CN111172159A - 一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒，包括探针的构建，所述探针根据牛属动物线粒体基因经过DNA序列设计获得，所述探针的构建包括将各牛属动物的扩增产物等质量混合，将混合后各牛属动物的扩增产物使用超声波破碎仪进行打断处理，将合成的生物素标签和磷酸化引物进行PCR扩增标记及酶切。本发明能获得高覆盖的跨牛属动物线粒体基因组捕获探针序列，实现牛属动物线粒体基因组的跨物种、高通量、准确性获取，配合商用的杂交捕获试剂即可完成牛属中任意种的线粒体基因组捕获测序，具有便捷性的优点。解决了现有技术中扩增测序和序列拼接，分析费时费力且成本昂贵，数据浪费等缺点。

Description

一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒。

背景技术

线粒体在机体细胞内具有多个拷贝，因此动物组织中的线粒体DNA比核基因组信息更易于被保存。基于以上特征，动物线粒体基因组的信息被广泛应用于多个领域，如被开发成分子标记应用于动物源成分鉴定、海关检验检疫、法医司法鉴别，或被应用于物种******确立、功能基因组进化分析以及核质基因互作等研究。随着技术发展，越来越多的科学研究和工业应用均需要利用到更多的动物线粒体基因组信息甚至整个线粒体基因组的序列，并且常常需要同时获取多个近缘物种的线粒体基因组信息以开展更大维度的研究或应用。

如专利号为CN109182328A公开了一种线粒体DNA提取试剂盒和方法，包括蛋白酶K、悬浮液、裂解液和洗脱液；但线粒体DNA提取试剂盒仅仅通过试剂搭配来测序，但不能获得较佳的测序结果。又如专利号为CN200610169638.3的专利公开了一种检测母系遗传线粒体耳聋基因A1555G突变的试剂盒，包括提取血样DNA的试剂、PCR扩增反应试剂混合液、实时荧光定量探针和扩增实时荧光定量探针的正向引物和反向引物，但检测效率以及准确性有待提高。

现有技术中运用PCR扩增结合Sanger测序获取牛属动物线粒体基因组序列的方法，仅能针对已有参考序列的物种适用；对于长达16.5kb的牛属线粒体基因组，一般需要用18对以上的专门设计的PCR扩增引物进行分别扩增测序和序列拼接，对于大群体分析费时费力且成本昂贵；对于跨种属的研究或分子鉴定，为保证扩增效率和准确性，需要针对不同的种属分别设计特异扩增引物，其投入成本和技术难度均大幅增加。一般重测序技术可以高通量、跨种属获取牛属动物线粒体基因组序列，然而由于线粒体基因组极小于核基因组，重测序获得的数据中线粒体基因组序列实际只占有极小的比例，因此造成极大的数据浪费。

在试剂盒制备领域，其实际应用中的亟待处理的实际问题还有很多未提出具体的解决方案。

发明内容

本发明提出了一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒以解决所述问题，为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒，包括探针的构建，所述探针根据牛属动物线粒体基因经过DNA序列设计获得，所述探针的构建包括将各牛属动物的扩增产物等质量混合，将混合后各牛属动物的扩增产物使用超声波破碎仪进行打断处理，并使用合成的生物素标签和磷酸化引物进行PCR扩增标记及酶切。

另外，还提供一种牛属动物线粒体基因组捕获的方法，所述方法包括如下步骤：

1).长片段扩增引物的设计

从NCBI数据库中收集牛属动物的参考线粒体基因组序列，并通过多重比对筛选保守区域，利用引物在保守区域上设计特定的牛属动物线粒体基因组通用长片段扩增引物，且扩增产物长度分别为8892bp和7966bp；

2).线粒体基因组扩增以及PCR产物回收

采用所述长片段扩增引物分别扩增不同牛属种的DNA，且PCR程序设置需要经过预变性、变性、退火、延伸、循环的操作，后将各扩增阳性产物使用不同的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行纯化，备用；

3).探针的构建

a.将各琼脂糖凝胶纯化回收的产物分别进行浓度检测，后等质量混合；

b.往等质量混合后的产物适当的双蒸水，使用超声波破碎仪进行打断处理，且所述打断处理的条件为：打断15s间歇30s，7个循环；

c.配置末端修复混合物，按照体积比为8:7:5的双蒸水、End Repair Buffer、EndRepair Enzyme Mix添加至混合装置中，涡旋混匀，与片段化的样品混匀得到溶液，置于混匀仪中20℃孵育30min，得到末端修复混合物；且所述的End Repair Buffer为End RepairBuffer(10×)；

d.往步骤c中的末端修复混合物中加入磁珠，涡旋混匀，室温放置10min后，将样品转移到磁力架上3-5min，待液体澄清后移除废液，继续添加200μL 80％酒精溶液冲洗30s，移去废液，重复清洗2次，开盖约2-3min使酒精挥发；

e.将配比为42:5:3的双蒸水、A-Tailing Buffer、A-Tailing Enzyme依次加入混合装置中，并添加至步骤d中，涡旋混匀，置于混匀仪30℃孵育30min；且A-Tailing Buffer为A-Tailing Buffer(10×)；

f.按照体积比，往步骤e中加入2倍量的PEG/NaCl溶液，涡旋混匀，室温放置10min后，将样品转移到磁力架上约，待液体澄清后移除废液，继续添加80％酒精溶液进行冲洗，移去废液，重复清洗2-3次，并使酒精挥发，得到混合物A；

g.按照体积比为32:10:5的双蒸水、Ligation Buffer以及DNA ligation依次添加至混合装置中，得到混合物B，并将混合物B转移至步骤f中的清洗后的混合物A中，并加入占混合物B体积3/47的Adapter，后置于恒温混匀仪中20℃孵育15min；且所述LigationBuffer为Ligation Buffer(5×)；

h.往步骤g中加入适量的PEG/NaCl溶液，涡旋混匀，室温放置10min后，转移到磁力架上，待液体澄清后移除废液，继续添加80％酒精溶液冲洗，移去废液，重复清洗2-3次，并使酒精挥发；后加入双蒸水进行溶解，室温放置5-10min后移至磁力架上，并取上清液；

i.进行文库扩增以及扩增后的清洗；

j.将扩增清洗后的产物电泳条件下切取200-300bp位置的凝胶片段使用OMEGA试剂盒进行回收，并测浓度；

k.进行扩增标记以及磁珠纯化操作；

l.按照体积比5:1.5取10×NEB Buffer以及限制性内切酶，补充双蒸水进行定量，后利用涡旋混匀后置于PCR仪中37℃孵育1h，完成第一次酶切；按照体积比5:1取10×NEBBuffer以及限制性内切酶，并补充双蒸水进行定量，置于PCR仪中37℃孵育3h，完成第二次酶切。

可选地，所述牛属动物的牛线粒体基因组全长为15-17kb。

可选地，所述引物包括F引物以及R引物。

可选地，所述F引物序列包括

CAGCGCAATCCTATTYAAGAGTCCATATCG序列以及

ATGAGGCATAATYATAACCAGCTCAATYTGC序列。

可选地，所述R引物序列包括

CTWGCTAGTAGTCATCARGTGGCTATTAGTG以及

TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGACT序列。

与现有技术相比，本发明所取得的有益技术效果是：

1、本发明通过对牛属多物种线粒体基因组序列，并多重比对筛选保守区域，在保守区域上设计特定的牛属动物线粒体基因组通用长片段扩增引物。

2、本发明对多个物种的总DNA用设计的通用长片段引物进行PCR扩增，回收各物种的长片段扩增产物，等量混合后随机打断，通过文库扩增和添加生物素标签等流程获得高覆盖的跨牛属动物线粒体基因组捕获探针序列。

3、本发明利用所得的探针序列配合商用的杂交捕获试剂即可完成牛属中任意种的线粒体基因组捕获测序，实现牛属动物线粒体基因组的跨物种、高通量、准确性获取，配合商用的杂交捕获试剂即可完成牛属中任意种的线粒体基因组捕获测序，具有便捷性的优点。

具体实施方式

为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明为一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒，综合本发明讲述以下实施例：

需要说明的是实施例中使用试剂如下：

2×A9 LongHiFi PCR MasterMix：北京艾德莱生物；琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒：北京艾德莱生物；KAPA Hyper Prep Kit：美国KAPA公司；KAPA HTP Library PreparationKit：美国KAPA公司；

Probes and Reagents Kit：美国IDT公司；

Gel Extraction Kit：美国Omega公司；Phusion超保真DNA聚合酶：美国NEB公司；Nb.Btsl限制性内切酶：美国NEB公司；NEB Buffer：美国NEB公司；Phusion PCR试剂盒：美国NEB公司。因此，本发明中涉及的英文试剂名称在本发明中可做公知处理，不再赘述。

实施例1：

一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒，包括探针的构建，所述探针根据牛属动物线粒体基因经过DNA序列设计获得，所述探针的构建包括将各牛属动物的扩增产物等质量混合，将混合后各牛属动物的扩增产物使用超声波破碎仪进行打断处理，并使用合成的生物素标签和磷酸化引物进行PCR扩增标记及酶切。

另外，还提供一种牛属动物线粒体基因组捕获的方法，所述方法包括如下步骤：

1).长片段扩增引物的设计

从NCBI数据库中收集牛属动物的参考线粒体基因组序列，并通过多重比对筛选保守区域，所述牛属动物的牛线粒体基因组全长为15-17kb；利用引物在保守区域上设计特定的牛属动物线粒体基因组通用长片段扩增引物，且扩增产物长度分别为8892bp和7966bp，且所述引物包括F引物以及R引物，所述F引物序列包括

CAGCGCAATCCTATTYAAGAGTCCATATCG序列以及

ATGAGGCATAATYATAACCAGCTCAATYTGC序列；所述R引物序列

包括CTWGCTAGTAGTCATCARGTGGCTATTAGTG以及

TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGACT序列；

2).线粒体基因组扩增以及PCR产物回收

采用所述长片段扩增引物分别扩增不同牛属种的DNA，且PCR程序设置需要经过预变性、变性、退火、延伸、循环的操作，后将各扩增阳性产物使用不同的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行纯化，备用；

3).探针的构建

a.将各琼脂糖凝胶纯化回收的产物分别进行浓度检测，后等质量混合；

b.往等质量混合后的产物适当的双蒸水，使用超声波破碎仪进行打断处理，且所述打断处理的条件为：打断15s间歇30s，7个循环；

c.配置末端修复混合物，按照体积比为8:7:5的双蒸水、End Repair Buffer(10×)、End Repair Enzyme Mix添加至混合装置中，涡旋混匀，与片段化的样品混匀得到溶液，置于混匀仪中20℃孵育30min，得到末端修复混合物；

d.往步骤c中的末端修复混合物中加入磁珠，涡旋混匀，室温放置10min后，将样品转移到磁力架上约3min，待液体澄清后移除废液，继续添加200μL80％酒精溶液冲洗30s，移去废液，重复清洗2次，开盖约2-3min使酒精挥发；

e.将配比为42:5:3的双蒸水、A-Tailing Buffer(10×)、A-Tailing Enzyme依次加入混合装置中，并添加至步骤d中，涡旋混匀，置于混匀仪30℃孵育30min；

f.按照体积比，往步骤e中加入2倍量的PEG/NaCl溶液，涡旋混匀，室温放置10min后，将样品转移到磁力架上约，待液体澄清后移除废液，继续添加80％酒精溶液进行冲洗，移去废液，重复清洗2-3次，并使酒精挥发，得到混合物A；

g.按照体积比为32:10:5的双蒸水、Ligation Buffer(5×)以及DNA ligation依次添加至混合装置中，得到混合物B，并将混合物B转移至步骤f中的清洗后的混合物A中，并加入占混合物B体积3/47的Adapter，后置于恒温混匀仪中20℃孵育15min；

h.往步骤g中加入适量的PEG/NaCl溶液，涡旋混匀，室温放置10min后，转移到磁力架上，待液体澄清后移除废液，继续添加80％酒精溶液冲洗，移去废液，重复清洗2-3次，并使酒精挥发；后加入双蒸水进行溶解，室温放置5-10min后移至磁力架上，并取上清液；

i.进行文库扩增以及扩增后的清洗；

j.将扩增清洗后的产物电泳条件下切取200-300bp位置的凝胶片段使用OMEGA试剂盒进行回收，并测浓度；

k.进行扩增标记以及磁珠纯化操作；

l.按照体积比5:1.5取10×NEB Buffer以及限制性内切酶，补充双蒸水进行定量，后利用涡旋混匀后置于PCR仪中37℃孵育1h，完成第一次酶切；按照体积比5:1取10×NEBBuffer以及限制性内切酶，并补充双蒸水进行定量，置于PCR仪中37℃孵育3h，完成第二次酶切。

且在本实施例中长片段PCR扩增体系的如下表1：

表1

成分	添加量
		F引物	0.5μM
R引物	0.5μM
		2×A9 LongHiFi PCR MasterMix	25μL
DNA	20ng
		ddH2O	补至50μL

本实施例中通过对牛属多物种线粒体基因组序列，并多重比对筛选保守区域，在保守区域上设计特定的牛属动物线粒体基因组通用长片段扩增引物，能有效实现牛属动物线粒体基因组的跨物种、高通量、准确性获取，配合商用的杂交捕获试剂即可完成牛属中任意种的线粒体基因组捕获测序，具有便捷性的优点。

实施例2：

一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒，包括探针的构建，所述探针根据牛属动物线粒体基因经过DNA序列设计获得，所述探针的构建包括将各牛属动物的扩增产物等质量混合，将混合后各牛属动物的扩增产物使用超声波破碎仪进行打断处理，并使用合成的生物素标签和磷酸化引物进行PCR扩增标记，酶切的步骤。

另外，还提供一种牛属动物线粒体基因组捕获的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)线粒体基因组扩增及Sanger测序

从NCBI数据库中收集牛属动物的参考线粒体基因组序列，并通过多重比对筛选保守区域，所述牛属动物的牛线粒体基因组全长为16.5kb；利用引物在保守区域上设计特定的牛属动物线粒体基因组通用长片段扩增引物，且扩增产物长度分别为8892bp和7966bp，并使用上述长片段扩增引物对四个牛属动物的DNA进行PCR扩增。扩增阳性产物使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行纯化，回收产物通过Sanger测序以获得线粒体基因组全序列；

(2)高通量测序文库构建

为保障文库质量和样本均一性，本实施例将四个牛种分别构建4个全基因组文库，使用KAPA Hyper Prep Kit，实验步骤根据操作手册进行优化，具体步骤如下：

1)预处理：使用Qubit 3.0进行浓度定量，以确定DNA样品的起始添加量；

2)预处理：按起始量计算所需DNA体积，使用ddH2O补齐至53μL体系，并用超声波破碎仪进行打断处理，且程序设置为打断15s间歇30s，7个循环；

3)末端修复和添加A-Tailing：取50μL片段化的DNA样品于PCR管中，添加7μL EndRepair&A-Tailing Buffer和3μL End Repair&A-Tailing Enzyme Mix，涡旋混匀，置于PCR仪中，程序设置为先20℃孵育30min，再65℃孵育30min，最后4℃保存；

4)接头连接：取上一步反应液60μL于1.5mL管中，添加2.5μL Adapter stock、7.5μL PCR-grade water、30μL Ligation Buffer和10μL DNA Ligase，吹打混匀得到110μL溶液，置于恒温混匀仪中20℃孵育15min；

5)连接后清洗：在上一步反应液中加入0.8×的KAPA Pure Beads得到混合样品，涡旋混匀，室温放置10min后，将样品转移到磁力架上约3min，待液体澄清后移除废液，继续添加200μL 80％酒精溶液冲洗30s，移除废液，重复清洗2次，开盖约2-3min使酒精挥发，但不要使磁珠过于干燥；

6)溶解：将离心管从磁力架取下，添加25μL双蒸水溶解，室温放置5min后转移到磁力架上，约2min后取上清液于新的1.5mL离心管中；

7)文库扩增：分别取25μL KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2×)、5μL KAPALibrary Amplification Primer Mix(10×)和20μL Adapter-ligated library DNA于PCR管中混匀进行扩增，PCR反应程序为：预反应98℃45s，变性98℃15s，退火60℃30s，延伸72℃30s，孵育72℃1min，最后4℃保存，7个循环；

8)扩增后清洗：在文库扩增后的PCR管中继续加入1×的KAPA Pure Beads，涡旋混匀，室温放置10min后，将样品转移到磁力架上约3min，待液体澄清后移除废液，继续添加200μL 80％酒精溶液冲洗30s，移去废液，重复清洗2次，打开管盖晾约2-3min，使酒精挥发，将离心管从磁力架上取下，添加25μL双蒸水溶解，室温静置5min后移至磁力架上，约2min后取上清液于新的1.5mL离心管中；

9)切胶回收：上一步产物跑电泳后在大约350-550bp位置的切取凝胶片段，使用OMEGA试剂盒进行回收，使用Qubit 3.0测浓度。

(3)杂交捕获

将构建的四个牛种的文库等量混合，使用牛属杂合探针捕获混合后的文库，要求探针和文库质量相等，本实施例使用Hybridization capture of DNA libraries using

Probes and Reagents Kit，实验操作依据操作手册进行调整，具体如下：

a)使用真空离心浓缩仪分别将探针和文库浓缩至干燥粉末状；

b)向盛有文库粉末的1.5mL离心管中加入8.5μL Hybridization Buffer(2×)、2.7μL Hybridization Buffer Enhancer和1.8μL Nuclease-Free Water，涡旋混匀，向盛有探针粉末的1.5mL离心管中加入5μL双蒸水溶解；

c)将文库混合液移至0.2mL管中，置于PCR仪中95℃10min使DNA变性；

d)在上一步反应的PCR管中加入4μL探针，混匀后在PCR仪中65℃反应4个小时，热盖温度设置为75℃；

e)准备洗脱缓冲液：需配置1×Bead Wash Buffer 500μL、1×Wash BufferⅠ300μL、1×Wash BufferⅡ200μL、1×Wash BufferⅢ200μL和1×Stringent Wash Buffer 400μL，分别按照对应试剂盒内的Buffer稀释相应的比例得到；其中100μL的Wash BufferⅠ和400μL Stringent Wash Buffer置于混匀仪中65℃保存，200μL的Wash BufferⅠ室温(15-25℃)保存；

f)准备磁珠：首先将

M-270Streptavidin beads放在垂直混合仪上平衡至少30min，取下后涡旋混匀15s；然后取100μL磁珠到1.5mL离心管中，置于磁力架上使磁珠和液体分离，移去液体；加200μL的1×Bead Wash Buffer，涡旋震荡10s后重新放在磁力架上使磁珠和液体分离，移除液体，再重复洗涤一次；添加100μL的1×Bead Wash Buffer到离心管中，混匀后将溶液移至0.2mL管中，置于磁力架，待磁珠吸附后移除液体；

g)结合：首先将65℃处理4h的反应产物转移到上一步准备的磁珠管中，吹打混匀，置于PCR仪中65℃反应45min，每12min取出震荡1次，每次3s；

h)65℃洗涤：添加100μL 65℃保存的Wash BufferⅠ到上一步产物中，涡旋混匀后转移至新的1.5mL离心管中，置于磁力架上，使磁珠和液体分离，移去液体；再添加200μL 65℃保存的Stringent Wash Buffer，轻柔的吹打混匀后65℃孵育5min，置于磁力架上，使磁珠和液体分离，移去液体，使用Stringent Wash Buffer重复洗涤一次；

i)室温洗涤：添加200μL室温保存的Wash BufferⅠ到上一步的反应物中，涡旋混匀2min，置于磁力架，使磁珠和液体分离，移除液体；添加200μL室温保存的Wash BufferⅡ到上一步的反应物中，涡旋混匀1min，置于磁力架，使磁珠和液体分离，移除液体；添加200μL室温保存的1×Wash BufferⅢ，到上一步的反应物中，涡旋混匀30s，置于磁力架，使磁珠和液体分离，移去液体；

j)磁珠重悬：将离心管从磁力架上取下，添加20μL双蒸水到管中，涡旋混匀；

k)PCR富集：添加25μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix、2.5μL10μM

P5 primer、2.5μL 10μM

P7 primer和20μL带有磁珠的混合液到0.2mL管中，涡旋振荡混匀；PCR程序为预反应98℃45s，变性98℃15s，退火60℃30s，延伸72℃30s，孵育72℃1min，4℃保存，6个循环，热盖温度为105℃；

l)纯化：添加80μL(1.6×)

XP beads到PCR产物中，涡旋混匀，室温放置几分钟后转移到磁力架上，移去液体；

m)洗脱：将PCR管从磁力架上取下，加入22μL of

Buffer EB到管中，涡旋混匀，放置几分钟后转移到磁力架上，将上清液转移至新的1.5mL离心管中；

n)浓度检测：电泳检测条带位置是否正确，并使用Qubit 3.0测浓度；

o)测序：将产物送至美因基因使用Illumina Hiseq X-Ten测序仪进行测序。

(4)数据分析

A)原始数据处理

DNA文库捕获后使用Illumina Hiseq X-ten平台测序，原始下机数据存储为fastq格式。使用FastQC软件查看原始数据的质量，统计Q20、Q30、GC含量、序列长度分布等。用Clip&Merge软件进行数据质量控制，删除含有接头、质量低于30、长度短于20bp的reads，将reads进行融合。

B)测序数据比对

因为线粒体DNA是环状DNA，使用CircularMapper更有利于线粒体基因组的拼接。分别以JN817298(Bos indicus)，KU891851(Bos grunniens)，MF614103(Bos frontalis)，V00654(Bos taurus)，AB074968(Bos taurus)，KM233417(Bos mutus)，FJ997262(Bosjavanicus)作为参考序列，以默认参数分别进行序列比对。使用Dedup软件删除因扩增产生的重复序列。使用QualiMap软件统计内源DNA含量、覆盖率、比对质量分布、比对到参考序列上的reads的碱基比例等。

C)捕获效果及准确性分析

以PCR扩增和Sanger测序得到的线粒体序列为标准，认为捕获测序得到的线粒体基因组中的差异位点是测序错误造成的。统计捕获测序中正确位点的数量，得到捕获测序的准确率。

试验结果

1.PCR产物Sanger测序结果：

通过对PCR产物进行Sanger测序分别得到普通牛、家养牦牛、瘤牛和大额牛样本的线粒体基因组全序列。将四个样本通过Sanger测序得到的线粒体基因组序列进行多重比对，发现牛属动物种间两两差异在2-8％之间，四个种的综合差异在10％左右，进一步证明本发明开发牛属动物跨种属线粒体基因组捕获探针的重要意义。

2.捕获结果：

用杂合探针分别去捕4个文库等量混合的文库，捕获产物纯化后需通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果显示条带分布约为400-600bp的区域片段，而非单一条带；使用Qubit3.0测浓度，牛属探针捕获产物浓度为51.7ng/μL。将产物送至美因基因使用IlluminaHiseq X-Ten测序仪进行测序。

3.探针捕获单一物种DNA的特异性

以大额牛序列为例。从混合文库捕获序列中拆分出大额牛序列，分别与6个牛属动物的7条参考序列做比对。结果显示，当选用大额牛序列MF614103(Bos frontails)作为参考序列时，各项指标都是最佳，尤其在覆盖度为5×时，只有MF614103这条序列能达到100％，可见本发明的牛属动物线粒体基因组捕获探针在捕获单一物种DNA时具有较强的特异性。探针捕获大额牛DNA的特异性结果如表2所示。

表2

4.探针捕获效果及准确性

选择与所测样本同种的序列作为参考序列进行测序数据比对分析，主要分析了以下指标：(1)覆盖度：即测序reads能覆盖线粒体基因组的比例；(2)正确率：以PCR扩增结合Sanger测序的序列作为标准，分析捕获测序与Sanger测序得到的线粒体序列的一致性。结果如表3所示。

表3

参考基因组	样本名称	平均覆测序深度	大于5×的覆盖度(％)	准确性(％)
					V00654(Bos taurus)	普通牛	368.26	100	100％
JN817298(Bos indicus)	瘤牛	240.92	99.47	100％
					KU891851(Bos grunniens)	家养牦牛	291.06	100	100％
MF614103(Bos frontalis)	大额牛	242.63	100	100％

从表2中分析可知，本发明可以直观清晰的看所构建的杂合探针捕获能够捕获到牛属线粒体基因组全序列，且与Sanger测序结果相比，测序正确率均为100％，可见探针具有较高的捕获效率和较强的准确性。

综合上，本发明能有效完成牛属中任意种的线粒体基因组捕获测序，实现牛属动物线粒体基因组的跨物种、高通量、准确性获取，配合商用的杂交捕获试剂即可完成牛属中任意种的线粒体基因组捕获测序，具有便捷性的优点。

虽然上面已经参考各种实施例描述了本发明，但是应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行许多改变和修改。也就是说上面讨论的方法，***和设备是示例。各种配置可以适当地省略，替换或添加各种过程或组件。例如，在替代配置中，可以以与所描述的顺序不同的顺序执行方法，和/或可以添加，省略和/或组合各种部件。而且，关于某些配置描述的特征可以以各种其他配置组合，如可以以类似的方式组合配置的不同方面和元素。此外，随着技术发展其中的元素可以更新，即许多元素是示例，并不限制本公开或权利要求的范围。

综上，其旨在上述详细描述被认为是例示性的而非限制性的，并且应当理解，以下权利要求(包括所有等同物)旨在限定本发明的精神和范围。以上这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明的记载的内容之后，技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

Claims (7)

1.一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒，其特征在于，包括探针的构建，所述探针根据牛属动物线粒体基因经过DNA序列设计获得，所述探针的构建包括将各牛属动物的扩增产物等质量混合；将混合后各牛属动物的扩增产物使用超声波破碎仪进行打断处理；将合成的生物素标签和磷酸化引物进行PCR扩增标记及酶切。

2.一种牛属动物线粒体基因组捕获的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1所述的探针进行捕获和测序分析。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1).长片段扩增引物的设计

从NCBI数据库中收集牛属动物的参考线粒体基因组序列，并通过多重比对筛选保守区域，利用引物在保守区域上设计特定的牛属动物线粒体基因组通用长片段扩增引物，且扩增产物长度分别为8892bp和7966bp；

2).线粒体基因组扩增以及PCR产物回收

采用所述长片段扩增引物分别扩增不同牛属种的DNA，且PCR程序设置需要经过预变性、变性、退火、延伸、循环的操作，后将各扩增阳性产物使用不同的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行纯化，备用；

3).探针的构建

a.将各琼脂糖凝胶纯化回收的产物分别进行浓度检测，后等质量混合；

b.往等质量混合后的产物加适当的双蒸水，使用超声波破碎仪进行打断处理，且所述打断处理的条件为：打断15s间歇30s，7个循环；

c.配置末端修复混合物，按照体积比为8:7:5的双蒸水、End Repair Buffer、EndRepair Enzyme Mix添加至混合装置中，涡旋混匀，与片段化的样品混匀得到溶液，置于混匀仪中20℃孵育30min，得到末端修复混合物；

d.往步骤c中的末端修复混合物中加入磁珠，涡旋混匀，室温放置10min后，将样品转移到磁力架上3-5min，待液体澄清后移除废液，继续添加80％酒精溶液冲洗30s，移去废液，重复清洗2次，开盖2-3min使酒精挥发；

e.将体积配比为42:5:3的双蒸水、A-Tailing Buffer、A-Tailing Enzyme依次加入混合装置中，并添加至步骤d中，涡旋混匀，置于混匀仪30℃孵育30min；

f.按照体积比，往步骤e中加入2倍量的PEG/NaCl溶液，涡旋混匀，室温放置10min后，将样品转移到磁力架上，待液体澄清后移除废液，继续添加80％酒精溶液进行冲洗，移去废液，重复清洗2-3次，并使酒精挥发，得到混合物A；

g.按照体积比为32:10:5的双蒸水、Ligation Buffer以及DNA ligation依次添加至混合装置中，得到混合物B，并将混合物B转移至步骤f中的清洗后的混合物A中，并加入占混合物B体积3/47的Adapter，后置于恒温混匀仪中20℃孵育15min；

h.往步骤g中加入适量的PEG/NaCl溶液，涡旋混匀，室温放置10min后，转移到磁力架上，待液体澄清后移除废液，继续添加80％酒精溶液冲洗，移去废液，重复清洗2-3次，并使酒精挥发；后加入双蒸水进行溶解，室温放置5-10min后移至磁力架上，并取上清液；

i.进行文库扩增以及扩增后的清洗；

j.将扩增清洗后的产物电泳条件下切取200-300bp位置的琼脂糖凝胶片段使用OMEGA试剂盒进行回收，并测浓度；

k.进行扩增标记以及磁珠纯化操作；

l.按照体积比5:1.5取10×NEB Buffer以及限制性内切酶，补充双蒸水进行定量，后利用涡旋混匀后置于PCR仪中37℃孵育1h，完成第一次酶切；按照体积比5:1取10×NEBBuffer以及限制性内切酶，并补充双蒸水进行定量，置于PCR仪中37℃孵育3h，完成第二次酶切。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述牛属动物的牛线粒体基因组全长为15-17kb。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物包括F引物以及R引物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述F引物序列包括CAGCGCAATCCTATTYAAGAGTCCATATCG序列以及ATGAGGCATAATYATAACCAGCTCAATYTGC序列。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述R引物序列包括CTWGCTAGTAGTCATCARGTGGCTATTAGTG以及TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGACT序列。