WO2022245098A1 - 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법 - Google Patents

세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법 Download PDF

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유가은
이정선
장송선
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Definitions

  • the present invention relates to immune cells with enhanced secretion of extracellular vesicles and immuno-cancer therapy using the same.
  • Immunotherapy is a treatment method that minimizes side effects by using the characteristics of immune cells in the body and strengthens the immune response so that the patient's body fights against cancer cells. It can be divided into therapeutic antibodies and immune cell therapy. Among them, with the development of genetic engineering technology, interest in immune cell therapy is rapidly increasing.
  • Immune cell therapy is a cell therapy method in which immune cells are extracted from the body, strengthened or genetically modified, and put back into the human body. It is also called adoptive cell transfer (ACT).
  • Representative methods for enhancing cellular immunity against cancer cells include tumor infiltrating lymphocyte (TIL), chimeric antigen receptor (CAR), and T-cell receptor (TCR) technologies.
  • TIL tumor infiltrating lymphocyte
  • CAR chimeric antigen receptor
  • TCR T-cell receptor
  • genetically modified T cells expressing CAR are rapidly emerging as innovative therapeutic agents for the treatment of hematological or non-hematologic tumors.
  • CAR-expressing gene-modified immune cell therapy can induce a rapid and sustainable clinical response, but on the other hand, it can cause unique acute toxicities and is vulnerable to immunosuppressive mechanisms. The point remains as a problem to be solved.
  • the extracellular endoplasmic reticulum is a nano-vesicle with a size of several tens of nm to hundreds of nm made of a double lipid membrane and is composed of substances having biological activity such as proteins, lipids, and genes.
  • these extracellular vesicles were considered as debris secreted from cells, but recently, as the clinical significance of extracellular vesicles has emerged, various studies have been conducted.
  • extracellular vesicles secreted from CAR-expressing immune cells (so-called CAR exosomes) contain CAR on their surface, express high concentrations of cytotoxic substances, and effectively inhibit tumor growth, similar to conventional CARs.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a technology capable of increasing the secretion of extracellular vesicles in immune cells, and as a result, it was confirmed that the secretion of extracellular vesicles of immune cells can be remarkably increased by enhancing the activity of extracellular vesicle secretion-stimulating proteins. Thus, the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to provide an immune cell with enhanced secretion of extracellular vesicles and a method for preparing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising, as an active ingredient, CAR-expressing immune cells with enhanced secretion of extracellular vesicles, a lysate thereof, or a culture thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing the secretion of extracellular vesicles, including an agent for inducing the expression of extracellular vesicle secretion-stimulating proteins.
  • Immune cells with enhanced secretion of extracellular vesicles according to the present invention particularly CAR-expressing cells with enhanced secretion of extracellular vesicles, lysates thereof, or cultures thereof can be usefully used for immunotherapy with improved stability and/or efficacy. have.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a gene for stimulating extracellular vesicle secretion and a recombinant vector containing the same.
  • Figure 2 shows the results of confirming whether or not genome integration in T cells after gene introduction of extracellular vesicle secretion stimulating proteins.
  • Figure 3 shows the result of confirming the amount of mRNA expression in T cells after gene introduction of the extracellular vesicle secretion stimulating protein.
  • Figure 4 shows the results of confirming the T cell content rate (CD3) protein production rate (GFP) in T cells after gene introduction of the extracellular vesicle secretion stimulating protein.
  • CD3 T cell content rate
  • GFP protein production rate
  • Figure 5 shows the result of confirming the size of the extracellular vesicles generated in T cells after gene introduction of the extracellular vesicle secretion stimulating protein.
  • Figure 6 shows the results of confirming the relative number of extracellular vesicles produced in T cells after gene introduction of extracellular vesicle secretion stimulating proteins.
  • FIG. 7 shows images of extracellular vesicles produced in T cells after gene introduction of extracellular vesicle secretion stimulating proteins.
  • Figure 8 shows the results of confirming the continuous release of extracellular vesicles in T cells after gene introduction of extracellular vesicle secretion stimulating proteins.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of a combination of an extracellular vesicle secretion stimulating gene and a CAR gene and a recombinant vector containing the same.
  • FIG. 10 shows the expression of extracellular vesicle secretion stimulating mRNA and CAR mRNA expression in T cells when a recombinant vector containing a combination of an extracellular vesicle secretion stimulating gene and a CAR gene is used.
  • FIG 11 shows that the use of a recombinant vector containing a combination of extracellular vesicle secretion stimulating DNA and CAR DNA increases the production of CAR-T-EVs (T-cell EV expressing a CAR that binds to MSLN) in T cells.
  • CAR-T-EVs T-cell EV expressing a CAR that binds to MSLN
  • Each shows the number of extracellular vesicles and the content of CAR in the extracellular vesicles.
  • MSLN Mesothelin
  • the present inventors first discovered that when MAL, CD9 or a combination thereof is overexpressed in immune cells, the extracellular vesicle secretion ability of immune cells is significantly increased, and by using this in CAR expressing cells, the conventional It was noted that the efficacy and stability of immuno-anticancer agents can be improved. Accordingly, the present invention provides the discovery of an extracellular vesicle secretion stimulating protein, a cell with enhanced extracellular vesicle secretion using the same, and a CAR expressing cell using the extracellular vesicle secretion stimulating protein.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is an immune cell in which the activity of an extracellular vesicle secretion-stimulating protein is enhanced compared to non-mutated cells, thereby enhancing the secretion of extracellular vesicles.
  • extracellular vesicle refers to a carrier composed of lipids discharged by cells into the extracellular space, and is a broad concept including microvesicles, exosomes, and the like.
  • the extracellular vesicle secretion stimulating protein refers to a protein capable of enhancing the extracellular vesicle secretion ability when the activity is enhanced in the cell compared to the original cell.
  • the extracellular vesicle secretion stimulating protein refers to MAL (myelin and lymphocyte protein) and/or CD9.
  • MAL is a tetraspanning membrane protein, and is known to be located in the myelin of cells in the nervous system and to be involved in myelin biosynthesis and function. MAL is known to have different expression patterns in immune cells (T cells, NK cells, etc.) and nerve cells (oligodendrocytes and Schwann cells, etc.) in a cell-dependent manner.
  • immune cells T cells, NK cells, etc.
  • nerve cells oligodendrocytes and Schwann cells, etc.
  • CD9 is a membrane protein belonging to the tetraspanin family and is involved in various biological processes such as adhesion, cell mobility, membrane fusion, signal transduction, and protein trafficking. known to be involved in
  • MAL is a protein specialized in forming tetraspanin-rich microdomains that produce extracellular endoplasmic reticulum
  • MAL is a membrane-modifying protein that helps tetraspanin microdomains exit the cell in the form of extracellular vesicles. function is strong. Therefore, it is thought that the secretion of extracellular vesicles was promoted while synergistically expressing some functionally different CD9 and MAL proteins together.
  • Amino acid sequence information of MAL and CD9 can be appropriately obtained by searching known literature or a database such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).
  • MAL of the present invention may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • CD9 may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but are not limited thereto.
  • a lentiviral vector overexpressing a nucleic acid encoding the MAL protein and/or a nucleic acid encoding the CD9 protein was constructed, and the vector was transduced into primary T cells to enhance MAL and/or CD9 activity.
  • Immune cell lines were obtained (Example 1 and Example 2). Then, as a result of confirming the number of extracellular vesicles generated in the culture of the immune cells, in cells with enhanced MAL or CD9 activity, the number of extracellular vesicles increased at least twice as compared to the control group, and MAL and CD9 were simultaneously overexpressed.
  • the term "enhancement" of protein activity means to improve the activity state of proteins possessed by cells. Since the core of the present invention is that the extracellular vesicle secretion ability can be increased by enhancing the activity of MAL and/or CD9 in immune cells, the enhancement of the activity of the protein in the present invention will enhance the activity of the target protein compared to non-mutated cells. As far as possible, the method is not particularly limited.
  • the enhancement of the activity is i) an increase in the copy number of the nucleic acid encoding each protein, ii) modification of the expression control sequence to increase the expression of the nucleic acid, iii) the nucleic acid sequence on the chromosome so that the activity of each protein is enhanced modification and iv) a combination thereof.
  • a method of inserting/integrating a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding each protein into a chromosome a method of introducing the nucleic acid into a cell by introducing the nucleic acid into a vector system, and an improved activity upstream of the nucleotide sequence encoding each protein.
  • the enhancement of the activity may be performed by arranging a sequence encoding a target protein in a form operably linked to a promoter that induces relatively strong expression in a recombinant expression vector.
  • the recombinant vector is a vehicle capable of introducing a foreign nucleic acid into a host cell, transforming the host cell, and promoting the expression of the introduced nucleic acid, and has the same meaning as the term commonly used in the art to which the present invention belongs.
  • the recombinant vector may be an expression vector co-expressing MAL and CD9 after being transformed into a host cell, or may be separate expression vectors expressing MAL and CD9 respectively.
  • the recombinant vector may be a plasmid vector, a viral vector, a cosmid vector, or an artificial chromosome vector.
  • a plasmid vector is a DNA molecule that can easily accommodate foreign DNA and can be easily introduced into a host cell, and is used in the same sense as commonly used in the technical field to which the present invention belongs.
  • a typical plasmid vector contains several hundred plasmid vectors per host cell, an origin of replication to ensure efficient replication, a selectable marker to allow selection of host cells transformed with the plasmid vector, and a marker into which foreign DNA fragments can be inserted.
  • a structure containing a restriction enzyme cleavage site is included. Even if an appropriate restriction enzyme cleavage site does not exist, the vector and foreign DNA can be easily ligated by using a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method.
  • the viral vector may be a DNA virus vector or an RNA virus vector, and may be a bacteriophage, animal virus or plant virus.
  • the viral vector may be vacciniavirus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), lentivirus, retrovirus, or herpesvirus.
  • AAV adeno-associated virus
  • lentivirus lentivirus
  • retrovirus retrovirus
  • herpesvirus it is not limited thereto.
  • the recombinant vector may include a promoter operably linked to a nucleic acid encoding an extracellular vesicle secretion stimulating protein.
  • operably linked means that a nucleic acid is linked to another nucleic acid such that it can perform its function. That is, that a gene encoding a specific protein or peptide is operably linked to a promoter means that the corresponding gene can be transcribed into mRNA by the promoter and translated into a protein or peptide.
  • the gene sequence in the recombinant vector may be modified in various ways within the coding region without changing the amino acid sequence of the extracellular vesicle secretion-stimulating protein expressed from the coding region.
  • Various modifications or modifications may be made within a range that does not affect gene expression even in parts other than the region, and such modified genes are also included in the scope of the present invention.
  • the nucleic acid contained in the recombinant vector of the present invention may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof of at least one nucleic acid base encoding a protein having an activity equivalent thereto.
  • the recombinant vector of the present invention may further contain any nucleic acid as long as it can express nucleic acids encoding MAL and/or CD9.
  • a self-cleaving peptide e.g., 2A peptide
  • IRES internal ribozyme entry site
  • one vector can express both proteins.
  • two proteins may be operably linked in one vector, or two proteins may be operably linked under the same but different promoters, or each protein may be expressed by two different vectors.
  • specific application forms are not particularly limited as long as the activity of MAL and/or CD9 protein in immune cells can be enhanced compared to non-mutated cells.
  • the recombinant vector may further include a sequence encoding a self-cleavable peptide linking a nucleic acid encoding MAL and a nucleic acid encoding CD9, and the self-cleavable peptide is not limited thereto. No, but it may be, for example, a 2A peptide.
  • 2A peptides (or 2A self-cleavage peptides) are known in the art as peptides with a length of 18 to 22 amino acids capable of inducing ribosomal skipping during protein translation in cells, and are representative of T2A, P2A, E2A, F2A, etc. are mentioned.
  • Nucleic acids inserted before and after the 2A peptide can be expressed independently of each other in the cell.
  • the recombinant vector may include nucleic acids encoding the CD9-self-cleaving peptide-MAL sequence in the 5' to 3' direction.
  • a recombinant vector was constructed using the P2A peptide (SEQ ID NO: 3) as an example of a self-cleavage peptide (Example 1), and a person skilled in the art self-cleavage belonging to the art when referring to this specification
  • a recombinant vector can be constructed in which nucleic acids encoding the same peptide are ligated with nucleic acids encoding MAL9 and CD9.
  • the recombinant vector of the present invention may further include any linker peptide known in the art (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) in addition to nucleic acids encoding MAL, CD9 and self-cleavable peptide.
  • linker peptide known in the art (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) in addition to nucleic acids encoding MAL, CD9 and self-cleavable peptide.
  • the immune cells may be at least one selected from the group consisting of neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, monocytes, macrophages, dendritic cells, NK cells, B cells, and T cells, but is not limited thereto.
  • the immune cell is a T cell, and may be a human-derived or non-human mammal-derived T cell.
  • the T cells can be obtained by isolation and purification from immune cells infiltrating body fluids such as blood and bone marrow, tissues such as the spleen, thymus, and lymph nodes, or cancer tissues such as primary tumors, metastatic tumors, and cancerous ascites.
  • Examples of such T cells include ⁇ T cells, ⁇ T cells, CD8 + T cells, CD4 + T cells, tumor infiltrating T cells, memory T cells, na ⁇ ve T cells, NKT cells, and the like, and T cells commonly used in the art As long as it falls within the category of, the type is not particularly limited.
  • T cells contained in human peripheral blood mononuclear cells were used as an example of immune cells (Example 2), and those skilled in the art, referring to this specification, T cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • MAL and/or CD9 in other suitable immune cells, immune cells with enhanced secretion of extracellular vesicles can be prepared.
  • Another aspect of the present invention is a composition for enhancing secretion of extracellular vesicles comprising an inducer of co-expression of MAL and CD9.
  • the agent for inducing co-expression of MAL and CD9 refers to any suitable physical, chemical and/or biological means known in the art that can jointly overexpress MAL and CD9 in a host cell to be treated.
  • the co-expression inducing agents include recombinant vectors for protein expression, siRNA, miRNA, mRNA, cell-permeable peptide fusion proteins, liposomes, etc. that can jointly overexpress MAL and CD9 proteins in cells, and MAL and CD9 It includes expression control means for upstream genes that can induce co-overexpression of .
  • the co-expression inducer of MAL and CD9 may be (i) one recombinant vector containing a nucleic acid encoding MAL and a nucleic acid encoding CD9, or (ii) a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding MAL.
  • a vector and a recombinant vector containing a nucleic acid encoding CD9 may be configured in a form included in different vectors, but are not limited thereto.
  • a person of ordinary skill in the art can achieve the effect of enhancing the secretion of extracellular vesicles by immune cells using MAL and CD9 co-expression inducer with reference to appropriate methods known in the art through this specification.
  • Another aspect of the present invention (i) in vitro ( in vitro or ex vivo ) step of enhancing the activity of the extracellular vesicle secretion stimulating protein in immune cells compared to non-mutated cells; and (ii) isolating immune cells with enhanced activity of the extracellular vesicle secretion-stimulating protein, a method for producing immune cells with enhanced secretion of extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicle secretion stimulating proteins, activity enhancement, immune cells, etc. are as described above.
  • the present inventors have attempted improvement in anticancer immunotherapy using a chimeric antigen receptor (CAR) for the purpose of achieving a more excellent immune-inducing effect or antitumor activity.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • MAL and CD9 which are the above-mentioned extracellular vesicle secretion stimulating factors
  • CAR-expressing cells expressing the extracellular vesicle secretion stimulating factors together with CAR were conceived.
  • MAL and CD9 which are the above-mentioned extracellular vesicle secretion stimulating factors
  • CAR-expressing cells expressing the extracellular vesicle secretion stimulating factors together with CAR were conceived.
  • a vector expressing the extracellular vesicle secretion stimulating factor together with a CAR into T cells, cells having superior immune induction effect or antitumor activity than conventional CAR-expressing cells can be prepared.
  • Another aspect of the present invention is an immune cell in which the activity of a chimeric antigen receptor (CAR) is introduced in addition to an immune cell in which the activity of the above-described extracellular vesicle secretion-stimulating protein is enhanced compared to non-mutated cells.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • introduction refers to any form of action that causes a non-active cell to exhibit activity by external manipulation.
  • any method known in the art may be used to introduce additional CAR activity into immune cells with increased secretion of extracellular vesicles, and the method is not particularly limited.
  • an expression vector such as a plasmid vector or a viral vector capable of introducing CAR activity into immune cells can be used, and the CAR can be introduced into immune cells as a separate step from enhancing the activity of extracellular vesicle secretion stimulating proteins.
  • a nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (CAR); And (ii) it may be introduced in the form of a CAR expression vector containing all of the nucleic acid encoding the extracellular vesicle secretion stimulating protein, but is not particularly limited thereto.
  • the CAR expression vector of the present invention may be in the form of a recombinant vector described above.
  • the CAR expression vector can efficiently transcribe and express each nucleic acid by operably arranging a nucleic acid encoding a CAR and a nucleic acid encoding an extracellular vesicle secretion stimulating protein downstream of a promoter sequence.
  • expression of a nucleic acid encoding the CAR can be easily confirmed by further including a marker gene such as GFP.
  • the nucleic acid encoding the CAR is not particularly limited as long as it is a nucleic acid encoding a polypeptide constituting the CAR, and a target binding domain that recognizes a cell surface antigen of cancer cells, a cell membrane penetrating domain, and activation of immune cells (eg, T cells) It may include nucleic acids encoding the polypeptides of the signaling domains inducing.
  • the CAR may include (i-1) a target binding domain, (i-2) a cell membrane penetrating domain, and (i-3) a signaling domain, but is not limited thereto.
  • the target binding domain (i-1) is, for example, a single chain antibody, and specifically consists of a light chain variable region and a heavy chain variable region (scFv) derived from an antigen binding site of a monoclonal antibody, and comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region. It may be an oligo or polypeptide interposed with a linker peptide.
  • the cell surface antigen of cancer cells recognized by the target binding domain is a biomolecule that is specifically expressed in cancer cells and their precursor cells, a biomolecule whose expression is newly confirmed by cancerization of cells, or an expression level in cancer cells compared to normal cells.
  • the transmembrane domain is a transmembrane polypeptide that allows the CAR to be anchored to the cell membrane in CAR-expressing cells, and includes CD8, T cell receptor ⁇ , ⁇ chains CD28, CD3 ⁇ CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, GITR-derived transmembrane region polypeptides are exemplified, and human CD8 transmembrane region polypeptides are preferable.
  • the CAR is anchored to the cell membrane of the T cell.
  • the cell membrane penetrating region may include a hinge region composed of an arbitrary oligopeptide or polypeptide and having a length of 1 to 100 amino acids, preferably 10 to 70 amino acids.
  • a hinge region composed of an arbitrary oligopeptide or polypeptide and having a length of 1 to 100 amino acids, preferably 10 to 70 amino acids.
  • the hinge region of human CD8 is exemplified.
  • the (i-3) signaling domain is a domain responsible for signal transduction into cells when the CAR-expressing cell (i-1) target binding domain recognizes an external target.
  • the signaling domain performs intracellular signaling functions when the target binding domain recognizes a cell surface antigen of cancer cells, CD28, 4-1BB (CD137), GITR, CD27, OX40, HVEM, CD3 ⁇ , Fc Receptor-associated may include at least one or two or more selected from the polypeptides of the intracellular region of the ⁇ chain, and more specifically, the polypeptides of the three intracellular regions of CD28, 4-1BB, and CD3 ⁇ .
  • Each specific region in the signaling domain may be connected via an oligopeptide linker or polypeptide linker consisting of 2 to 10 amino acids, and a glycine-serine continuous sequence may be used as such a linker sequence.
  • a spacer region composed of an arbitrary oligopeptide or polypeptide may be provided between the nucleic acid encoding the above-described (i-1) target binding domain (i-2) cell membrane penetrating domain and (i-3) signaling domain.
  • the length of the spacer region may be 1-100 amino acids, such as 10-50 amino acids, such as a glycine-serine contiguous sequence.
  • Another aspect of the present invention is (i) in vitro ( in vitro or ex vivo ) to enhance the activity of the extracellular vesicle secretion stimulating protein in immune cells compared to non-mutated cells and to encode a chimeric antigen receptor (CAR) introducing a nucleic acid; and (ii) isolating immune cells having enhanced activity of the extracellular vesicle secretion-stimulating protein.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention provides (a) an immune cell in which the activity of an extracellular vesicle secretion-stimulating protein is enhanced compared to non-mutated cells, and (b) an immune cell into which the activity of a chimeric antigen receptor (CAR) is introduced, a lysate thereof, or It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a culture thereof as an active ingredient.
  • Extracellular vesicle secretion stimulating protein, CAR, etc. are as described above.
  • the present invention provides an anti-cancer composition comprising the above-described CAR expressing cells as an active ingredient.
  • cancer also referred to as a malignant tumor or a neoplasia
  • a malignant tumor or a neoplasia refers to a disease related to the control of cell death, and refers to a condition or disease caused by excessive proliferation of cells when the normal cell death balance is disrupted.
  • these abnormal hyperproliferative cells invade surrounding tissues and organs to form masses and destroy or transform normal structures in the body.
  • the cancer is a hematological cancer such as acute myeloid leukemia (AML), acute lymphocytic leukemia (ALL), chronic myeloid leukemia (CML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), myeloproliferative tumor (MPN), myelodysplastic syndrome (MPN) ), lymphoma, multiple myeloma, or a combination thereof.
  • AML acute myeloid leukemia
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • CML chronic myeloid leukemia
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • MPN myeloproliferative tumor
  • MPN myelodysplastic syndrome
  • lymphoma multiple myeloma, or a combination thereof.
  • the cancer is a solid cancer such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous carcinoma, undifferentiated cancer, large cell carcinoma, small cell carcinoma, skin cancer, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, vaginal cancer, cervical cancer, uterine cancer, liver cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, spleen cancer.
  • lung cancer tracheal cancer, bronchial cancer, colon cancer, small intestine cancer, gastric cancer, esophageal cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, ovarian cancer, etc.
  • cartilage Sarcomas such as sarcoma, Ewing sarcoma, malignant hemangioendothelioma, malignant Schwannoma, osteosarcoma, soft tissue sarcoma, hepatoblastoma, hydroblastoma, nephroboma, neuroblastoma, pancreatoblastoma (pancreatoblastoma), pleuropulmonary sarcoma, retinoblastoma, etc. It may be a subtype of, germ cell tumor, mesothelioma, cholangiocarcinoma, colon cancer, th
  • the term “for preventing or treating cancer” refers to use for directly preventing, improving, resolving, alleviating, alleviating, improving, or treating cancer-related symptoms.
  • CAR expressing cells eg, CAR-T cells
  • adoptive transfer of immune cells (eg, T cells) expressing the CAR recognizes a specific antigen presented on tumor cells and activates the immune cells (eg, T cells) to specifically target these tumor cells
  • the anticancer effect can be further improved by enhancing the activity of the extracellular vesicle secretion stimulating protein of the present invention.
  • the present invention provides an anticancer agent comprising the above-mentioned CAR expressing cells and pharmaceutically acceptable additives.
  • the additive is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable additive that can be used with the CAR expressing cell of the present invention, and examples thereof include physiological saline, buffered physiological saline, cell culture medium, dextrose, water for injection, glycerol, ethanol, and the like.
  • physiological saline physiological saline
  • buffered physiological saline cell culture medium
  • dextrose dextrose
  • water for injection glycerol
  • ethanol ethanol
  • the anticancer agent of the present invention can be administered to a patient in need of cancer treatment using a conventional method in the art belonging to the present invention, and the method of administration includes intravenous, intratumoral, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal. , intraarterial, intramedullary, intracardiac, intraarticular, intrasynovial, intracranial, intrathecal, and subarachnoid (bone marrow) injections.
  • the amount of the CAR-expressing cells of the present invention included in the anticancer agent to be administered may be appropriately adjusted depending on the type, location, severity, age, weight and condition of the subject to be treated, for example, 1 ⁇ 10 4 in one administration.
  • ⁇ 1 ⁇ 10 10 for example, 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 , more specifically, 5 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 8 , but is not limited thereto.
  • the anticancer agent to be administered is 4 times, 3 times, 2 times or once a day, 1 day apart, 2 days apart, 3 days apart, 4 days apart, 5 days apart, once a week, 7 days apart, 8 days apart. , 9 days apart, twice a week, once a month or twice a month may be independently administered, but is not limited thereto.
  • the anticancer agent of the present invention can be used in combination with one or more known anticancer agents capable of enhancing immunotherapy of CAR-expressing cells.
  • the present invention provides an anti-cancer composition
  • an anti-cancer composition comprising, as an active ingredient, the endoplasmic reticulum present in the above-described CAR-expressing cells, that is, a lysate of the immune cells as an active ingredient.
  • the present invention provides an anti-cancer composition
  • an anti-cancer composition comprising, as an active ingredient, the extracellular vesicles secreted from the above-described CAR-expressing cells, that is, the culture of the immune cells as an active ingredient.
  • CAR-containing extracellular vesicles are known to express high concentrations of cytotoxic molecules, inhibit tumor growth, and, compared to CAR-expressing cells, do not express PD-1, thereby preventing immune checkpoint inhibitor treatment such as recombinant PD-L1 treatment.
  • immune checkpoint inhibitor treatment such as recombinant PD-L1 treatment.
  • the immuno-anticancer effect is not weakened.
  • stability is secured compared to CAR-expressing cells, it can be usefully used for anticancer therapy (Reference [Fu, Wenyan, et al. "CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity.” Nature communications 10.1 (2019): 1-12.], etc.).
  • the present invention provides (a) an immune cell in which the activity of an extracellular vesicle secretion-stimulating protein is enhanced compared to non-mutated cells, and (b) an immune cell into which the activity of a chimeric antigen receptor (CAR) is introduced, a lysate thereof, or It provides a method for preventing or treating cancer comprising administering a pharmaceutical composition containing the culture thereof as an active ingredient to a patient in need thereof.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention is an immune cell in which (a) the activity of an extracellular vesicle secretion-stimulating protein is enhanced compared to non-mutated cells, and (b) the activity of a chimeric antigen receptor (CAR) is introduced, wherein the cell
  • the ectoplasmic reticulum secretion stimulating protein provides a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, myelin and lymphocyte protein (MAL), CD9, or a combination thereof, immune cells, a lysate thereof, or a culture thereof, for use in preventing or treating cancer.
  • MAL myelin and lymphocyte protein
  • Extracellular vesicle secretion stimulating proteins, CARs, pharmaceutical compositions and the like are as described above.
  • Embodiments of the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below.
  • embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
  • "include” a certain component throughout the specification means that other components may be further included without excluding other components unless otherwise stated.
  • Example 1 Construction of a recombinant vector expressing an extracellular vesicle secretion stimulating protein
  • the recombinant vector for expressing the extracellular vesicle secretion stimulating protein of the present invention pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP (SYSTEM BIOSCIENCE) plasmid was used.
  • the mock plasmid utilizes the plasmid
  • the transfer plasmid is a plasmid in which a gene of interest (GOI) is inserted into the MCS region of the mock plasmid.
  • GOI gene of interest
  • the gene transfer plasmid is a mock plasmid in which alanine (GCC) and valine (ACC) are inserted into the MCS region, and then the CD9 and/or MAL genes listed in the table below are introduced downstream.
  • CD9 plasmid (CD9) and MAL respectively.
  • CD9 plasmid 5'-CD9-3' SEQ ID NO: 5
  • MAL plasmid 5'-MAL-3' SEQ ID NO: 6
  • CD9-MAL plasmid 5'-CD9-Linker-P2A-MAL-3' SEQ ID NO: 7
  • MAL-CD9 plasmid 5'-MAL-Linker-P2A-CD9-3' SEQ ID NO: 8
  • the CD9-MAL plasmid and the MAL-CD9 plasmid are a linker (SEQ ID NO: 10) and P2A (SEQ ID NO: 9) connected between the CD9 and MAL genes, where P2A is the translation of the transgene sequence into protein, and then the CD9 and MAL proteins It is responsible for the function that allows them to be separated from each other.
  • each grown colony was taken and inoculated into an LB culture medium containing 4 ml of ampicillin (100 ⁇ g/ml), and then in a shaking incubator at 180 rpm and 37 ° C. After culturing for 6 hours, 2 ml of the culture medium was put into 200 ml of LB culture medium and cultured overnight at 180 rpm and 37 °C in a shaking incubator. Plasmids were extracted from the culture medium using a plasmid purification kit (QIAGEN).
  • the extracted gene transfer plasmid was introduced into HEK293TN cells to generate a viral vector.
  • HEK293TN cells were plated at a density of 8 ⁇ 10 6 cells per 10 cm 2 plate in 10 ml of DMEM (WELGENE) medium containing 1% penicillin/streptomycin (WELGENE) and 10% FBS (Capricorn). .
  • the medium was removed, and the packaging plasmid psPAX2, the envelope plasmid pMD2G, and the gene transfer plasmid described above were mixed 1:1:3 in 1.5 ml of OptiMem I (GIBCO) medium, and 1.5 ml of A mixture containing Lipofectamine3000 reagent and P3000 reagent in OptiMem I medium was prepared, mixed, incubated at RT for 20 minutes, and then added to cells for transfection. 6 hours after the start of transfection, the medium was changed to DMEM medium containing 10% FBS without antibiotics.
  • OptiMem I OptiMem I
  • the medium was removed from the plate, stored at 4° C., and then replaced once more with DMEM medium containing 10% FBS without antibiotics. 52 hours after the start of the transfection, the medium was removed from the plate and combined with the first obtained medium. Cells and debris were pelleted from the medium by centrifugation at 2000 rpm for 10 minutes at 4°C. The supernatant was filtered through a 40 ⁇ M pore size sterile filter to remove any remaining HEK293TN cells. The virus was divided into single doses of various sizes and stored at -80 °C until use. Viral concentration was determined using a p24 capsid ELISA.
  • p24 ELISA was performed to measure the number of particles instead of the infectious titer for the cultured cells so that a known amount of virus particles could be transduced.
  • the lentivirus prepared in Example 1 was transduced into human PBMC (peripheral blood mononuclear cells). Specifically, human PBMCs were thawed and pelleted, and then cultured at 37° C. for 24 hours at a ratio of CD3/CD28 beads (GIBCO), which are T cell active beads, to T cell numbers of 1:1. Culture medium included 5% CTSTM Immune Cell SR (GIBCO), 1% P/S, 1 X MEM Nonessential Amino Acid Solution (WELGENE), 2 mM L-glutamine (WELGENE), 20 ng/ml IL-2 (PEPROTECH ) was used.
  • T cells activated for 24 hours were counted in a hemocytometer, and then 5 ⁇ 10 5 cells were plated in a 24-well plate.
  • viral supernatants containing MOCK, CD9, MAL, CD9-MAL or MAL-CD9 genes were added at 10 MOI.
  • polybrene (Merck) was added at a concentration of 8 ⁇ g/ml to increase the binding force between the virus and T cells, and after Spinoculation (800 g, 32 °C, 1 hr), the incubator (37 °C, 5% CO 2 ) for 24 hours.
  • the degree of integration of the gene of the coding sequence part included in the lentivirus into the genomic DNA of the primary T cell was confirmed using Real Time Polymerase Chain Reaction, and the method is as follows.
  • a kit (Accuprep Genomic DNA extraction kit, Bioneer, Korea) using a silica-based DNA binding column was used for DNA extraction of primary T cells transduced on day 5 from the time of culture. Briefly, proteins and RNA of primary T cells were removed with proteinase K and RNAse A, and binding buffer containing guanidine chloride, which serves to form a bright light so that DNA adheres to the silica membrane of the column, was added and vortexed. After reacting at 60 °C for 10 minutes, ethanol was added and loaded onto the binding column to attach DNA to the membrane.
  • PCR polymerase chain reaction
  • ROCHE LightCycler® 480 SYBR Green I Master
  • CD9 DNA increased about 410,000 times compared to the control group
  • MAL DNA increased about 100,000 times compared to the control group.
  • CD9-MAL When CD9 and MAL were simultaneously overexpressed (CD9-MAL), it was confirmed that the DNA of CD9 and MAL increased about 130,000-fold and 27,000-fold, respectively. was well integrated into the chromosome of primary T cells.
  • RNA of primary T cells was obtained with RNAiso Plus (TAKARA), and cDNA was synthesized using PrimeScriptTM RT Master Mix (TAKARA).
  • TAKARA PrimeScriptTM RT Master Mix
  • PCR was amplified in a total volume of 20 ⁇ l with each primer and DNA template using LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE).
  • ROCHE LightCycler® 480 SYBR Green I Master
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • B cells B cells
  • NK cells NK cells
  • monocytes in addition to T cells.
  • CD3 exists as a receptor commonly expressed in T cells.
  • peripheral blood mononuclear cells were cultured on CD3/CD28 beads to induce activation and proliferation of primary T cells among various cells. Based on the above background, the T cell content was confirmed by CD3, and whether the CD9, MAL, or CD9-MAL coding sequence mRNAs introduced into the identified T cells were translated into proteins was confirmed by GFP produced together with the respective proteins.
  • FACS buffer PBS + 1% BSA
  • CD3-PE Biolegend
  • T cells in peripheral blood mononuclear cells into which the target gene was introduced As a result of analyzing the content of T cells in peripheral blood mononuclear cells into which the target gene was introduced, it was confirmed that more than 80% of T cells were contained in CD9, MAL, or CD9-MAL cells, and the percentage of peripheral blood mononuclear cells other than T cells. It was confirmed that it was 15% or less (FIG. 4). In addition, it was confirmed that the GFP gene was strongly expressed in more than 25% of CD3 + T cells. Through this, it was finally confirmed that the coding genes of the gene transfer plasmid prepared by the inventors were introduced into primary T cells, and that the introduced genes were translated into proteins in primary T cells.
  • Example 3 Enhancement of extracellular vesicle secretion by immune cells overexpressing extracellular vesicle secretion-stimulating protein
  • the lentivirus prepared in Example 1 was transformed into T cells according to the method described in Example 2, and primary T cell cultures were obtained on the 14th day from the time of culture.
  • NTA Nanosight NS300, Malvern, UK
  • primary T cells were cultured in particle-depleted media. After 3 days of culture, after removing the CD3/CD28 active beads in the culture medium, the cells were settled and only the supernatant was obtained. The number of cells in each group was measured using a hemocytometer. Thereafter, a filtration spin column (Vivaspin, Satorius, New Zealand) was used to separate extracellular vesicles from the culture medium produced by the primary T cells.
  • extracellular vesicles were separated from the supernatant after centrifugation at 3000 g for 20 minutes to remove apoptotic vesicles in the culture medium.
  • a filtration spin column was used to remove small proteins not associated with exosomes in the culture medium, and extracellular vesicles were obtained.
  • the size and number of the extracellular vesicles separated as above were measured with a nanoparticle tracking analyzer, and a graph of the size is shown in FIG. 5, and the number is shown in FIG. 6 in comparison to the number of cells.
  • the size of the extracellular vesicles showed no difference depending on the overexpressed stimulator protein.
  • Figure 6 as a result of comparing the number of extracellular vesicles compared to the number of cells, it was confirmed that the CD9 and MAL overexpressing group generated about 2.5 times and 2.2 times more extracellular vesicles than the control group, respectively. did In addition, it was confirmed that primary T cells co-overexpressing MAL and CD9 produced about 6 times as many extracellular vesicles as compared to the control group. demonstrated a significant increase.
  • Example 4 Construction of a recombinant vector co-expressing extracellular vesicle secretion stimulating protein and CAR (Chimeric Antigen Receptor) protein, and generation and characterization of extracellular vesicles
  • the recombinant vector for expressing the extracellular vesicle secretion stimulating protein of the present invention pCDH-MSCV-MCS1-EF1-MCS2 was prepared in-house.
  • the mock plasmid utilizes the plasmid itself, and the transfer plasmid is a plasmid in which a gene of interest (GOI) is inserted into the MCS region of the mock plasmid.
  • GOI gene of interest
  • the gene transfer plasmid is one in which alanine (GCC) and valine (ACC) are inserted into the MCS1 and MCS2 sites of the mock plasmid, and then the genes listed in the table below are introduced downstream.
  • Plasmids (CAR), CAR, CD9, and MAL were divided and introduced into MCS1 and MCS2, respectively, and the plasmid vectors were named CAR-CD9-MAL plasmid (CAR-CD9-MAL) (FIG. 9 and Table 2).
  • the MSCV and EF1 promoters have been proposed as a way to increase the overall expression rate of CAR and extracellular vesicles, and the CD9-MAL portion of the CAR-CD9-MAL plasmid has P2A (SEQ ID NO: 9) linked between the CAR, CD9, and MAL genes. , where P2A is responsible for allowing the CD9 and MAL proteins to be separated from each other after the plasmid sequence has been translated into protein.
  • the nucleic acid and amino acid sequences of the CAR gene are shown in SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively.
  • RNA of primary T cells was obtained with RNAiso Plus (TAKARA), and cDNA was synthesized using PrimeScriptTM RT Master Mix (TAKARA).
  • TAKARA PrimeScriptTM RT Master Mix
  • PCR was amplified in a total volume of 20 ⁇ l with each primer and DNA template using LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE).
  • ROCHE LightCycler® 480 SYBR Green I Master
  • a cancer cell line (OVCAR3) overexpressing MSLN (mesothelin), which is the target of the CAR used in the above example, and a cancer cell line (PANC- 1) cancer cell killing ability was evaluated.
  • OVCAR3 and PANC-1 cell lines were stained with anti-MSLN-PE antibodies, respectively, and analyzed by flow cytometry (Novocyte, Agilemt, CA, United States). As shown in FIG. 12, it was confirmed that PANC-1 showed a low MSLN expression of about 2%, and OVCAR3 showed a high expression of around 50%.
  • CAR-T-EVs extracellular endoplasmic reticulum of T cells containing CAR
  • CAR-T-EVs obtained from T cells into which the CAR-CD9-MAL plasmid was introduced
  • T-EVs extracellular endoplasmic reticulum of T cells without CAR
  • the 1 ⁇ m pore of the transwell is a size that allows only the extracellular vesicles to pass through without passing CAR-T or T cells.
  • Cancer cells were cultured in the lower culture dish of the transwell, and whether or not cancer cell death occurred by extracellular vesicles was evaluated.
  • CAR-T-EVs recognize cancer antigens and induce the death of cancer cells that selectively express target antigens, and increase the secretion of extracellular vesicles through CD9 and MAL, resulting in target-specific anticancer effects. proved to be significantly increased.

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Abstract

본 발명은 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포, 특히 세포외소포체 분비능이 증진된 CAR 발현 세포는 안정성 및/또는 유효성이 개선된 면역항암요법에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법
본 발명은 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법에 관한 것이다.
지난 수십년 동안 항암 요법은 꾸준히 변화하고 발전해왔다. 최근들어, 기존 항암 요법의 한계를 뛰어넘기 위해 면역항암요법 (immunotherapy)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 면역항암요법은 체내 면역세포들의 특성을 이용하여 부작용을 최대한 줄이고 환자의 신체가 암세포와 맞서 싸우도록 면역 반응을 강화하는 치료방법으로, 면역관문억제제 (immune checkpoint inhibitor), 항암 백신 (anticancer vaccine), 항체 치료제 (therapeutic antibodies) 및 면역세포요법 (immune cell therapy) 등으로 구분될 수 있다. 이중, 유전공학 기술의 발전에 따라 면역세포요법에 대한 관심이 급증하고 있다.
면역세포요법은 체내의 면역세포를 추출하여 이를 강화하거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 인체에 투입하는 세포치료 방식으로, 입양세포치료제 (adoptive cell transfer; ACT)라 불리기도 한다. 대표적으로 암세포에 대한 세포성 면역을 강화시키는 방법으로 종양 침윤 림프구 (tumor infiltrating lymphocyte; TIL), 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor; CAR), T 세포 수용체 (T-cell receptor; TCR) 기술 등이 있다. 특히, CAR를 발현하는 유전자 변형된 T 세포는 혈액 종양 또는 비혈액 종양의 치료를 위한 혁신적인 치료제로 급부상하고 있다.
CAR 발현 유전자 변형 면역세포요법은 신속하고 지속가능한 임상적 반응을 유도할 수 있으나, 다른 한편으로는 특유의 급성 독성(acute toxicities) 문제를 야기할 수 있고, 면역억제 기전(immunosuppressive mechanism)에 취약하다는 점 등이 해결해야 할 과제로 남아 있다.
한편, 세포외소포체는 이중지질막으로 이루어진 수십 nm에서 수백nm 크기를 가진 나노 소포체로 단백질, 지질, 및 유전자 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있다. 종래에는 이러한 세포외소포체가 세포에서 분비되는 찌꺼기로 여겨졌으나, 최근에는 세포외소포체들의 임상학적 의미가 대두되면서 다양한 연구가 진행되고 있다. 최근 연구에 따르면, CAR 발현 면역세포에서 분비되는 세포외소포체 (이른바, CAR 엑소좀)는 표면에 CAR를 함유하고 있고, 고농도의 세포독성 물질을 발현하며, 종양 성장을 효과적으로 억제하는 등 종래의 CAR-T 세포가 갖는 장점을 가지고 있으면서도, CAR-T 치료에 비해 상대적으로 안전하고 면역저해에 영향을 받지 않아 CAR-T 세포의 대안적 치료 요법으로 각광받고 있다 (문헌[Fu, Wenyan, et al. "CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity."　Nature communications　10.1 (2019): 1-12.]).
[선행기술문헌]
[특허문헌]
국제특허공개 WO 2016/056228
[비특허문헌]
Fu, Wenyan, et al. "CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity."　Nature communications　10.1 (2019): 1-12.
본 발명자들은 면역세포에서 세포외소포체 분비능을 증대시킬 수 있는 기술을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 강화시킴으로써 면역세포의 세포외소포체 분비능을 현저히 증대시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 세포외소포체 분비능이 증진된 CAR 발현 면역세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 발현 유도제를 포함하는, 세포외소포체 분비 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포, 특히 세포외소포체 분비능이 증진된 CAR 발현 세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물은 안정성 및/또는 유효성이 개선된 면역항암요법에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 및 이를 포함하는 재조합 벡터의 도식이다.
도 2는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포 내 유전체 통합 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포 내 mRNA 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포 내 T 세포 함유율 (CD3) 단백질 생성 비율 (GFP)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포에서 생성된 세포외소포체 크기를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포에서 생성된 세포외소포체의 상대적 개수를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포에서 생성된 세포외소포체를 촬영한 이미지를 나타낸다.
도 8은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포에서 지속적인 세포외소포체의 배출을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 세포외소포체 분비 자극 유전자와 CAR 유전자의 조합 및 이를 포함하는 재조합 벡터의 도식이다.
도 10은 세포외소포체 분비 자극 유전자와 CAR 유전자 조합을 포함하는 재조합 벡터의 사용 시, T 세포에서 세포외소포체 분비 자극mRNA 발현과 CAR mRNA 발현을 나타낸다.
도 11은 세포외소포체 분비 자극 DNA와 CAR DNA 조합을 포함하는 재조합 벡터의 사용시, T 세포에서 CAR-T-EVs (MSLN에 결합하는 CAR를 발현하는 T 세포 EV) 생성이 증가되는 것을 나타낸다. 각각 세포외소포체의 개수와 세포외소포체에 CAR의 함유율을 보여준다.
도 12는 MSLN (Mesothelin)이 발현하는 암세포를 확인한 결과이다.
도 13은 CAR-T-EVs 가 암세포를 사멸시키는 효능을 확인한 결과이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명자들은 MAL, CD9 또는 이들의 조합을 면역세포에서 과발현시킬 경우, 면역세포의 세포외소포체 분비능이 현저히 증가한다는 점을 최초로 발견하고, 이를 CAR 발현 세포에 활용함으로써 종래의 면역항암제의 유효성 및 안정성을 개선할 수 있음에 주목하였다. 이에, 본 발명은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 발굴, 이를 이용한 세포외소포체 분비능이 증진된 세포 및 세포외소포체 분비 자극 단백질을 활용한 CAR 발현 세포 등을 제공한다.
1. 세포외소포체 분비 자극 단백질의 발굴 및 이를 이용한 세포외소포체 분비능이 증진된 세포
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화되어 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포이다.
본 발명에서 용어, "세포외소포체 (Extracellular vesicle)"는 세포에 의해 세포 외부 공간으로 배출되는 지질로 구성된 운반체를 의미하며 미세운반체 (microvesicle), 엑소좀 등을 포함하는 넓은 개념이다. 본 발명에서 세포외소포체 분비 자극 단백질은 본래 세포와 비교하여 그 세포에서 활성이 강화될 경우 세포외소포체 분비능을 증진시킬 수 있는 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 특히 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질은 MAL (myelin and lymphocyte protein) 및/또는 CD9을 말한다.
본 발명에서, MAL은 막 관통 형태가 4 번 반복되는 (tetraspanning) 막 단백질로서, 신경계에서 세포의 미엘린에 위치하고 미엘린 생합성 및 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. MAL은 면역세포 (T 세포, NK 세포 등)와 신경세포 (올리고덴드로사이트 및 슈완 세포 등)에서 세포 의존적으로 발현양상이 상이한 것으로 알려져있다.
본 발명에서, CD9은 테트라스파닌 (tetraspanin) 패밀리에 속하는 막 단백질로서, 접착 (adhesion), 세포 이동성 (motility), 막 융합 (membrane fusion), 신호전달, 단백질 이동 (trafficking)과 같은 다양한 생물학적 과정에 관여하는 것으로 알려져있다.
본 발명에서는 놀랍게도, MAL과 CD9의 동시 발현으로 시너지한 효과를 확인하였다. 기능적으로, CD9이 세포외소포체를 생성하는 테트라스파닌이 다수 함유된 마이크로도메인을 형성하는데 특화된 단백질이라면, MAL은 테트라스파닌 마이크로 도메인이 세포밖 소포의 형태로 세포 밖으로 배출되도록 돕는 막 변형 단백질의 기능이 강하다. 따라서 기능적으로 일부 상이한 CD9과 MAL 단백질을 함께 발현시켰을 때 시너지를 내면서 세포외소포체의 분비를 촉진한 것으로 생각된다.
MAL 및 CD9의 아미노산 서열 정보는 공지된 문헌이나 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 MAL은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, CD9은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 MAL 단백질을 코딩하는 핵산 및/또는 CD9 단백질을 코딩하는 핵산을 과발현하는 렌티바이러스 벡터를 제작하였으며 이를 일차 T 세포에 형질 도입하여 MAL 및/또는 CD9의 활성이 강화된 면역세포주를 수득하였다 (실시예 1 및 실시예 2). 그 다음 상기 면역세포의 배양액에 생성된 세포외소포체의 개수를 확인한 결과, MAL 또는 CD9의 활성이 강화된 세포에서는 대조군 대비 세포외소포체 개수가 최소 2 배 이상 상승하였고, MAL과 CD9를 동시에 과발현한 면역세포에서는 대조군 대비 약 6 배 이상의 세포외소포체 분비능 증진 효과를 확인하였다 (실시예 3; 도 6 내지 8). 위 결과로부터, 면역세포에서 MAL 및/또는 CD9의 활성을 강화할 경우 세포외소포체 분비능이 증가한다는 것을 알 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, 단백질 활성의 "강화"는 세포가 보유하고 있는 단백질의 활성 상태를 향상시키는 것을 의미한다. 본 발명의 핵심은 면역세포에서 MAL 및/또는 CD9의 활성을 강화시킴으로써 세포외소포체 분비능을 증가시킬 수 있다는 점에 있으므로, 본 발명에서 단백질의 활성 강화는 목적 단백질의 활성을 비변이 세포 보다 강화시킬 수 있는 한, 그 방법에 있어서 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 활성의 강화는 i) 각 단백질을 코딩하는 핵산의 카피수 증가, ii) 상기 핵산의 발현이 증가하도록 발현 조절 서열의 변형, iii) 각 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 핵산 서열의 변형 및 iv) 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는 각 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 핵산을 염색체에 삽입/통합시키는 방법, 상기 핵산을 벡터 시스템에 도입하여 세포에 도입하는 방법, 각 단백질을 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 각 단백질을 도입하는 방법, 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법 및 각 단백질을 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 일례로, 상기 활성의 강화는 재조합 발현 벡터에 상대적으로 강한 발현을 유도하는 프로모터와 작동가능하게 연결된 형태로 표적 단백질을 코딩하는 서열을 배치함으로써 수행될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 외래 핵산을 숙주 세포로 도입하고, 상기 숙주 세포를 형질전환하며, 도입된 핵산의 발현을 촉진할 수 있는 비히클로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 용어와 동일한 의미로 사용된다. 구체적으로 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에 형질전환되어 MAL 및 CD9을 공동 발현하는 발현 벡터일 수 있고, 또는 MAL과 CD9을 각각 발현하는 별도의 발현 벡터일 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 또는 인공 염색체 벡터일 수 있다.
본 발명에서, 플라스미드 벡터는 외래 DNA를 용이하게 수용할 수 있고, 숙주 세포에 용이하게 도입될 수 있는 DNA 분자로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 의미로 사용된다. 전형적인 플라스미드 벡터는 숙주세포 당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, 플라스미드 벡터로 형질전환 된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 선별 표지 및 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 포함한다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.
본 발명에서, 바이러스 벡터는 DNA 바이러스 벡터 또는 RNA 바이러스 벡터일 수 있고, 박테리오파지, 동물 바이러스 또는 식물 바이러스일 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스 벡터는 백시니아바이러스 (vacciniavirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated virus; AAV), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스 (restovirus), 헤르페스 바이러스 (herpesvirus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 재조합 벡터는 세포외소포체 분비 자극 단백질을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 특정 핵산이 그 기능을 발휘할 수 있도록 다른 핵산에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 상기 프로모터에 의해 해당 유전자가 mRNA로 전사되어 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있음을 의미한다.
상기 재조합 벡터 내 유전자 서열은 코돈의 축퇴성 (degeneracy)을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 재조합 벡터 내에 포함되는 핵산은 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 이상 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 MAL 및/또는 CD9을 코딩하는 핵산을 발현할 수 있는 이상, 임의의 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터가 MAL 및 CD9을 코딩하는 핵산을 모두 포함할 경우, MAL을 코딩하는 핵산과 CD9을 코딩하는 핵산 사이에 자기 절단형 펩티드 (예컨대, 2A 펩티드), 또는 IRES (internal　ribozyme　entry　site)를 코딩하는 서열을 더 포함하여 하나의 벡터에서 2 개의 단백질을 모두 발현하도록 할 수 있다. 또는 하나의 벡터에서 각기 다른, 또는 동일하지만 별개의 프로모터 하에서 2 개의 단백질이 작동가능하게 연결되거나, 2 개의 각기 다른 벡터에 의해 각 단백질이 발현되는 형태일 수 있다. 본 발명의 목적에 따라 면역세포에서 MAL 및/또는 CD9 단백질의 활성을 비변이 세포에 비해 강화시킬 수 있는 한 구체적인 적용 형태는 특별히 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 상기 재조합 벡터는, MAL을 코딩하는 핵산과 CD9을 코딩하는 핵산을 서로 연결하는 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있으며, 상기 자기 절단형 펩티드는 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 2A 펩티드일 수 있다. 2A 펩티드 (또는 2A 자기 절단형 펩티드)는 세포 내에서 단백질의 번역 동안 리보좀 스킵 (ribosomal skipping)을 유도할 수 있는 18 내지 22 아미노산 길이의 펩티드로 당업계에 공지되어 있으며, 대표적으로 T2A, P2A, E2A, F2A 등을 들 수 있다. 2A 펩티드를 통해 그 전후에 삽입된 핵산은 세포 내에서 서로 독립적으로 발현될 수 있다. 구체적인 일례로, 상기 재조합 벡터는 5'에서 3' 방향으로 CD9-자기 절단형 펩티드-MAL의 순서로 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 자기 절단형 펩티드의 일례로 P2A 펩티드 (서열번호 3)를 사용한 재조합 벡터를 제작하였으며 (실시예 1), 통상의 기술자는 본 명세서를 참조할 경우 당업계에 속하는 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 핵산이 MAL9 및 CD9을 코딩하는 핵산을 서로 연결하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 MAL, CD9 및 자기절단형 펩티드를 코딩하는 핵산들 외에도 당업계에 공지된 임의의 링커 펩티드 (예컨대, 서열번호 4의 아미노산 서열)를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포는 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 매크로파지, 수지상 세포, NK 세포, B 세포 및 T 세포로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포는 T 세포이며, 인간 유래 또는 비인간 포유동물 유래의 T 세포일 수 있다. 상기 T 세포는 혈액, 골수액 등의 체액이나, 비장, 흉선, 림프절 등의 조직, 혹은 원발 종양, 전이성 종양, 암성 복수 등의 암 조직에 침윤하는 면역 세포로부터 단리, 정제하여 얻을 수 있다. 이러한 T 세포로서는, αβT 세포, γδT 세포, CD8＋T 세포, CD4＋T 세포, 종양 침윤 T 세포, 메모리 T 세포, 나이브 T 세포, NKT 세포 등을 들 수 있으며, 해당 기술분야에서 통상적으로 T 세포의 범주에 들어가는 한 특별히 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에서, 면역세포의 일례로 인간 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell;　PBMC)에 포함된 T 세포를 사용하였으며 (실시예 2), 통상의 기술자는 본 명세서를 참조할 경우 T 세포 외에도 다른 적합한 면역세포 내에 MAL 및/또는 CD9을 발현시킴으로써 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포를 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, MAL 및 CD9의 공동 발현 유도제를 포함하는 세포외소포체 분비 증진용 조성물이다.
상기 MAL 및 CD9의 공동 발현 유도제는 처리되는 숙주세포 내에서 MAL 및 CD9을 공동으로 과발현시킬 수 있는 당업계에 알려진 적합한 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 수단을 의미한다. 구체적으로, 상기 공동 발현 유도제는 MAL 및 CD9 단백질을 세포 내에서 공동으로 과발현시킬 수 있는 단백질 발현용 재조합 벡터, siRNA, miRNA, mRNA, 세포투과성 펩티드 융합 단백질, 리포좀 등을 들 수 있으며, MAL 및 CD9의 공동 과발현을 유도할 수 있는 상류 유전자에 대한 발현 조절 수단을 포함한다.
일례로, 상기 MAL 및 CD9의 공동 발현 유도제는 (i) MAL을 코딩하는 핵산 및 CD9을 코딩하는 핵산을 포함하는 하나의 재조합 벡터일 수 있고, 또는 (ii) MAL을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 CD9을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 각기 다른 벡터에 포함된 형태로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
통상의 기술자는 본 명세서를 통해 본 발명이 속한 기술 분야에 알려진 적절한 방법을 참조하여 MAL 및 CD9 공동 발현 유도제를 사용하여 면역세포의 세포외소포체 분비 증진 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (i) 시험관 내 (in vitro 또는 ex vivo)에서 면역세포에 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 비변이 세포에 비해 강화시키는 단계; 및 (ii) 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 강화된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포의 제조방법이다. 세포외소포체 분비 자극 단백질, 활성 강화, 면역세포 등은 앞서 설명한 바와 같다.
2. 세포외소포체 분비 자극 단백질을 활용한 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 세포의 제조 및 이의 용도
본 발명자들은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 이용한 항암 면역 요법에서, 보다 뛰어난 면역 유도 효과나 항종양 활성을 달성하는 것을 목적으로 하여 개량을 시도했다. 그 과정에서, 상술한 세포외소포체 분비 자극 인자인 MAL 및 CD9의 기능에 주목하여, CAR와 함께 상기 세포외소포체 분비 자극 인자를 발현하는 CAR 발현 세포를 착안하게 되었다. 구체적으로, CAR와 함께 상기 세포외소포체 분비 자극 인자를 발현하는 벡터를 T 세포에 도입하여, 종래의 CAR 발현 세포보다 뛰어난 면역 유도 효과나 항종양 활성을 갖는 세포를 제작할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상술한 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화된 면역세포에 추가로 키메라 항원 수용체 (CAR)의 활성이 도입된, 면역세포이다. 본 발명에서 용어 "도입"은 세포에 활성이 존재하지 않던 것을 외부 조작에 의해 활성을 나타내도록 하는 모든 형태의 행위를 의미한다.
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 세포외소포체 분비능이 증가된 면역세포에 추가로 CAR의 활성을 도입하기 위해 당업계에 공지된 어떠한 방법도 사용될 수 있으며, 그 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다. 일례로, 면역세포에 CAR 활성을 도입할 수 있는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터를 사용할 수 있으며, CAR는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성 강화 수단과는 별도의 단계로 면역세포에 도입될 수 있고, 혹은 (i) 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)를 코딩하는 핵산; 및 (ii) 세포외소포체 분비 자극 단백질을 코딩하는 핵산을 모두 포함하는 CAR 발현 벡터의 형태로 도입될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 CAR 발현 벡터는 상술한 재조합 벡터 형태일 수 있다. 예컨대, 상기 CAR 발현 벡터는 프로모터 서열의 하류에 작동 가능하게 CAR를 코딩하는 핵산 및 세포외소포체 분비 자극 단백질을 코딩하는 핵산을 배치함으로써 각각의 핵산을 효율적으로 전사 및 발현시킬 수 있다. 추가적으로, GFP 등 마커 유전자를 더 포함시켜 CAR를 코딩하는 핵산의 발현을 용이하게 확인할 수 있다.
상기 CAR를 코딩하는 핵산은 CAR를 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이면 특별히 제한되지 않고, 암세포의 세포 표면 항원을 인식하는 타겟 결합 도메인, 세포막 관통 도메인, 및 면역세포(예컨대, T 세포)의 활성화를 유도하는 신호전달 도메인의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 상기 CAR는 (i-1) 타겟 결합 도메인, (i-2) 세포막 관통 도메인, 및 (i-3) 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (i-1) 타겟 결합 도메인은 예컨대 단일사슬 항체이며, 구체적으로 단일 클론 항체의 항원 결합 부위에 유래하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 (scFv)으로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 사이에 링커 펩티드가 위치하는 올리고 또는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 타겟 결합 도메인이 인식하는 암세포의 세포 표면 항원은 암세포 및 그 전구 세포에 특이적으로 발현하는 생체 분자, 세포의 암화에 의해 새롭게 발현이 확인되게 된 생체 분자, 혹은 암세포에서 정상세포에 비해 발현 레벨이 증가하고 있는 생체 분자일 수도 있으며, 예컨대 AFP, PSMA, PD-L1, CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR 변이체, ROR1, ROR2, c-Met, HER2, CEA, 메소텔린 (mesothelin), GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD70, CD74, CD80/86, Ny-ESO-1, MUC16, MUC1, cMet, DR5, MUC1, MMP, MG7, DLL-3, EGFRvIII, EPCAM, EpHA2, ErbB ligands, FAP, FR-alpha, Melan A, MAGE-A1/A3/A4, FAP, FR-alpha, LMP1, GD2, IL-12Ra2, HER2, GPC3, gp100, CD117, CD171, CD123,　CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13 Ra2, BCMA, LewisY, IgG kappa　chain, 폴산 수용체-알파, PSCA, EpCAM, NKG2A, NKG2B, NKG2D, VEGFR2, AXL 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자는 표적으로 하는 암종에 따라서 적절한 타겟 결합 도메인을 선정하고 이를 본 발명에 적용할 수 있다.
(i-2) 세포막 관통 도메인은 CAR 발현 세포에서 CAR가 세포막에 고정되도록 하는 세포막 관통 폴리펩티드로서, CD8, T 세포 수용체의 α, β 사슬 CD28, CD3ε CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, GITR 유래의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 들 수 있고, 인간 CD8 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 바람직하게 들 수 있다. 이러한 세포막 관통 영역에 의해, CAR이 T 세포의 세포막에 고정된다. 상기 세포막 관통 영역에는, 임의의 올리고 펩티드 또는 폴리펩티드로 이루어지고, 길이가 1~100 아미노산, 바람직하게는 10~70 아미노산의 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 힌지 영역으로서는, 인간 CD8의 힌지 영역을 들 수 있다.
상기 (i-3) 신호전달 도메인은 CAR 발현 세포가 (i-1) 타겟 결합 도메인이 외부 타겟을 인식하였을 때에 세포 내로 신호 전달 기능을 담당하는 도메인이다. 예컨대, 상기 신호전달 도메인은 타겟 결합 도메인이 암세포의 세포 표면 항원을 인식했을 때에, 세포 내에 신호전달 기능을 수행하며, CD28, 4-1BB(CD137), GITR, CD27, OX40, HVEM, CD3ζ, Fc　Receptor-associated　γ chain의 세포 내 영역의 폴리펩티드에서 선택되는 적어도 1종 또는 2종 이상을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 CD28, 4-1BB, 및 CD3ζ의 3종의 세포 내 영역의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
상기 신호전달 도메인 내 각각의 세부 영역은 2~10 아미노산으로 이루어지는 올리고 펩티드 링커 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결되어 있을 수도 있고, 이러한 링커 서열로서 글리신-세린 연속 서열을 들 수 있다.
또한, 상술한 (i-1) 타겟 결합 도메인 (i-2) 세포막 관통 도메인을 코딩하는 핵산, 및 (i-3) 신호전달 도메인 사이에는, 임의의 올리고 펩티드 또는 폴리펩티드로 이루어지는 스페이서 영역을 설치할 수도 있다. 스페이서 영역의 길이는 1~100 아미노산, 예컨대 10~50 아미노산일 수 있고 예컨대 글리신-세린 연속 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (i) 시험관 내 (in vitro 또는 ex vivo)에서 면역세포에 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 비변이 세포에 비해 강화시키고 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (ii) 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 강화된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외소포체 분비능이 증진된 면역 세포의 제조방법이다. 면역세포에 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 강화시키는 것과 CAR 활성을 도입하는 것은 상술한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화되고, (b) 키메라 항원 수용체 (CAR)의 활성이 도입된 면역세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 세포외소포체 분비 자극 단백질, CAR 등에 대해서는 상술한 바와 같다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 CAR 발현 세포를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 암은 악성 종양 또는 신생물로도 불리는 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 무너져 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 상태 또는 질병을 지칭한다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 된다.
상기 암은 혈액암, 예컨대 급성골수성백혈병 (AML), 급성림프구성백혈병 (ALL), 만성골수성백혈병 (CML), 만성림프구성백혈병 (CLL), 골수증식성종양 (MPN), 골수이형성증후군 (MPN), 림프종 (Lymphoma), 다발골수종 (Multiple myeloma) 또는 이들의 조합일 수 있다.
또는, 상기 암은 고형암, 예컨대 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화암, 대세포암, 소세포암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 경부암, 자궁암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 폐암, 기관암, 기관지암, 결장암, 소장암, 위암, 식도암, 담낭암, 정소암, 난소암 등의 암이나, 골조직, 연골 조직, 지방조직, 근조직, 혈관 조직 및 조혈조직의 암 외에, 연골육종, 유잉육종, 악성 혈관내피종, 악성 슈반종, 골육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 간아종, 수아종, 신아종, 신경아종, 췌아종 (췌장 모세포종), 흉막폐아종, 망막아종 등의 아종, 배세포 종양, 악성중피종, 담관암, 대장암, 흉선암 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "암의 예방 또는 치료용"은 암과 관련된 증상을 직접적으로 예방, 호전, 해소, 완화, 경감, 개선, 치료하기 위한 용도를 의미한다.
본 발명의 CAR 발현 세포 (예컨대, CAR-T 세포)는 입양 면역요법에 사용될 수 있다. 구체적으로, CAR를 발현하는 면역세포 (예컨대, T 세포)를 입양 전달하여, 종양 세포 상에 제시되는 특이적 항원을 인식하고 면역세포(예컨대, T 세포)를 활성화시켜 이들 종양 세포를 특이적으로 용해시킴으로써 종양 세포를 사멸하기에 유용한 항종양 치료 요법으로서, 본 발명의 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 강화시킴으로써 항암 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 CAR 발현 세포 및 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 항암제를 제공한다. 상기 첨가제는 본 발명의 CAR 발현 세포와 함께 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 첨가제라면 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 생리 식염수, 완충 생리 식염수, 세포 배양 배지, 덱스트로오스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합, 안정제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 방부제, 등장화제, 충진제, 윤활제 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 항암제는 본 발명에 속하는 기술분야의 종래 방법을 이용하여, 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있고, 투여 방법으로서는, 정맥내, 종양내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내, 활액낭내, 두엽내, 수강내, 및 지주막하 (골수액)에 대한 주사를 들 수 있다.
투여하는 항암제에 포함되는 본 발명의 CAR 발현 세포의 양은, 암의 종류, 위치, 중증도, 치료를 받는 피험체의 연령, 체중 및 상태 등에 따라 적절히 조정할 수 있고, 예컨대 1 회의 투여에서 1×104 ~ 1×1010 개, 예컨대 1×105 ~ 1×10 9개, 보다 구체적으로 5×106 ~ 5×108 개일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
투여되는 항암제는, 1 일 4 회, 3 회, 2 회 또는 1 회, 1 일 간격, 2 일 간격, 3 일 간격, 4 일 간격, 5 일 간격, 주 1 회, 7 일 간격, 8 일 간격, 9 일 간격, 주 2 회, 월 1 회 또는 월 2 회 독립적으로 투여할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항암제는, CAR 발현 세포의 면역항암요법을 강화할 수 있는 공지된 1종 이상의 항암제와 병용하여 이용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 CAR 발현 세포에 존재하는 소포체를 유효성분으로 포함하는, 즉 상기 면역세포의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 CAR 발현 세포에서 분비된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는, 즉 상기 면역세포의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
CAR 발현 세포에서 생산, 분비되는 세포외소포체는 대부분 엑소좀의 형태를 띄고 있으며 표면에 CAR를 함유하고 있다. CAR 함유 세포외소포체는 고농도의 세포독성 분자를 발현하고, 종양 성장을 억제하는 것으로 알려져 있으며, CAR 발현 세포와 비교하여 PD-1을 발현하지 않아 재조합 PD-L1 치료와 같은 면역관문억제제 치료에 의해 면역항암 효과가 약화되지 않은 이점이 있다. 또한, CAR 발현 세포 대비 안정성을 확보하고 있어, 항암요법에 유용하게 활용될 수 있다(문헌[Fu, Wenyan, et al. "CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity."　Nature communications　10.1 (2019): 1-12.] 등 참조).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화되고, (b) 키메라 항원 수용체 (CAR)의 활성이 도입된 면역세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화되고, (b) 키메라 항원 수용체 (CAR)의 활성이 도입된 면역세포로서, 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질은 MAL (myelin and lymphocyte protein), CD9 또는 이들의 조합인, 면역세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 약학적 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다. 세포외소포체 분비 자극 단백질, CAR, 약학적 조성물 등에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포외소포체 분비 자극 단백질을 발현하는 재조합 벡터의 제작
본 발명의 세포외소포체 분비 자극 단백질 발현용 재조합 벡터의 일례로 pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP (SYSTEM BIOSCIENCE) 플라스미드를 사용하였다. 본 실시예에서, Mock 플라스미드는 상기 플라스미드를 활용한 것이고, 유전자 전달 플라스미드 (transfer plasmid)는 상기 Mock 플라스미드의 MCS 부위에 GOI (gene of interest)를 삽입한 플라스미드이다.
구체적으로, 유전자 전달 플라스미드는 Mock 플라스미드의 MCS 부위에 알라닌 (GCC)과 발린 (ACC)을 삽입 후 하류 방면에 하기 표에 기재된 CD9 및/또는 MAL 유전자를 도입한 것으로 각각 CD9 플라스미드 (CD9), MAL 플라스미드 (MAL), CD9-MAL 플라스미드 (CD9-2A-MAL) 및 MAL-CD9 플라스미드 (MAL-2A-CD9)로 명명하였다.
벡터명 도입 유전자
CD9 플라스미드 5'-CD9-3' (서열번호 5)
MAL 플라스미드 5'-MAL-3' (서열번호 6)
CD9-MAL 플라스미드 5'-CD9-Linker-P2A-MAL-3' (서열번호 7)
MAL-CD9 플라스미드 5'-MAL-Linker-P2A-CD9-3' (서열번호 8)
CD9-MAL 플라스미드와 MAL-CD9 플라스미드는 CD9 및 MAL 유전자 사이에 링커 (서열번호 10) 및 P2A (서열번호 9)가 연결된 것으로, 여기서 P2A는 도입 유전자 서열이 단백질로 번역된 이후 CD9과 MAL 단백질이 서로 분리될 수 있도록 하는 기능을 담당한다.
상기 CD9 및/또는 MAL 발현용 플라스미드를 클로닝 이후 One Shot™ Stbl3 균주 (Invitrogen)에서 증폭하여 실험에 사용하였다. 각 플라스미드 5 μl (DNA 400 ng)를 One Shot™ Stbl3 균주 50 μl에 섞어 얼음에서 30 분간 반응시킨 후, 42 ℃에서 45 초간 열처리하고 얼음에 2 분간 인큐베이션하였다. S.O.C 배양액 250 μl에 넣은 후 쉐이킹 인큐베이터에서 225 rpm, 37 ℃로 1 시간 배양하였다. LB 배양액 1 ml을 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 배양하였다. 배양 후 앰피실린 (100 μg/ml)이 포함된 아가 플레이트에 도말하여 37 ℃에서 12 ~ 16시간 배양하였다. 원하는 DNA 절편을 지닌 벡터를 가진 형질전환 대장균을 선별하기 위하여, 성장한 각 콜로니들을 취하여 4 ml의 앰피실린 (100 μg/ml)이 포함된 LB 배양액에 접종한 후 쉐이킹 인큐베이터에서 180 rpm, 37 ℃로 6 시간 배양하고, 배양액의 2 ml을 200 ml의 LB 배양액에 넣어 쉐이킹 인큐베이터에서 180 rpm, 37 ℃로 밤새 배양해주었다. 배양액에서 플라스미드 정제 키트 (QIAGEN)를 이용해 플라스미드를 추출하였다.
상기 추출된 유전자 전달 플라스미드를 HEK293TN 세포에 도입하여 바이러스 벡터를 생성하였다. 상세하게는, HEK293TN 세포를 1 % 페니실린/스트렙토마이신 (WELGENE), 10 % FBS (Capricorn)를 포함하는 10 ml의 DMEM (WELGENE) 배지 내에 10 cm2 플레이트 당 8 × 106 세포의 밀도로 도말하였다. 세포를 도말하고 24 시간 후에, 배지를 제거하고 1.5 ml의 OptiMem I (GIBCO) 배지에 패키징 플라스미드인 psPAX2, 엔벨롭 플라스미드 pMD2G, 및 상술한 유전자 전달 플라스미드를 1 : 1 : 3으로 배합하고 1.5 ml의 OptiMem I 배지에 Lipofectamine3000 시약, P3000 시약을 배합한 혼합물을 각각 제작 후 이를 혼합하여 RT에서 20 분 동안 인큐베이션한 다음 세포에 가하여 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션이 시작된 지 6 시간 후에 항생제가 없는 10 % FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하였다. 혼합액을 세포에 트랜스펙션한 시간을 기준으로 24시간 후에 배지를 플레이트에서 제거하고 4 ℃에서 보관한 후, 항생제가 없는 10 % FBS을 포함하는 DMEM 배지로 한번 더 교체하였다. 트랜스펙션이 시작된 지 52 시간 후에, 배지를 플레이트에서 제거하고 처음 수득한 배지와 합하였다. 2000 rpm에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심분리하여 배지로부터 세포와 잔해물을 펠렛화하였다. 상등액을 세공 크기 40 μM의 멸균된 필터를 통해 여과하여 남아 있는 HEK293TN 세포를 모두 제거하였다. 바이러스를 다양한 크기의 단일 사용량으로 나누고, 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다. p24 캡시드 ELISA를 사용하여 바이러스 농도를 측정하였다. 다른 외피를 포함하는 바이러스의 감염성은 세포에 따라 크게 다를 수 있으므로, 알려진 양의 바이러스 입자가 형질도입될 수 있도록 p24 ELISA (ORIGENE)를 수행하여 배양된 세포에 대한 감염역가 대신 입자 수를 측정하였다.
<실시예 2> 세포외소포체 분비 자극 단백질을 과발현하는 면역세포의 제작
실시예 1에서 제작한 렌티바이러스 (lentivirus)를 인간 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)에 형질 도입하였다. 상세하게는, 인간 PBMC를 해동하여 펠렛화한 후 T 세포 수 대비 T 세포 활성 비드인 CD3/CD28 비드 (GIBCO)의 비율을 1 : 1로 하여 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 배양 배지로는 5 % CTS™ Immune Cell SR (GIBCO), 1 % P/S, 1 X MEM 비필수 아미노산 용액 (WELGENE), 2 mM L-글루타민 (WELGENE), 20 ng/ml IL-2 (PEPROTECH)을 함유하는 CTS™ OpTmizer™ T Cell Expansion SFM (GIBCO)을 이용하였다. 24 시간 활성화시킨 T 세포를 헤모사이토미터에서 센 다음, 24-웰 플레이트에 5 x 105의 세포를 깔아주었다. 형질도입을 위해 MOCK, CD9, MAL, CD9-MAL 또는 MAL-CD9 유전자를 함유한 바이러스 상층액을 10 MOI로 가하였다. 이 때, 바이러스와 T세포의 결합력을 증가시키기 위해 폴리브렌 (Merck)을 8 μg/ml의 농도로 넣어주고, Spinoculation (800 g, 32 ℃, 1 hr)해준 후 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO2)에서 24 시간 동안 실행하였다.
렌티바이러스에 포함된 코딩 서열 부분의 유전자가 일차 T 세포 (primary T cell)의 게놈 DNA에 통합된 정도를 실시간 중합효소연쇄반응 (Real Time Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 확인하였으며 방법은 하기와 같다.
상세하게는, 배양시점으로부터 5 일째에 형질도입된 일차 T 세포의 DNA 추출을 위하여 실리카 기반의 DNA 결합 컬럼을 이용한 키트 (Accuprep Genomic DNA extraction kit, bioneer, Korea)를 사용하였다. 간단히 살펴보면, 일차 T 세포의 단백질과 RNA를 proteinase K와 RNAse A로 제거하고, DNA가 컬럼의 실리카 막에 붙도록 bright를 형성하는 역할인 구아니딘 클로라이드가 함유된 결합 완충액을 넣고 볼텍싱하였다. 60 ℃에서 10 분간 반응 후 에탄올을 넣고 결합 컬럼에 로딩하여 막에 DNA를 부착시켰다. 세척 용액으로 막을 세척한 후 낮은 염도의 용출 용액을 넣어 5 분간 반응하여 실리카 막과 DNA를 분리한 다음 원심분리를 이용하여 DNA를 얻었다. 이어서 분리한 DNA를 중합효소연쇄반응 (PCR)으로 Mock, CD9, MAL의 코딩 서열을 증폭하는 프라이머로 각각 증폭해주었다. PCR은 LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE)를 이용하여 각 프라이머와 DNA 주형으로 전체 부피 20 μl로 하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 값은 Mock군 대비 상대적으로 분석하여 표현하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 과발현을 한 군에서 해당 유전자의 게놈 DNA 통합을 확인하였다. CD9을 과발현한 군의 경우 대조군 대비 약 41만배의 CD9 DNA가 증가하였고, MAL을 과발현한 경우 대조군 대비 약 10만배의 MAL DNA의 증가를 관찰하였다. CD9과 MAL을 동시 과발현 (CD9-MAL)한 경우, CD9, MAL 각각의 DNA가 약 13만배, 2만 7천배 증가함을 확인하여, 렌티바이러스를 통해 코딩 서열인 CD9, MAL, CD9-MAL 유전자가 일차 T 세포의 염색체에 통합이 잘 이루어졌음을 확인하였다.
다음으로, 일차 T 세포의 게놈 DNA에 통합된 코딩 서열이 mRNA로 전사가 되는지를 확인하였다. 상세하게는, 배양시점으로부터 5 일째에 일차 T 세포의 RNA를 RNAiso Plus (TAKARA)로 얻었으며, cDNA는 PrimeScript™ RT Master Mix (TAKARA)를 이용하여 합성하였다. PCR은 LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE)를 이용하여 각 프라이머와 DNA 주형으로 전체 부피 20 μl로 하여 증폭하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, CD9, MAL, CD9-MAL 바이러스로 유전자를 일차 T 세포에 통합하여 T 세포 내의 CD9과 MAL의 mRNA 발현이 80 ~ 250 배 사이로 증대됨을 확인하였고, CD9-MAL 조합에 의해서도 80 ~ 250 배 사이로 CD9과 MAL 각각의 mRNA 발현이 증대됨을 확인할 수 있었다.
말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 T 세포 외에도 B 세포, NK 세포와 단핵구 등으로 다양한 세포로 구성되어있다. 이 중 T 세포에서 공통적으로 발현하는 수용체로 CD3가 존재한다. 본 연구에서는 말초 혈액 단핵세포들을 CD3/CD28 비드에서 배양하여, 다양한 세포 중에서 일차 T 세포의 활성화 및 증식을 유도하였다. 상기와 같은 배경으로 T 세포의 함유율을 CD3로 확인하고 확인된 T 세포 내에 도입된 CD9, MAL, CD9-MAL 코딩 서열 mRNA가 단백질로 번역되는지를 각 단백질들과 함께 생성되는 GFP로 확인하였다. 앞서 언급된 과정으로 6 일 동안 배양된 말초 혈액 단핵세포에 FACS 완충액 (PBS + 1% BSA) 2 ml을 넣고 1500 rpm에서 5 분 동안 2 회 세척하였고, CD3-PE (Biolegend) 항체 4 μl를 넣고 얼음 위에서 반응시켰다. 30 분 후에 FACS 완충액 2 ml을 넣고 1500 rpm에서 5 분 동안 3 회 세척하였다. 상층액을 제거한 후, 500 μl의 FACS 완충액을 다시 넣고 유세포분석기 (Novocyte, Agilemt, CA, United States)를 이용하여 세포 표면에 발현한 형광 (CD3-PE 와 GFP)들을 측정하였다.
타겟 유전자가 도입된 말초 혈액 단핵세포에서 T 세포의 함유율을 분석한 결과 CD9, MAL 또는 CD9-MAL이 도입된 세포에서 모두 80 % 이상의 T 세포가 함유됨을 확인하였고 T 세포 외의 말초 혈액 단핵세포의 비율은 15 % 이하임을 확인하였다 (도 4). 또한, CD3+ T 세포 중에서도 25 % 이상의 세포에서 GFP 유전자가 강하게 발현되는 현상을 확인하였다. 이를 통해 발명자들이 제작한 유전자 전달 플라스미드의 코딩 유전자들이 일차 T 세포로 도입되었고, 도입된 유전자가 일차 T 세포에서 단백질로 번역되었음을 최종 확인하였다.
<실시예 3> 세포외소포체 분비 자극 단백질을 과발현하는 면역세포의 세포외소포체 분비 증진 효과
면역세포 배양액 내 세포외소포체의 크기 및 개수 측정
실시예 1에서 제작한 렌티바이러스를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 T 세포에 형질전환하였으며, 배양 시점으로부터 14 일째에 일차 T 세포의 배양액을 수득하였다.
상세하게는, 배양 총 기간 11 일째에 자극 단백질이 과발현된 일차 T 세포가 생성한 세포외소포체의 개수를 나노입자추적분석기 (Nanoparticle tracking analysis, NTA, Nanosight NS300, Malvern, UK)로 측정하기 위하여 일차 T 세포 각 군을 2 번씩 세척한 후 파티클 제거 배지 (particle-depleted media)에서 배양하였다. 배양 3 일 후, 배양액 내 CD3/CD28 활성 비드를 제거한 후 세포를 가라앉혀 상등액만 획득하였다. 각 군의 세포 수는 헤모사이토미터를 이용하여 측정하였다. 그 후, 일차 T 세포가 생성한 배양액 내의 세포외소포체를 분리하기 위하여 필트레이션 스핀 컬럼 (Filtration spin column)(Vivaspin, Satorius, New Zealand)을 사용하였다. 먼저, 배양액 내 세포사멸소포 (Apoptotic vesicle)를 제거하기 위하여 3000 g에서 20 분 동안 원심분리 후의 상등액으로 세포외소포체를 분리하였다. 필트레이션 스핀 컬럼으로 배양액의 엑소좀과 연관되지 않은 작은 단백질들은 제거하고 세포외소포체를 획득하였다.
위와 같이 분리한 세포외소포체의 크기와 개수를 나노입자추적분석기로 측정하여 크기의 그래프는 도 5에, 개수는 세포 수 대비하여 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 세포외소포체의 크기는 과발현하는 자극 단백질에 따라 차이가 없음을 보여주었다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 세포외소포체의 개수를 세포 수 대비하여 비교한 결과 CD9과 MAL을 과발현한 군의 경우 대조군에 비해 각각 약 2.5 배, 2.2 배의 더 많은 세포외소포체를 생성하였음을 확인하였다. 또한, MAL과 CD9을 동시 과발현한 일차 T 세포는 놀랍게도 대조군 대비 약 6 배 많은 세포외소포체를 생성함을 확인하여 각각의 자극 단백질을 과발현하는 T 세포 보다 최소 2 배 이상으로 세포외소포체의 생성량이 현저히 증가함을 증명하였다. 세포에서 분비되는 세포외소포체의 수는 한계가 있기 때문에 대조군 대비 6 배 수준으로 분비량이 증가된 것은 그 자체로도 예측할 수 없었던 현저한 효과이다. 또한, CD9 또는 MAL을 과발현시켰을 때 세포외소포체 분비 증가가 확인된 것으로부터 CD9과 MAL을 동시에 과발현시켰을 때 단독 발현 대비 세포외소포체 분비의 일부 상승은 기대할 수 있을지라도, 세포외소포체 분비량의 한계치를 가질 수밖에 없는 세포의 특성을 고려할 때 단순히 이들 각각의 효과를 합친 수준으로까지 증가될 것을 예상하기는 어려우나, 본 발명에서는 CD9-MAL 과발현시 각 유전자를 단독 발현시킨 경우의 효과를 단순 합한 경우 보다도 더욱 높은 분비 수준을 보임을 확인하여, CD9 및 MAL 조합의 시너지 효과를 직접적으로 증명하였다.
다음으로, 대조군과 CD9, MAL을 동시 과발현하는 T 세포에서 생성된 세포외소포체의 사진을 나노입자추적분석기로 촬영하여 도 7에 나타내었다. 카메라를 통해 관찰 결과 비교군과 대비하여 CD9과 MAL을 동시 과발현하는 세포에서 현저히 많은 수의 세포외소포체 (흰 점)를 관찰할 수 있었다.
세포외소포체 분비능의 지속적 증진 효과 확인
본 발명의 세포외소포체 분비 자극 단백질이 일차 T 세포에 과발현되었을 때 지속적으로 세포외소포체 생성을 유지하는지 확인하기 위하여 세포외소포체의 개수 변화를 5 일까지 측정 후 누적 그래프로 표현하였다. 실시예 3과 같은 방법으로 얻은 배양액 내 세포외소포체를 각 연속적으로 수득하여 도입된 MAL 유전자에 의해 일차 T 세포 내에서 세포외소포체의 생성이 지속적으로 증가함을 증명하였다. 상세하게는 배양시점 8 일 이후 총 5 일 동안 파티클 제거 배지 (particle-depleted media)에서 배양하였고 두 번 (2 일과 5 일) 일차 T 세포의 배양액을 수득하였다. 배양액을 필트레이션 스핀 컬럼으로 분리하고 나노입자추적분석기를 사용하여 누적된 세포외소포체의 개수를 도 9에 그래프로 표현하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 자극 단백질인 MAL을 과발현하는 세포의 경우 2 일차에 대조군에 비해 2.5 배의 세포외소포체가 더 생성되었고, 이는 점점 더 축적되어 5 일차에는 대조군 대비 약 3.5 배의 세포외소포체가 축적되어 시간이 지날수록 축적된 세포외소포체의 차이가 증가함을 확인하였다. MAL 유전자의 경우, 일차 T 세포에 특이적으로 세포외소포체의 생성을 지속적으로 증대시키는 특성을 확인하였다.
<실시예 4> 세포외소포체 분비 자극 단백질과 CAR (Chimeric Antigen Receptor) 단백질을 동시 발현하는 재조합 벡터의 제작 및 세포외소포체 생성 및 특성 분석
본 발명의 세포외소포체 분비 자극 단백질 발현용 재조합 벡터의 일례로 pCDH-MSCV-MCS1-EF1-MCS2를 자체 제작하였다. 본 실시예에서, Mock 플라스미드는 상기 플라스미드 자체를 활용한 것이고, 유전자 전달 플라스미드 (transfer plasmid)는 상기 Mock 플라스미드의 MCS 부위에 GOI (gene of interest)를 삽입한 플라스미드이다.
구체적으로, 유전자 전달 플라스미드는 Mock 플라스미드의 MCS1과 MCS2 부위에 알라닌 (GCC)과 발린 (ACC)을 삽입한 후 하류 방면에 하기 표에 기재된 유전자를 도입한 것으로, CAR 유전자를 도입한 플라스미드 벡터를 CAR 플라스미드 (CAR), CAR와 CD9 및 MAL을 구분하여 MCS1과 MCS2에 각각 나누어 도입한 플라스미드 벡터를 CAR-CD9-MAL 플라스미드 (CAR-CD9-MAL)로 명명하였다 (도 9 및 표 2).
벡터명 도입 유전자
CAR 플라스미드 5'-CAR-3' (서열번호 11)
CAR-CD9-MAL 플라스미드 5'-CAR-CD9-P2A-MAL-3'
MSCV와 EF1 프로모터들은 CAR와 세포외소포체의 발현율을 전체적으로 높이기 위한 방법으로 제안되었고, CAR-CD9-MAL 플라스미드에서 CD9-MAL 부분은 CAR와 CD9 및 MAL 유전자 사이에 P2A (서열번호 9)가 연결된 것으로, 여기서 P2A는 플라스미드 서열이 단백질로 번역된 이후 CD9과 MAL 단백질이 서로 분리될 수 있도록 하는 기능을 담당한다. CAR 유전자의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 11, 12에 각각 표기하였다.
일차 T 세포의 게놈 DNA에 통합된 코딩 서열이 mRNA로 전사되는지를 확인하였다. 상세하게는, 배양시점으로부터 5 일째에 일차 T 세포의 RNA를 RNAiso Plus (TAKARA)로 얻었으며, cDNA는 PrimeScript™ RT Master Mix (TAKARA)를 이용하여 합성하였다. PCR은 LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE)를 이용하여 각 프라이머와 DNA 주형으로 전체 부피 20 μl로 하여 증폭하였다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, CAR-CD9-MAL 바이러스로 유전자를 일차 T 세포에 통합하여 T 세포 내의 CD9과 MAL의 mRNA 발현이 40-250 배 사이로 증대됨을 확인하였고, CAR는 약 300000 배 증대됨을 확인할 수 있었다. CAR 바이러스로 도입한 경우는 CD9과 MAL이 mock에 비해 증대되지 않음을 확인하였다.
배양 시점으로부터 14 일째에, 일차 T 세포의 배양액을 수득한 후 실시예 3과 마찬가지로 세포외소포체를 수득하였다. 세포외소포체의 개수를 나노입자추적분석기로 측정한 결과, CAR만 발현시킨 경우에는 세포외소포체 수의 변화가 거의 없었으나, CAR-CD9-MAL 바이러스를 도입한 T 세포는 세포외소포체가 mock 대조군 및 CAR 단독 발현군 대비 2 배 이상 증가함을 확인하였다 (도 11 왼쪽). 다음으로, 증가된 EV의 각각에 CAR의 함유 비율을 비교하였다. 세포외소포체를 CAR를 염색하는 형광물질로 염색한 결과, 도 11 오른쪽 그림 (CAR on indicidual EV)에서 확인할 수 있듯이, CAR의 단독 발현군이 도입된 혹은 CAR-CD9-MAL이 도입된 면역세포 유래 세포외소포체는 CAR를 함유하고 있음을 확인하였다. 결론적으로, 상기 CAR-CD9-MAL 바이러스를 도입한 T 세포는 CAR-T-EVs (CAR를 함유한 EVs)의 분비량 역시 증가되었음을 알 수 있다.
<실시예 5> CAR 단백질을 함유하는 세포외소포체의 암세포 사멸능 분석
본 발명의 세포외소포체의 항암 활성을 확인하기 위한 하나의 예시로서, 상기 실시예에서 사용한 CAR가 표적으로 하는 MSLN (mesothelin)을 과발현하는 암세포주 (OVCAR3)와 약한 발현을 보이는 암세포주 (PANC-1)에서 암세포 사멸능을 평가하였다.
먼저, OVCAR3 및 PANC-1 세포주를 각각 항-MSLN-PE 항체로 염색한 후 유세포분석기 (Novocyte, Agilemt, CA, United States)로 분석하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, PANC-1은 2 % 정도로 MSLN의 발현이 낮고, OVCAR3는 50 % 근방의 높은 발현을 보임을 확인하였다.
다음으로, CAR-T-EVs (CAR를 함유한 T 세포의 세포외소포체)의 지속적인 암세포 사멸 능력을 보여주기 위해, CAR-CD9-MAL 플라스미드를 도입한 T 세포로부터 수득한 CAR-T-EVs, 또는 Mock플라스미드를 도입한 T 세포로부터 수득한 T-EVs (CAR를 함유하지 않는 T 세포의 세포외소포체)를 1 ㎛의 공극을 가진 트랜스웰의 상단 배양접시에 배양하였다. 트랜스웰의 1 ㎛ 공극은 CAR-T 혹은 T 세포가 통과되지 않고 세포외소포체만이 통과 가능한 크기이다. 트랜스웰의 하단 배양접시에는 암세포를 배양하여, 세포외소포체에 의해 암세포 사멸이 일어나는지 여부를 평가하였다.
구체적으로, 배양 1 일째와 배양 5 일째에 암세포의 생존률을 WST-1으로 측정, 확인하였다. 도 13에서 나타낸 바와 같이, MSLN을 거의 발현하지 않는 PANC-1에서 5 일 동안 처리해본 결과, T-EVs와 CAR-T-EVs의 세포 사멸 능력에서 큰 차이를 보이지 않았다 (CAR-T-Evs의 경우 5 일 동안 처리한 경우에만 약 10 % 수준의 생존율 차이를 보임). 반면에, MSLN을 과발현하는 OVCAR3에서는 배양 1 일째부터 T-EVs와 CAR-T-EVS의 세포 사멸에 큰 차이를 보였다. 특히, CAR-T-EVs를 5 일 동안 OVCAR-3에 처리한 그룹에서는 암세포가 60 %이상 사멸되어 40 % 이하로 생존하였고, 이와 달리 T-EVs를 OVCAR3에 5 일 동안 처리한 결과에서는 90 %의 생존을 보였다 (50 %의 생존율 차이). 또한, CAR-CD9-MAL 플라스미드를 도입한 T 세포는 CAR만 발현시킨 T 세포에 비하여 CAR-T-EVs에 따른 항암 효과가 현저히 우수한 것으로 확인되었다.
본 결과는 CAR-T-EVs가 암 항원을 인지하여 선별적으로 표적 항원을 발현하는 암세포의 사멸을 유도한다는 것을 보여주며, CD9 및 MAL을 통해 세포외소포체 분비량을 증가시킴으로써 표적 특이적 항암 효과가 현저히 증가함을 증명한 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화된 면역세포로서, 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질은 MAL (myelin and lymphocyte protein), CD9 또는 이들의 조합인, 면역세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 매크로파지, 수지상 세포, NK 세포, B 세포 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 면역세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 활성이 도입된, 면역세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체 (CAR)는
    (i-1) 타겟 결합 도메인;
    (i-2) 세포막 관통 도메인; 및
    (i-3) 신호전달 도메인을 포함하는, 면역세포.
  5. (a) 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화되고,
    (b) 키메라 항원 수용체 (CAR)의 활성이 도입된 면역세포로서,
    상기 세포외소포체 분비 자극 단백질은 MAL (myelin and lymphocyte protein), CD9 또는 이들의 조합인,
    면역세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 면역세포의 배양물은 세포외소포체 (Extracellular vesicles)를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포외소포체는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. MAL (myelin and lymphocyte protein) 및 CD9의 공동 발현 유도제를 포함하는, 세포외소포체 분비 증진용 조성물로서, 상기 MAL 및 CD9의 공동 발현 유도제는
    (i) MAL을 코딩하는 핵산 및 CD9을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 또는
    (ii) MAL을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 CD9을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터인 조성물.
  9. (i) 시험관 내 (in vitro 또는 ex vivo)에서 면역세포에 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 비변이 세포에 비해 강화시키는 단계; 및
    (ii) 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 강화된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외소포체 분비능이 증진된 면역 세포의 제조방법으로서,
    상기 자극 단백질은 MAL, CD9 또는 이들의 조합인, 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 세포외소포체 분비능이 증진된 면역 세포의 제조방법.
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