CN111194210B - 一种利用纳米电穿孔和其他非内吞的细胞转染制备治疗性外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

含有高拷贝功能性核酸的治疗性细胞外囊泡(EV)通过将供体细胞放置在芯片表面，将各种质粒、其他转染载体及其组合添加到芯片上的缓冲液中，对放置在芯片表面顶部的细胞和芯片表面下方的质粒/载体缓冲溶液施加脉冲电场，收集转染细胞分泌的多个EV的方法而大量生产。所述芯片表面上具有在其上形成的三维(3D)纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片，能够处理大量供体细胞。所述缓冲液适用于接收质粒和其他转染载体。

Description

一种利用纳米电穿孔和其他非内吞的细胞转染制备治疗性外 泌体的方法

技术领域

本发明涉及通过将DNA质粒和其他载体非内吞的递送至供体细胞中来制备治疗性细胞外囊泡(EV)，特别是外泌体的方法，所述EV包含功能性信使RNA(mRNA)、microRNA(miR)、短发夹RNA(shRNA)、蛋白质和其他生物分子，其方式是由递送引起的强烈刺激触发供体细胞在细胞内产生大量的囊泡，而DNA质粒和载体的非内吞递送会引起细胞质内快速RNA转录和蛋白质翻译，使这些功能性生物分子在作为EV从供体细胞分泌出来前内源性地封装在囊泡中。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)包括外泌体、微囊泡和其他囊泡，可由多种细胞分泌。在人体中，1mL血液中有>10E12个EV，它们也存在于其他体液中。外泌体为一种纳米囊泡(40-150nm)，而微囊泡的大小为<100nm至>1微米不等。它们包含编码和非编码RNA及其片段、DNA片段、蛋白质和其他与细胞有关的生物分子。EV及它们的生物分子内容物已被提出作为疾病诊断的生物标记。此外，它们对于肿瘤微环境和循环中的细胞间通讯也具有重要意义。

载有功能性RNA和蛋白质的EV也被提出用于治疗用途的药物和药物载体。为了能在体外和体内将特异性核酸和/或蛋白质递送至靶组织或细胞类型中，需要能够制备具有内源性或外源性治疗性货物(cargo)EV的方法。

近年来，已开发了通过常规的批量电穿孔(BEP)将外源小干扰RNA(siRNA)和shRNA质粒后***预先存在的外泌体中。尽管已在几种癌症和非癌症疾病的小鼠模型中成功证明了它们的治疗功能，但该方法仍面临许多局限性。首先，将大生物分子(如DNA质粒、mRNA和蛋白质)后***至纳米大小的外泌体是低效率的。其次，BEP产生的强电场会分解许多外泌体，导致治疗性外泌体的产量较低。此外，许多大生物分子，例如mRNA和蛋白质，外源合成是困难和昂贵的。

如果可以开发出可以用DNA质粒或其他载体转染供体细胞以内源性地产生大量含有治疗性RNA和蛋白质靶标的外泌体或其他EV的新方法是十分理想的。

在早先的美国专利申请14/282630中，我们开发了一种纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片，该芯片可通过优良的剂量管控将DNA质粒或其他带电粒子和分子非内吞地递送至单个细胞中。在此，我们证明了NEP可以产生大量含有高拷贝的功能性mRNA和microRNA靶标的治疗性外泌体，而此通过上述后***法是无法实现。除NEP以外，其他非内吞的递送方法(如基因枪、微/纳米注射等)也可以实现类似的效果，但前提是它们需要提供恰当的细胞刺激和快速的质粒/载体递送。

发明内容

本发明涉及新概念和方法的开发，该新概念和方法利用强烈的细胞刺激，可以将DNA质粒和其他载体非内吞地递送至供体细胞中，从而在转染细胞内形成大量的囊泡和转录的RNA以及翻译的蛋白质。细胞会分泌许多含有特定RNA和具有治疗功能的蛋白质靶标的细胞外囊泡(EV)。

为了证明上述设计概念，制造了三维(3D)NEP生物芯片，其可以用预先指定的DNA质粒转染许多供体细胞，以分泌10～100倍包括外泌体在内的多个EV。这些EV含有比从未转染的供体细胞分泌的EV多数千倍的完整的高拷贝mRNA和miR靶标。

本发明的一个方面为一种制备大量含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(EV)的方法。这样的方法包括以下步骤：

将供体细胞放置在芯片的表面上，所述表面具有在其上形成的三维(3D)纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片；

将各种质粒、其他转染载体及其组合添加到芯片上的缓冲液中；

对放置在芯片表面顶部的细胞和芯片表面下方的质粒/载体缓冲溶液施加脉冲电场，使细胞受到强烈刺激并将质粒/载体以非内吞的方式递送至细胞中；和

收集转染细胞分泌的多个EV。

在一些方法中，纳米通道的直径在50-900nm之间。

在一些方法中，其中所述质粒和载体转录mRNA、microRNA、shRNA和其他RNA，并引起蛋白质和其他生物分子在转染细胞中的翻译。

在一些方法的实施例中，由转染细胞分泌的EV包含转录的mRNA、microRNA、shRNA和其他RNA、以及翻译的蛋白质和其他生物分子。

在一些方法的实施例中，其中将增强热休克蛋白和促进转染细胞中的囊泡形成和胞吐作用的其他蛋白的表达的方法添加到***中，其中所述方法包括细胞的热休克处理，或在细胞培养基中添加热休克蛋白。

在一些实施例中，将增强促进转染细胞中外泌体形成的蛋白的表达的方法添加到***中，其中所述方法包括CD63、CD9和其他DNA质粒的共转染。

在一些实施例中，将多个DNA质粒和其他载体连续地递送至转染细胞，以促进RNA/蛋白质靶标的共定位和EV分泌。

在一些实施例中，将诸如DNA质粒、其他转染载体、RNA、蛋白质/肽、小分子药物的外源生物分子封装在细胞内的囊泡中，和通过NEP连续的进行供体细胞的转染，作为治疗性EV分泌出来。在一些情况中，除了NEP以外，使用其他细胞转染方法用于制备具有相似功效的治疗性EV，所述其他细胞转染方法为供体细胞提供强烈刺激，以促进EV分泌和非内吞的质粒/载体递送，用于实现快速的RNA转录和蛋白质翻译。在另一些情况中，其他细胞转染方法包括基因枪、微注射或纳米注射。

在一些实施例中，将所述质粒和/或其他载体系留(tether)在纳米或微米大小的金或其他固体颗粒上，和使用基因枪在气动力(pneumatuc force)作用下将那些颗粒注入供体细胞中，以引起强烈的细胞刺激和非内吞的质粒/载体递送。

在一些实施例中，将所述质粒和/或其他载体系留在纳米或微米大小的尖端阵列上，和通过这些尖端挤压供体细胞，以引起强烈的细胞刺激和非内吞的质粒/载体递送至供体细胞中。

本发明的其他方面通过用于大量制备含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(EV)的装置而实现，所述装置包括：芯片，所述芯片具有三维(3D)纳米通道电穿孔(NEP)的生物芯片和在其上形成的用于接收的缓冲液，所述缓冲液适用于接收质粒和其他转染载体。

本发明的其他方面包括通过任何上述方法转染的细胞。

附图说明

参考以下附图可以更好地理解本发明的许多方面。附图中的组件无需按比例，而是将重点放在清楚地说明本发明的原理上。在附图中：

图1为用于供体细胞转染的3D纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片的示意图；

图2显示了使用Yoyo-1荧光标记的Achaete-Scute复合体类似物-1(Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1))DNA质粒(一种神经元相关基因)，在转染1后小时，基于BEP和NEP的细胞转染的对比；

图3显示了含有或不含有DNA质粒的NEP细胞转染均能显著地刺激来自转染的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的EV分泌，其性能远优于基于脂质体(Lipo)和BEP的细胞转染。Ctrl代表未转染的MEF细胞；NEP代表利用DNA质粒的NEP细胞转染；NEP-PBS代表仅利用PBS缓冲液的NEP细胞转染。所用的DNA质粒是Achaete-Scute复合物类似物-1(Ascl1)、Pou结构域3类转录因子2(Pou Domain Class 3Transcription factor 2，(Pou3f2或Brn2))和髓鞘转录因子1类似物(Myelin Transcription Factor 1Like(Myt1l))，其重量比为2/1/1。这些DNA质粒的混合物已知可将供体细胞重编程为诱导神经元(iN)；

图4显示了热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白90(HSP90)抑制剂对来自NEP转染的MEF细胞的EV分泌的影响。在NEP转染后，将细胞培养基替换为含有HSP70抑制剂(VER155008、50μM)、HSP90抑制剂(NVP-HSP990、1μM)或其混合的新鲜培养基。转染后24h收集培养基，并通过动态光散射(DLS)测角法测定EV量；

图5显示了CD63 DNA质粒的NEP转染对MEF细胞EV分泌的影响。通过NEP转染含有或不含有CD63质粒的细胞。每4小时收集细胞培养基并用新鲜培养基替换。通过DLS测角法测定EV量；

图6显示了细胞转染后24小时通过DLS测量的获得的实施或不实施NEP的EV的大小分布图；

图7表明了转染24小时后通过qRT-PCR测定来自MEF细胞的EV Ascl1 mRNA的表达，所述MEF细胞使用不同技术以2/1/1的比的Ascl1/Brn2/Myt1l DNA质粒转染；

图8显示了转染24小时后通过qRT-PCR测定来自MEF细胞的EV Brn2 mRNA的表达，所述MEF细胞使用不同技术以2/1/1的比的Ascl1/Brn2/Myt1l DNA质粒转染；

图9显示了转染24小时后通过qRT-PCR测定来自MEF细胞的EV Myt1l mRNA的表达，所述MEF细胞使用不同技术以2/1/1的比的Ascl1/Brn2/Myt1l DNA质粒转染；

图10显示了只有通过NEP获得的EV含有通过体外翻译确定的功能性mRNA；

图11显示了来自NEP的EV-mRNA存在于外泌体中，而不存在于微囊泡中。

图12显示了来自NEP细胞转染的外泌体mRNA，而非微囊泡RNA，可以翻译蛋白质；

图13显示了NEP转染的MEF细胞的EV-mRNA分泌图；

图14描述了通过膜片钳的动作电位检测，其显示了利用Ascl1/Brn2/Myt1l mRNA隔天转染而从NEP获得含有EV的MEF细胞，24天后可被重新编程为功能性诱导神经元(iN)；

图15显示了转染后24小时通过qRT-PCR检测来自MEF细胞的EV miR-128的表达，所述MEF细胞使用不同技术通过miR-128DNA质粒转染；

图16为通过NEP将DNA质粒转染至MEF细胞而分泌的含有miR-128的EV与通过BEP后***加载了预先收集的miR-128的现有EV的对比；

图17为通过NEP将DNA质粒转染至MEF细胞而分泌的含有Brn2 mRNA的EV与通过BEP后***法加载了预先收集的Brn2 mRNA的现有EV的对比；以及

图18显示了通过连续NEP在同一EV中增加的mRNA共定位。对于NEP转染，Ascl1、Brn2和Myt1l质粒如上所述在同一时间转染。对于连续NEP，首先转染Myt1l质粒，Brn2质粒在4小时后转染，而Ascl1质粒在Brn2转染4小时后转染。在Myt1l转染后24小时，收集培养基用于TLN试验。将等量的FAM-Ascl1、Cy3-Brn2和Cy5-Myt1l MB封装在系留的脂质复合物纳米颗粒中，用于EV-mRNA检测。黄色箭头：包含3种mRNA的EV；蓝色箭头：包含2种mRNA的EV；粉色箭头：包含1种mRNA的EV。

具体实施方式

示例1-3D NEP生物芯片示意图和使用不同转染方法的EV分泌和EV mRNA含量的对比

图1显示了具有放置在芯片表面的单层供体细胞的3D NEP生物芯片的示意图。细胞孵育过夜后，通过纳米通道将预先加载的DNA质粒PBS缓冲液注入到单个供体细胞中，并在纳米通道上施加220伏的电场。可以选择不同的电穿孔条件，如电压水平、脉冲数和脉冲长度。

使用Yoyo-1荧光染料标记的Achaete-Scute复合体类似物-1(Ascl1)DNA质粒，图2显示利用BEP或NEP转染后1小时，在488nm的波长下使用荧光显微镜的转染细胞成像。使用NIS软件测定荧光强度。两组荧光强度的对比通过条形图给出。结果表明，在制造商建议的最佳条件下BEP比在220V电压下施加5个10ms的脉冲的NEP向MEF细胞递送近3倍多的质粒。但在BEP转染后1小时，大部分质粒仍接近细胞表面，而NEP注射的质粒在同一时间已均匀散布在细胞质内。这意味着基于BEP的细胞转染主要依赖于电穿孔介导的内吞作用，而基于NEP的细胞转染是非内吞的。

图3比较了通过脂质体(Lipo)、BEP或NEP以2/1/1重量比转染相同的Ascl1、Brm2和Myt1l DNA质粒的相同数量的MEF细胞(5E6个细胞)所分泌的EV数。转染后24小时，从细胞培养基中收集所有EV，并通过NanoSight^TM测定总EV量。对于BEP，转染电压为1250V，1个30ms脉冲。对于NEP，转染电压为220V，5个10ms脉冲。所用质粒的浓度为Ascl1/Brn2/Myt1l＝200/100/100ng/μl。对于脂质体转染，按照制造商说明书，使用5μg质粒混合物(Ascl1/Brn2/Myt1l＝2/1/1)。在1500g下通过简单离心分离10分钟，从细胞培养基中收集EV。结果表明，基于脂质体转染(Lipo)的细胞转染不会改变EV的分泌。转染或未转染的EV浓度约为2E9/ml。显然，纳米颗粒载体对质粒的缓慢内吞作用过程不会对转染细胞产生太多的刺激，因此，EV分泌几乎没有变化。相比之下，基于BEP的细胞转染则导致分泌更多的EV，达到通过添加或不添加质粒的NEP细胞转染，可以观察到EV分泌会显著增加至>1.3E11/ml。这意味着转染细胞在某种程度上受到BEP的刺激，但在受到NEP的高度刺激后，后者引起EV非常显著的增加。

在电穿孔过程中，由施加的电场引起的焦耳热可能会暂时提高细胞温度，而对转染细胞造成热休克。已知热休克可由于细胞内热休克蛋白的增加而引起伴侣蛋白介导的自噬，而增加EV的细胞分泌(8-10)。实际上，我们发现NEP可以使转染的MEF细胞相较于未转染的MEF细胞(Ctrl)中的热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白90(HSP90)的表达分别大幅地增加13.8倍和4.2倍。在电穿孔后将HSP抑制剂添加到细胞培养基中时，可以抑制EV的分泌。图4显示了利用HSP 70抑制剂(VER 155008，50μM)、HSP90抑制剂(NVP-HSP990，1μM)及其混合将NEP转染的MEF细胞的EV分泌分别降低了50％、40％和70％。在此，在NEP转染后，立即使用含有HSP70抑制剂(VER 155008)、HSP90抑制剂(NVP-HSP990)或其混合的新鲜培养基代替细胞培养基。转染后24小时收集培养基，并通过动态光散射(DLS)测角法测量EV量。这些结果显示，任何可以增加热休克蛋白表达的细胞刺激都会增强EV的分泌。

类似地，细胞中晚期内体多囊泡小体(MVB)形成所需的蛋白质的增加也可能促进外泌体的分泌。图5显示了CD63 DNA质粒的NEP转染对MEF细胞EV分泌的影响。用NEP转染含有或不含有CD63 DNA质粒的细胞。每4小时收集细胞培养基并用新鲜培养基替换。通过DLS测角法测定EV量。结果表明，在NEP转染后的前16小时内，两种情况下EV的分泌情况相似。但是，含CD63 DNA质粒的NEP转染后16至44小时，分泌了更多的EV。CD63蛋白是内体膜重组为富含四跨膜蛋白的微区所必需的，所述CD63蛋白是外泌体分泌的前体。

图6显示了通过DLS测角法测量的MEF(ctrl)和NEP转染的MEF分泌的EV大小分布。NEP刺激并未太多地改变较大的EV(主要是微囊泡)的分布，但大幅地增加了大小在40至110nm的外泌体的分泌。

图8-9显示了使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确定由Ascl1、Brn2、Myt1lDNA质粒的NEP细胞转染而分泌的EV含有大量相应的Ascl1、Brn2、Myt1l mRNA或其片段。与EV量相似，基于脂质体的细胞转染并没有太多地改变mRNA的表达，但基于BEP的细胞转染可使mRNA表达增加数倍。相比之下，基于NEP的细胞转染导致靶标mRNA数千倍的增加。在此，获得了相同数量的总RNA，并且根据制造商的说明书使用qRT-PCR进行逆转录。

图10显示了某些EV mRNA是完整且具有功能性，因为其能够翻译Ascl1、Brn2和Myt1l蛋白。在此，根据制造商的说明书，使用兔网织红细胞裂解***(RabbitReticulocyte Lysate System(Promega))将来自每种转染方法的相同数量的总RNA(1μg)应用于体外蛋白质翻译。用SDS-PAGE分离样品，并用不同抗体检测蛋白质，如免疫印迹图所示。

对于收集的总EV，通过10,000g下30分钟超速离心分离对较大的微囊泡进行分选。将上清液进一步以100,000g离心2小时收集较小的外泌体。从上述两个部分中收集总RNA。使用Nanodrop^TM测定总mRNA浓度，同时使用qRT-PCR测量Ascl1、Brn2和Myt1l mRNA的ABM表达。图11显示外泌体中的RNA比微囊泡中的RNA多两倍以上，但大多数Ascl1、Brn2和Myt1lmRNA仅存在于外泌体中。图12显示功能性Asc1、Brn2和Myt1l mRNA也存在于外泌体中，并且那些外泌体携带典型的外泌体蛋白质标志物、CD9、CD63和Tsg101。相比之下，较大的微囊泡携带典型的蛋白质标记物、Arf6。

图13显示了利用Ascl1、Brn2和Myt1l DNA质粒进行NEP转染后，EV分泌和内容物随时间的变化的谱图。Ascl1质粒是三者中最小的一个(7k bp)，Mytl1质粒则是最大的(9kbp)，Brn2质粒介于两者之间(8k bp)。在指定的时间点收集细胞培养基中的EV，用新鲜培养基替换培养基。使用上述DLS测角法测定EV量，同时如上所述使用qRT-PCR测定EV mRNA表达。结果表明，转染后4小时内EV分泌迅速增加，并在8小时时达到峰值，EV持续分泌超过24h。含有Ascl1和Brn2 mRNA的EV也在转染后4小时内出现，其谱图与EV分泌的谱图相匹配。含有Myt1l mRNA的EV出现时间较晚，但仍在24小时内。这意味着细胞中的EV分泌时间和mRNA转录时间需要相匹配，而这可以通过基于NEP的细胞转染来实现。

为了证明NEP产生的含有内源性mRNA的EV具有治疗功能，我们每隔一天用这些EV处理MEF细胞，总EV RNA浓度为每100,000个细胞1μg。几天后，处理过的MEF细胞开始表现出神经元样形态，并且在24天，处理过的细胞显示出电生理活性，如图14所示，表示为其受诱导动作电位的能力。相比之下，NEP转染的MEF在第21天也表现出类似的电生理活性。细胞展示出必要的电压门控电流以激发动作电位。在去极化电压模拟中，观察到瞬时向内电流和持续向外电流。对20pa电流注入的典型响应如图14所示，表明细胞响应去极化电流激发了动作电位。

采用全细胞膜片钳记录法测定应激性。用含有115mM NaCl、2mM KCl、1.5mMMgCl₂、3mM CaCl₂、10mM HEPES和10mM葡萄糖(pH7.4)的细胞外浴液连续灌注(superfuse)细胞。在玻璃电极(3-4MΩ)中充满含有115mM葡萄糖酸钾、10mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、4mM NaCl、0.5mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1.5mM MgCl₂的移液管溶液(pH 7.3)。获得全细胞通路后，细胞的贴片电阻>100MOhm，串联电阻补偿40-50％。使用Axopatch 200B放大器、Digidata 1322A数字转换器和Clampex 9软件(分子设备，桑尼维尔，加利福尼亚州(Molecular Devices,Sunnyvale,CA))收集数据。为了分析电压门控电流，基础保持电位为-70mV，在-120mV至80mV时对细胞进行以10mV的增量步进400ms。由于电压门控钠通道的活动，从测量峰值振幅中分离出瞬时内向电流。反映电压门控钾电流的持续平台电流被测量为电流平台相中电压阶跃的最后50ms的平均值。用电流钳测量动作电位感应。电流保持在0pA，然后以20pA为间隔步进1秒。

示例2-使用不同转染方法的EV MicroRNA含量

为了证明更广泛的治疗适用性，我们还用一种DNA质粒转染了MEF细胞，所述质粒将在细胞中转录microRNA靶标。图15显示了利用各种技术转染(miR-128质粒)后24小时从细胞培养基获得的EV的EV miR-128的表达。总RNA按制造商的说明书获取。同样数量的总RNA(30n g)用于miR-128的检测，该检测使用上述程序通过qRT-PCR进行。同样，基于NEP的转染能够产生含有大量miR-128的EV(增加了4500倍以上)，这是基于BEP或脂质体的细胞转染所不能实现的。

示例3-通过NEP将DNA质粒转染至MEF细胞而获得的含有内源性RNA的多个EV与通过BEP后***装载预先收集的RNA的现有多个EV的对比

在此，我们比较了使用我们基于NEP的细胞转染和其他研究者使用的BEP后***法生产的多个治疗性EV的功效。对于前者，根据上述程序，将miR-128质粒与CD63-GFP质粒通过NEP共转染至MEF细胞，生成含有miR-128的多个EV。对于后者，首先在NEP后24h从转染CD63-GFP质粒的MEF细胞中获得空白EV。同时，通过NEP转染后24小时从转染miR-128质粒的MEF细胞中收集miR-128。按照其他研究人员使用的条件，将收集的miR-128(1μg)与空白EV(10E6)混合，并用BEP(1250V，30ms)进行电穿孔。在全内反射荧光(TIRF)显微镜上使用系留的脂质体纳米颗粒(TLN)生物芯片测试来自这两种方法的多个EV。图16A显示了TLN-TIRF试验的示意图(2.11)。简而言之，设计用于RNA靶标的分子信标(MB)，并将其封装在阳离子脂质体纳米颗粒中。这些阳离子脂质复合物纳米颗粒被系留在载玻片上，所述载玻片能够通过静电相互作用捕获带负电的多个EV，从而形成更大的纳米级复合物。脂质复合物-EV融合物会导致在生物芯片界面附近的RNA和MB在纳米尺度的限制内混合。TIRF显微镜能够检测单个生物分子和测量靠近界面<300nm的信号，而该处是系留脂质体纳米颗粒所在的位置。

图16B为捕获的EV的代表性TLN-TIRF图像。绿色荧光来自含有CD63-GFP的多个EV，而红色荧光来自捕获的多个EV中的miR-128分子与Cy5-miR128 MB的杂交。显然，我们的NEP方法比BEP后***方法能够产生更多的含有更高拷贝的miR-128的EV。图16C-E显示了这两种方法的定量对比。尽管两种方法都能产生含有miR-128的多个EV(约占捕获多个的EV的80％)，但基于NEP的直接细胞转染的多个EV中的EV miR-128浓度要比基于BEP的microRNA后***法中的EV miR-128浓度高得多(约3倍MB荧光强度)。此外，BEP后***法往往会破坏近一半的空白EV，导致治疗性EV的产量非常低。

使用与miR-128同样的方法，对更大的RNA、Brn2 mRNA(Brn2 mRNA的6272个碱基相对于miR-128的21个碱基)也进行相似的对比。图17显示我们的NEP方法可以产生>70％含有Brn2 mRNA的多个EV，而通过BEP后***方法，只有极少数存在的EV可以装载相同的mRNA。NEP产生的多个EV中Brn2 mRNA的浓度很高，而在BEP后***法中其浓度却很低。

示例4-通过DNA质粒连续NEP转染至MEF细胞，改善同一分泌的多个EV中的多mRNA共定位

图13表明，由于质粒的大小差异或其他原因，即使同时将多个DNA质粒递送至细胞中，不同的mRNA靶标也可以以不同的时间和速率在转染细胞中被转录。这可能导致个别EV仅包含一个或少量mRNA靶标。为了获得更好的治疗效果，如果可以将更多或所有mRNA靶标封装在同一分泌的多个EV中，将是有价值的。根据转录时间使用NEP将每个DNA质粒连续递送到MEF细胞，图18显示我们可以大幅地增加含有所有三种mRNA，即Ascl1、Brn2和Myt1l(>50％对于<25％)的分泌的EV，所述分泌的EV为重新编程iN所需。对于NEP转染，如前所述，在同一时间转染Ascl1、Brn2和Myt1l质粒。对于连续NEP，首先转染Myt1l质粒，4h后再转染Brn2质粒，而Ascl1质粒在Brn2转染后4小时转染。在Myt1l转染后24小时，收集培养基用于TLN试验。将等量的FAM-Ascl1、Cy3-Brn2和Cy5-Myt1l MB封装在系留的脂质复合物纳米颗粒中，以用于EV-mRNA检测。在图中，黄色箭头表示含有所有3种mRNA的EV，蓝色箭头表示含有2种mRNA的EV，而粉红色箭头表示仅含有1种mRNA的EV。

虽然本发明仅就其优选实施例进行了说明，但应当理解，在阅读本说明书时，所做出的各种修改对本领域技术人员来说都是显而易见的。因此，应当理解，本文所公开的发明旨在包括属于所附权利要求范围内的修改。

Claims (15)

1.一种大量制备含有高拷贝功能性核酸的治疗性细胞外囊泡（EV）的方法，包括：

将供体细胞放置于形成的三维（3D）纳米通道电穿孔（NEP）生物芯片的第一表面上；

将若干载体添加到与三维纳米通道电穿孔生物芯片的第二表面接触的缓冲液中，其中若干通道将所述三维纳米通道电穿孔生物芯片的第一表面与所述三维纳米通道电穿孔生物芯片的第二表面连接，其中所述若干通道被定位为使得所述若干通道中的单个通道接触单个供体细胞；

对所述若干通道施加脉冲电场，使细胞受到刺激并将若干载体以非内吞的方式递送至所述供体细胞中；

收集转染所述供体细胞分泌的多个EV。

2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述若干通道中的单个通道的直径在50-900 nm之间。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述若干载体被转录成mRNA、microRNA或shRNA，或者其中所述多个载体被转录并翻译成供体细胞中的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述由供体细胞分泌的多个EV包含转录的mRNA、microRNA、shRNA或翻译的蛋白质。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括：加入增强促进细胞中的囊泡形成和胞吐作用的热休克蛋白的表达的方式；其中所述方式包括细胞的热休克处理，或在细胞培养基中添加热休克蛋白。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括将供体细胞与CD63或CD9共转染。

7.根据权利要求1所述的方法，其中将多于1个载体连续地递送至供体细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中包含DNA质粒、质粒以外形式的载体、RNA、蛋白质/肽或小分子药物的外源生物分子封装在供体细胞内的囊泡中，并作为EV分泌出来。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括其他细胞转染方法。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述其他细胞转染方法包括基因枪、微注射或纳米注射。

11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述载体系留在纳米或微米大小的金或其他固体颗粒上，并使用基因枪在气动力的作用下将这些颗粒注射到所述供体细胞中，以引起强烈的细胞刺激和非内吞的载体递送。

12.根据权利要求10所述的方法，其中将所述载体系留在纳米或微米大小的尖端阵列上，并通过所述尖端阵列穿透供体细胞以引起强烈的细胞刺激和非内吞的载体递送至供体细胞。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在施加脉动电场后最多24小时内收集所述EV。

14.根据权利要求1所述的方法，其中在施加脉动电场后最多48小时内收集所述EV。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体包括质粒。