CN1112160A - L-苹果酸高产突变株曲霉n1-14′及生产l-苹果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
L-苹果酸高产突变株曲霉(Aspergillus sp.)
N1-14′及利用该菌株生产L-苹果酸的方法，本发
明涉及工业微生物及其利用。本发明提供的曲霉
N1-14′CCTCCM94103能够直接发酵糖质原料产生L-苹果酸，该产酸菌株在20m3罐上，发酵糖质原料100—120小时，产酸75—85g/l，产酸速率0.65—0.71g/l.h，对糖转化率65—68％。本发明还提供了一套包括发酵过程和L-苹果酸提取过程的可行的工业化工艺流程，其工艺流程合理，简化，产品中L-苹果酸含量≥99×100-2，其突出特点是富马酸含量极低，小于0.2×10-2。
Description
本发明涉及一种可直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的微生物菌株及利用该菌株生产L-苹果酸的方法。
L-苹果酸学名为L-羟基丁二酸（L-hydroxysuccinic acid），是继柠檬酸之后的一个很有发展前景的产品，可广泛应用于食品、医药、印染、化工、电镀及建筑材料等各个方面。
迄今为止，制造L-苹果酸的途径大致有5条：1，从植物茎叶及果实中提取;2、拆分化学合成的DL-苹果酸;3、利用微生物产生的富马酸酶转化富马酸为L-苹果酸（简称酶法）;4、利用微生物发酵糖质原料生产L-苹果酸;5、利用微生物发酵非糖质原料生产L-苹果酸。目前，国内外市场的L-苹果酸产品主要采用酶法生产，然而由于化学合成的高纯度富马酸价格较高，加上产品中的富马酸含量较高等因素，很多国家一直在探讨和发展直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的方法。1990年以色列人Battat等，采用黄曲霉（Aspergillus flavus）在16L发酵罐上发酵葡萄糖约192小时，产酸113g/L，产酸速率0.59g/L.h，但该菌种产生黄曲霉毒素，因此不能应用于生产（Biotechnology and Bioengineering 37∶1108～1116）。1991年日本公开特许公报（平3-180187）公布了采用稗疣黑粉菌（Ustilago crus-galli）等摇瓶发酵葡萄糖168小时，产酸52g/L，产酸速率0.31g/L.h的结果。1988年中国无锡轻工业学院金其荣等（食品科学2∶12-19）报告了采用不产黄曲霉毒素的黄曲霉摇瓶发酵大米水解糖140小时，产酸60-70g/L，产酸速率0.43-0.50g/L.h，500L规模中试平均产酸44g/L的结果。上述L-苹果酸产生菌的产酸水平及其发酵工艺技术均未达到工业化生产的水平。
本发明的目的是提供一种能直接发酵糖质原料生产L-苹果酸，产酸速率及对糖转化率高，可进行工业化生产L-苹果酸的微生物菌株以及利用该微生物菌株生产L-苹果酸的可行的工业化生产方法。
本发明所提供的微生物菌株是经选育的L-苹果酸高产突变株曲霉（Aspergillus SP.）N1-14′，该曲霉N1-14′的样品保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），编号为：M94013。该菌株以下简称为：N1-14′CCTCC M94013。
N1-14′CCTCC M94013在察氏（Czapek）培养基上，28-32℃下培养5-7天，其菌落直径约1-2cm。在生长初期，菌落浅黄白色，老后呈淡褐黄色，较致密，没有特殊气味，反面淡黄色，具较明显的皱褶。菌丝短羊毛状，白色，有隔;分生孢子梗从壁厚而膨大的足细胞垂直长出，无隔，上部较粗大，顶端膨大成近球形的泡囊，从泡囊的全部表面放射状地生出小梗，小梗单层或双层，分生孢子生于小梗顶端，最初为椭圆形或洋梨形，成熟后为球形或近球形，带黄褐色和粗糙的小刺，并具有不很明显的双层壁。N1-14′CCTCC M94013的生长适宜条件为：1、培养物质：20×10-2马铃薯汁500-1000ml/L，葡萄糖10-30g/L，KH2PO42-5g/L，MgSO4·7H2O 1-3g/L，琼脂15-20g/L;2、培养温度：25-35℃;3、培养pH值：5.5-7.5。本突变株经测定不产生黄曲霉毒素，其全发酵液急性中毒试验属实际无毒级，慢性蓄积试验属弱蓄积。
利用N1-14′CCTCC M94013直接发酵糖质原料可生产L-苹果酸，本发明在摇瓶试验的基础上，通过1.2L，20L，240L，1.7m3及20m3发酵罐的逐步扩大试验，已经形成了利用N1-14′CCTCC M94013直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的合适发酵工艺条件，并建立了从发酵液中提取L-苹果酸的可行方法。
本发明所提供的生产L-苹果酸的方法，其主要特点是利用N1-14′CCTCC M94013对糖质原料进行直接发酵。所说的糖质原料可为葡萄糖，淀粉水解糖，蔗糖及淀粉等，如采用淀粉为原料，则需加α-淀粉酶进行液化处理。
利用N1-14′CCTCC M94013直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的工艺过程包括：
1、发酵工艺过程：
1.1、在25-35℃温度范围并加入其主要成份为葡萄糖和KH2PO4的产孢促进剂的条件下，使N1-14′CCTCC M94013在三角瓶麸皮培养基内大量产生孢子，即菌种制备;
1.2、将成熟的孢子接入种子罐中含有碳酸钙的培养基进行种子培养;
1.3、将成熟的种子移入繁殖罐中含有碳酸钙的培养基中进行深层液体孢子生产;
1.4、将合适菌龄的种子及成熟的孢子移入发酵罐中含有碳酸钙的培养基中，对糖质原料进行直接发酵得到发酵醪;
2、L-苹果酸提取工艺过程：
2.1、直接真空抽滤发酵醪收得含有菌体的L-苹果酸钙;
2.2、用无砷硫酸解含有菌体的L-苹果酸钙，并对酸解液进行除杂和脱色;
2.3、对上述除杂脱色后的酸解液真空抽滤去除菌体和硫酸钙，获得L-苹果酸粗溶液;
2.4、在L-苹果酸粗溶液中加入絮凝剂澄清后精滤，然后使精滤液通过阴阳离子交换树脂进行净化;
2.5、将净化后的L-苹果酸溶液进行浓缩、结晶，最后将离心收得的湿晶体进行干燥。
本发明在菌种制备阶段采用产孢促进剂，可以极大地提高孢子产量，一般可使麸皮培养基产生孢子由1.0×106/克培养基（干重）提高到4.0×108/克培养基（干重），产孢促进剂的主要成份为葡萄糖与KH2PO4，两者的比例为葡萄糖：KH2PO4＝1∶0.005-0.05（重量份）。所使用的麸皮培养基成份（按每公斤培养基所含克重g/kg计算）为：新鲜麸皮400-600，余量为水。加入培养基中的产孢促进剂的用量为麸皮培养基的（1-10）×10-2，而以（3-6）×10-2为佳。N1-14′CCTCC M94013适宜的产孢温度范围为25-35℃，较好的产孢温度范围为28-32℃。
本发明采用的深层液体孢子生产步骤（步骤1.3）目的是进一步解决真菌发酵的孢子产量问题，可以使液体中孢子产量达到5.0×105个/毫升。适宜的种子培养及深层液体孢子生产步骤所用的培养基成份（按每升培养基所含克重g/L计算）为：还原糖30-70，（NH4）2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，FeSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO320-60。自然pH，其中（NH4）SO4分开灭菌。
在步骤1.4中，适宜的发酵产酸的培养基成份（按每升培养基所含克重g/L计算）为：还原糖115-135，（NH4）2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，FeSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO370-120。自然pH，其中（NH4）2SO4分开灭菌。
本发明用以澄清L-苹果酸粗溶液的絮凝剂（步骤2.4）主要采用聚丙烯酰胺，其用量为1-30mg/L（L-苹果酸粗溶液），最佳用量为5-10mg/L（L-苹果酸粗溶液）。
用以净化L-苹果酸溶液的阴离子交换树脂（步骤2.4）可采用F-1柠檬酸阴离子交换树脂，也可采用A561阴离子交换树脂。阳离子交换脂可采用732阳离子交换树脂或C26阳离子交换树脂。
利用N1-14′CCTCC M94103直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的具体工艺过程为：
1、发酵工艺过程：
1.1、菌种制备：将新配制的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）试管斜面接种后，置28-32℃下培养5-7天，待孢子成熟后，加入无菌水，把制得的孢子悬浮液接入三角瓶麸皮培养基内，麸皮培养基内加有产孢促进剂，置28-32℃下培养5-7天后，放在4-6℃冰箱内，保存备用;
1.2、种子培养：将成熟的麸曲接入种子罐中，保持温度30-37℃，搅拌速度200-300r/m，通气量0.4-0.7vvm，罐压0.01-0.1MPa，培养20-30小时;
1.3、深层液体孢子生产：将成熟的种子移入繁殖罐内，保持温度33-38℃，搅拌速度150-250r/m，通气量0.3-0.6vvm，罐压0.01-0.1MPa，培养18-23小时；
1.4、发酵罐发酵：把合适菌龄的种子及成熟的孢子移入发酵罐中对糖质原料直接发酵，保持温度32-37℃，搅拌速度50-150r/m，通气量0.05-0.3vvm，罐压0.01-0.1MPa，培养100-120小时，待残糖下降至5g/L，停止发酵，获得发酵醪。
2、L-苹果酸提取工艺过程：
2.1、直接真空抽滤成熟的发酵醪，并用少量无盐水将滤饼（含有菌体的L-苹果酸钙）中的残糖洗净;
2.2、用1-3倍滤饼重量的稀酸水将滤饼调成浆状，加入（20-60）×10-2的无砷硫酸，维持搅拌速度50-100r/m，温度30-50℃的温和条件，对L-苹果酸钙进行酸解，采用双管法检查酸解终点，并对酸解液进行除杂和脱色;
2.3、真空抽滤除去菌体和硫酸钙，并用少量无盐水将滤饼中的L-苹果酸洗脱下来;
2.4、在L-苹果酸粗溶液加入絮凝剂澄清后，进行精滤，然后将精滤液送至高位槽，先引入732阳离子交换树脂柱或C26阳离子交换树脂柱，然后引入F-1柠檬酸专用阴离子交换树脂柱或A561阴离子交换树脂柱，阳柱流出液主要检查有无Fe2+和Ca2+的漏出，阴柱流出液主要检查有无SO4 2-和Cl-的漏出。
2.5、把净化后的L-苹果酸溶液引入浓缩塔中，在50-70℃下浓缩至1000-1300g/L，再将浓缩液引入结晶罐中，冷却至5-20℃，加入适量晶种，在1-10r/m缓慢搅拌下结晶，然后用离心机把晶体从母液中分离出来，并用少量无盐水洗涤干净，再将洗涤后的晶体置沸腾干燥床中，在进风温度30-80℃下干燥，最后将干燥后的L-苹果酸包装即完成全部工艺过程。
本发明利用优良的L-苹果酸高产突变株N1-14′CCTCC M94103，在20m3罐上发酵糖质原料100-120小时，产酸75-85g/L，产酸速率0.65-0.71g/L.h，对糖转化率65-68%，大大优于国内外现有的L-苹果酸产生菌的产酸水平。
本发明所提供的生产L-苹果酸的工艺技术，工艺过程简化，L-苹果酸回收率达50-60%，产品中L-苹果酸的含量≥99×10-2，其突出的特点是富马酸含量极低，小于0.2×10-2
实施例一
以蔗糖为原料直接发酵生产L-苹果酸。
将4℃冰箱内保存的N1-14′斜面菌种，转接到新配制的马铃薯葡萄糖琼脂试管斜面上，置28-32℃下培养6天后，获得新鲜试管斜面菌种。马铃薯葡萄糖琼脂培养基成份（按每升培养基所含的量计算）：20×10-2马铃薯汁800ml，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 2g，pH6.5，琼脂18g。然后，将新鲜成熟的试管斜面菌种，加入无菌水，制得孢子悬浮液，接入三角瓶麸皮培养基内。麸皮培养基的成份（按每公斤培养基所含克重g/kg计算）：新鲜麸皮500，水500。所加入其中的产孢促进剂的成份为葡萄糖：KH2PO4＝1∶0.01，其用量为麸皮培养基的3×10-2。接种后的培养基，置28-32℃下培养6天后，其孢子产量为4.5×108个/克培养基（干重）。
种子罐容积为600L，装液450L，采用种子培养基。种子培养基的成份（按每升培养基所含克重g/L计算）：蔗糖50，（NH4）2SO42.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.5，CaCO340;自然pH，其中（NH4）2SO4分开灭菌。种子培养基采用121℃灭菌25分钟，冷却后接入麸曲种，保持温度33-35℃，搅拌速度230-240r/m，通气量0.5vvm，罐压0.03-0.05MPa，培养23小时，残糖10g/L，移入繁殖罐中培养。
繁殖罐容积为3m3，装液2.4m3，采用深层孢子生产培养基（成份与种子培养基相同），121℃灭菌20分钟，冷却后移入成熟种子培养液，保持温度35-36℃，搅拌速度200-220r/m，通气量0.4vvm，罐压0.03-0.05MPa，培养20小时，孢子产量为6.7×105个/毫升，残糖8g/L，移入发酵罐。
发酵罐容积为20m3，装液16m3，采用发酵产酸培养基。发酵产酸培养基成份（按每升培养基所含克重g/L计算）：蔗糖115，（NH4）2SO42.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.5，CaCO390;自然pH，其中（NH4）2SO4分开灭菌。发酵产酸培养基121℃灭菌10分钟，冷却后移入合适菌龄的种子及成熟的孢子培养液，保持温度34-35℃，搅拌速度80-100r/m，通气量0.1vvm，罐压0.03-0.05MPa，培养107小时，产酸为76.1g/L，残糖为5g/L，停止发酵，进行L-苹果酸提取。
放罐后直接真空抽滤发酵醪，获得含有菌体的L-苹果酸钙滤饼;将滤饼用稀酸水（无砷硫酸）调成浆状后，在温度40℃，搅拌速度70-80r/m的温和条件下进行酸解、除杂和脱色;过滤除去石膏渣及菌体等后，加入聚丙烯酰胺絮凝剂进行澄清，絮凝剂的用量为10mg/L;L-苹果酸粗溶液进行精滤和通过F-1柠檬酸阴离子交换树脂柱及732阳离子交换树脂柱后，在60℃下，采用两级浓缩，浓缩至1200g/L时，引入结晶罐中，在5-6r/m搅拌下，冷却至10℃，加入适量晶种进行结晶;结晶后，用离心机将晶体分离出来，母液和洗水进行再浓缩或净化处理，晶体则在进风温度50-60℃下沸腾干燥后立即包装。
实施例二
以淀粉为原料直接发酵生产L-苹果酸。
将4℃冰箱内保存的N1-14′斜面菌种，转接到新配制的马铃薯葡萄糖琼脂试管斜面上，置25-27℃下培养7天，获得新鲜试管斜面菌种。马铃薯葡萄糖琼脂培养基成份（按每升培养基所含的量计算）：20×10-2马铃薯汁500ml，葡萄糖10g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，pH5.0，琼脂15g。然后，将新鲜成熟的试管斜面菌种，加入无菌水，制得孢子悬浮液，接入三角瓶麸皮培养基内。麸皮培养基的成份（按每公斤培养基所含克重g/kg计算）：新鲜麸皮600，水400。所加入其中的产孢促进剂的成份葡萄糖：KH2PO4＝1∶0.005，其用量为麸皮培养基的5×10-2。接种后的培养基，置25-27℃下培养7天后，其孢子产量为4.3×103个/克培养基（干重）。
淀粉在直接使用前，要先调成300-350g/L浓度的淀粉浆，升温至50-55℃时，加入5-10个单位/克淀粉的α-淀粉酶和1g/L的CaCl2，然后再升温至85-90℃下进行液化处理。
种子罐容积为600L，装液450L，采用种子培养基。种子培养基的成份（按每升培养基所含克重g/L计算）：淀粉70，（NH4）2SO41.0，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.3，CaCO320;自然pH，其中（NH4）2SO4分开灭菌。种子培养基采用121℃灭菌25分钟，冷却后接入麸曲种，保持温度30-32℃，搅拌速度200-220r/m，通气量0.4vvm，罐压0.08-0.1MPa，培养30小时，残糖10g/L，移入繁殖罐中培养。
繁殖罐容积为3m3，装液2.4m3，采用深层孢子生产培养基（成份与种子培养基相同），121℃灭菌20分钟，冷却后移入成熟种子培养液，保持温度33-34℃，搅拌速度150-180r/m，通气量0.3vvm，罐压0.08-0.1MPa，培养23小时，孢子产量为5.5×105个毫升，残糖10g/L，移入发酵罐。
发酵罐容积为20m3，装液16m3，采用发酵产酸培养基。发酵产酸培养基成份（按每升培养基所含克重g/L计算）：淀粉135，（NH4）2SO41.0，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.3，CaCO370;自然pH，其中（NH4）2SO4分开灭菌。发酵产酸培养基121℃灭菌10分钟，冷却后移入合适菌龄的种子及成熟的孢子培养液，保持温度32-34℃，搅拌速度50-70r/m，通气量0.05vvm，罐压0.08-0.1MPa，培养115小时，产酸75.0g/L，残糖5g/L，停止发酵，进行L-苹果酸提取。
放罐后直接真空抽滤发酵醪，获得含有菌体的L-苹果酸钙滤饼;将滤饼用稀酸水（无砷硫酸）调成浆状后，在温度30℃，搅拌速度50-60r/m的温和条件下进行酸解、除杂和脱色;过滤除去石膏渣及菌体等后，加入聚丙烯酰胺絮凝剂进行澄清，絮凝剂的用量为30mg/L;L-苹果酸粗溶液进行精滤和通过F-1柠檬酸阴离子交换树脂柱及C26阳离子交换树脂柱后，在50℃下，采用两级浓缩，浓缩至1000g/L时，引入结晶罐中，在1-3r/m搅拌下，冷却至5℃，加入适量晶种进行结晶;结晶后，用离心机将晶体分离出来，母液和洗水进行再浓缩或净化处理，晶体则在进风温度30-50℃下沸腾干燥后立即包装。
实施例三
以葡萄糖为原料直接发酵生产L-苹果酸。
将4℃冰箱内保存的N1-14′斜面菌种，转接到新配制的马铃薯葡萄糖琼脂试管斜面上，置32-35℃下培养5天，获得新鲜试管斜面菌种。马铃薯葡萄糖琼脂培养基成份（按每升培养基所含的量计算）：20×10-2马铃薯汁1000ml，葡萄糖30g，KH2PO45g，MgSO4·7H2O 3g，pH7.5，琼脂20g。然后，制得孢子悬浮液，接入三角瓶麸皮培养基内。麸皮培养基的成份（按每公斤培养基所含克重g/L计算）：新鲜麸皮400，水600。所加入其中的产孢促进剂的成份为葡萄糖：KH2PO4＝1∶0.05，其用量为麸皮培养基的10×10-2。接种后的培养基，置32-35℃下培养5天后，其孢子产量为4.0×106个/克培养基（干重）。
种子罐容积为600L，装液450L，采用种子培养基。种子培养基的成份（按每升培养基所含克重g/L计算）：葡萄糖30，（NH4）2SO45.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 1.2，MnSO4·H2O 1.2，FeSO4·7H2O 1.5，CaCO360;自然pH，其中（NH4）2SO4分开灭菌。种子培养基采用121℃灭菌25分钟，冷却后接入麸曲种，保持温度35-37℃，搅拌速度280-300r/m，通气量0.7vvm，罐压0.01-0.02MPa，培养20小时，残糖7g/L，移入繁殖罐中培养。
繁殖罐容积为3m3，装液2.4m3，采用深层孢子生产培养基（成份与种子培养基相同），121℃灭菌20分钟，冷却后移入成熟种子培养液，保持温度36-38℃，搅拌速度240-250r/m，通气量0.6vvm，罐压0.01-0.02MPa，培养18小时，孢子产量为5.0×105个/毫升，残糖9g/L，移入发酵罐。
发酵罐容积为20m3，装液16m3，采用发酵产酸培养基。发酵产酸培养基成份（按每升培养基所含克重g/L计算）：葡萄糖125，（NH4）2SO45.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 1.2，MnSO4·H21.2，FeSO4·7H2O 1.5，CaCO3120;自然pH，其中（NH4）2SO4分开灭菌。发酵产酸培养基121℃灭菌10分钟，冷却后移入合适菌龄的种子及成熟的孢子培养液，保持温度35-37℃，搅拌速度140-150r/m，通气量0.3vvm，罐压0.01-0.02MPa，培养120小时，产酸85.0g/L，残糖5g/L，停止发酵，进行L-苹果酸提取。
放罐后直接真空抽滤发酵醪，获得含有菌体的L-苹果酸钙滤饼;将滤饼用稀酸水（无砷硫酸）调成浆状后，在温度50℃，搅拌速度90-100r/m的温和条件下进行酸解、除杂和脱色;过滤除去石膏渣及菌体等后，加入聚丙烯酰胺絮凝剂进行澄清，絮凝剂的用量为1mg/L；L-苹果酸粗溶液进行精滤和通过A561阴离子交换树脂柱及C26阳离子交换树脂柱后，在70℃下，采用两级浓缩，浓缩至1300g/L时，引入结晶罐中，在8-10r/m搅拌下，冷却至20℃，加入适量晶种进行结晶;结晶后，用离心机将晶体分离出来，母液和洗水进行再次浓缩或净化处理，晶体则在进风温度70-80℃下沸腾干燥后立即包装。
Claims (18)
1、L-苹果酸高产突变株曲霉(Aspergillus sp.N1-14′)，其特征在于该突变株是其样品保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为M94013这样的微生物菌株。
2、一种生产L-苹果酸的方法，其特征在于利用N1-14′CCTCC M94013直接发酵糖质原料而生产L-苹果酸。
3、按权利要求2所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于所说的糖质原料为葡萄糖、淀粉水解糖、蔗糖或淀粉。
4、按权利要求2所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于生产的工艺过程包括：
4.1、发酵工艺过程：
4.1.1、在25-35℃温度范围并加入其主要成份为葡萄糖和KH2PO4的产孢促进剂的条件下，使N1-14′CCTCC M94013在三角瓶麸皮培养基内大量产生孢子;
4.1.2、将成熟的孢子接入种子罐中含有碳酸钙的培养基进行种子培养;
4.1.3、将成熟的种子移入繁殖罐中含有碳酸钙的培养基进行深层液体孢子生产;
4.1.4、将合适菌龄的种子及成熟的孢子移入发酵罐中含有碳酸钙的培养基，对糖质原料进行直接发酵得到含L-苹果酸钙的发酵醪;
4.2、L-苹果酸提取工艺过程：
4.2.1、直接真空抽滤发酵醪收得含有菌体的L-苹果酸钙;
4.2.2、用无砷硫酸酸解含有菌体的L-苹果酸钙，并对酸解液进行除杂和脱色;
4.2.3、对上述酸解液真空抽滤去除菌体和硫酸钙，获得L-苹果酸粗溶液;
4.2.4、在L-苹果酸粗溶液中加入絮凝剂澄清后精滤，然后使精滤液通过阴阳离子交换树脂进行净化;
4.2.5、将净化后的L-苹果酸溶液进行浓缩、结晶，最后将离心收得的湿晶体进行干燥。
5、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.1.1的过程包括将新配制的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）试管斜面接种后，置28-32℃培养5-7天，待孢子成熟后，加入无菌水，把制得的孢子悬浮液接入三角瓶麸皮培养基内，培养基内加有其主要成份为葡萄糖和KH2PO4的产孢促进剂，置28-32℃下培养5-7天。
6、按权利要求4或5所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于所说的产孢促进剂成份比例为：葡萄糖∶KH2PO4＝1∶0.005-0.05（重量份）。
7、按权利要求6所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.1.1中产孢促进剂的用量为麸皮培养基的（1～10）×10-1
8、按权利要求6所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.1.1中产孢促进剂的用量为麸皮培养基的（3～6）×10-1
9、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.1.2和4.1.3中所说的含有碳酸钙的培养基的成份（按每升培养基所含克重g/L计算）为：还原糖30-70，（NH4）2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，FeSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO，20-60。
10、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.1.4中所说的含有碳酸钙的培养基的成份（按每升培养基所含克重g/L计算）为：还原糖115-135，（NH4）2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，FeSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO，70-120。
11、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.1.2中种子培养是在温度为30-37℃，搅拌速度为200-300r/m，通气量为0.4-0.7vvm，罐压为0.01-0.1MPa的条件下培养20-30小时。
12、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.1.3中深层液体孢子生产是在温度为33-38℃，搅拌速度为150-250r/m，通气量为0.3-0.6vvm，罐压为0.01-0.1MPa的条件下培养18-23小时。
13、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.1.4中是在温度为32-37℃，搅拌速度为50-150r/m，通气量为0.05-0.3vvm，罐压为0.01-0.1MPa的条件下对糖质原料进行发酵。
14、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤2.2中是加入（20-60）×10-2的无砷硫酸，并于温度为30-50℃，搅拌速度为50-100r/m的条件下酸解含有菌体的L-苹果酸钙。
15、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.2.4中所使用的絮凝剂主要为聚丙烯酰胺，其用量为1-30mg/L。
16、按权利要求14所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于聚丙烯酰胺的用量为5～10mg/L。
17、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.2.4中所使用的阴离子交换树脂为F-1柠檬酸阴离子交换树脂或A561阴离子交换树脂。
18、按权利要求4所述的生产L-苹果酸的方法，其特征在于步骤4.2.4中所使用的阳离子交换树脂为732阳离子交换树脂或C26阳离子交换树脂。
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