CN116943430A - 一种四步分离纯化甘油葡糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了甘油葡糖苷的分离纯化方法。该分离纯化方法，包括：((1)对酶法制备甘油葡糖苷的初始产物依次进行微滤、超滤和纳滤，去除其中的杂质，得到主要物质为果糖和甘油葡糖苷的过滤产物；(2)用色谱分离法对步骤(1)所得过滤产物进行分离，使甘油葡糖苷与果糖分开，收集分离纯化的甘油葡糖苷。本发明方法操作简单，GG纯度高。
Description
技术领域
本发明属于分离纯化领域，具体涉及一种酶法合成的甘油葡糖苷的分离纯化方法。
背景技术
甘油葡糖苷(GG)是一类由甘油分子和葡萄糖分子通过糖苷键连接而形成的糖苷类化合物。因其具有极强的“滋润、锁水、保湿”生理功效，以及展现出的良好的预防龋齿、抑制脂肪细胞内中性脂的累积及抗过敏效果，甘油葡糖苷在化妆品、医药及食品行业具有巨大的应用价值和广阔的市场前景。
利用蔗糖磷酸化酶以蔗糖和甘油为底物合成甘油葡糖苷的酶法生产工艺，绿色高效，专一性强，且最终反应液中组分明确，主要含有酶催化剂、甘油、GG和果糖，是目前GG生产的主要工艺之一。该工艺需要对反应液中GG进行分离纯化，目前酶法生产GG较成熟的分离纯化技术是由德国Bitop公司在本世纪初开发的，依赖固定化酶实现反应后酶催化剂的离心分离去除，随后使用活性炭-硅藻土分段乙醇梯度洗脱法纯化GG，可达到较高纯度，GG收率56％。固定化酶相对生成成本较高，目前主流的生产工艺研发倾向是利用全细胞酶催化剂合成GG，但其对应的下游GG分离纯化工艺尚在摸索阶段，未开发出适用于工业化制备的分离纯化工艺。
目前分离纯化存在两个问题：(1)如何高效去除酶催化剂；(2)如何将理化性质非常相似的果糖和GG进行高效分离的同时，还保证GG的高回收率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从酶法GG合成反应液中分离纯化甘油葡糖苷的分离纯化工艺。
本发明的甘油葡糖苷的分离纯化方法，包括：
(1)对酶法制备甘油葡糖苷的初始产物进行过滤处理，去除其中的酶催化剂、甘油及蛋白质等杂质，得到主要物质为果糖和甘油葡糖苷的过滤产物；
(2)用色谱分离法对步骤(1)所得过滤产物进行分离，使甘油葡糖苷与果糖分开，收集分离纯化的甘油葡糖苷。
本发明方法中，所述过滤处理的方法包括微滤(或使初始产物中的蛋白质变性后再进行离心或滤纸过滤，收集滤液)、超滤和纳滤。
本发明方法中，所述微滤为将初始产物过膜，收集透过液。所述超滤为将微滤透过液过膜，取透过液；所述纳滤为将超滤透过液过膜，取截留液。
本发明方法中，所述微滤的膜为中空纤维膜或陶瓷膜。
本发明方法中，所述微滤膜的孔径为0.1um或截留分子量为100KD。
本发明方法中，超滤使用的膜的截留分子量为600-2500Da。
本发明方法中，纳滤使用的膜的截留分子量为150-300Da。
所述用于微滤的料液的粘度为4mPa.s-550mPa.s，具体为550mPa.s、440mPa.s、250mPa.s、150mPa.s、50mPa.s、12mPa.s或4mPa.s。
酶法制备甘油葡糖苷是指用蔗糖磷酸化酶催化甘油和蔗糖生成甘油葡糖苷。
酶法制备甘油葡糖苷时所用的蔗糖磷酸化酶可以是固定化的，也可以是不固定化的，可以为纯蔗糖磷酸化酶也可以是未经纯化的蔗糖磷酸化酶，还可以为表达蔗糖磷酸化酶的重组细胞或表达蔗糖磷酸化酶的重组细胞的裂解液或表达蔗糖磷酸化酶的重组细胞的发酵液。
酶法制备甘油葡糖苷的反应体系可以是加缓冲液的，也可以是不加缓冲液而加水的。
本发明方法中，所述色谱分离法中使用的填料为强酸型阳离子交换树脂。
本发明方法中，所述强酸型阳离子交换树脂的阳离子为钙或钠。
本发明方法中，强酸型阳离子交换树脂的基本材料，如以苯乙烯和二乙烯苯聚合。
本发明方法中，所述强酸型阳离子交换树脂中强酸性的反应基为磺酸基。
本发明方法中，填料粒度为0.20mm-0.35mm，优选为0.25mm-0.30mm。
本发明方法中，流动相为水。
本发明方法中，所述色谱分离法为模拟移动床色谱(SMB)法。
本发明方法中，模拟移动床的形式可以是现有技术公开的任何形式，比如顺序式、四区式等等。模拟移动床可以采取6柱、8柱、12柱等任意柱子数。
本发明方法中，所述色谱分离中料液中溶质质量百分比浓度为10％-50％，具体为10％，20％，30％，40％或50％。
本发明方法中，采用顺序式模拟移动床时，进样液流速为0.007BV/min，流动相的流速为0.01BV/min；
采用四区式模拟移动床时，进样液流速为0.001BV/min，流动相的流速为0.01BV/min，提取液的流速为0.001BV/min，提余液的流速为0.002BV/min，阀切换时间为8min。
纳滤步骤的透过液主要为甘油，可以将甘油回收。模拟移动床步骤将GG与果糖分离，可分别回收GG和果糖。
本发明的分离纯化工艺需四个步骤即可完成，能高效去除酶催化剂和蛋白等杂质，分别纯化收获甘油、果糖和GG。该方法全程用水，省去了去除离子的步骤。该方法操作简单，对酶法合成放大生产的GG进行分离纯化，GG纯度高，且回收率高。该方法比Bitop工艺更安全，且绿色环保。
附图说明
图1为超滤透过液的HPLC色谱分析图。
图2为纳滤浓缩液的HPLC色谱分析图。
图3为模拟移动床纯化GG的HPLC色谱分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验方法
蛋白检测：使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0006)，按照试剂盒说明书列出的标准方法进行蛋白浓度检测，作为指示反应液/样品中酶催化剂等蛋白分子分离去除度的指标。蛋白浓度的标准曲线为：Y(mg/ml)＝1.7566X(A595nm样品-A595nm空白对照)-0.0364，R2＝0.9953。
菌体检测：按照《2015版化妆品安全技术规范》中列出的标准检测方法(菌落总数检验方法)进行样品菌落总数(CFU/ml)的计数，作为指示反应液/样品中菌体细胞催化剂分离去除度的指标。
粘度检测：SNB-1数字式粘度计测定。18℃，检测样品体积：100ml，转子编号sp1，转子转速60±3.5％。
GG、甘油、果糖和蔗糖的检测：
HPLC检测条件：色谱柱：Shodex Asahipak NH2P(4.6×250mm)；柱温：30℃；流动相：80％乙腈；流速：1ml/min；进样量：10μ1；运行时间：16分钟；检测器：RID示差检测器。
GG标准品(青岛中科蓝智生物科技发展有限公司，螺旋藻GG，CAS：22160-26-5)出峰时间：8.65min，GG标准曲线方程：Y(Area)＝89393.96X(g/L)-464.39597，R2＝0.99546；甘油标准品(国药集团，货号10010618)出峰时间：4.94min，甘油标准曲线方程：Y(Area)＝80755.0103X(g/L)+1868.00912，R2＝0.99585；果糖标准品(Macklin，货号D809612，CAS：57-48-7)出峰时间：7.67min，果糖标准曲线方程：Y(Area)＝90397.00182X(g/L)+1650.69614，R2＝0.99536；蔗糖标品(国药集团，货号10021463)的出峰时间：14.03min，蔗糖标准曲线方程：Y(Area)＝95374.45721X(g/L)+1288.14650，R2＝0.99608；反应液GG、甘油、果糖和蔗糖的出峰时间与标准品一致。
模拟移动床设备由进样泵、洗脱泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、***控制器计算机等部件连接组成。工作压力2-10MPa；工作温度室温～65℃。
实施例1、分离填料的选择
使用GG和果糖标准品配置用于填料筛选的初始料液(简称勾兑液)。本实施例使用勾兑液中溶质浓度为92g/L GG，40g/L果糖。
通过单柱摸索不同类型填料对果糖和GG的分离效果，具体包括活性炭、大孔吸附树脂及离子交换树脂等。
对于活性炭类填料，主要测试是否可以通过吸附GG及果糖中任一成分的方式，从而达到分离目的。待测试样品来自上海浦士达环保科技(活性炭型号PSMD-1P)以及北京日新远望科技发展有限公司(活性炭型号RX-1至RX-5，RX-8，RX-9)。采用静态吸附方式，活性炭添加量为10％，处理时间30分钟，取样检测GG及果糖浓度，并与原液比较，计算吸附率。测试结果如下表：
表：不同活性炭对GG及果糖吸附效果
结果可知，以上活性炭样品对GG及果糖吸附效果相同，因此对GG和果糖无分离效果。
针对树脂类填料，主要测试GG及果糖成分经过填料后是否会产生分离度，根据分离度大小选择树脂类型。树脂样品为Lan-1至Lan-7(西安蓝晓科技-大孔吸附树脂)、CSR-1Ca型(粒径：0.2-0.25mm)；CSR-2Ca型(粒径：0.25-0.30mm)，CSR-3Ca型(0.30-0.35mm)(淄博东大化工-苯乙烯系凝胶型强酸性(磺酸基)阳离子交换树脂(钙型))、SDM-04和SDM-06(厦门世达膜科技-苯乙烯系凝胶型强酸性(磺酸基)阳离子交换树脂(钠型))、Finex#001(芬兰芬奈树脂-苯乙烯·二乙烯共聚体强酸性阳离子交换树脂(钠型))。分离度计算公式为
分离度＝2*(T2-T1)/(W1+W2)
其中，T1、T2分别为峰1及峰2的保留时间；W1、W2分别为峰1及峰2的基线峰宽。分离度数值越高证明分离效果越好。
树脂测试采用动态分离模式，装柱径高比为1：10，流速约1BV/h，进样量0.5BV，每5min取样HPLC检测样品浓度，BV：柱体积。计算后各树脂分离度如下表：
表：不同树脂对GG及果糖分离度数据
结果表明，进口Finex#001型树脂对GG及果糖分离度最高，但成本较高；国产Ca型和钠型强酸性(磺酸基)离子交换树脂均可对GG和果糖进行一定程度的分离，尤其是CSR-Ca型树脂分离度数值更高，对GG及果糖分离效果更优，且成本低，维护方便。
通过单柱摸索CSR-2Ca型树脂对GG、果糖和甘油标准品配置的三组分勾兑液的分离效果。本实施例使用GG、果糖和甘油三组分勾兑液中溶质浓度分别为140g/L GG，95g/L果糖，80g/L甘油。树脂测试采用动态分离模式，装柱径高比为1：30，流速约0.18BV/h，进样量0.07BV，每10min取样HPLC检测样品浓度，BV：柱体积。
结果显示：GG和果糖之间的分离度为0.495，GG与甘油之间的分离度为0.72，果糖与甘油之间的分离度为0.211，表明CSR-2Ca型树脂对GG与果糖和甘油仍有较好分离效果。
实施例2、微滤
发明人将上述工艺方法用于GG的放大生产，对100L酶法生产GG反应液进行了GG的纯化制备。
一、甘油葡糖苷酶法合成
1、大肠杆菌蔗糖磷酸化酶重组菌的诱导表达
LmSP蔗糖磷酸化酶来源于(Leuconostoc mesenteroides，Q59495)，专利US10，683，525B2公开。
将蔗糖磷酸化酶的编码基因导入大肠杆菌，诱导表达，得到表达蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌。所用载体为pET28b，LB培养基，IPTG诱导。离心收集的上述大肠杆菌菌体作为后续酶法催化合成反应的全细胞催化剂。
2、利用LmSP全细胞催化剂催化GG合成
100L反应体系包含480g/L甘油，650g/L蔗糖，25g/L离心后收集的表达蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌菌体。37℃，40rpm，催化反应10天获得酶反应液。通过HPLC方法检测酶反应液中各主要成分的浓度，使用SNB-1数字式粘度计测定最终酶反应液的粘度。
结果：最终酶反应液中含有300g/L甘油，340g/L果糖，430g/L GG，25g/L菌体，底物蔗糖完全消耗，粘度为550mPa.s，相当于95％甘油水溶液在同等条件下的粘度。
二、全细胞催化剂的高效去除(中空纤维膜微滤分离)
分别取上述酶反应液10L，进行以下处理，通过对比全细胞菌体的去除效果和蛋白质杂质的去除效果，从而筛选出高效的酶催化剂去除方法：
(1)中空纤维膜
选用0.1μm孔径和截留分子量分别为100KD和50KD的三款中空纤维膜(材质PP)进行微滤，运行压力范围0.05-0.4MPa，运行温度为10-45℃。获得透过液。
(2)陶瓷膜
选用0.05μm孔径和0.1μm孔径的两款陶瓷膜(材质三氧化二铝)进行微滤处理，运行温度为10-45℃。运行压力范围：0.05-0.5MPa，，获得透过液。
(3)离心法
酶反应液首先95℃加热1h变性处理，待冷却至室温后，直接使用13000g离心40min，获得上清液。
(4)滤纸过滤
酶反应液首先95℃加热1h热变性处理，随后冷却到室温后，使用Whatman中速双圈定性滤纸(杭州沃华滤纸有限公司，直径9cm，孔径8μ m，货号99-102-090)进行真空泵抽滤处理，抽滤瓶收集透过液。
表1不同处理法对酶反应液的处理效率统计
| 样品 | 处理效率 |
| 离心法 | 6L/h(不含前处理加热变性1h) |
| 滤纸过滤法 | 2L/h/m2(不含前处理加热变性1h) |
| 陶瓷膜法(0.05μm膜孔径) | 0 |
| 陶瓷膜法(0.1μm膜孔径) | 3L/h/m2 |
| 中空纤维膜法(0.1μm膜孔径) | 4.5L/h/m2 |
| 中空纤维膜法(100KD截留范围) | 0.2L/h/m2 |
| 中空纤维膜法(50KD截留范围) | 0 |
表2不同处理方法获得样品中的蛋白含量和菌落数
结果四种方法处理后，尽管透过液样品中甘油、果糖和GG三种物质的回收率均高于98％，但不同处理方法的处理效率和酶催化剂的去除效果却呈现明显差异，具体如表1：首先，0.05μm膜孔径陶瓷膜和50KD截留范围的中空纤维膜处理无法分离收集到透过液，不能用于酶反应液中菌体和蛋白的去除。其余处理方法能够收集到分离液，其中以0.1μm膜孔径中空纤维膜处理操作简单，且效率最高。
此外，上述四种处理方法均可有效去除酶反应液中的菌体细胞催化剂和蛋白质杂质(表2)，但0.1μm膜孔径中空纤维膜处理后料液中全细胞菌体和蛋白质杂质完全去除，处理效果最优。
三、不同粘度反应液的微滤
取实施例4粘度为550mPa.s全细胞酶催化反应液分别用水稀释，各获得20L如下粘度的酶催化反应稀释液：440mPa.s、250mPa.s、150mPa.s、50mPa.s、12mpa.s、4mPa.s，进行0.1μ m膜孔径中空纤维膜处理，评估中空纤维膜法对不同粘度酶催化反应液的处理效果。运行压力范围为0.05-0.4MPa，运行温度范围为4-45℃。
结果：在4-45℃温度范围内，上述不同粘度酶反应液经过中空纤维膜处理，样品菌落总数为0CFU/ml，蛋白含量也为0mg/ml，而且随着酶反应液粘度下降和运行温度升高，中空纤维膜的处理通量显著提高，粘度12mPa.s的酶反应稀释液，40℃运行温度下，处理通量可达30L/h/m2；粘度4mPa.s的酶反应稀释液，40℃运行温度下，处理通量高达70L/h/m2。
实施例3：酶法合成甘油葡糖苷反应液的微滤-超滤-纳滤-SMB四级分离纯化
发明人采用微滤-超滤-纳滤-SMB四级分离纯化工艺流程对30L放大生产的酶法合成GG反应液进行了GG的纯化制备。
(1)微滤
取30L上述实施例2的酶反应液，用纯水等体积稀释后，使用0.1μ m孔径的中空纤维膜进行微滤处理，运行压力为0.05-0.4MPa，室温。取透过液。检测结果显示：透过液中蛋白浓度均为0.02mg/ml区间内，菌落数为0。可实现甘油、果糖、GG完全透膜，三者的回收率分别高达97％，97％和98％。
微滤处理回收率Y的计算公式为：Y＝(透过液的浓度×透过液的体积)/(原始料液的浓度×透过液的体积)。
(2)超滤
选用分子量截留范围为600Da的超滤膜对微滤产物进行超滤分离，运行压力为1-2.4MPa，运行温度为15-40℃之间。取透过液。检测结果显示：透过液中蛋白浓度均为0mg/m1，表明超滤膜将微滤处理后料液中残留的蛋白、多肽等杂质完全去除。实现甘油和果糖的完全透膜、97％GG实现透膜，三者的回收率分别高达99.9％，99.9％和97％(图1)。
超滤处理回收率Y的计算公式为：Y＝(透过液的浓度×透过液的体积)/(原始料液的浓度×透过液的体积)；超滤处理截留率R的计算公式为：Y＝1-透过液的浓度/料液的浓度。
(3)纳滤
选用分子量截留范围为150-300Da的纳滤膜对超滤产物进行纳滤分离，运行压力为1.5-4MPa，运行温度为4-40℃之间。检测结果表明，甘油在透过液中回收，纳滤透过液甘油回收率为99.2％，纯度80％。浓缩液中不含有甘油，即可通过纳滤分离完全去除甘油。取浓缩液进行检测，其果糖和GG的回收率分别高达76.4％和98％(如图2所示)。收集的110L纳滤浓缩液中溶质质量浓度百分比为28％。
(4)模拟移动床分离
上述纳滤浓缩液进一步旋蒸浓缩至溶质质量浓度百分比为50％，采用模拟移动床(SMB)连续分离纯化GG。
使用江苏汉邦公司提供的6柱顺序式SMB设备，单柱尺寸：直径3.5cm，长度70cm，树脂填料：CSR-2Ca，6柱总填料量4L。SMB分离参数如下：压力2MPa，进样液流速为0.007BV/min，进样量0.023BV，洗脱液水的流速为0.01BV/min，循环分离10min，工作温度为55℃。参照实验方法，使用HPLC对SMB分离纯化收集的GG进行检测。
结果如图3：GG纯度达到99％，GG收率达到90％。该步同时可回收果糖组分，纯度80％收率91％。
实施例4：酶法合成甘油葡糖苷反应液的微滤-超滤-纳滤-SMB四级分离纯化
发明人采用微滤-超滤-纳滤-SMB四级分离纯化工艺流程对40L放大生产的酶法合成GG反应液进行了GG的纯化制备。
(1)微滤
取40L上述实施例2的酶反应液，用纯水等体积稀释后，使用0.1μm孔径的中空纤维膜进行微滤处理运行压力为0.05-0.4MPa，运行温度为20-65℃之间。取透过液。
结果显示：微滤透过液中蛋白浓度均为0.01mg/ml，表明该微滤操作有效去除酶反应液中全细胞酶催化剂和其它蛋白等杂质。甘油、果糖和GG三种物质的回收率均高于95％。
(2)超滤
选用分子量截留范围为2500Da的超滤膜对微滤透过液进行超滤分离，运行压力为0.05-2.4MPa，运行温度为8-30℃之间。取透过液。
结果显示：超滤膜处理后，透过液中的蛋白浓度均为0mg/ml，表明2500Da截留范围的超滤膜也可实现残留蛋白、多肽的有效去除。甘油、果糖和GG的回收率分别为99％，93％和86％。
(3)纳滤
选用分子量截留范围为150-300Da的纳滤膜对超滤膜分离的透过液进行纳滤分离，运行压力为0.05-4MPa，运行温度为15-35℃之间。取浓缩液。
结果显示：甘油存在于透过液中，纳滤透过液的甘油回收率99.2％，纯度81％。浓缩液中不含有甘油，果糖和GG的回收率分别为77.1％和95.4％。收集的200L纳滤浓缩液中溶质质量浓度百分比为20％。
(4)模拟移动床分离
上述纳滤浓缩液用水稀释至溶质质量浓度百分比为10％，采用模拟移动床(SMB)连续分离纯化GG。使用8柱四区式SMB设备，单柱尺寸：直径2.0cm，长度36cm，树脂填料：Finex#001，8柱总填料量0.9L。SMB分离参数如下：压力2MPa，进样液流速为0.001BV/min，洗脱液水的流速为0.01BV/min，提取液的流速为0.001BV/min，提余液的流速为0.002BV/min，阀切换时间为8min，工作温度为60℃。参照实验方法，使用HPLC对SMB分离纯化收集的GG进行检测。
结果：GG纯度达到99％，GG收率达到85％。该法同时得果糖组分，果糖纯度74％，果糖收率93％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种甘油葡糖苷的分离纯化方法，包括：
(1)对酶法制备甘油葡糖苷的初始产物依次进行微滤、超滤和纳滤，去除其中的杂质，得到主要物质为果糖和甘油葡糖苷的过滤产物；
(2)用色谱分离法对步骤(1)所得过滤产物进行分离，使甘油葡糖苷与果糖分开，收集分离纯化的甘油葡糖苷。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述微滤为将初始产物过膜，收集透过液；所述超滤为将微滤透过液过膜，取透过液；所述纳滤为将超滤透过液过膜，取截留液。
3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于：所述微滤的膜为中空纤维膜或陶瓷膜；和/或，所述膜的孔径为0.1μm或截留分子量为100KD。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：超滤使用的膜的截留分子量为600-2500Da。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：纳滤使用的膜的截留分子量为150-300Da。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述用于微滤的料液的粘度为4mPa.s-550mPa.s，具体为550mPa.s，440mPa.s、250mPa.s、150mPa.s、50mPa.s、12mpa.s或4mPa.s。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述色谱分离法中使用的填料为强酸型阳离子交换树脂；所述强酸型阳离子交换树脂的阳离子为钙或钠。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述色谱分离法中填料粒度为0.20mm-0.35mm，优选为0.25mm-0.30mm。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述流动相为水；或，所述色谱分离中料液中溶质质量百分比浓度为10％-50％。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述色谱分离法为模拟移动床色谱法；
采用顺序式模拟移动床时，进样液流速为0.007BV/min，流动相的流速为0.01BV/min；
采用四区式模拟移动床时，进样液流速为0.001BV/min，流动相的流速为0.01BV/min，提取液的流速为0.001BV/min，提余液的流速为0.002BV/min，阀切换时间为8min。
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