CN111172317A

CN111172317A - 一种与芝麻开花期主效qtl位点紧密连锁的分子标记hsrc3911及其应用

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Publication number: CN111172317A
Application number: CN202010177574.1A
Authority: CN
Inventors: 梅鸿献; 刘艳阳; 郑永战; 崔承齐; 杜振伟; 武轲; 江晓琳
Original assignee: Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-01-18
Filing date: 2020-03-14
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2040-03-14
Also published as: CN111172317B

Abstract

本发明属于分子生物学及遗传育种学技术领域，涉及与芝麻开花期主效QTL位点紧密连锁的分子标记HSRC3911及其应用。本发明利用BC1群体和BC1F2家系在芝麻LG08连锁群定位了一个控制开花期的主效QTL位点，在不同环境中可解释表型变异的41.50％～57.55％，命名为qFT_LG08，并开发出与qFT_LG08紧密连锁的SSR分子标记，该分子标记为HSRC3911，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，其引物序列为：HSRC3911F：5'‑GTTCTAATCAGCTATCGCATTTCTT‑3'，HSRC3911R：5'‑ACACACGCACATACACCACGCACAC‑3'。通过本发明分子标记的应用，可以有效预测芝麻遗传分离材料开花期长短，通过分子标记辅助选择，可以在低世代对育种材料开花期进行快速、准确、高效地筛选。

Description

一种与芝麻开花期主效QTL位点紧密连锁的分子标记 HSRC3911及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种学技术领域，具体涉及与芝麻开花期主效QTL位点紧密连锁的分子标记HSRC3911及其应用。

背景技术

芝麻(Sesamum indicum L.)是我国重要的特色优质油料作物，常年种植面积约53.3万公顷，年产量约60～80万吨。芝麻种子含油量约55％，油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸含量高达85％，是优质食用油的重要来源。此外，芝麻还富含特殊的天然抗氧化物质-木酚素类化合物，在人类营养保健、医疗及抗衰老等方面受到广泛地关注。随着人民生活水平的提高，国内芝麻产量难以满足日益增长的市场需求，2018年我国进口芝麻已突破90万吨。

同大多数作物一样，我国芝麻育种中也存在反复利用少数优异骨干亲本，导致育成品种遗传基础极度狭窄的问题，严重影响了遗传改良进度，导致芝麻品种选育进入长时间的平台期。外来种质被认为是拓宽作物品种遗传基础的重要基因资源，引进和利用外来种质可以持续有效地改良当地品种的农艺性状，提高品种对现有生物或非生物逆境胁迫和对未来环境变化的适应能力。近年来，在国家“948(引进国际先进农业科学技术计划)”和国家“现代农业产业技术体系建设”等项目的资助下，河南省农业科学院芝麻研究中心收集了一批来自非洲、美洲、南亚及我国亚热带地区的芝麻种质资源。这些资源具有广泛的地理来源，在产量、品质、抗逆等性状上存在丰富的遗传多样性，是我国芝麻育种中不可多得的外来种质。但这些来自热带和亚热带的种质具有很强的光周期敏感性，在温带地区长日照环境下营养生长旺盛、开花晚，一些极端敏感的材料根本不能开花，是有效利用外来种质的限制因素。开花时间是研究光周期敏感性的重要性状，与作物成熟期、产量、品质等重要育种目标性状都存在密切的关系。在拟南芥和水稻中，对开花(抽穗)相关基因及其调控网络的研究已经比较清楚。与模式植物和主要农作物相比，关于芝麻开花期的研究十分薄弱。Rhind(1935)首次报道了短日照使芝麻提前开花，长日照延缓芝麻开花，并认定芝麻为典型的短日照作物。而后，国内外学者研究了日照长度、温度等对芝麻开花时间及农艺性状的影响，认为不同芝麻种质资源在光周期敏感程度上存在差异，并肯定开花期为复杂的数量性状。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种芝麻开花期主效QTL位点qFT_LG08，位于第8连锁群。

本发明的目的之二在于提供一种与上述芝麻开花期主效QTL位点紧密连锁的分子标记HSRC3911及其引物。

本发明的目的之三在于提供一种上述分子标记HSRC3911在芝麻开花期标记辅助选择中的应用方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明芝麻开花期主效QTL位点qFT_LG08的获得，包括以下步骤：

(1)利用开花期存在显著差异的芝麻品种豫芝4号和孟加拉小籽杂交获得F1种子，并以豫芝4号为父本进行回交，获得BC1群体，而后自交获得BC1F2家系；

(2)分别在河南平舆、南阳、漯河种植BC1F2家系群体，调查开花期，获得表现型数据；

(3)提取豫芝4号、孟加拉小籽及BC1群体叶片基因组总DNA；

(4)利用自主设计开发的SSR标记引物对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带大小进行判断，筛选亲本间有多态性的SSR标记；

(5)利用筛选到的多态性SSR标记引物分别对BC1群体DNA进行PCR扩增，获得BC1群体基因型数据；

(6)将BC1群体基因型数据输入IciMapping软件，进行遗传连锁图构建；

(7)将BC1群体基因型、遗传连锁图和开花期表现型数据输入IciMapping软件进行QTL定位；其中LG08连锁群上的一个主效QTL均能在上述河南平舆、南阳、漯河3个环境中检测到，分别解释表型变异的41.50％、57.55％、45.14％，命名为qFT_LG08。

本发明分子标记HSR3911与qFT_LG08紧密连锁(遗传距离0.8cM)，为自主开发设计的共显性SSR标记，其引物在早开花品种豫芝4号中只能扩增出289bp产物，在晚开花品种孟加拉小籽中只能扩增出267bp产物，在杂合基因型中则能扩增出289bp和267bp两种产物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；HSR3911的引物序列为：

HSR3911F:5'–GTTCTAATCAGCTATCGCATTTCTT–3'，

HSR3911R:5'–ACACACGCACATACACCACGCACAC–3'。

上述分子标记HSRC3911在芝麻开花期标记辅助选择中的应用方法为：用HSR3911F和HSR3911R引物扩增芝麻育种后代材料叶片或其他组织总DNA，若只获得289bp的扩增片段，表明在上述qFT_LG08位点上只存在与豫芝4号相同的等位基因，材料开花较早；若只获得267bp的扩增片段，表明在上述qFT_LG08位点上只存在与孟加拉小籽相同的等位基因，材料开花较晚；若获得289bp和267bp两种扩增片段，则表明在上述qFT_LG08位点上同时存在两种杂合等位基因，仍需进一步自交和选择。

本发明的积极有益效果在于：

(1)本发明首次在芝麻中定位了一个控制开花期的主效QTL位点qFT_LG08，可解释表型变异的41.50％～57.55％，同时获得了与qFT_LG08紧密连锁(遗传距离0.8cM)的SSR分子标记HSR3911。

(2)传统育种中，开花期受日照长度和温度等环境因素影响很大，并容易与其它产量品质性状发生偶联，严重影响外来种质的应用。本发明中SSR标记HSR3911与芝麻开花期主效QTL紧密连锁，且为共显性分子标记，通过检测HSR3911在育种材料中的扩增产物，可以确定材料中qFT_LG08的等位基因状态；利用该标记在早期世代即可对芝麻育种材料开花期进行准确预测和标记辅助选择，不受环境影响，显著提高育种效率。

附图说明

图1控制开花期的主效QTL位点qFT_LG08的基因组位置。

图2分子标记HSR3911的引物在BC1群体(豫芝4号×孟加拉小籽)中扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳的胶板照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，实施过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。

本发明以开花期存在显著差异的芝麻品种豫芝4号和孟加拉小籽作为研究材料，旨在为芝麻外来种质的有效利用提供新的方法。豫芝4号是河南省驻马店市农业科学研究所上世纪80年代培育的优良芝麻品种，过去30年在我国黄淮芝麻产区得到广泛种植，现在仍为黄淮流域区域试验的对照品种；同时，豫芝4号也是中国芝麻育种中的重要亲本，30％以上的育成品种均与其有较近的亲缘关系。孟加拉小籽是从孟加拉国进口的商品芝麻中***选择而成，蒴粒数多，籽粒较小，木酚素含量高，但在中高位纬度地区开花较晚，无法正常结实。以上两个材料代表了芝麻种质资源光周期敏感性的两个类型，均保存在河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库。

实施例1

与芝麻开花期主效QTL位点紧密连锁的分子标记HSR3911的获得：

(1)BC1群体构建：以豫芝4号为母本，孟加拉小籽为父本杂交获得F1种子，并以豫芝4号为父本进行回交，获得BC1群体，而后自交获得BC1F2家系。

(2)开花期表型鉴定：分别在河南平舆、南阳、漯河种植BC1F2家系群体，随机区组排列，单行区，三重复，调查开花期，获得表现型数据。

(3)DNA提取：采用CTAB法，提取豫芝4号、孟加拉小籽及BC1群体叶片DNA。具体步骤为：液氮研磨叶片0.5g，将粉末加入2ml的离心管中，加入1ml的提取缓冲液，冰上放置10min，12000rpm离心5min，弃上清液；加入裂解缓冲液600μl，混匀，65℃水浴30～60min；加入1ml苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，V/V/V)混匀30次，静置5min，12000rpm离心5min，吸取上清液；加入等体积异丙醇，混匀后放置10min，12000rpm离心5min，弃上清液；75％的乙醇清洗两次，通风橱内吹干，加入1×TE溶解(500μl)，加入两倍体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，V/V/V)，混匀50次，静置5min，12000rpm离心5min；吸上清液，加入等体积氯仿混匀50次，静置5min，12000rpm离心5min；吸取上清液，加入十分之一体积3mol/L NaAc(pH 5.2)，加入等体积异丙醇，混匀，12000rpm离心5min，弃上清液，75％乙醇清洗两次，通风橱内吹干，加入适量含有RNase的TE(50μl)溶解沉淀，37℃水浴30min，消化RNA。Nanodrop分析仪检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，保存于-20℃备用。

(4)利用基因组重测序进行SSR标记开发：利用超声波将豫芝4号和孟加拉小籽DNA打断，构建测序文库并在Illumina HiSeq 2000平台测序(在北京百迈克生物科技有限公司完成)。利用BWA软件将双端Reads比对到中芝13号基因组(Wang et al.2014)，分别利用GATK3.7和MISA进行InDel和SSR扫描，筛选豫芝4号和孟加拉小籽间存在InDel的SSR区域作为多态性候选SSR标记。选择均匀分布在全基因组的SSR，用Primer5.0软件设计引物，共设计了1024对SSR引物。

(5)多态性引物筛选及群体基因型鉴定：利用合成的SSR引物扩增豫芝4号和孟加拉小籽DNA，共筛选到多态性SSR引物315对，利用筛选到的多态性SSR标记引物分别对BC1群体DNA进行PCR扩增，获得BC1群体基因型数据。PCR反应体系为10μL，包含1μL的模板DNA(25-50ng/μL)，0.1μL的Taq酶(5U/μL)，1μL的10×PCR buffer，0.2μL的dNTPs(10mM/μL)，0.2μL的正向引物(10μM/μL)，0.2μL的反向引物(10μM/μL)，7.3μL的ddH₂O；扩增程序为：预变性94℃1min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，35个循环，延伸72℃10min；将扩增产物采用9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离70min，电泳后银染显色，观察带型。

(6)遗传连锁图及QTL定位：将BC1群体基因型数据输入IciMapping软件，构建遗传图谱；将BC1群体基因型、遗传连锁图和开花期表现型数据输入IciMapping软件进行QTL定位；其中LG08连锁群上的一个主效QTL均能在上述河南平舆、南阳、漯河3个环境中检测到，分别解释表型变异的41.50％、57.55％、45.14％，命名为qFT_LG08。

(7)与主效QTL紧密连锁标记的获得：HSR3911与qFT_LG08紧密连锁(遗传距离0.8cM)，在早开花品种豫芝4号中只能扩增出289bp产物，在晚开花品种孟加拉小籽中只能扩增出267bp产物，在杂合基因型中则能扩增出289bp和267bp两种产物；HSR3911的引物序列为HSR3911F:5'–GTTCTAATCAGCTATCGCATTTCTT–3'，HSR3916R:5'–ACACACGCACATACACCACGCACAC–3'。

实施例2

利用F2群体验证分子标记HSR3911的辅助选择效果：

(1)F2群体构建：以豫芝4号为母本，孟加拉小籽为父本杂交获得F1种子，并自交获得F2群体。

(2)DNA提取：在海南三亚种植F2群体，提取单株DNA，方法同实施例1。

(3)F2群体基因型鉴定：利用HSR3911引物扩增F2单株DNA，鉴定F2群体基因型，PCR反应体系、凝胶及产物观察方法同实施例1。在152个F2单株中，37个单株只扩增出289bp产物，41个单株只扩增出267bp产物，74个单株同时扩增出289bp和267bp两种产物，符合1:2:1的分离比例。

(4)分子标记HSR3911的辅助选择效果：在海南三亚调查开花期，获得152个单株表现型数据(见表1，表中，A代表只扩增出289bp产物，B代表只扩增出267bp产物，H代表同时扩增出289bp和267bp两种产物)。37个只扩增出289bp产物的单株平均开花天数为37.35天，74个同时扩增出289bp和267bp两种产物的单株平均开花天数为40.47天，而41个单株只扩增出267bp产物的单株平均开花天数则为52.12天，差异达极显著水平(P≤0.01)。说明利用分子标记HSR3911进行芝麻开花期辅助选择具有较好的效果。

表1 152个F2单株基因型及开花天数

序列表

<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心

<120> 与芝麻开花期主效QTL位点紧密连锁的分子标记HSRC3911及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttctaatcagctatcgcatttctttttcaattttatcgaccacaaacttgagaagttttgctgaatgataccccctccttgttctggctttcctatttccatgttagtgcgtctttttttgtgtatgtgggtgtgtgtgagggtgtgtgtgtgtgtgtgcgagcgtgtgtgagtgtgattgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgagggtatgtgtgtgtgtgcgagcgtgtgtgtatgtgtgtgtggggtgtgtgcggtggtgtgtgtgcgtggtgtatgtgcgtgtgt

289

<210> 2

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttctaatcagctatcgcatttctttttcaattttatcgaccacaaacttgagaagttttgctgaatgataccccctccttgttctggctttcctatttccatgttagtgcgtctttttttgtgtatgtgggtgtgtgtgagggtgtgtgtgtgtgtgtgcgagcgtgtgtgagtgtgattgtgtgtatgtgtgtgtgtgcgagcgtgtgtgtatgtgtgtgtggggtgtgtgcggtggtgtgtgtgcgtggtgtatgtgcgtgtgt

267

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttctaatcagctatcgcatttctt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acacacgcacatacaccacgcacac 25

Claims

1.一种与芝麻开花期主效QTL位点qFT_LG08紧密连锁的分子标记HSRC3911，其与qFT_LG08的遗传距离0.8cM。

2.根据权利要求1所述的分子标记HSRC3911，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示。

3.根据权利要求1所述的分子标记HSRC3911，其引物序列为：

HSR3911F:5'–GTTCTAATCAGCTATCGCATTTCTT–3'，

HSR3911R:5'–ACACACGCACATACACCACGCACAC–3'。

4.权利要求1所述分子标记HSRC3911在芝麻开花期标记辅助选择中的应用。

5.权利要求3所述分子标记HSRC3911在芝麻开花期标记辅助选择中的应用方法，包括以下步骤：

用所述引物扩增芝麻育种后代材料叶片或其他组织的总DNA，若只获得289bp的扩增片段，表明在其qFT_LG08位点上只存在与豫芝4号相同的等位基因，则材料开花较早；若只获得267bp的扩增片段，表明在其qFT_LG08位点上只存在与孟加拉小籽相同的等位基因，则材料开花较晚。

6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于：所述扩增过程中PCR反应体系为10μL，包含1μL的模板DNA，0.1μL的Taq酶、1μL的10×PCR buffer、0.2μL的dNTPs、0.2μL的正向引物、0.2μL的反向引物、7.3μL的ddH₂O；扩增程序为：预变性94℃1min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，35个循环，再延伸72℃10min。

7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于：所述模板DNA浓度为25-50ng/μL，所述Taq酶为5U/μL；所述dNTPs的浓度为10mM/μL；所述正、反向引物的浓度为10μM/μL。