CN111206099A - 一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒 - Google Patents
一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111206099A CN111206099A CN202010127397.6A CN202010127397A CN111206099A CN 111206099 A CN111206099 A CN 111206099A CN 202010127397 A CN202010127397 A CN 202010127397A CN 111206099 A CN111206099 A CN 111206099A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluorescent probe
- kit
- mutation
- egfr gene
- fluorescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明了公开了一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒,涉及核酸检测技术领域。该试剂盒包括:用于检测L858R位点突变的引物对、突变型荧光探针、野生型荧光探针、阳性质控品、阴性质控品和反应预混液。该试剂盒针对EGFR基因L858R位点设计了特定序列的引物和锁核酸探针,并优化了其反应体系,利用数字PCR平台实现了对EGFR基因L858R位点突变的高灵敏度检测,对低浓度DNA样本能够有效分辨低至1:3000的突变,操作简单,结果稳定,准确度高,数据扩增效果好,可广泛应用于非小细胞肺癌EGFR突变型的早筛和治疗过程中的耐药监测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域,具体涉及一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒。
背景技术
近年来,每年的新发癌症病例高达429万,其中肺癌位居发病率与死亡率第一位,分别占恶性肿瘤新发病例的13%和18%,尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高,但肺癌的死亡率仍未得到有效控制。在全部肺癌中,非小细胞肺癌(Non-Small Cell LungCancer,NSCLC)占80%以上,中国人群非小细胞肺癌患者最常见的致病突变来自表皮生长因子受体基因(epidermal growth factor receptor,EGFR)。
表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜蛋白,广泛分布于人体各组织细胞膜上,是跨膜受体酪氨酸家族中的成员之一。由细胞外的配体结合区、疏水跨膜结构域和细胞内的激酶区三部分组成。EGFR基因可调控细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环,加快肿瘤细胞的增殖,促进新生血管生成,加速肿瘤转移并抑制肿瘤细胞凋亡。EGFR基因突变主要发生在第19-21号外显子上,包括第19号外显子的缺失突变(19del),第20号外显子的点突变(T790M)和片段***,以及第21号外显子的点突变(如:L858R、L861Q等)。在肿瘤的治疗中,酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)通过与EGFR胞外配体结合部位的竞争,阻断EGFR信号通路,从而起到抗肿瘤的作用。然而,相当一部分患者会出现耐药性,这种获得性耐药主要由基因的二次突变引起的,常见的突变包括:T790M和L858R等。
近年来,以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展。当肿瘤组织难以获取时,无创、易采集的血液检测是组织EGFR基因突变分析合适的替代选择,并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性,可实现无创实时动态检测等,广泛应用于肺癌早筛和治疗中耐药性监测。由于血液中游离DNA含量极低,长度约70-200bp,其中突变相关游离DNA(cell free DNA,cfDNA)含量更少,约占总游离DNA含量的1%,普通试剂盒精密度和灵敏度无法达到检测要求。
目前,用于检测外周血EGFR突变的方法有很多,包括测序法、实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)、变性高效液相色谱法(denaturing high performance 1iquidchromatography,DHPLC)及数字PCR(dPCR)等。测序法是目前检测基因突变最基础、应用最广泛的一种方法,但需要对待测序样品进行扩增、纯化、序列分析,过程繁琐,耗时较长,灵敏度较低,因此在临床应用中存在一定的限制,不适用于大量临床样品分析。用RT-PCR检测目的基因,虽然可检测出微小突变,但该技术的定量检测依赖于Ct值,而Ct值会受扩增效率的影响,这在一定程度上限制了精确定量检测,得到的是相对含量,无法实现绝对定量。DHPLC技术的检测灵敏度同样较低,且不能检测出突变的具体类型,结果判读容易出错,当有多个片段需要检测时,由于有多个解链温度,需要多步检测,增加了工作量。数字PCR技术无需采用内参基因和标准曲线,准确度高、重现性好,可以实现绝对定量分析,为有效提高基因突变检测灵敏度以及精准度提供了可能。该技术是将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元里。根据每个反应单元中扩增后的荧光信号相对比例和反应单元的体积,通过泊松分布计算出核酸靶分子的浓度。数字PCR技术极大地提高了检测灵敏度和检出率。但目前使用的数字PCR仪器操作步骤多且复杂,滴定式数字PCR由于液滴有相对损耗,对于超低含量的目的物检测不准,需要额外的质控体系;芯片式数字PCR也同样需要多种仪器组合,价格昂贵且操作不便利,无法满足临床便捷使用的需求。
基于数字PCR***提供相应的检测试剂,成为现今检测基因突变的必然趋势。中国专利CN108998526A公开了一种检测EGFR基因21外显子基因突变的试剂盒及方法,该试剂盒基于dPCR平台能检出0.1%的突变率。中国专利CN108841953A公开了一种利用数字PCR技术检测EGFR基因22种突变的试剂盒,该试剂盒可检测出2ng/μL的DNA样本。现有的基于数字PCR检测EGFR基因突变的试剂种类较少,仍存在一些不足之处,包括难以有效检测出DNA含量极低的样本,且灵敏度低等。
因此,本发明开发了一种基于数字PCR检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒。对肿瘤、血液、唾液、血清中EGFR基因的L858R突变进行快速检测,提供绝对定量。操作更加便捷,能够对极低检测目的物进行准确的定性、定量检测,灵敏度更高,数据结果稳定可靠,能够更便捷地用于辅助诊断与临床治疗指导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒。克服了现有技术中存在的问题,能够对极低检测目的物进行准确的定性、定量检测,提高了灵敏度。
本发明一方面提供了一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒,所述的试剂盒包括引物对A和荧光探针B;
所述的引物对A包括上游引物和下游引物;
所述上游引物的核苷酸序列为:5’-CACCGCAGCATGTCAAGATCA-3’;如SEQ ID NO:1所示;
所述下游引物的核苷酸序列为:5’-CTTTGCCTCCTTCTGCATGGTAT-3’;如SEQ ID NO:2所示;
所述的荧光探针B包括突变型荧光探针和野生型荧光探针;
所述突变型荧光探针的核苷酸序列为:5’-TTGGGCGGGCCAAAC-3’;如SEQ ID NO:3所示;
所述野生型荧光探针的核苷酸序列为:5’-TTGGGCTGGCCAAAC-3’;如SEQ ID NO:4所示;
进一步地,所述突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端第7位碱基均是经锁核酸修饰的碱基。
进一步地,所述的锁核酸结构如式(1)所示:
优选地,所述的荧光探针B的5’端含有荧光报告基团FAM和/或CY3,3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1和/或BHQ-2;
进一步优选地,所述的突变型荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM,所述的突变型荧光探针的3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1;所述的野生型荧光探针的5’端含有荧光报告基团CY3,所述的野生型荧光探针的3’端含有荧光淬灭基团BHQ-2。
优选地,所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品;所述的阳性质控品含有1%L858R突变的DNA,所述的阴性质控品含有EGFR基因野生型的DNA。
优选地,所述的试剂盒还包括反应预混液,所述的反应预混液包括但不限于以下试剂:dATP、dCTP、dGTP、dTTP、镁离子、BSA(牛血清白蛋白)、热启动Taq酶和单分子扩增增强剂等;
所述的单分子扩增增强剂包括甜菜碱2M、体积比为0.2%的TritonX-100、和热稳定焦磷酸酶0.1U。
进一步优选地,所述的反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mM,BSA浓度为10μg/μL,热启动Taq酶浓度为1U。
本发明所述的试剂盒可检测的样本来源多样,包括肿瘤、血液、唾液、血清等中的核酸。
本发明另一方面提供了上述试剂盒在制备用于检测肺癌患者EGFR基因是否发生L858R位点突变的产品中的应用。
本发明另一方面还提供了上述试剂盒在制备用于检测肺癌患者服用EGFR-TKI是否发生耐药的产品中的应用。
本发明另一方面还提供了一种利用上述试剂盒检测EGFR基因L858R位点突变的方法,包括如下步骤:
(1)待测的DNA模板、上述试剂盒中的引物对A、荧光探针B与反应预混液混合,制备得到数字PCR反应体系;
PCR反应体系如下:
a:DNA模板终浓度为0.5-1.5ng/μL,优选为1ng/μL;
b:引物对A的终浓度为0.2-0.6μM,优选为0.4μM;
c:荧光探针B的终浓度为0.1-0.4μM,优选为0.2μM;
(2)根据步骤(1)得到的数字PCR反应体系,制作PCR微反应单元,进行PCR扩增反应,得到扩增产物;
扩增条件为:95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃延伸30s,共进行40个循环;10℃终止反应;
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行荧光信号收集,根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有EGFR基因L858R位点突变的DNA模板及其数量和含量。
具体地,一种利用上述试剂盒检测EGFR基因L858R位点突变的方法,包括如下步骤:
(1)待测的DNA模板、上述试剂盒中的引物对A、荧光探针B与反应预混液混合,制备得到数字PCR反应体系;
人工合成两种分别含有突变位点野生型和突变型的长度为200bp的DNA片段,并将其转入载体质粒中,制成DNA模板。以Qubit进行双链DNA定量并根据如下公式计算真实拷贝数:
(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)=copies/μL,模板DNA浓度为10ng/μL;
所述的PCR反应体系如下:
PCR反应体系如下:
a:DNA模板终浓度为0.5-1.5ng/μL,优选为1ng/μL;
b:引物对A的终浓度为0.2-0.6μM,优选为0.4μM;
c:荧光探针B的终浓度为0.1-0.4μM,优选为0.2μM;
(2)根据步骤(1)得到的数字PCR反应体系,制作PCR微反应单元,进行PCR扩增反应,得到扩增产物;
扩增条件为:95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃延伸30s,共进行40个循环;10℃终止反应;
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行荧光信号收集,根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有EGFR基因L858R位点突变的DNA模板及其数量和含量。
与现有技术相比,本发明的积极和有益效果在于:
本发明所提供的一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒,该试剂盒针对EGFR基因L858R位点设计了特定序列的引物和锁核酸探针,并优化了其反应体系。能够有效检测低浓度样本,且灵敏度高,能够有效分辨低至1:3000的突变,能够顺利完成液体活检的技术要求,操作简单,减少人为操作干扰,结果稳定,准确度高,数据扩增效果好;另外,可检测的样本来源多样,包括肿瘤、血液、唾液、血清中核酸,扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围,可以广泛应用于非小细胞肺癌EGFR突变型的早筛和治疗过程中的耐药监测。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中,而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。本发明中使用的数字PCR仪为专利CN201911061352.7中的核酸扩增仪。本发明中相关序列详见序列表。
实施例中未注明具体技术或条件,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
实施例1:检测EGFR基因L858R位点突变的引物对和探针的设计与合成
根据EGFR 21号外显子第858位突变(即L858R突变,c2573T>G),设计并合成本发明基于数字PCR技术用于检测EGFR基因L858R位点突变的引物对A和荧光探针B;具体序列如下:
引物对A包括上游引物和下游引物;
上游引物的核苷酸序列为:5’-CACCGCAGCATGTCAAGATCA-3’;
下游引物的核苷酸序列为:5’-CTTTGCCTCCTTCTGCATGGTAT-3’
荧光探针B包括突变型荧光探针和野生型荧光探针;
突变型荧光探针的核苷酸序列为:5’-TTGGGCGGGCCAAAC-3’;
野生型荧光探针的核苷酸序列为:5’-TTGGGCTGGCCAAAC-3’;
所述突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端第7位碱基均是经锁核酸修饰的碱基。
引物和探针的合成均由上海生工公司进行合成,使用HPLC级纯化。突变型荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM,3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1;野生型荧光探针的5’端含有荧光报告基团CY3,3’端含有荧光淬灭基团BHQ-2。荧光报告基团和淬灭基团还可以根据具体的平台进行合理选择。
实施例2:一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒
本发明提供的试剂盒包括:实施例1提供的引物对A、荧光探针B、阳性质控品、阴性质控品和反应预混液。
阳性质控品的制备方法为:人工合成两种分别含有突变位点野生型和突变型的长度为200bp的DNA片段,分别装入质粒载体pET-23d(+)(Promega)。使用Qubit 3.0进行定量,计算两种类型质粒的拷贝数浓度,根据拷贝数比例突变型:野生型=1:100混合两种质粒(含有1%L858R突变的DNA),之后通过超声将质粒混合物打断为约180bp的片段,定量到10ng/μL,作为阳性质控品。
阴性质控品由上述含有野生型的质粒单独构成(即只含有EGFR基因野生型的DNA),然后采用同样方法打断为约180bp的片段,定量到10ng/μL,作为阴性质控品。
反应预混液包括:dATP、dCTP、dGTP、dTTP、镁离子、BSA(牛血清白蛋白)、热启动Taq酶、单分子扩增增强剂;所述的单分子扩增增强剂包括甜菜碱2M、体积比为0.2%的TritonX-100、和热稳定焦磷酸酶0.1U。
其中,dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mM,BSA浓度为10μg/μL,热启动Taq酶浓度为1U。
实施例3:检测EGFR基因L858R位点突变的方法
采用实施例2所述试剂盒,按照表1建立PCR反应体系,按照ddH2O、反应预混液、探针、引物、模板DNA的顺序,将上述样品按照表1中反应体系加入到PCR管中,使用轻柔涡旋将混合体系混匀15s,并通过短时离心将溶液收集到试管底部。将配制好的反应体系上样到PCR芯片上,形成微反应单元。将芯片放入数字PCR仪中,按照表2中PCR反应条件进行PCR反应,选择FAM和CY3作为荧光检测的通道。
表1:反应体系
表2:PCR反应条件
扩增结束后,通过电脑分析,对两个通道的有效荧光阳性点进行判读,并对结果进行分析。
实施例4:标准品的检测
含突变基因的标准品制备方法:人工合成两种分别含有突变位点野生型和突变型的长度为200bp的DNA片段,分别装入质粒载体pET-23d(+)(Promega)。使用Qubit 3.0进行定量,计算两种类型质粒的拷贝数浓度。根据拷贝数比例突变型:野生型比例1:10、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000和1:3000(即突变率为10%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%和0.033%)进行混合,再将所得混合质粒打断为与ctDNA片段接近的180bp的片段化DNA;野生型标准品(对照组,Wild type)的制备方法为:将EGFR基因L858R野生型的DNA质粒打断为与ctDNA片段接近的180bp的片段化DNA;无模板样本对照(NTC)。
按照上述方法获得的8个突变标准品、1个野生型标准品对照和无模板样本对照(NTC)。分别用实施例3中的方法进行检测,实验重复3次。实验结果见表3。
表3:标准品的检测结果
由表3可知,本发明提供的试剂盒能够有效检测DNA终浓度为1ng/μL的样本,能够有效分辨低至1:3000的突变标准品,可检测出最低突变率为0.033%的EGFR基因L858R位点突变,能够顺利完成液体活检的技术要求,可以广泛应用于非小细胞肺癌EGFR突变型的早筛和治疗过程中的耐药检测。
实施例5:模板DNA终浓度对标准品检测的影响
利用实施例2中的试剂盒检测实施例4中的标准品,检测方法与实施例3所述方法的区别仅在于,反应体系中模板DNA的终浓度为0.5ng/μL或1.5ng/μL。
检测结果:当模板DNA的终浓度为0.5ng/μL和1.5ng/μL时,均能够有效分辨低至1:3000的突变标准品。
实施例6:上下游引物终浓度对标准品检测的影响
利用实施例2中的试剂盒检测实施例4中的标准品,检测方法与实施例3所述方法的区别仅在于,反应体系中上下游引物的终浓度为0.2μM或0.6μM。检测结果如表4、5所示(此处只展示低浓度检测结果)。
表4:引物浓度0.2μM的检测结果
表5:引物浓度0.6μM的检测结果
结果显示:当上下游引物的终浓度为0.2μM或0.6μM时,均能够有效分辨低至1:3000的突变标准品。
实施例7:探针终浓度对标准品检测的影响
利用实施例2中的试剂盒检测实施例4中的标准品,检测方法与实施例3所述方法的区别仅在于,反应体系中突变型探针和野生型探针的终浓度为0.1μM或0.4μM。检测结果如表6、7所示(此处只展示低浓度检测结果)。
表6:探针浓度0.1μM的检测结果
表7:探针浓度0.4μM的检测结果
结果显示:当突变型探针和野生型探针的终浓度为0.1μM或0.4μM时,均能够有效分辨低至1:3000的突变标准品。
实施例8:非小细胞肺癌患者的样品检测
利用实施例2中的试剂盒和实施例3中的方法对血液样品中的ctDNA进行检测,采样量为10mL。样品来源于6例临床确诊非小细胞肺癌患者,并经过EGFR-TKI治疗6-7个月的血液。该样本在使用本发明的方法检测的同时,还有一部分血液(9mL左右),送去专业检测公司使用NGS方法进行检测。NGS方法检测目前是该项检测项目的金标准,可以直接同本发明所述方法进行结果对比。
样本中ctDNA的提取方法为:从采血管中吸取1mL血液样本,利用ctDNA/RNA提取试剂盒(购自Aline Biosciences公司,货号:CFD-6001-50)对样本中的ctDNA进行提取,基于磁珠法,样本经蛋白酶消化后,经DNA结合,洗涤,ctDNA片段的选择及洗脱,就可以提取到高质量的循环ctDNA。ctDNA经质检及Qubit进行定量后确认总量不低于20ng,采用实施例2中的试剂盒按照实施例3中的方法进行检测,检测结果如表8:6例样本中有3例检测出突变,分别为1号样本突变率4.5%,2号样本突变率0.9%,5号样本1.1%。其余3例样本未检测出突变。
表8:6例临床样本的检测结果
样本编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
突变率检测结果(%) | 4.5 | 0.9 | 0 | 0 | 1.1 | 0 |
上述结果与NGS检测结果相符。实验结果说明,本发明提供的试剂盒能够满足临床液体活检要求,相对于NGS的检测方法,大大降低检测时间和成本。
本申请的发明人还对血清、血浆、外周血、胸腔积液、体液或者组织来源的DNA进行EGFR基因L858R位点突变的检测,其检测限也能达到1:3000,且重复性良好。
对比例1:
利用实施例2中的试剂盒检测实施例4中的标准品,检测方法与实施例3所述方法的区别仅在于,反应体系中上下游引物的终浓度为0.1μM。
检测结果:当反应体系中上下游引物的终浓度为0.1μM时,通过实时对阳性孔的荧光强度进行分析,发现阳性孔荧光强度达到可检测下限的循环数显著增加,且两个通道的阳性点数量也减少,说明反应效率明显降低,影响最终定量结果,能够有效分辨低至1:1000的突变标准品。
对比例2:
利用实施例2中的试剂盒检测实施例4中的标准品,检测方法与实施例3所述方法的区别仅在于,反应体系中突变型探针和野生型探针的终浓度为0.05μM。
检测结果:当反应体系中突变型探针和野生型探针的终浓度为0.05μM时,通过实时对阳性孔的荧光强度进行分析,发现阳性孔荧光强度达到可检测下限的循环数显著增加,反应完成时阳性孔的荧光强度也未达到平台期,且两个通道的阳性点数量也减少,说明体系中探针数量不足,影响结果检测,能够有效分辨低至1:500的突变标准品。
对比例3:一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒
该试剂盒与实施例2所述的试剂盒区别仅在于,突变型荧光探针和野生型荧光探针不经过锁核酸修饰。利用该试剂盒检测实施例4中的标准品,检测方法为实施例3所述的方法。
检测结果:当反应体系中突变型探针和野生型探针的终浓度为0.05μM时,通过实时对阳性孔的荧光强度进行分析,发现阳性孔荧光强度达到可检测下限的循环数显著增加,且两个通道的阳性点数量也减少,说明反应效率明显降低,影响最终定量结果,能够有效分辨低至1:500的突变标准品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司
<120> 一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒
<130> 2020
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
caccgcagca tgtcaagatc a 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ctttgcctcc ttctgcatgg tat 23
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ttgggcgggc caaac 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ttgggctggc caaac 15
Claims (10)
1.一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括引物对A和荧光探针B;
所述的引物对A包括上游引物和下游引物;
所述上游引物的核苷酸序列为:5’-CACCGCAGCATGTCAAGATCA-3’;
所述下游引物的核苷酸序列为:5’-CTTTGCCTCCTTCTGCATGGTAT-3’;
所述的荧光探针B包括突变型荧光探针和野生型荧光探针;
所述突变型荧光探针的核苷酸序列为:5’-TTGGGCGGGCCAAAC-3’;
所述野生型荧光探针的核苷酸序列为:5’-TTGGGCTGGCCAAAC-3’;
所述突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端第7位碱基均是经锁核酸修饰的碱基。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的荧光探针B的5’端含有荧光报告基团FAM和/或CY3,3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1和/或BHQ-2。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的突变型荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM,所述的突变型荧光探针的3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1;
所述的野生型荧光探针的5’端含有荧光报告基团CY3,所述的野生型荧光探针的3’端含有荧光淬灭基团BHQ-2。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品;
所述的阳性质控品含有1%L858R突变的DNA,所述的阴性质控品含有EGFR基因野生型的DNA。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括反应预混液,所述的反应预混液包括:dATP、dCTP、dGTP、dTTP、镁离子、BSA、热启动Taq酶和单分子扩增增强剂;
所述的单分子扩增增强剂包括甜菜碱2M、体积比为0.2%的TritonX-100、和热稳定焦磷酸酶0.1U。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述的反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mM,BSA浓度为10μg/μL,热启动Taq酶浓度为1U。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的试剂盒在制备用于检测肺癌患者EGFR基因是否发生L858R位点突变的产品中的应用。
8.根据权利要求1-6任意一项所述的试剂盒在制备用于检测肺癌患者服用EGFR-TKI是否发生耐药的产品中的应用。
9.一种利用权利要求1-6任一项所述的试剂盒检测EGFR基因L858R位点突变的方法,其特征在于,所述的方法包括如下步骤:
(1)制备数字PCR反应体系:将待测的DNA模板与权利要求1-6任一项所述的试剂盒中的引物对A和荧光探针B以及反应预混液混合,得到数字PCR反应体系;
所述的PCR反应体系如下:
a:DNA模板终浓度为0.5-1.5ng/μL;
b:引物对A的终浓度为0.2-0.6μM;
c:荧光探针B的终浓度为0.1-0.4μM;
(2)根据步骤(1)得到的数字PCR反应体系,制作PCR微反应单元,进行PCR扩增反应,得到扩增产物;
扩增条件为:95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃延伸30s,共进行40个循环;10℃终止反应;
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行荧光信号收集,根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有EGFR基因L858R位点突变的DNA模板及其数量和含量。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的PCR反应体系如下:
a:DNA模板终浓度为1.0ng/μL;
b:引物对A的终浓度为0.4μM;
c:荧光探针B的终浓度为0.2μM。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010127397.6A CN111206099A (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010127397.6A CN111206099A (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111206099A true CN111206099A (zh) | 2020-05-29 |
Family
ID=70783900
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010127397.6A Pending CN111206099A (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111206099A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113913514A (zh) * | 2020-07-09 | 2022-01-11 | 铭炽生物科技(上海)有限公司 | 人ctnnb1基因突变的数字pcr检测方法及应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106520931A (zh) * | 2016-10-17 | 2017-03-22 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒 |
CN108130362A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-08 | 安徽安龙基因科技有限公司 | 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用 |
CN108728537A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-02 | 广州永诺生物科技有限公司 | 一种检测人egfr基因21号外显子l858r位点突变的引物、试剂盒和方法 |
CN110066873A (zh) * | 2019-03-26 | 2019-07-30 | 德路通(石家庄)生物科技有限公司 | 基于数字pcr技术检测egfr基因l858r突变的特异性引物、探针及试剂盒 |
-
2020
- 2020-02-28 CN CN202010127397.6A patent/CN111206099A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106520931A (zh) * | 2016-10-17 | 2017-03-22 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒 |
CN108130362A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-08 | 安徽安龙基因科技有限公司 | 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用 |
CN108728537A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-02 | 广州永诺生物科技有限公司 | 一种检测人egfr基因21号外显子l858r位点突变的引物、试剂盒和方法 |
CN110066873A (zh) * | 2019-03-26 | 2019-07-30 | 德路通(石家庄)生物科技有限公司 | 基于数字pcr技术检测egfr基因l858r突变的特异性引物、探针及试剂盒 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113913514A (zh) * | 2020-07-09 | 2022-01-11 | 铭炽生物科技(上海)有限公司 | 人ctnnb1基因突变的数字pcr检测方法及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106520931B (zh) | Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
CN108949990B (zh) | 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法 | |
CN105349654B (zh) | 一种用于检测egfr基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒 | |
CN108642154A (zh) | 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用 | |
CN111206100A (zh) | 一种检测egfr基因t790m位点突变的试剂盒和方法 | |
CN111235272A (zh) | 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用 | |
CN112048560B (zh) | 一种多内参结合序贯概率比检验分析her2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法 | |
CN107988369A (zh) | 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒 | |
CN113718021A (zh) | 一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒 | |
CN108949961A (zh) | 用于检测腺病毒肺炎的试剂盒及其筛选 | |
CN111748628A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒 | |
CN110863053A (zh) | 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法 | |
CN111206099A (zh) | 一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒 | |
CN110408612B (zh) | 一种低浓度dna标准物质的保护剂、保存方法及应用 | |
CN111304329A (zh) | 一种检测braf基因v600e位点突变的试剂盒 | |
CN109321569B (zh) | 一种引物探针组合物及其应用 | |
CN108728538B (zh) | Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
CN108531598B (zh) | Ros1基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
CN115851935A (zh) | 一种用于met基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组和试剂盒 | |
CN111471751B (zh) | 一种可定量检测动物血液或组织中人源dna的方法 | |
CN107904289A (zh) | 提高egfr基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用 | |
CN111793675B (zh) | 一种用于egfr基因18外显子g719x突变检测的核酸序列、试剂盒及其应用 | |
CN112899365A (zh) | 一种肺癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒 | |
CN109811041A (zh) | 一种检测pik3ca基因h1047r位点的特异性引物对、探针及试剂盒 | |
CN110684849A (zh) | 基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200529 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |