“细胞治疗剂”作为从人分离、培养并通过特殊操作而制备的细胞及组织，是用于治疗、诊断及预防目的药物(美国FDA规定)，并且是为了恢复细胞或组织功能，通过在体外增殖、筛选或由其他方法改变活体自身、同种或异种细胞的生物学特性的一系列行为，来以治疗、诊断及预防的目的使用的药物。
在本发明中，术语“预防”是指通过给药本发明的组合物或细胞治疗剂来抑制肌肉骨骼***疾病或延迟肌肉骨骼***疾病的进展的所有行为。
在本发明中使用的术语“治疗”是指通过给药本发明组合物或细胞治疗剂来使肌肉骨骼***疾病好转或有利地改变的所有行为。
本发明的药剂学组合物或细胞治疗剂可用于人或动物。
为了预防及治疗肌肉骨骼疾病，本发明的药剂学组合物或细胞治疗剂可以单独或与手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法、生物反应调节剂、植入物、人工关节或人工软骨等的***、其他再生治疗等方法结合使用。
根据本发明的又一方面，本发明提供肌肉骨骼***干细胞的筛选方法。
根据本发明的优选实例，本发明包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
a)对于作为外胚层标记的巢蛋白(NES，Nestin)呈阳性；
b)对于作为肌源性卫星标记(myogenic satellite marker)的Pax7呈阳性；
c)对于作为中胚层标记的α-SMA呈阳性；
d)对于作为多能性标记的LIN28呈阴性；以及
f)对于作为间充质干细胞标记的CD90呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
对于作为间充质干细胞标记的CD271呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
对于作为多能性标记的DPPA4呈阳性。
根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
对于作为中胚层标记的T及结节(Nodal)呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
对于作为神经外胚层(neuroectoderm)标记的Pax6呈阳性。
根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
对于作为肠干细胞(intestinal stem cell)标记的LGR5呈阳性。
根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
对于作为软骨细胞(chondrocyte)标记的SOX9呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
对于作为成肌细胞(myoblast)标记的肌分化因子(MyoD)呈阴性。
根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选对于CD10、CD44、CD105、CD146和/或CD166呈阳性的细胞的步骤。
使用本发明的筛选方法可以容易地筛选出有效分化成骨骼、软骨、肌腱、韧带、肌肉等的肌肉骨骼***干细胞。
发明的效果
本发明的特征及优点概括如下：
(i)本发明提供衍生自胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的肌肉骨骼***干细胞。
(ii)并且，本发明提供肌肉骨骼***干细胞的制备方法，上述肌肉骨骼***干细胞的制备方法包括在包含头蛋白、白血病抑制因子及碱性成纤维细胞生长因子等的培养基中培养胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的步骤的肌肉骨骼***干细胞的制备方法。
(iii)本发明的肌肉骨骼***干细胞可以容易地从人类胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞诱导，并且不仅有效分化成骨骼，还可以有效分化成软骨、肌腱、肌肉，从而可有效地用于预防或治疗肌肉骨骼***疾病。
附图说明
图1示出从人类胚胎干细胞分化的人类肌肉骨骼***干细胞的特征。图1a为示出通过肌肉骨骼干细胞诱导培养基继代培养人类胚胎干细胞的7继代至19继代为止的细胞形状的变化的照片。图1b示出通过细胞免疫荧光法观察在人类肌肉骨骼***干细胞中的多能性标记OCT4、NANOG、SOX2、LIN28的表达结果。图1c为通过转录组测序(RNA-sequencing)分别确认两次在人类胚胎干细胞、人骨髓间充质干细胞及7继代、17继代中的人类肌肉骨骼***干细胞中多能、外胚层、中胚层及内胚层标记的表达的结果。图1d示出为了研究人类肌肉骨骼***干细胞的特性，通过流式细胞分析仪测量细胞表面抗原的表达的结果。图1f示出为了研究人类肌肉骨骼***干细胞的特性，通过细胞免疫荧光法分析各种系的细胞特异性标记表达的结果。图中，DAPI是被染色的核。图中，蓝色三角形标识指β-半乳糖苷酶阳性细胞(β-galactosidase positive cell)。
图2示出将人类肌肉骨骼***干细胞的试管内分化能力与其他种类细胞进行比较的数据。图2a示出对人骨髓间充质干细胞及人类肌肉骨骼***干细胞的试管内骨骼、软骨、脂肪分化能力进行比较的结果。图2b示出通过对作为人类骨骼肌细胞特异性标记的MYH9的细胞免疫荧光法确认肌肉骨骼***干细胞具有分化成骨骼肌的潜力的结果。C2C12用作骨骼肌细胞的阳性对照组。图2c及图2d示出通过对内皮细胞特异性标记CD31和VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)的细胞免疫荧光法确认人类肌肉骨骼***干细胞没有分化成内皮细胞的潜力的结果。图2f示出通过对神经细胞特异性标记微管相关蛋白(MAP2)的细胞免疫荧光法确认人类肌肉骨骼***干细胞没有分化成神经细胞的潜力的结果。作为阳性对照组使用从H9人类胚胎干细胞分化的神经干细胞(neural stem cells)。
图3示出在体内测量人类肌肉骨骼***干细胞的分化潜能的结果。图3a的a部分示出确认了在将人类肌肉骨骼***干细胞移植到肾脏内的情况下，苏木精—伊红染(H&E)染色形成了典型的肌肉、脂肪、肌腱的结果。图3a的b部分示出确认了在将人类肌肉骨骼***干细胞移植到肾脏内的情况下，通过对作为肌肉特异性标记的磷酸化肌球蛋白轻链(pMLC)、作为脂肪特异性标记的过氧化物酶体增殖激活性受体(PPAr，PPARgamma)，作为韧带特异性标记的Scx的组织免疫荧光法，分化成肌肉、脂肪、肌腱细胞的结果。人类白细胞抗原(hLA)是为了作为人细胞特异性标记显示人源细胞而染色的结果。图3b的a部分为通过微型CT扫描出在人类肌肉骨骼***干细胞的肾脏内移植部分中形成骨骼的结果。图3b的b部分及图3b的c部分示出通过苏木精—伊红染(H&E)及五色组织化学染色确认了形成骨骼的结果。图3b的d部分为通过组织免疫荧光法从成骨组织内部的细胞确认了作为人细胞标记的人类白细胞抗原(hLA，human leukocyte antigen)、作为骨标记的成骨相关转录因子(Osx，osterix)、Runx2、牙本质基质蛋白(DMP1)，骨钙蛋白(OCN，osteocalcin)、作为血管标记的vWF表达方式的结果。图3c示出在将人类肌肉骨骼***干细胞移植到皮下的情况下，作为分化成软骨细胞的结果，通过苏木精—伊红染(H&E)及甲苯胺蓝免疫组织化学染色确认了形成软骨的结果。并且，通过组织免疫荧光法还确认了作为软骨标记的胶原蛋白II(ColII，collagen II)的表达。
图4为确认了人类肌肉骨骼***干细胞对骨折恢复的效果的结果。图4a为示出在对骨折部位移植人骨髓间充质干细胞的情况下，小鼠体内细胞形成了骨骼而不是基于人骨髓间充质干细胞的结果。图4a的a部分为在对骨折部位移植人骨髓间充质干细胞后，在第二周、第四周、第六周后拍摄的显微电子计算机断层扫描(MicroCT)。图4a的b部分为包含移植了人骨髓间充质干细胞的骨折部位的股骨的苏木精—伊红染(H&E)组织化学染色结果。图4a的c部分为放大了图4a的b部分的红色正方形部位的结果。图4a的d部分为通过对作为骨细胞标记的Runx2及作为人细胞标记的人类白细胞抗原的组织免疫荧光法确认所移植的人骨髓间充质干细胞未分化成骨细胞的结果。图4b为示出在移植人类肌肉骨骼***干细胞的情况下，与上述人细胞的情况不同地，通过人类肌肉骨骼***干细胞的分化形成骨的结果。图4b的a部分为在对骨折部位移植人类肌肉骨骼***干细胞后，在第二周、第四周、第六周后拍摄的显微电子计算机断层扫描(MicroCT)。图4b的b部分为包含移植了人类肌肉骨骼***干细胞的骨折部位的股骨的苏木精—伊红染(H&E)组织化学染色结果。图4b的c部分为放大了图4b的b部分的红色正方形部位的结果。图4b的d部分为通过对作为骨细胞标记的Runx2及作为人细胞标记的人类白细胞抗原的组织免疫荧光法确认所移植的人类肌肉骨骼***干细胞分化成骨细胞的结果。
图5为确认人类诱导性多能干细胞是否也与人类胚胎干细胞相同地分化成上述人类肌肉骨骼***干细胞的结果的图。图5a为通过细胞免疫荧光法在从人类诱导性多能干细胞分化的人类肌肉骨骼***干细胞中确认作为多能性标记的Oct4、Nanog、Sox2及Lin28的表达水平的结果的图。图5b为通过流式细胞分析仪在从人类诱导性多能干细胞分化的人类肌肉骨骼***干细胞中确认特异性细胞表面抗原的表达的结果的图。图5c为在从人类诱导性多能干细胞分化的人类肌肉骨骼***干细胞重确认向试管内骨骼、软骨、脂肪的分化能力的结果的图。图5d为示出在骨骼肌分化培养基培养从人类诱导性多能干细胞分化的人类肌肉骨骼***干细胞，从而在分化成骨骼肌后，对作为骨骼肌标记的MYH9进行细胞免疫荧光法的结果的图。
图6为示出通过流式细胞分析仪对由CM培养基和人类肌肉骨骼***干细胞诱导培养基诱导的人类肌肉骨骼***干细胞中CD44的表达量进行比较的结果的图。
图7为示出在缺乏人类肌肉骨骼***干细胞培养基的成分中的一部分成分的情况下，通过软骨或骨分化趋势变化结果确认了可确认是否软骨分化的阿尔辛蓝(Acian blue)染色及可确认是否骨分化的碱性磷酸酶(ALP)及茜素红S(Alizarin red S)的染色结果的图。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，对于本领域技术人员而言显而易见的是，根据本发明的要旨，本发明的范围不受这些实施例限制。
实施例
实验材料及实验方法
实施例1.实验动物
所有Balb/c-nude背景的7周龄至10周龄的小鼠(20g至24g)均购自Orient bio(韩国城南)。所有动物相关实验均按照全北大学动物管理及使用委员会的指导进行。将动物保持在受控温度(21℃至24℃)及12：12小时的敏感循环环境下，并使其自由饮水和进食。
实施例2.1.诱导从人类胚胎干细胞分化成人类肌肉骨骼***干细胞
H9人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells)购自WiCell(美国密歇根州麦迪逊)。人类胚胎干细胞在通过丝裂霉素C处理停止细胞***的CF1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF，mouse embryonic fibroblast)的基础营养细胞上进行培养。人类胚胎干细胞培养基由添加了20％的血清替代物(KnockOut Serum Replacement，以下标记为KSR，Invitrogen，美国)、1mM的谷氨酰胺(Invitrogen，美国)、1％的非必需氨基酸(Invitrogen，美国)、0.1mM的β-巯基乙醇(Invitrogen，美国)以及0.1％的青霉素/链霉素(Invitrogen，美国)以及15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(R&D Systems，美国)的DMEM/F12(Invitrogen，美国)制备。
作为用于诱导人类胚胎干细胞分化成人类肌肉骨骼***干细胞(humanmuscloskeletal stem cells)培养基，使用包含如下组成成分的培养基(以下，称为“肌肉骨骼***干细胞培养基”)诱导分化。
1)250ng/ml的人类头蛋白(KOMA Biotech，韩国)，
2)20ng/ml的人类白血病抑制因子(KOMA Biotech，韩国)，
3)15ng/ml的碱性(basic)成纤维细胞生长因子(FGF，Fibroblast growthfactor)(R&D Systems，美国)(FGF2信号激活剂)，
4)3μM的CHIR99021(Cayman，美国)(Wnt信号激活剂)，
5)1μM的PD0325901(Cayman，美国)(细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulated kinase)信号抑制剂)，
6)10μM的SB431542(Tocris，英国)(转化生长因子-β/激活素/结节(TGF-β/activin/nodal)信号抑制剂)，
7)其他：由10％的knockout serum replacement(Invitrogen，美国)、1％的N2补充剂(supplement)(Gibco，美国)、2％的B27补充剂(Gibco，美国)、1％的非必需氨基酸(Gibco，美国)、43％的DMEM/F12(Gibco，美国)、43％的Neurobasal(Gibco，美国)、1mM的谷氨酰胺、0.1mM的β-巯基乙醇、0.1％的青霉素-链霉素及5mg/ml的牛血清白蛋白(Gibco，美国)等组成。
为了提高上述人类胚胎干细胞的生存能力，将蛋白相关卷曲螺旋激酶(ROCK，Rho-associated coiled-coil kinase)抑制剂(Y-27632，10μM，Calbiochem，德国)及蛋白激酶C(PKC，protein kinase C)抑制剂(Go6983，2.5μM，Sigma，美国)处理24小时后，将用胰酶替代物(TrypLE)(Life technology，美国)处理而使胰蛋白酶化(trypsinized)的人类胚胎干细胞在涂敷有玻连蛋白+玻明胶(1ng/ml，Sigma，美国)的培养皿中使用上述人类肌肉骨骼***干细胞培养基培养至7继代，从而诱导向肌肉骨骼***干细胞的细胞分化。确认了5继代以上开始上述分化的肌肉骨骼***干细胞细胞株具有稳定的相同形态特征，并于2018年10月10日在韩国细胞系库中保藏培养了10继代的上述细胞株，并授予第KCLRF-BP-00460号的保藏编号。
实施例2.2.从人类诱导性多能干细胞向人类肌肉骨骼***干细胞分化的诱导
人类诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells)是通过Hasegawa等人开发的方法将仙台病毒(sendai virus)作为介导的OCT4、KLF4、SOX2及cMYC基因导入BJ成纤维细胞(fibroblast)(
Figure BDA0002277923930000171
CRL2522TM)而成的(Fusaki et al.，2009，PNAS 85，348-362)。人类胚胎干细胞在通过丝裂霉素C处理停止细胞***的CF1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF，mouse embryonic fibroblast)的基础营养细胞上进行培养。人类胚胎干细胞培养基由添加了20％的血清替代物(KnockOut Serum Replacement，以下标记为KSR，Invitrogen，美国)、1mM的谷氨酰胺(Invitrogen，美国)、1％的非必需氨基酸(Invitrogen，美国)、0.1mM的β-巯基乙醇(Invitrogen，美国)以及0.1％的青霉素/链霉素(Invitrogen，美国)以及15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(R&D Systems，美国)的DMEM/F12(Invitrogen，美国)制备。
作为用于诱导人类胚胎干细胞分化成人类肌肉骨骼***干细胞(humanmuscloskeletal stem cells)培养基，使用包含如下组成成分的培养基(以下，称为“肌肉骨骼***干细胞培养基”)诱导分化。
1)250ng/ml的人类头蛋白(KOMA Biotech，韩国)，
2)20ng/ml的人类白血病抑制因子(KOMA Biotech，韩国)，
3)15ng/ml的碱性(basic)成纤维细胞生长因子(FGF，Fibroblast growthfactor)(R&D Systems，美国)(FGF2信号激活剂)，
4)3μM的CHIR99021(Cayman，美国)(Wnt信号激活剂)，
5)1μM的PD0325901(Cayman，美国)(细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulated kinase)信号抑制剂)，
6)10μM的SB431542(Tocris，英国)(转化生长因子-β/激活素/结节(TGF-β/activin/nodal)信号抑制剂)，
7)其他：由10％的knockout serum replacement(Invitrogen，美国)、1％的N2补充剂(supplement)(Gibco，美国)、2％的B27补充剂(Gibco，美国)、1％的非必需氨基酸(Gibco，美国)、43％的DMEM/F12(Gibco，美国)、43％的Neurobasal(Gibco，美国)、1mM的谷氨酰胺、0.1mM的β-巯基乙醇、0.1％的青霉素-链霉素及5mg/ml的牛血清白蛋白(Gibco，美国)等组成。
为了提高上述人类胚胎干细胞的生存能力，将蛋白相关卷曲螺旋激酶(ROCK，Rho-associated coiled-coil kinase)抑制剂(Y-27632，10μM，Calbiochem，德国)及蛋白激酶C(PKC，protein kinase C)抑制剂(Go6983，2.5μM，Sigma，美国)处理24小时后，将用胰酶替代物(TrypLE)(Life technology，美国)处理而使胰蛋白酶化(trypsinized)的人类胚胎干细胞在涂敷有玻连蛋白+玻明胶(1ng/ml，Sigma，美国)的培养皿中使用上述肌肉骨骼***干细胞培养基培养至7继代，从而诱导向人类肌肉骨骼***干细胞的细胞分化。确认了5继代以上开始上述分化的肌肉骨骼***干细胞细胞株具有稳定的相同形态特征。
实施例3.组织化学染色
如实施例10.1及实施例10.2所示，将在实施例2.1分化的人类肌肉骨骼***干细胞注射到Balb/c-nude皮下及肾脏，将分化的试样在2％的多聚甲醛(PFA)(Wako，日本)，在4℃的温度下固定过夜。用于了解是否分化成骨骼的试样在PBS(pH 7.2)中的0.4M的乙二胺四乙酸(EDTA)，在4℃的温度下去除石灰2周。之后，依次使用乙醇和二甲苯脱水，包埋在石蜡中，并切成5μm的厚度。用苏木精—伊红染(H&E)及Modified Movat’s pentachrom(Cosmobio，日本)染色切面。
实施例4.转录组测序(RNA-sequencing)
使用取试剂(Trizol reagent)(Invitrogen，美国)从H9人类胚胎干细胞、人间充质干细胞(hMSCs，Human Mesenchymal Stem Cells，Lonza，瑞士)及实施例2.1的人类肌肉骨骼***干细胞等中提取核糖核酸(RNA)。核糖核酸质量(quality)通过Agilent 2100生物分析仪(bioanalyser)及核糖核酸6000纳芯片(Nano Chip)(Agilent Technologies，美国)进行评估，并通过ND-2000分光光度计(spectrophotometer)(Thermo Inc.，美国)进行定量。使用SENSE 3’mRNA-Seq Library Prep Kit(Lexogen Inc.，Australia)构建了用于转录组测序的核糖核酸文库。通过NextSeq 500(Illumina Inc.，美国)进行转录组测序。用Bowtie2 version 2.1.0对SENSE 3’mRNA-Seq reads进行对齐(alignment)。使用Rversion 3.2.2.内的EdgeR将基因表达差异定为BIOCONDUCTOR version。读取计数(Readcounts)数据用Genowiz version 4.0.5.6(Ocium Biosolutions，美国)进行处理。
实施例5.免疫荧光染色
本说明书中所说明的“细胞免疫荧光染色”根据以下方法进行。
为了用免疫荧光染色细胞，将细胞固定在4％的多聚甲醛，用0.5％的Triton X-100透过后，磷酸盐缓冲液(PBS)内的10％的正常山羊(normal goat)、正常兔(normalrabbit)或胎牛血清(fetal bovine serum)阻断。用对于Tuj1(Covance，美国)、α-smoothmuscle(α-SMA，Sigma，美国)、同源域蛋白(Nanog)(Santa Cruz，美国)、Oct3/4(SantaCruz，美国)、Sox2(Santa Cruz，美国)、CD31(DAKO，日本)、血管内皮钙黏蛋白(vascularendothelial-cadherin)(R&D，美国)、MYH9(Santa Cruz，美国)、HNK-1(Santa Cruz，美国)及MAP-2(Santa Cruz，美国)的一抗，在4℃的温度下，对试样染色过夜。之后，用二抗AlexaFluor488-山羊抗小鼠(goat anti-mouse)IgG、Alexa Fluor 594-驴抗兔(donkey anti-rabbit)IgG、Alexa Fluor 488-驴抗兔(donkey anti-rabbit)IgG及Alexa Fluor 594-驴抗小鼠(donkey anti-mouse)IgG(Invitrogen，美国)染色细胞。用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，4，6-diamidino-2-phenylindole)染色细胞核。使用Olympus IX71荧光显微镜和MetaMorph微软(Molecular Devices，美国)获得图像。
本说明书中所说明的“组织免疫荧光染色”根据以下方法进行。
用PBS内4％的PFA(Wako，日本)将组织在4℃的温度下固定过夜。用莫氏(Morse’)溶液从所有试样中去除石灰。之后，依次使用乙醇和二甲苯对试样进行脱水，用石蜡包埋(Leica Biosystems，德国)后，以5μm的厚度切割试样。将组织切面在3％的过氧化氢中阻断15分钟后，与一抗一同在4℃的温度下培养过夜。在切面处理的一抗如下：对HLA class I的小鼠单克隆抗体(Abcam，英国)、对Collagen Type II的山羊多克隆抗体(Santacruz，美国)、对骨钙素(Osteocalcin)的兔多克隆抗体(Santacruz，美国)、转录因子(Osterix)(Abcam，美国)、磷酸化肌球蛋白轻链(pMLC，phospho-myosin light chain)(Abcam，美国)、Scleraxis(antibodies-online，美国)、过氧化物酶体增殖激活性受体(PPAr，PPARgamma)(Santacruz，美国)、Runx2(Novus，美国)、牙本质基质蛋白(Santacruz，美国)、血管性血友病因子(vWF)(Santacruz，美国)及骨硬化蛋白(Sclerostin)(Santacruz，美国)。所使用的二抗为Alexa 555(Invitrogen，美国)及Alexa 488(Invitrogen，美国)IgG。用TO-PRO3(Invitrogen，美国)对照染色免疫染色的切面，以突出细胞核。用Leica DM 5000显微镜(Leica Microsystems，德国)或共聚焦显微镜(LSM510；Carl Zeiss，德国)捕获用荧光标记的组织切面，并用Zen软件进行确认。
实施例6.流式细胞分析
将实施例2.1及实施例2.2的人类肌肉骨骼***干细胞用胰蛋白酶/EDTA处理以分离单细胞悬浮液后，通过PBS内的2％的BSA阻断非特异性结合后，在缓冲溶液[1XPBS、1％的BSA及0.01％的叠氮化钠]内与对Sca、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD31、CD34、CD44、CD45、CD51、CD56、CD73、CD90、CD105、CD146、CD166、CD235a、CD271的单克隆抗体(BD Biosciences，美国)反应并洗涤后，用Alexa Fluor 488secondary mouse-IgGs(Invitrogen，美国)反应细胞并洗涤后，使用流式细胞分析仪(FACStar PlusFlowcytometer，BD Biosciences，美国)进行分析。正常小鼠IgGs(BD Biosciences，美国)用作阴性对照组。
实施例7.1.人间充质干细胞(hMSCs，Human Mesenchymal Stem Cells)及人类肌 肉骨骼***干细胞在体外(in vitro)向成骨细胞的分化
为了将实施例2.1及实施例2.2的人类肌肉骨骼***干细胞分化成成骨细胞，将细胞在成骨分化培养基(
Figure BDA0002277923930000211
Osteogenesis Differentiation Kit，Lifetechnology，美国)内，在37℃、5％的CO2的条件下，培养14天。为了观察骨形成，进行了碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining)(Roche，瑞士)及茜素红S(alizarin redS)(Sigma，美国)染色。人骨髓间充质干细胞(Lonza，瑞士)也以与上述方法相同的方法分化成成骨细胞，并进行比较。
实施例7.2.人间充质干细胞(hMSCs，Human Mesenchymal Stem Cells)及人类肌 肉骨骼***干细胞在体内(in vitro)向脂肪细胞的分化
为了将实施例2.1及实施例2.2的人类肌肉骨骼***干细胞分化成脂肪细胞，将细胞在脂肪形成分化培养基(
Figure BDA0002277923930000212
adipogenesis Differentiation Kit，Lifetechnology，美国)内，在37℃、5％的CO2的条件下，培养14天。为了观察脂肪生成，染色油红O(oil red O)(Sigma，美国)。人骨髓间充质干细胞(Lonza，瑞士)也以与上述方法相同的方法分化成脂肪细胞，并进行比较。
实施例7.3.人间充质干细胞(hMSCs，Human Mesenchymal Stem Cells)及人类肌 肉骨骼***干细胞在体外向软骨细胞的分化
为了将实施例2.1及实施例2.2的人类肌肉骨骼***干细胞分化成软骨细胞，将细胞重悬于软骨形成培养基(
Figure BDA0002277923930000221
chondrogenesis Differentiation Kit，Lifetechnology，美国)后，再次离心。为了形成微团(micromass)，将颗粒以1×105活细胞/μl重悬于分化培养基，在未吸附的96-孔板的中央点滴5μl的细胞溶液并进行接种。微团在高湿度条件下培养2个小时后，在培养容器内添加加热的软骨形成培养基，并在5％的CO2、37℃条件的培养基内进行培养。每3-4天再喂料(re-feeded)。培养14天后，将软骨生成颗粒用阿尔辛蓝(Alcian blue)染色。人骨髓间充质干细胞(Lonza，瑞士)也以与上述方法相同的方法分化成软骨细胞，并进行比较。
实施例8.1.人类肌肉骨骼***干细胞在体内分化成内皮细胞的能力
确认了实施例2.1的人类肌肉骨骼***干细胞是否分化成内皮细胞(ECs，endothelial cells)。用EC分化培养基(endothelial growth medium(EGM)-2(Lonza，Walkersville，MD，美国)内的50ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF，vascular endothelialgrowth factor：ProSpec，Rehovot，以色列)及10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor；ProSpec，Rehovot，以色列)培养并分化人类肌肉骨骼***干细胞6天。进行细胞免疫荧光染色，以确认是否分化。
实施例8.2.人类肌肉骨骼***干细胞的在体内分化成骨骼肌细胞的能力
确认了实施例2.1及实施例2.2的人类肌肉骨骼***干细胞是否分化成骨骼肌细胞(skeletal muscle cells)。在由基质胶(matrigel)涂敷的盖玻片(coverslip)诱导性多能干细胞上，用骨骼肌分化培养基(包含2％的B27的DMEM)培养并分化人类肌肉骨骼***干细胞2周。进行细胞免疫荧光染色，以确认是否分化。
实施例9.对于人类肌肉骨骼***干细胞在体内分化成神经细胞的诱导
为了分化成神经细胞，将实施例2.1的人类肌肉骨骼***干细胞接种在涂敷有聚鸟氨酸和层粘连蛋白的培养皿。2天后，将培养基更换为神经分化培养基(包含2％的B27、2mM的GlutaMAX及抗生剂的培养基(Neurobasal medium))。在分化的第七天，每天添加0.5mM的二丁基环磷酸腺苷(dibutyl cAMP)(Sigma，美国)，持续3天。为了用作对照组，以与上述相同的方法，将从H9人类胚胎干细胞分化的人类神经干细胞(neural stem cells)(Gibco，美国)分化成神经细胞。进行细胞免疫荧光染色，以确认是否分化。
实施例10.1.人类肌肉骨骼***干细胞在小鼠肾脏内的分化能力
为了测量实施例2.1的人类肌肉骨骼***干细胞在小鼠肾脏内的分化能力，在间充质干细胞GM-CD(Lonza，瑞士)培养基培养人类肌肉骨骼***干细胞2继代-5继代，并收集为单细胞后，在琼脂糖胶孔(agarose gel well)中，用DMEM+20％FBS培养人类肌肉骨骼***干细胞(2×105cells)2天，以制备细胞凝集，并移植到Balb/c裸鼠的肾脏内(kidneycapsule)。移植4周后，进行了组织化学染色和组织免疫荧光染色。
实施例10.2.人类肌肉骨骼***干细胞在小鼠皮下的分化能力
为了测量实施例2.1的人类肌肉骨骼***干细胞在小鼠皮下的分化能力，用间充质干细胞GM-CD(Lonza，瑞士)培养基培养人类肌肉骨骼***干细胞2继代-5继代，并收集为单细胞后，将人类肌肉骨骼***干细胞(2×105cells)放置于添加了1μg/ml的透明质酸(hyaluronic acid)(Sigma，美国)的纤维蛋白胶(fibrin glue)(
Figure BDA0002277923930000241
greencross，韩国)，并移植到Balb/c裸鼠的皮下。移植4周后，进行了组织化学染色和组织免疫荧光染色。
实施例11.1.使用人骨髓间充质干细胞的骨形成试验
为了在股骨模型中分析人骨髓间充质干细胞的骨形成，用间充质干细胞GM-CD(Lonza，瑞士)培养基培养人骨髓间充质干细胞(Lonza，瑞士)7继代，并收集为单细胞后，将细胞吸收到切成1mm×1mm的胶原膜(SK bioland，Korea)。在6周龄的Balb/c-裸鼠中，用1mm左右的钻头(Bosch professional，德国)在一侧股骨钻孔后，将胶原膜所包含的人骨髓间充质干细胞***到小鼠的骨折部位。每2周麻醉小鼠后，使用显微电子计算机断层扫描(Micro-CT)(Skyscan 1076，Antwerp，比利时)获得骨折部位的图像。6周后进行组织化学染色和组织免疫荧光染色。
实施例11.2.使用人类肌肉骨骼***干细胞的骨形成试验
为了在股骨模型中分析人类肌肉骨骼***干细胞的骨形成，用人类肌肉骨骼***干细胞GM-CD(Lonza，瑞士)培养基培养实施例2.1的人类肌肉骨骼***干细胞(Lonza，瑞士)2继代-5继代，并收集为单细胞后，将细胞吸收到切成1mm×1mm的胶原膜(SK bioland，Korea)。在6周龄的Balb/c-裸鼠中，用1mm左右的钻头(Bosch professional，德国)在一侧股骨钻孔后，将胶原膜所包含的人类肌肉骨骼***干细胞***到小鼠的骨折部位。每2周麻醉小鼠后，使用显微电子计算机断层扫描(Micro-CT)(Skyscan 1076，Antwerp，比利时)获得骨折部位的图像。6周后进行组织化学染色和组织免疫荧光染色。
实施例12.显微电子计算机断层扫描(micro CT)
使用显微电子计算机断层扫描(Skyscan 1076，Antwerp，比利时)扫描实施例10.1中进行的人类肌肉骨骼***干细胞的肾脏内移植部分上生成的骨部位，从而获得三维重建的电子计算机断层扫描(CT，computed tomography)图像。之后，使用图像采集卡将数据数字化，使用综合TeX存档网络(CTAN)地形重建软件(Comprehensive TeX Archive Network(CTAN)topographic reconstruction software)将所获得的图像传输到计算机。
实施例13.对scx、Runx2、MYH9的信使核糖核酸(mRNA)表达量进行测定
根据制造商的方案，使用500μL的Trizol(Life Technologies，美国)提取实施例2.1的人类肌肉骨骼***干细胞的肾脏内植入物的核糖核酸(RNA)。对人类肌肉骨骼***干细胞的肾脏内植入物处理脱氧核糖核酸酶(DNAse)(RQ1 DNase，Promega，美国)后，通过Superscript III RT(Life Technologies，美国)的第一链cDNA合成方案，并使用寡聚体(T)及无规六聚体，将500ng的核糖核酸转录成cDNA。Sybr Green(Applied Biosystems，Foster City，CA)在StepOne Plus PCR循环仪(Applied Biosystems)上，进行qRT-PCR。使用△△CT方法分析信使核糖核酸表达数据，并用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)进行标准化以检测基因。经验证的qRT-PCR引物(primer)购自Quagen(美国)。为了用作对照组，人类肌肉骨骼***干细胞也以相同方式提取核糖核酸，并进行qRT-PCR。
实验结果
试验例1.对于源自人类胚胎干细胞的人类肌肉骨骼***干细胞的分化诱导的确 认
老化标记
如上述实施例2所示，从人类胚胎干细胞诱导人类肌肉骨骼***干细胞的分化，并将观察所诱导的人类肌肉骨骼***干细胞的形态变化而获得结果的示于图1a。如图1a所示，确认了单细胞化的未分化的H9人类胚胎干细胞在7继代之内分化成成纤维细胞形式的单个群体。从7继代至17继代的10继代以上，以相似的形状生长，而在19继代之后染色老化标记β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，其结果呈阳性反应，由此可以确认老化已进行。
通过免疫荧光法确认多能性标记
在人类胚胎干细胞诱导后经过7继代以上的人类肌肉骨骼***干细胞中通过免疫荧光法观察多能性标记的表达，将其结果示于图1b。将通过免疫荧光法确认H9人类胚胎干细胞的多能性标记的表达的结果也一同示出，以进行比较。
参照图1b，H9人类胚胎干细胞对OCT4、NANOG、SOX2、LIN28均呈阳性，可以确认具有多能。相反地，从H9人类胚胎干细胞诱导的人类肌肉骨骼***干细胞对OCT4、NANOG、SOX2及LIN28呈阴性。
通过转录组测序(RNA-sequencing)确认多能性标记、外胚层、中胚层、内胚层标记
通过转录组测序在人类胚胎干细胞、人骨髓间充质干细胞及7继代、17继代的人类肌肉骨骼***干细胞中确认多能、外胚层、中胚层及内胚层标记的表达，并将其结果示于图1c。在H9人类胚胎干细胞(人类胚胎干细胞-1、人类胚胎干细胞-2)中，确认了TDGF、NANOG、POU5F1、SOX2、DPPA4、LEFTY1及GDF3等的多能性标记的信使核糖核酸的表达。另一方面，虽然在从H9人类胚胎干细胞诱导的人类肌肉骨骼***干细胞中观察到作为多能性标记的DPPA4的表达，但未观察到多能性标记TDGF、NANOG、POU5F1、LEFTY1及GDF3的表达。确认了DPPA4表达水平类似于H9人类胚胎干细胞。
可知，DPPA4在人间充质干细胞中不表达。并且，确认了在人类肌肉骨骼***干细胞中，作为外胚层标记的巢蛋白呈阳性，相反地，除了DES和作为初期中胚层标记的T及结节之外，大部分的中胚层标记呈阳性，且对大部分的内胚层标记呈阴性。尤其，巢蛋白在间充质干细胞中不表达。
通过细胞表面抗原表达确认间充质干细胞标记
如图1d所示，测量了人类肌肉骨骼***干细胞的表面抗原表达。对间充质干细胞特异性细胞表面抗原的表达的研究结果表明，在间充质干细胞标记中，CD44、CD51、CD73、CD105、CD146、CD166在人类肌肉骨骼***干细胞中表达，相反地，在间充质干细胞标记中，CD90及CD271在人类肌肉骨骼***干细胞中不表达。并且，作为血统细胞表面标记的CD2、CD3、CD7、CD8、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD31、CD34、CD56不表达，相反地，作为pre-B细胞标记的CD10表达。
确认其他谱系细胞特异性标记
如图1f所示，为了研究人类肌肉骨骼***干细胞的特性，对各种谱系的组织特异性标记表达进行分析的结果表明，作为中胚层标记的平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、作为神经外胚层标记的Pax6、作为肌原性卫星标记的Pax7及作为肠干细胞标记的LGR5表达，作为软骨细胞标记的SOX9及作为成肌细胞标记的MyoD等不表达。这意味着人类肌肉骨骼***干细胞是分化到软骨细胞及肌肉细胞之前的前体细胞。
试验例2.人类肌肉骨骼***干细胞在体内的分化能力
对人骨髓间充质干细胞和实施例2.1的人类肌肉骨骼***干细胞测试了试管内骨形成、软骨形成、脂肪形成(实施例7)，并将其结果示于图2a。在图2a中可以确认，人骨髓间充质干细胞在试管内分化成骨骼、软骨、脂肪。然而，在与适用于人骨髓间充质干细胞相同条件的试管内诱导环境中，人类肌肉骨骼***干细胞虽分化成骨骼、软骨，但几乎不会分化成脂肪。即，确认了与间充质干细胞存在功能差异。
分化成骨骼肌的能力
评估上述试验例1的人类肌肉骨骼***干细胞是否具有分化成骨骼肌的能力。
在由基质胶(matrigel)涂敷的盖玻片(coverslip)上，用人类骨骼肌分化培养基(包含2％的B27的DMEM)培养并分化肌肉骨骼***干细胞2周后，对作为骨骼肌的标记的MYH9进行免疫荧光法。将其结果示于图2b。将C2C12用作阳性对照组。如图2b所示，在人类骨骼肌分化培养基中培养肌肉骨骼***干细胞的情况下，确认作为骨骼肌特异性标记的MYH9表达，从而可以确认人类肌肉骨骼***干细胞具有分化成骨骼肌的潜力。
分化成内皮细胞的能力
评估上述试验例1的人类肌肉骨骼***干细胞是否具有分化成内皮细胞的能力。
用EC分化培养基(endothelial growth medium(EGM)-2(Lonza，Walkersville，MD，美国)内的50ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF，vascular endothelial growthfactor：ProSpec，Rehovot，以色列)及10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor；ProSpec，Rehovot，以色列)培养并分化分类肌肉骨骼***干细胞6天后，对作为内皮细胞标记的CD31、VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)进行了免疫荧光法。将其结果示于图2c及图2d。将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用作内皮细胞分化的阳性对照组。如图2c及图2d所示，在人类肌肉骨骼***干细胞中未观察到CD31、VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)的表达，这意味着人类肌肉骨骼***干细胞没有分化成内皮细胞的潜力。相反地，确认了作为对照组的HUVEC表达上述标记。
向神经细胞分化的能力
将人类肌肉骨骼***干细胞在神经分化培养基(包含2％的B27、2mM的GlutaMAX及抗生剂的培养基(Neurobasal medium))中孕育(incubation)7天后，每天添加0.5mM的二丁基环磷酸腺苷(dibutyl cAMP)(Sigma)，持续3天。之后，对作为向神经细胞的分化标记的MAP2进行细胞免疫荧光法，并将其结果示于图2f。将神经干细胞(NSC，neuronal stemcells)用作神经细胞分化的阳性对照组。如图2f所示，由于神经干细胞的细胞形状变为神经细胞形状，并且表达作为神经细胞特意性标记的MAP2，因此可以确认分化成神经细胞，而在人类肌肉骨骼***干细胞的情况下，没有细胞形状变化，MAP2也未表达，因此可以确认没有分化成神经细胞的潜力。
如上述试验例1中所确认，尽管人类肌肉骨骼***干细胞对作为外胚层标记的巢蛋白呈阳性，但没有分化成神经细胞。可知，肌肉骨骼***干细胞可以分化成中胚层，更具体地，可以分化成骨骼、软骨、肌肉。
试验例3.确认人类肌肉骨骼***干细胞在体内分化成骨骼、软骨、肌肉、脂肪及肌 腱
为了在体内测量以与实施例2相同的方式诱导的人类肌肉骨骼***干细胞的分化潜能，将人类肌肉骨骼***干细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾脏内(实施例10.1)及皮下(实施例10.2)。将人类肌肉骨骼***干细胞移植到小鼠肾脏内经过3周～4周后，用苏木精—伊红染(H&E)染色组织，并将与骨骼、肌肉、脂肪、肌腱的特意性标记有关的免疫荧光染色结果及TO-PRO3的核对照染色结果示于图3a及图3b。
图3a示出在间充质干细胞GM-CD(Lonza，瑞士)培养基培养人类肌肉骨骼***干细胞2-5继代并移植到肾脏内后经过4周的结果，通过苏木精—伊红染(H&E)染色可以确认在肾脏内形成典型的肌肉、脂肪、肌腱(图3a的a部分)。通过确认上述分化的肌肉组织，可以确认均分化成骨骼肌，并未分化成平滑肌。相反，在以相同的条件移植人类间充质干细胞的情况下，没有形成肌肉、脂肪、肌腱等(data not shown)。移植部分的免疫组织化学分析结果显示，在各分化组织中，作为肌肉标记的磷酸化肌球蛋白轻链(pMLC，phospho-myosinlight chain)、作为脂肪标记的PPARgamma(PPAr)、作为肌腱标记的sleraxis(Scx)等呈阳性，这些均对作为人细胞标记的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen)也呈阳性。由此，可知所移植的人类肌肉骨骼***干细胞分化成肌肉、脂肪、肌腱细胞(这与在试管内试验中未分化成脂肪的结果相反。)(图3a的b部分)。
图3b的a部分为用显微电子计算机断层扫描扫描肾脏内人类肌肉骨骼***干细胞的移植部分的结果，可以看出形成了硬组织，即，骨骼。
图3b的b部分及图3b的c部分示出通过苏木精—伊红染(H&E)染色及五色组织化学染色确认了形成骨骼的结果。因此，可知所移植的人类肌肉骨骼***干细胞在肾囊下均分化成骨骼。
图3b的d部分示出移植部位的免疫组织化学分析结果。确认了在组织内部的细胞中，作为人细胞标记的人类白细胞抗原(hLA，human leukocyte antigen)、作为骨标记的成骨相关转录因子(Osx，osterix)、Runx2、牙本质基质蛋白(DMP1)、骨钙蛋白(OCN，osteocalcin)等呈阳性，并且由于作为血管标记的vWF也渗透到骨组织中，因而可知形成了与全身循环***连接的骨骼，从而可知所移植的人类肌肉骨骼***干细胞分化成骨骼。
图3c示出在将人类肌肉骨骼***干细胞接种到添加了透明质酸(hyaluronicacid)的纤维蛋白胶(fibrin glue)并移植到小鼠的皮下的情况下，分化成软骨细胞的结果。通过苏木精—伊红染(H&E)及甲苯胺蓝染色确认形成软骨。
综上所述，可以确认本发明的人类肌肉骨骼***干细胞可以通过依赖移植部分分化成软骨、肌肉、肌腱及骨骼且分化能力优异。
试验例5.对于人类肌肉骨骼***干细胞对骨折恢复的效果的确认
为了确认以与实施例2相同的方法诱导的人类肌肉骨骼***干细胞对骨折恢复的效果，进行了如上述实施例11所述的骨折研究，并将其结果示于图4a至图4b。
在股骨骨折模型中，在将人骨髓间充质干细胞移植到骨折部位的情况下，可以确认约6周后在骨折部位形成了骨。然而，发现虽然骨形成部位对于骨标记物Runx2呈阳性，而对于人细胞标记的人类白细胞抗原呈阴性，因此可以评估骨形成不是由人骨髓间充质干细胞引起的，而是小鼠自身中的细胞形成了骨(图4a)。相反地，在以相同条件移植人类肌肉骨骼***干细胞的情况下，约6周后在骨折部位形成骨，并且该骨形成部位对Runx2呈阳性，并且对作为人细胞标记的人类白细胞抗原呈阳性。据估计，骨是由人类肌肉骨骼***干细胞的分化形成的(图4b)。
试验例6.确认从人类诱导性多能干细胞向人类肌肉骨骼***干细胞的分化诱导 及所诱导的人类诱导性多能干细胞的特性
人类诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells)是通过Hasegawa等人开发的方法将仙台病毒(sendai virus)作为介导的OCT4、KLF4、SOX2及cMYC基因导入BJ成纤维细胞(fibroblast)(
Figure BDA0002277923930000311
CRL2522TM)而成的(Fusaki et al.，2009，PNAS 85，348-362)。
与实施例2相同地，从人类诱导性多能干细胞诱导人类肌肉骨骼***干细胞以获得人类肌肉骨骼***干细胞(以下，iPS-hMSSC)。将在iPS-hMSSC通过免疫荧光法及RT-PCR确认多能性标记的Oct4、Nanog、Sox2及Lin28的表达水平结果分别示于图5a。
在图5a中，诱导性多能干细胞对所有OCT4、NANOG、SOX2、LIN28均呈阳性，确认了它们具有多能。相反地，确认了iPS-hMSSC对作为多能性标记的OCT4、NANOG、SOX2及LIN28均呈阴性。
图5b是测量iPS-hMSSC的表面抗原的表达的结果。对间充质干细胞特异性细胞表面抗原的表达研究结果表明，在间充质干细胞标记中，CD44、CD51、CD73、CD105、CD146、CD166在iPS-hMSSC中表达，相反地，在间充质干细胞标记中，CD90及CD271在iPS-hMSSC中不表达。并且，作为血统细胞表面标记的CD2、CD3、CD7、CD8、CD14、CD20、CD56不表达，相反地，作为pre-B细胞标记的CD10表达。
并且，以与试验例2相同的方法评估了iPS-hMSSC的骨形成、软骨形成、脂肪形成，并将其结果示于图5c。如图5c所示，确认了从人类诱导性多能干细胞诱导的人类肌肉骨骼***干细胞在试管内分化成骨骼、软骨，但几乎不分化成脂肪。
并且，在由基质胶(matrigel)涂敷的盖玻片(coverslip)上，用骨骼肌分化培养基(包含2％的B27的DMEM)培养并分化肌iPS-hMSSC两周后，对作为骨骼肌的标记的MYH9进行免疫荧光法，并将其结果示于图5d。将C2C12用作阳性对照组。如图5d所示，确认了从人类诱导性多能干细胞诱导的人类肌肉骨骼***干细胞具有分化成骨骼肌的潜力。
综上所述，可以确认从人类诱导性多能干细胞诱导的人类肌肉骨骼***干细胞具有与从hECS诱导的人类肌肉骨骼***干细胞相同的特性，可以确认作为hECS的代替方案使用人类诱导性多能干细胞获得人类肌肉骨骼***干细胞。
试验例7.从人类诱导性多能干细胞诱导的人类肌肉骨骼***干细胞在体内的分 化能力
肾脏内移植
在将上述试验例6的人类肌肉骨骼***干细胞移植到小鼠肾脏内3～4周后，当用苏木精—伊红染(H&E)染色组织时，可以确认在肾脏内形成典型的肌肉、脂肪、肌腱。移植部位的免疫组织化学分析显示，作为肌肉标记的磷酸化肌球蛋白轻链(pMLC，phospho-myosinlight chain)、作为脂肪标记的PPARgamma(PPAr)、作为肌腱标记的sleraxis(Scx)等呈阳性，这些均对作为人细胞标记的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen)也呈阳性。并且，可以确认作为骨标记的成骨相关转录因子(Osx，osterix)、Runx2、牙本质基质蛋白、骨钙蛋白(OCN，osteocalcin)等呈阳性。通过上述方法可以确认从诱导性多能干细胞诱导的人类肌肉骨骼***干细胞可以分化成肌肉、脂肪、肌腱及骨骼。
皮下移植
将上述试验例6的人类肌肉骨骼***干细胞接种到添加了透明质酸(hyaluronicacid)的纤维蛋白胶(fibrin glue)并移植到小鼠的皮下后，通过苏木精—伊红染(H&E)及甲苯胺蓝染色，可以确认上述人类肌肉骨骼***干细胞可以分化成形成软骨。
比较例1.对添加了头蛋白的肌肉骨骼***干细胞培养基与添加了条件培养基 (Conditioned Media)的CM培养基的分化能力进行的比较
在上述实施例2的肌肉骨骼***干细胞培养基的七种组分中，代替组分1)的人类头蛋白(Life technology)，使用添加了条件培养基(Conditioned Media)(利用在完全培养基中将DMEM/F12置换为Knockout DMEM的培养基(由20％的Knockout SerumReplacement(Invitrogen，美国)、1mM的谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸(Invitrogen，美国)、0.1mM的β-巯基乙醇、0.1％的青霉素-链霉素、5mg/ml的牛血清白蛋白(bovine serumalbumin)补充的Knockout DMEM)培养CF1小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblasts)24小时后获得的培养上清液)的培养基(剩余组分2)-7)相同)(以下，称为“CM培养基”)，对肌肉骨骼***干细胞培养基与CM培养基的分化能力进行比较。
在此情况下，头蛋白通常用于在人类胚胎干细胞培养时维持其特性(ChaturvediG，Simone PD，Ain R，Soares MJ，Wolfe MW.Noggin maintains pluripotency of humanembryonic stem cells grown on Matrigel.Cell Prolif.2009Aug；42(4)：425-33)，与已知机制相反，大大增加了向中胚层的倾向性，如下表1所示，与使用CM培养基的情况相比，在使用头蛋白的情况下，骨分化的倾向性增加了10倍以上。
表1
诱导培养基 骨骼 肌肉 肌腱 脂肪
CM培养基 1/20 20/20 2/20 2/20
包含头蛋白的培养基 15/20 20/20 10/20 12/20
对肌肉骨骼***干细胞培养基vs.CM培养基的分化倾向性进行比较(20次中发现分化的次数)
并且，对使用各个培养基的情况的CD44表达量进行比较。用包含CM的培养基(CM培养基)和包含头蛋白培养基(肌肉骨骼***干细胞培养基)分化诱导后，以与实施例6相同的方法测量了CD44的表达量。实验结果表明，在与使用CM培养基的情况相比，在使用包含头蛋白的肌肉骨骼***干细胞培养基的情况下，CD44的表达量大幅度增加(图6)。
已知，骨形成在骨分化时软骨形成(chondrogenesis)之后，以软骨内化骨(endochondral bone)形式进行，其中CD44对软骨形成起到非常重要的作用(Wu SC，ChenCH，Chang JK，Fu YC，Wang CK，Eswaramoorthy R，Lin YS，Wang YH，Lin SY，Wang GJ，HoML：Hyaluronan initiates chondrogenesis mainly via cd44 in human adipose-derived stem cells.J Appl Physiol(1985)2013；114：1610-1618)。综上所述，可知与CM培养基相比，肌肉骨骼***干细胞培养基更适用于骨分化。
可以确认，在将人类肌肉骨骼***干细胞移植到肾脏内的情况下，与通过CM培养基分化的细胞相比，通过人类骨髓来源的间充质干细胞培养基分化的细胞的分化速度快1周～2周。使用CM培养基的情况与使用人类骨髓来源的间充质干细胞培养基的情况下分化速度之差异如下表2所示。
表2
Figure BDA0002277923930000341
对肌肉骨骼***干细胞培养基vs.CM培养基的分化速度进行比较(基于移植前人类肌肉骨骼***干细胞的信使核糖核酸量的增加率)
比较例2.对基于肌肉骨骼***干细胞培养基的组分之间组合的协同效果进行比 较
这次对上述实施例2的肌肉骨骼***干细胞培养基的组分中不包含1)至6)的成分之一的情况的分化能力与全部包含的情况进行比较。实验结果表明，在缺乏上述1)至6)的成分中的任一组分的情况下，不能完全的分化成软骨(Acian blue)或骨骼(ALP及Alizarinred S)(图7，表3)。
表3
Figure BDA0002277923930000351
Figure BDA0002277923930000361
肌肉骨骼***干细胞培养基vs.缺乏一种组分培养基的分化能力进行比较
以上详细描述了本发明的特定部分，对于本领域的技术人员显而易见的是，具体技术仅是优选实施例，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来定义。
编号
保藏机构名称：韩国细胞系研究联盟
保藏编号：KCLRFBP00460
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译文
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地址：(561-756)韩国全罗北道全州市德津区金岩洞2-20山，全北大学医院生命科学大楼408
Figure BDA0002277923930000362
Figure BDA0002277923930000371
格式BP/4(KCTC Form 17)
课题唯一编号：2017M3A9B4065302
部门名称：信息通信科学技术部
研究管理专业机构：韩国研究财团
研究事业名称：干细胞研究事业
研究课题名称：使用肌肉骨骼干细胞的肌肉骨骼***疾病治疗技术开发
贡献率：1/1
主管机构：全北大学
研究期限：2017.06.30～2019.01.29

Claims (5)

1.一种用于诱导分化成肌肉骨骼***干细胞的分化诱导用培养基组合物，其特征在于，
包含头蛋白、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、Wnt信号激活剂、细胞外信号调节激酶信号抑制剂以及转化生长因子-β／激活素／结节信号转导抑制剂，上述肌肉骨骼***干细胞能够分化成骨骼、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪，
上述Wnt信号激活剂为CHIR99021（9-溴-7，12-二氢-吡啶并[3'，2'：2，3]叠氮基[4，5-b]吲哚-6（5H）-酮），
上述细胞外信号调节激酶信号抑制剂为PD0325901（N-[（2R）-2，3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-2-[（2-氟-4-碘苯基）氨基]-苯甲酰胺），
上述转化生长因子-β／激活素／结节信号转导抑制剂为SB431542（4-[4-（1，3-苯并二恶唑-5-基）-5-（2-吡啶基）-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺）。
2.一种肌肉骨骼***干细胞的制备方法，其特征在于，包括在权利要求1所述的用于诱导分化成肌肉骨骼***干细胞的培养基组合物中培养诱导性多能干细胞的步骤。
3.根据权利要求2所述的肌肉骨骼***干细胞的制备方法，其特征在于，上述培养是在不改变培养基组成的情况下，培养5继代以上。
4.一种肌肉骨骼***干细胞，其特征在于，使用权利要求1所述的用于诱导分化成肌肉骨骼***干细胞的分化诱导用培养基组合物制备而成，上述肌肉骨骼***干细胞具有如下特征：
a）对于作为外胚层标记的巢蛋白呈阳性；
b）对于作为肌源性卫星标记的Pax7呈阳性；
c）对于作为中胚层标记的α-SMA呈阳性；
d）对于作为多能性标记的LIN28呈阴性；以及
e）对于作为间充质干细胞标记的CD90呈阴性。
5.一种肌肉骨骼***干细胞的筛选方法，其特征在于，上述肌肉骨骼***干细胞是使用权利要求1所述的用于诱导分化成肌肉骨骼***干细胞的分化诱导用培养基组合物制备而成的，
上述肌肉骨骼***干细胞的筛选方法包括筛选具有如下特征的细胞的步骤：
a）对于作为外胚层标记的巢蛋白呈阳性；
b）对于作为肌源性卫星标记的Pax7呈阳性；
c）对于作为中胚层标记的α-SMA呈阳性；
d）对于作为多能性标记的LIN28呈阴性；以及
e）对于作为间充质干细胞标记的CD90呈阴性。
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