CN111164090A - 用于从微生物发酵纯化中性母乳寡糖（hmo）的方法 - Google Patents

用于从微生物发酵纯化中性母乳寡糖（hmo）的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于从发酵液中纯化中性母乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括以下步骤：(i)从所述发酵液分离生物质以提供粗溶液；(ii)用以下项处理所述粗溶液：(a)阳离子交换材料；(b)阴离子交换材料；和(c)阳离子交换吸附树脂；从而获得含有所述中性母乳寡糖的经纯化的溶液。进一步地，本发明涉及一种用于在发酵液中发酵生产HMO并从所述发酵液中纯化所述HMO的方法。

Description

用于从微生物发酵纯化中性母乳寡糖(HMO)的方法
本发明涉及一种用于纯化中性母乳寡糖(HMO)的方法。
母乳含有各种寡糖(HMO)，其对于婴儿的健康发育是重要的。许多HMO在健康肠道微生物组的发育中起重要作用。可以化学合成HMO。然而，此种方法具有技术和经济限制。WO2012/112777提供了用于在细菌中生产HMO的发酵方法。描述了用于2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的纯化方法，所述方法包括在粗碳柱上捕获产物并且用有机溶剂洗脱以获得洗脱液，接着蒸发所述溶剂以获得粗糖产物(糖浆或干燥产物)。然后使所述糖产物在细碳和离子交换介质上经受快速色谱法。需要快速色谱法是不利的，特别是当纯化要以工业规模进行时。
WO 2015/106943涉及生产HMO的另外的酶促和发酵方法，并且观察到现有技术中用于从复杂混合物(如发酵液)中纯化各寡糖产物的方法在技术上是复杂的并且对于食品应用而言是不经济的。根据WO 2015/106943，例如凝胶过滤色谱法不能有效地扩大规模并且不适合于连续操作。WO 2015/106943进一步涉及提供已经有效地除去重组DNA或蛋白质的寡糖产物的需要。根据实例，通过包括以下后续步骤的纯化方法可以获得产率为约70％时的94％的2’-FL纯度：通过以下方式从发酵培养基(包含2’-FL)中分离生物质：使用具有10kDa截留的过滤膜进行超滤，使所述发酵培养基经过强阳离子交换剂以除去带正电荷的污染物，紧接着使所述发酵培养基经过强阴离子交换剂柱。然后将如此获得的溶液渗滤，并且其后通过纳滤进一步浓缩。然后用活性炭处理经浓缩的2’-FL-溶液以除去产生颜色的物质如美拉德反应(Maillard reaction)产物和羟醛反应产物。接着，使经浓缩的2’-FL溶液经受电渗析并浓缩以获得45％的2’-FL溶液，将其再次用离子交换剂、活性炭和电渗析进行处理。
需要一种替代的纯化方法，其以令人满意的产率和纯度提供中性HMO产物，特别是不需要电渗析和/或不需要重复离子交换和吸附步骤的这样的方法。
现在已经可以从其中已经发酵产生HMO的发酵液中以令人满意的产率和纯度获得HMO产物。
因此，本发明涉及一种用于从发酵液中纯化中性母乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从所述发酵液分离生物质以提供粗溶液；
(ii)用以下项处理所述粗溶液：
-阳离子交换材料；
-阴离子交换材料；和
-阳离子交换吸附树脂；
从而获得含有所述中性母乳寡糖的经纯化的溶液。
本发明进一步涉及一种用于生产中性母乳寡糖的方法，所述方法包括通过在发酵液中进行微生物发酵生产所述中性母乳寡糖，并且使用根据本发明的用于纯化中性母乳寡糖的方法纯化所生产的中性母乳寡糖。
在实施例中，获得了包含HMO的溶液，优选浓溶液(糖浆)，优选水溶液。此种糖浆通常具有至少25wt.％、优选25-50wt.％，特别是25-35wt.％的HMO含量。所述糖浆例如可以通过浓缩根据本发明获得的经纯化的溶液而获得。
在实施例中，所获得的产物呈粉末形式，所述粉末具有小于10wt.％、优选小于8wt.％、更优选小于5wt.％的水含量。典型地，此种粉末的水含量基于干物质(DM)是在2％至4％的范围内。粉末可以例如通过干燥根据本发明获得的糖浆而获得。
根据本发明，已经发现在不需要电渗析、不需要活性炭、不需要用纳滤或反渗透进行纯化，并且仅需要用阳离子交换材料、阴离子交换材料和吸附树脂进行单次循环处理的情况下，70％或更高(基于发酵液中的HMO含量)的产率和90wt.％或更高(基于干物质)、特别是90-95wt.％的HMO纯度是可行的。在优选的实施例中，产率在75-99wt.％的范围内，在具体的实施例中，产率在80-97wt.％的范围内(基于发酵液中的HMO含量)。
特别地，本发明允许从发酵液中以基于干物质的90wt.％或更高纯度获得2’-岩藻糖基乳糖(在本文中另外称为2’-FL)。优选地，从发酵液中以以下纯度获得2’-FL：92wt.％或更高、更优选94wt.％或更高、甚至更优选95wt.％或更高、还甚至更优选96wt.％或更高、还甚至更优选97wt.％或更高并且最优选98wt.％或更高，所有都基于干物质。优选地，从发酵液中以以下产率获得2’-FL：70％或更高、更优选75％或更高、甚至更优选80％或更高、还甚至更优选85％或更高并且最优选90％或更高，所有都基于发酵液中的2’-FL含量。在优选的实施例中，根据本发明的方法以基于发酵液中2’-FL含量的80％或更高的产率提供2’-FL，其具有基于干物质的90wt.％或更高、更优选92wt.％或更高、甚至更优选94wt.％或更高并且最优选95wt.％或更高的纯度。在另一个优选的实施例中，根据本发明的方法以基于发酵液中2’-FL含量的85％或更高的产率提供2’-FL，其具有基于干物质的90wt.％或更高、更优选92wt.％或更高、甚至更优选94wt.％或更高并且最优选95wt.％或更高的纯度。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另外说明，并且除非从上下文得出其必须意指‘或者…或者’，否则如本文使用的术语“或”意指“和/或”。
除非另外说明，并且除非从上下文得出其必须意指‘仅一个/种’，否则如本文所用的术语“一个/种(a/an)”意指“至少一个/种”。
除非另外说明，并且除非从上下文得出其必须意指单数形式，否则当以单数提及“名词”(例如化合物、添加剂等)时，旨在包括复数。
与值相关的术语“约”通常包括所述值周围的范围，如本领域技术人员将理解的。具体地，所述范围是从低于所述值至少10％至高于所述值至少10％，更具体地从低于所述值5％至高于所述值5％。
为了清楚和简明描述的目的，本文将特征描述为同一或不同实施例的一部分，然而，将理解，本发明的范围可包括具有所描述的特征中的全部或一些的组合的实施例。
发酵液典型地包含用于生产HMO的微生物或其残余物，以及用于微生物的营养物。还可存在由其生产HMO的残余碳源。进一步地，可能存在通过微生物产生的一种或多种副产物。
可以依据根据本发明的方法从发酵液中回收的HMO包括选自由以下组成的组的中性HMO：2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳糖-N-四糖(LnT)、6’-半乳糖基乳糖和3’-半乳糖基乳糖。已经发现根据本发明的方法特别适合于从发酵液中获得经纯化的2’-FL。
HMO的发酵生产可以基于已知的用于寡糖微生物生产的方法进行，例如，如上文提及的现有技术或其中引用的现有技术中所述。优选地，乳糖用作碳源，所述碳源通过微生物在发酵液中转化为HMO。有待在根据本发明方法的步骤(i)中处理的含有HMO的发酵液通常具有总含量为0-0.20wt.％、优选0.01-0.15wt.％、更优选0.01-0.10wt.％、特别是0.02-0.07wt.％的乳糖，例如约0.05wt.％的乳糖。
从液相中分离生物质(步骤(i))(提供包含HMO的粗溶液)原则上可以以本身对于已经用于生产HMO的发酵液类型已知的方式实现。例如可以使用澄清和/或过滤。在步骤(i)之前，可以使发酵液经受脱气步骤。此种步骤也可以在步骤(i)期间或之后进行。合适的脱气步骤通常是本领域已知的。脱气是有利的，因为它降低了在步骤(ii)期间形成气泡的风险。此类气泡可能不利地影响步骤(ii)的效力；假如在步骤(ii)中使用填充柱，则气泡可能干扰粗溶液流过柱，并且假如使用松散珠粒，则气体形成可能引起吸附材料的漂浮。
根据本发明，分离生物质以获得粗HMO溶液通常包括微滤步骤(MF)。通常用具有小于1μm、优选约0.1μm至约0.2μm的孔径的膜进行MF。MF(步骤(i)(a))特别适合于除去细胞材料(完整细胞、其片段)和其他超分子碎片。MF可以在约环境温度下进行。温度通常在20℃-75℃的范围内。优选地，MF在至少30℃的温度下进行，更优选在35℃-70℃范围内的温度下进行。已经发现相对高的温度有利于HMO的增加产率。特别有利的是在约40℃-50℃范围内的温度，如约45℃的温度，或在约60℃-70℃范围内的温度，如约65℃。不受理论的约束，诸位发明人认为在升高的温度下改善来自生物质的分泌物进入液相。进一步地，高温、特别是约60℃至70℃的温度有利于在微滤期间实现细胞物质的更高浓缩系数，这对HMO的产率具有积极影响。
当在相对高的温度如至少约45℃的温度下与MF组合时，UF之前的热处理可以是MF的集成部分。例如，高温、特别是约60℃至70℃的温度与MF渗余物通过通风罐的再循环和/或MF渗透物在通风罐中的接收组合产生经脱气的MF渗透物。
此外，高温、特别是约60℃至70℃的温度可以改性蛋白质，例如使其变性，从而其在随后的步骤中变得较不可渗透通过UF膜。
可替代地，如果MF在约20℃至50℃(例如在40℃-50℃，如45℃)的温度下进行，则与通风罐组合的热处理可以作为单独的步骤进行。
使步骤(i)(a)的MF的渗透物优选经受超滤(UF)步骤(步骤(i)(b))。超滤步骤特别适合于从渗透物中除去蛋白质、DNA和/或内毒素。热处理用于改性蛋白质，例如使其变性，从而其变得较不可渗透通过UF膜。步骤(i)(b)通常使用具有5kDa或更小、特别是约3kDa或更小的截留的UF膜进行。截留通常为至少约1kDa。
因此，在优选的实施例中，本发明涉及一种用于从发酵液中纯化中性母乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从所述发酵液分离生物质，所述分离包括以下步骤：
(a)微滤(MF)；和
(b)用具有5kDa或更小的截留分子量的膜使MF渗透物经受超滤(UF)；
以提供粗溶液；和
(ii)用以下项处理所述粗溶液：
(a)阳离子交换材料；
(b)阴离子交换材料；和
(c)阳离子交换吸附树脂；
从而获得含有所述中性母乳寡糖的经纯化的溶液。
在此优选的实施例中，进一步优选的是步骤(i)(a)中的微滤在20℃-75℃范围内、优选在30℃-70℃范围内、特别是在40℃-50℃范围内或在60℃-70℃范围内的温度下进行。任选地，使步骤(i)(a)的MF渗透物在步骤(i)(b)之前经受热处理。
进一步优选的是步骤(b)中的超滤用具有3kDa或更小、优选3kDa的截留分子量的膜进行。
为了增加从发酵液的HMO回收率，步骤(i)(a)的MF和/或步骤(i)(b)的UF可与渗滤一起施加。
同样在此实施例中，中性母乳寡糖通常选自由以下组成的组：2’-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳糖-N-四糖(LnT)、6’-半乳糖基乳糖和3’-半乳糖基乳糖。优选地，中性HMO是2’-FL。
用阳离子交换材料(步骤(ii)(a))、阴离子交换材料(步骤(ii)(b))、和阳离子交换吸附树脂(步骤(ii)(c))处理从液相中分离生物质后获得的粗溶液。通常优选至少用阳离子交换材料进行处理，并且随后用阴离子交换材料进行处理。已经用以下方法实现了特别良好的结果，其中首先用阳离子交换树脂、其后用阴离子交换树脂、并且其后用吸附树脂处理粗溶液。
离子交换处理可以是弱离子交换处理或强离子交换处理。术语‘弱离子交换’和‘强离子交换’在本领域中是通常已知的。一旦离子交换剂平衡，强离子交换剂将不显著损失其基质上的电荷，并且因此可以使用宽的pH范围，通常是从强酸性pH到强碱性pH。弱离子交换剂具有更具体的pH值范围，其中它们将保持它们的电荷，在弱阴离子交换材料的情况下通常为酸性至约中性pH，对应地在弱阳离子交换材料的情况下为碱性至约中性pH。
离子交换材料可以例如作为膜、作为电荷改性的深度滤芯提供在填充柱中或用作悬浮或流化在有待用所述离子交换材料处理的液体中的材料。离子交换材料典型包括提供有固定官能团(用于阴离子交换材料的阳离子，用于阳离子交换材料的阴离子)的基质。合适的离子交换材料的实例包括纤维凝胶、微晶凝胶或珠状凝胶。这些可以由例如选自衍生以携带阴离子或阳离子基团的基于多糖的材料(例如琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素)、基于二氧化硅的材料和有机聚合物基质材料(例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯)的任何材料制成。
对于特定的关注的材料，可以以本身已知的方式，例如如供应商所指定的，使用离子交换材料。强离子交换剂比弱离子交换剂更具优势，因为它对从粗溶液中捕获离子的pH依赖性低。弱离子交换剂的优点是更易再生，即需要较少的化学品进行再生以后续使用。
在步骤(ii)(a)中的阳离子交换材料用作阳离子交换剂，即，用于除去带正电的组分。阳离子交换步骤(ii)(a)优选包括用强阳离子交换材料处理。优选地，阳离子交换材料是选自由苯乙烯-二乙烯基苯阳离子交换树脂组成的组的强酸性阳离子交换材料，更优选凝胶型苯乙烯-二乙烯基苯阳离子交换树脂。通常，使用呈H+形式的阳离子交换材料进行阳离子交换(步骤(ii)(a))。特别地，用包含磺酸官能团的阳离子交换材料已经实现了良好的结果。最优选地，阳离子交换材料是具有苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质和磺酸官能团的强酸性阳离子交换树脂。
在步骤(ii)(b)中的阴离子交换材料用作阴离子交换剂，即，用于除去带负电的组分。阴离子交换(步骤(ii)(b))优选包括用弱阴离子交换材料处理。对于弱阴离子交换材料，已经发现在其中它结合来自发酵液的阴离子的条件下，它基本上不吸附2’-FL或另一种HMO。它有利地用于除去痕量的DNA。当使用强阴离子交换材料时，至少在一些实施例中，HMO的吸附可能是问题。因此，使用弱阴离子交换材料可以有助于特别高的HMO产率。通常，使用呈OH-形式的阴离子交换材料进行阴离子交换(步骤(ii)(b))。优选地，阴离子交换材料是选自由交联丙烯酸基弱阴离子交换树脂组成的组的弱碱性阴离子交换树脂，优选凝胶型交联丙烯酸基弱碱性阴离子交换树脂。特别地，使用包含叔胺官能团的阴离子交换材料已经实现了良好的结果。最优选地，弱碱性阴离子交换材料是具有叔胺官能团的交联丙烯酸基阴离子交换树脂、优选凝胶型交联丙烯酸基阴离子交换树脂。
步骤(ii)(c)中的吸附树脂也是阳离子交换型材料。在根据本发明的方法中，其被用来从发酵液中吸附组分，典型地有机组分，特别是非阳离子组分，更特别是除HMO以外的在发酵液的pH下为中性的组分。此种材料例如优于活性炭的优点是其对中性寡糖吸附的惰性。令人惊讶地，已经发现阳离子交换吸附树脂还适合从含有HMO的溶液中除去颜色。特别地，已经发现它在除去美拉德反应产物和羟醛反应产物方面有效。步骤(ii)(c)的吸附树脂-其优选在阳离子交换(步骤(ii)(a))和阴离子交换(步骤(ii)(b))之后使用-也能够除去源自发酵液的(残留)阳离子。因此，步骤(ii)(c)中的吸附树脂用于除去(通过吸附)组分、特别是中性组分(除HMO以外)。优选地，阳离子交换吸附树脂是提供有磺酸官能团以便增加亲水性的聚芳族吸附树脂。树脂基质优选是基于苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的。树脂通常是高度多孔的。更优选地，吸附树脂是高度多孔的并具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物基质，其亲水性通过磺酸基团的存在而增加。孔隙度优选为约0.8至1.2ml/g、更优选约0.9至约1.1ml/g、甚至更优选约0.95至约1.05ml/g、并且最优选约1.0ml/g，并且平均表面积优选大于≥600m2/g、更优选≥650m2/g、甚至更优选≥670m2/g并且最优选≥700m2/g。在特别优选的实施例中，孔隙度为约1.0ml/g，并且平均表面积≥700m2/g。此类吸附树脂是可商购的。
因此，本发明涉及一种用于从发酵液中纯化中性母乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从所述发酵液分离生物质以提供粗溶液；
(ii)用以下项处理所述粗溶液：
(a)用于除去带正电的组分的阳离子交换材料；
(b)用于除去带负电的组分的阴离子交换材料；和
(c)用于吸附组分、特别是中性组分(除HMO以外)的阳离子交换吸附树脂；
从而获得含有所述中性母乳寡糖的经纯化的溶液。
步骤(ii)(c)的阳离子交换吸附树脂优选具有约0.8至1.2ml/g的孔隙度和≥600m2/g的平均表面积。
步骤(ii)(a)和(ii)(b)的顺序也可以颠倒，即，步骤(ii)(b)的用弱碱性阴离子交换树脂进行的处理可以在步骤(ii)(a)的用强酸性阳离子交换树脂进行的处理之前或之后进行。因此，步骤(ii)中处理(a)、(b)和(c)的顺序可以是(a)接着是(b)接着是(c)，或者可替代地是(b)接着是(a)接着是(c)。
在根据本发明方法的步骤(ii)的优选的实施例中，将步骤(i)中获得的粗溶液用以下项进行处理：
(ii)(a)强酸性阳离子交换树脂，优选具有苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质和磺酸官能团的强酸性阳离子交换树脂；
(ii)(b)弱碱性阴离子交换树脂，优选具有交联丙烯酸凝胶型基质和叔胺官能团的弱碱性阴离子交换树脂；以及
(ii)(c)阳离子交换吸附树脂，优选具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物基质和磺酸官能团的阳离子交换吸附树脂。
在此实施例中，进一步优选的是，步骤(i)包括(i)(a)MF，接着是(i)(b)MF渗透物的UF以获得粗溶液，且步骤(ii)(c)在步骤(ii)(a)和(ii)(b)之后进行。特别地，用以下方法获得了良好的结果，其中步骤(i)包括(i)(a)MF，接着是(i)(b)MF渗透物的UF以获得粗溶液，并且首先进行用所述强酸性阳离子交换树脂的阳离子交换步骤(ii)(a)，其后进行用所述弱碱性阴离子交换树脂的阴离子交换步骤(ii)(b)，并且其后进行用阳离子交换吸附树脂的吸附步骤(ii)(c)。
在此实施例中，进一步优选地是，步骤(ii)(c)中的阳离子交换吸附树脂的孔隙度为约0.8至1.2ml/g、更优选约0.9至约1.1ml/g、甚至更优选约0.95至约1.05ml/g、并且最优选约1.0ml/g，并且平均表面积优选大于≥600m2/g、更优选≥650m2/g、甚至更优选≥670m2/g并且最优选≥700m2/g。在特别优选的实施例中，孔隙度为约1.0ml/g，并且平均表面积≥700m2/g。
在特别优选的实施例中，本发明涉及一种用于从发酵液中纯化中性母乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从所述发酵液分离生物质，所述分离包括以下步骤：
(a)微滤(MF)，任选与渗滤一起进行；和
(b)用具有5kDa或更小的截留分子量的膜使MF渗透物经受超滤(UF)，任选与渗滤一起进行；
以提供粗溶液；和
(ii)用以下项处理所述粗溶液：
(a)强酸性阳离子交换树脂，优选具有苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质和磺酸官能团的强酸性阳离子交换树脂；
(b)弱碱性阴离子交换树脂，优选具有交联丙烯酸凝胶型基质和叔胺官能团的弱碱性阴离子交换树脂；和
(c)阳离子交换吸附树脂，优选具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物基质和磺酸官能团的阳离子交换吸附树脂。
从而获得含有所述中性母乳寡糖的经纯化的溶液。
更优选地，步骤(ii)(c)中的阳离子交换吸附树脂的孔隙度为约0.8至1.2ml/g、更优选约0.9至约1.1ml/g、甚至更优选约0.95至约1.05ml/g、并且最优选约1.0ml/g，并且平均表面积优选大于≥600m2/g、更优选≥650m2/g、甚至更优选≥670m2/g并且最优选≥700m2/g。甚至更优选地，阳离子交换吸附树脂具有约1.0ml/g的孔隙度和≥700m2/g的平均表面积。
同样在根据本发明方法的此实施例中，中性母乳寡糖通常选自由以下组成的组：2’-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳糖-N-四糖(LnT)、6’-半乳糖基乳糖和3’-半乳糖基乳糖。最优选地，中性HMO是2’-FL。
使粗溶液经受用阴离子交换材料、阳离子交换材料和吸附树脂进行的单次(顺序)处理通常足以获得含有中性母乳寡糖的经纯化的溶液。如果需要，可以将经纯化的溶液进一步处理，例如进一步纯化和/或浓缩。此种进一步的处理优选包括选自由纳滤(NF)和反渗透(RO)组成的组中的至少一种处理。NF或RO处理典型用于除去水，从而浓缩HMO。如果需要高通量(需要较小的膜面积)，则NF被认为是特别合适的。已经发现在相对高的压力下操作的RO特别适合于获得具有高HMO含量(如35-50wt.％的HMO含量)的高度浓缩的糖浆。
可替代地或另外地，可以使经纯化的溶液经受蒸发步骤以浓缩溶液，例如以获得浓溶液(糖浆)。
在具体的实施例中，在步骤(ii)中处理粗溶液之后，使含有HMO的经纯化的溶液经受额外的精制(polishing)步骤。为此，可以使用吸附材料如活性炭。如果使经纯化的溶液进一步经受浓缩步骤，则通常在浓缩步骤之前进行所述精制步骤。如果需要进一步减少有机化合物和/或如果需要除去残留的颜色，它是特别有用的。
在具体的实施例中，在步骤(ii)中处理粗溶液之后，使含有HMO的经纯化的溶液经受额外的精制步骤。为此，可以使用吸附材料如电荷改性的深度过滤器。如果使经纯化的溶液进一步经受浓缩步骤，则通常在浓缩步骤之前进行所述精制步骤。它特别可用于减少潜在的残留DNA片段。
在具体的实施例中，浓缩步骤(例如通过NF、RO或蒸发)之后是灭菌级微滤步骤以确保溶液中不存在细菌或孢子。
在根据本发明方法的有利实施例中，使经纯化的溶液(任选地在浓缩处理之后)经受结晶步骤以获得结晶的HMO。合适的结晶条件可以基于本领域已知通常用于寡糖或者特别是关注的HMO的那些。
在根据本发明方法的有利实施例中，使经纯化的溶液(任选地在浓缩处理之后)经受干燥步骤以获得呈粉末形式的HMO。合适的干燥条件可以基于本领域已知通常用于寡糖或者特别是关注的HMO的那些。优选的干燥步骤包括喷雾冷却、喷雾干燥和冻干(冷冻干燥)。特别地，用喷雾干燥已经实现了良好的结果。
现在将通过以下实例说明本发明。
实例1
通过将葡萄糖微生物转化为GDP-岩藻糖、接着细胞内酶促转化为呈α-1,2-键联的乳糖产生2’-FL。在30℃下在发酵液中通过存在于大肠杆菌(E.coli)K12细菌工程宿主菌株中的岩藻糖基转移酶催化反应，总体上如WO 2012/112777和WO 2014/018596中所述，区别在于甘油被葡萄糖代替且DF204消泡剂被Basildon 98/007K代替。发酵液中的其他组分包括铵、钠、镁、磷酸盐、钾、硫酸盐、消泡剂、次氮基三乙酸(NTA)和痕量元素。为了最高纯度，使用脱矿质水。在发酵过程期间将温度、pH和溶解氧控制在限定的范围内。
发酵用1000升无菌培养基开始并持续直至已经形成3.52％2’-FL。
使所得的含有2’-FL的发酵液经受
(ia)使用具有10.8m2的膜面积和0.1μm截留的膜进行微滤以除去细胞。
MF操作数据：
发酵液质量 2028kg
再循环流量 6000-6500L/h
TMP 1.8
温度 45℃
渗滤 进料的80％
在VCR下开始渗滤 1.7
最终浓缩VCR 2.5
MF细节：
Figure BDA0002426276390000131
*(或添加更少的透析水)
基于MF后存在的2’-FL的总量，经MF的产率计算为：91％。
化学分析如下：
Figure BDA0002426276390000132
接下来，使MF的渗透物经受
(ib)使用2×7m2膜面积、具有5kDa的截留的膜进行超滤以除去蛋白质和矿物质。
操作数据
MF渗透物质量 3080kg
再循环流量 2000L/h
TMP 1.6
温度 14℃-15℃
渗滤 500kg
在VCR下开始渗滤 250kg IBC-12
最终浓缩VCR 150kg IBC-20
UF细节：
Figure BDA0002426276390000141
UF的2’-FL产率为99％。
对于OD450，达到2倍的减少。这主要是通过UF实现的。超滤阻挡了一部分(颜色)组分，从而已经减少了需要另外在后续步骤中除去的一部分颜色。
Figure BDA0002426276390000151
在如用布拉德福德测定定量的蛋白质水平上看出组分的主要减少。MF渗透物中的布拉德福德水平为12000ppm。这在UF渗透物中降至600ppm(均以总干物质计)。
其后，使HMO的粗溶液(UF的渗透物)随后经受
(iia)在280l柱中的具有苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质和磺酸官能团的强酸性阳离子交换树脂的阳离子交换；
(iib)在225l柱中的具有交联丙烯酸凝胶型基质和叔胺官能团的弱碱性阴离子交换树脂的阴离子交换；
(iic)在280l中的具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物基质和磺酸官能团且具有约1.0ml/g的孔隙度和≥700m2/g的平均表面积的阳离子交换吸附树脂的吸附树脂上的吸附。
在使粗溶液通过柱之前，首先将柱用水冲洗约60min(以约1100l/h)。
使粗溶液以1100l/h的速率通过柱。在最后一个柱(iic)的出口处，使用BRIX(通常已知的用于溶液的糖含量的量度)监测洗脱液的2’-FL含量。一旦BRIX值达到0.2，就开始收集洗脱液(含2’-FL)。继续收集直到BRIX下降。收集的洗脱液是含有中性母乳寡糖的经纯化的溶液。在步骤(iic)之后的数据：
Figure BDA0002426276390000161
基于2’-FL以及UF渗透物和收集的洗脱液总量的分析数据，步骤(iia)-(iic)的2’-FL产率为99％。
其后，将收集的洗脱液通过NF进一步处理以除去水(浓缩2’-FL)。
工艺数据：
NF渗余物体积 178
再循环流量 1400
压力 30
温度 6-10
最终浓缩VCR 31BRIX
2’-FL从1.7BRIX浓缩到32BRIX。2’-FL含量从1.63％增至28.6％。电导率从28增至123uS/m。浓缩后的OD290(有机物)和OD420(颜色)仍然是低的，分别为0.356和0.002。
化学分析
以DM计的NF渗余物 液体
％DM ％ 32
2’-FL/DM ％ 91
灰分/DM ％ 0.1
布拉德福德/DM ppm 59
重金属 ppm
有机酸(总和) ％
随后使NF后获得的具有32％干物质含量的浓缩物经受巴氏灭菌步骤，并将经巴氏灭菌的浓缩物喷雾干燥以获得2’-FL粉末。
从发酵液开始的总产率为83％。
实例2
使以基本上如实例1所述的方式获得的发酵液经受巴氏灭菌(80℃，15s)，并经受步骤(ia)、(ib)、(iia)、(iib)和(iic)，基本上如实例1中所述。只要BRIX大于0.1，就收集来自步骤(iic)的洗脱液。使洗脱液经受RO而不是NF。
Figure BDA0002426276390000171
渗余物的量太低而不能浓缩至>30Brix。2’-FL产率为93％。
实例3
通过将葡萄糖微生物转化为GDP-岩藻糖、接着细胞内酶促转化为呈α-1,3-键联的乳糖产生3-岩藻糖基乳糖(3-FL)。通过存在于发酵液中大肠杆菌的工程宿主菌株中的岩藻糖基转移酶来催化反应，总体上如WO 2012/112777中所述。
基本上如以上实例1中所述，使包含3-FL的发酵液经受步骤(i)、(iia)、(iib)和(iic)。产物的Brix、电导率和颜色的测量示出3-FL溶液的纯度大大增加。
步骤(ii)(c)之后的数据
Figure BDA0002426276390000181
实例4
如WO 2014/153253中所述生产乳糖-N-四糖(LNT)。基本上如以上实例1中所述，使包含LNT的发酵液经受步骤(i)、(iia)、(iib)和(iic)。产物的Brix、电导率和颜色的测量示出LNT溶液的纯度大大增加。
步骤(ii)(c)之后的数据
Figure BDA0002426276390000182

Claims (18)

1.一种用于从发酵液中纯化中性母乳寡糖(HMO)的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从所述发酵液分离生物质以提供粗溶液；
(ii)用以下项处理所述粗溶液：
(a)阳离子交换材料；
(b)阴离子交换材料；和
(c)阳离子交换吸附树脂；
从而获得含有所述中性母乳寡糖的经纯化的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述中性母乳寡糖选自由以下组成的组：2’-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳糖-N-四糖(LnT)、6’-半乳糖基乳糖和3’-半乳糖基乳糖。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，步骤(ii)(a)中的所述阳离子交换材料为强酸性阳离子交换材料，优选为选自由凝胶型苯乙烯/二乙烯基苯阳离子交换树脂组成的组的强酸性阳离子交换材料，更优选为具有苯乙烯/二乙烯基苯凝胶型基质和磺酸官能团的强酸性阳离子交换树脂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(ii)(b)中的所述阴离子交换材料为弱碱性阴离子交换材料，优选为选自由交联丙烯酸基阴离子交换树脂组成的组的弱碱性阴离子交换材料，更优选为具有叔胺官能团的凝胶型交联丙烯酸基阴离子交换树脂。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(ii)(c)中的所述阳离子交换吸附树脂具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物基质和磺酸官能团、约0.8至1.2ml/g的孔隙度和≥600m2/g的平均表面积。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)中，首先用所述阳离子交换材料、其后用所述阴离子交换材料并且其后用所述吸附树脂处理所述粗溶液。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(i)包括：
(a)微滤(MF)；和
(b)用具有5kDa或更小的截留分子量的膜使MF渗透物经受超滤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(b)中的所述超滤用具有3kDa或更小、优选3kDa的截留分子量的膜进行。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述微滤是在20℃-75℃范围内、优选在30℃-70℃范围内、特别是在40℃-50℃范围内或在60℃-70℃范围内的温度下进行。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，使步骤(i)(a)的MF渗透物在步骤(i)(b)之前经受热处理。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括：使已经在步骤(ii)中获得的所述经纯化的溶液经受纳滤或反渗透。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使已经在步骤(ii)中获得的所述经纯化的溶液-任选在一个或多个进一步处理步骤之后-经受(iii)干燥或结晶步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，在步骤(iii)中，通过喷雾干燥来干燥所述经纯化的溶液。
14.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述中性母乳寡糖以粉末形式获得，所述粉末基于干物质具有小于10wt.％、优选小于8wt.％、更优选小于5wt.％的水含量，并且具有90wt.％或更高、优选92wt.％或更高、更优选94wt.％或更高的纯度。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述中性母乳寡糖以糖浆形式获得。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法在无电渗析步骤的情况下进行。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)之后，使所述经纯化的溶液进一步经受用精制材料进行的处理。
18.一种用于生产中性母乳寡糖的方法，所述方法包括通过在发酵液中进行微生物发酵来生产所述中性母乳寡糖，并且使用根据前述权利要求中任一项所述的方法纯化所生产的中性母乳寡糖。
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