CN111154916A - 呼吸道病原多重rpa检测用引物群、检测试剂及试剂盒 - Google Patents

呼吸道病原多重rpa检测用引物群、检测试剂及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供呼吸道病原多重RPA检测用引物群、检测试剂及试剂盒，通过对人巨细胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜肺军团菌中的至少5种呼吸道病原进行RPA引物的设计改造，成功获得高特异性的多重RPA检测用引物群，并采用该引物群来配制检测试剂、制作试剂盒，从而推测其能够实现最多15重呼吸道病原菌的RPA检测，并且，还能缩短整个检测流程所需的时间，简化步骤。

Description

呼吸道病原多重RPA检测用引物群、检测试剂及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及呼吸道病原多重RPA检测用引物群、检测试剂及试剂盒。
背景技术
RPA技术（全称“重组酶介导扩增技术”） 被称为是可以替代PCR技术的核酸检测技术。RPA技术是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合引物的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和DNA聚合酶；这三种酶的混合物的最佳反应温度在37°C左右。RPA技术的原理为：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列，一旦引物搜索到与之完全互补的同源序列，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使双链DNA模板解链、引物与同源序列配对结合，并在DNA 聚合酶的作用下启动DNA合成，对双链DNA模板上的目标区域进行指数式扩增，与此同时，被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在RPA技术的扩增体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，通常在1 h 内即能获得可检出水平的扩增产物。与PCR技术相比，RPA技术的整个反应不需要高温循环，简单快速，因此特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。
RPA技术的关键在于引物的设计。现有的PCR扩增引物多半是不适用的，因为RPA引物比PCR引物要长，通常需要达到30-38个碱基。并且，在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物设计不像传统PCR那样成熟，这就需要研究者自己摸着进行引物的设计和优化。由于RPA技术通常在等温条件下进行，使得其无法如普通PCR扩增通过调节反应时的退火温度和降温速率来避免多重检测时不同呼吸道病原引物组之间Tm值差异和扩增效率的不同所带来的多种扩增产物之间的互相干扰，也使得获得适合多重检测用的、高特异性的RPA扩增引物的难度非常大。目前，使用RPA技术进行单重检测的报道较多，最多实现4重检测。
急性呼吸道传染性疾病的临床诊断比较复杂，导致同一症状的病原往往高达10数种以上。基于RPA技术所具有的操作简单、扩增快速的优点。临床医学迫切希望开发出呼吸道病原多重检测用RPA引物群、检测试剂及试剂盒。
发明内容
本发明的目的之一在于提供呼吸道病原多重RPA检测用引物群，采用该引物群对待测样本的DNA和RNA中的任一种进行RPA扩增，并进行检测，能够一次实现5重以上（最多15重）呼吸道病原菌的检测，并且，还能缩短整个流程所需的时间，简化步骤。
呼吸道病原多重RPA检测用RPA引物群，该引物群由15 对引物中的至少5对组成，所述的15对引物的核苷酸序列分别为：
①人巨细胞病毒（简称：HCMV）
HCMV-F：5'biotin–CGGTACGGGCTGCAGGTAAAGTGCGATCAAGAACG 3'、
HCMV-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTCGTGCTTTTTAGCCTCTTTTTTTTTTTGCAGCTGCG
TCACGGGTCTAGCCGGCCATAATCAC 3'；
②腺病毒（简称ADV）
ADV-F：5'biotin –CTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTCG 3'、
ADV-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCGTCGTGCGTAGGCGCTTTTTTTTTTACCGTGGGGTT
TCTAAACTTGTTATTCAGGCTGA 3'；
③副流感病毒1 型（简称：PIV1）
PIV1-F：5'biotin –AAATGAGACTACAGATTACTCGAGTGAAGGTATA 3'、
PIV1-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTTAGAAAAAGGATGGTCATTTTTTTTTAAGTTATATCT
TCATTTTTGTATCGATGAGATT 3'；
④副流感病毒2 型（简称：PIV2）
PIV2-F：5'biotin –CAACTGATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTCTA 3'、
PIV2-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCAACTGCAGGATTGATTTTTTTTTTTTTGGCCCAT
TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGATAT 3'；
⑤副流感病毒3 型（简称：PIV3）
PIV3-F1：5'biotin –ACAGATAGGGATAATAACTGTAAACTCAGACT 3'、
PIV3-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTAGTGCTAGAGAACATGTTTTTTTTTTCTTCCTATTGT
CATTTATGTTAAAAGTATGAGA 3'；
⑥呼吸道合胞病毒（简称：RSV）
RSV-F：5'biotin –TCCTCACTTCTCCAGTGTAGTATTAGGCAATGCT 3'、
RSV-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTAATCACACCATTTTCTTTTTTTTTTTTTGAGTTGTTCA
GCATATGCCTTTGCTGCATCATATA 3'；
⑦金黄色葡萄球菌（简称：SA）
SA-F：5'biotin –GAAAAAATCTTAGAATTAATGGAAGCTGTAGATACTT 3'、
SA-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTCAACAGTACCACGACCAGTTTTTTTTTTTGAATACGTC
CTCAACTGGCATCATGAATGGTTTGT 3'；
⑧肺炎链球菌（简称：SP）
SP-F：biotin – CGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTT 3'、
SP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCCAACAAATCGTTTACCTTTTTTTTTTTCCGCGAACA
CTTGAATTGCTGGGGTCTTCCA 3'；
⑨肺炎支原体（简称：MP）
MP-F：5'biotin– GCGCTAAGGGCATCACTGCCGGCAGTGGCAGTCAAC 3'、
MP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTCGAGGTCGTATAAGGCTTTTTTTTTTTCGCCCGGCGAG
GTCATACCGGCGTAACGCAAAGGTGG 3'；
⑩肺炎支原体（简称：MP）
CP-F：5'biotin–GCCATTTTATCTCCAACTTGAAGTTTTCTCTTAGA 3'、
CP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTTATTTCCGTGTCGTCCTTTTTTTTTTTGCCATTTTATCT
CCAACTTGAAGTTTTCTCTTAGA 3'；
⑾肺炎克雷伯菌（简称：KP）
KP-F：5'biotin–CTGGATCTGACCCTGCAGTACCAGGGTAAAAAC 3'、
KP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTGCTCGCTGATTATCATGTTTTTTTTTTTGCGGTTGGCC
GATCATGTTTGGCCTGATCCTCTCTGCG 3'；
⑿鲍曼不动杆菌（简称：AB）
AB-F：5'biotin–AGCTCAAGTCCAATACGACGAGCTAAATCTTGAT 3'、
AB-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTATTTAAGTGGGATGGTTTTTTTTTTTTTATTCCCAGAATG
GGAAAAGGACATGACCCTAGGC 3'；
⒀铜绿假单胞菌（简称：PA）
PA-F：5'biotin–CTTCAACGAGAACCTGCTCTGCTTCACCAACAAC、
PA-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCGGCCTCGATGTAGTTGTTTTTTTTTTTCAGGTTACG
CGTCAGCGCCGAACGGAAACCGGCC 3'；
⒁嗜麦芽窄食单胞菌（简称：SM）
SM-F：5'biotin–AGCGACGAGCGAACGCGGACTAGCCCTTAAGCTGAT 3'、
SM-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCTCGTCTTCACTGAAATGTTTTTTTTTTTCCCTTTCA
GATACAGGGCTATCACCTTCTATGGCCAC 3'；
⒂嗜肺军团菌（简称：LP）
LP-F：5'biotin–GCAATGGCTGCAACCGATGCCACATCATTAGCT 3'
LP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTACATCTATGCCTTGATTTTTTTTTTTCCCCAAATCGG
CACCAATGCTATAAGACAACTTA 3'。
上述的HCMV-F、AD-F、PIV1-F、PIV2-F、PIV3-F、RSV–F、SA-F、SP-F、MP-F、CP-F、KP-F、AB-F、PA-F、SM-F、LP-F 中的“-F”均指相应病原的5’端生物素修饰的上游引物，而HCMV-R、AD- R、PIV1- R、PIV2- R、PIV3- R、RSV –R、SA- R、SP- R、MP- R、CP- R、KP- R、AB- R、PA- R、SM- R、LP-R中的“-R”指的是相应病原的5’端氨基修饰的下游引物。
与多重PCR检测方法相比，由于多重RPA技术在恒温条件下进行，不同呼吸道病原引物组之间Tm值差异和扩增效率的不同所带来的多种扩增产物之间的互相干扰，使得获得适合多重RPA检测用的、高特异性的引物的难度更大，因此，多重RPA检测方法的灵敏度和特异度通常来说会比多重PCR检测方法要差，故，现有技术所公布的多重RPA检测方法最多只能达到4重检测，随着引物群中引物对种类数量的增加，各对引物之间、各种扩增产物之间以及引物与产物之间均会相互干扰，会使检测的灵敏度大大下降，检测结果的准确度也随之下降。本发明经过无数次试验配合经验，选定了病原基因组上的保守序列，并将保守序列作为扩增序列，根据碱基互补配对原则进行了引物设计，与此同时，在对下游引物进行制备时，在初步筛选得到的下游引物的5’端添加相应的多个与扩增片段互补的碱基（即“锚定序列”），同时还对引物上的部分碱基进行了修饰，增加了引物与模板的结合效率，使得即便进行呼吸道疾病病原多达15重的检测，依然能够大大提高检测的灵敏度，并且，也未造成特异性的下降，与此同时，还大大缩短了整个流程所需的时间，简化了操作步骤。
本发明的目的之二在于提供呼吸道病原多重RPA检测试剂，其含有上述的引物群中的所有上游引物、引物-微球偶联体、游离的四种脱氧单核苷酸（简称“dNTP”）、酶、单链结合蛋白、藻红蛋白（简称“SA-PE”）、缓冲液和ATP，所述引物-微球偶联体包括由上述引物群中的各个下游引物分别与带有不同检测标记的微球一一对应偶联形成的至少5种引物-微球偶联体，所述酶主要由重组酶和DNA聚合酶组成。本发明直接采用下游引物与微球进行偶联制备引物-微球偶联体，并将该引物-微球偶联体加入扩增体系中进行扩增，扩增过程中完成标记引物锚定到微球的过程，相对于现有的PCR检测方法（现有的PCR检测方法一般需要先进行PCR扩增再将事先制备好的探针—微球偶联体与扩增产物进行杂交，杂交后需要打开反应管，手工向反应管的杂交产物中加入藻红蛋白，并在37℃的温度条件下孵育15分钟进行结合反应，结合反应后才能进行液态悬浮芯片***检测）来说，本发明可以减少杂交过程和藻红蛋白结合过程，缩短检测时间，简化步骤，也减少人工参与。
本发明的目的之三在于提供上述呼吸道病原多重RPA检测试剂的使用方法，包括以下步骤：将提取得到的待测样品中的RNA和DNA中的任一种作为核酸模板，并与上述呼吸道病原多重RPA检测试剂一次性全部混合在一起后，再进行RPA扩增，最后采用液态悬浮芯片***对扩增产物进行检测。正是由于本申请人开发出了高特异性的引物群，才使得本发明的所有上游引物和引物-微球偶联体得以能够一次性混合在一起进行反应和检测，使用方法也更为简单、快捷。
在具体实施过程中，RPA扩增时反应温度为37～42℃，反应时间为10~20min。
本发明的目的之四在于提供一种含有上述呼吸道病原多重RPA检测试剂的试剂盒。
具体实施方式
现具体阐述本发明的实施方式：
下述实施例和对比例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例和对比例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
（一）呼吸道病原多重RPA检测用引物群，该引物群由15 对引物组成，所述的引物的构建过程为：
1）本发明人用Clustal Omega与Vector NTI Suite 8.0软件对病原（也称为“病原体”）的已知特异基因的DNA 序列进行比对，筛选出急性呼吸道传染性病原特异性序列，其核苷酸序列如下所示：
①巨细胞病毒（简称HCMV）的特异序列：
AAGTTTGTGCCCCAACGGTACGGGCTGCAGGTAAAGTGCGATCAAGAACGCGATAACGCCGATCACAAACAGCGTGACGATGACCTGCCATCGACGGTGATTATGGCCGGCTAGACCCGTGACGCAGCTGCAGAGGCTAAAAAGCACGC；
②腺病毒( 简称ADV) 的特异序列：
CGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTCG
CCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACA；
③人副流感病毒1 型（简称PIV1）的特异序列：
CCGGAAATTTCTCATACCTATGACATCAACGACAACAGGAAATCATGTTCTGTAATAGCTGCAGGAACAAGGGGTTATCAGTTATGCTCCTTGCCCACTGTAAATGAGACTACAGATTACTCGAGTGAAGGTATAGAAGATTTAGTATTTGACATATTAGATCTCAAGGGAAAGACCAAATCTCATCGATACAAAAATGAAGATATAACTTTTGACCATCCTTTTTCTGCAATGTATCCAAGTGTAGGAAGTGGGATAAAGATTGAAAATACACTCATCTTCTTAGGGTACGGTGGCTTAACAACTCCGCTCAAGG；
④人副流感病毒2 型( 简称PIV2) 的特异序列：
ATGGAATCAATCGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACCAGGAGGTTGTGTCTTGTATTGCTATGTAGCTA
CAAGATCTGAGAAAGAAGATTATGCCACAACTGATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTCTATTATTATAATGATACCTTTATTGAAAGAGTCATATCTCTTCCAAATACAACAGGGCAATGGGCCACAATCAATCCTGCAGTTGGAAGCGGGAT
CTATCATC ；
⑤人副流感病毒3 型（简称PIV3）的特异序列：
CTCGAGGTTGTCAGGATATAGGAAAATCATATCAAGTCTTACAGATAGGGATAATAACTGTAAACTCAGACTTGGTACCTGACTTAAATCCCAGGATCTCTCATACTTTTAACATAAATGACAATAGGAAGTCATGTTCTCTAGCACTCCTAAATACAGATGTATATCAACTGTGTTCAACTCCCAAAG ；
⑥呼吸道合胞病毒( 简称RSV) 的特异序列：
CAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGCCCAAAAATTGGGTGGTGAAGCAGGATTCTACCATATATTGAACAAC
CCAAAAGCATCATTATTATCTTTGACTCAATTTCCTCACTTCTCCAGTGTAGTATTAGGCAATGCTGCTGGCCTAGGCATAATGGGAGAGTACAGAGGTACACCGAGGAATCAAGATCTATATGATGCAGCAAAGGCATATGCTGAACAACTCAAAGAAAATGGTGTGATTAACTACAGTGTACTAGACTTGACAGCAGAA ；
⑦金黄色葡萄球菌（简称SA）的特异序列：
GGAAGTTCGTGACTTATTAAGCGAATATGACTTCCCAGGTGACGATGTACCTGTAATCGCTGGTTCAGCAT
TAAAAGCTTTAGAAGGCGATGCTCAATACGAAGAAAAAATCTTAGAATTAATGGAAGCTGTAGATACTTACATTCCAACTCCAGAACGTGATTCTGACAAACCATTCATGATGCCAGTTGAGGACGTATTCTCAATCACTGGTCGTGGTACTGTTGCTACAGGCCGTGTTGAACGTGGTCAAATCAAAGTTGGTGAAGAAGTTGAAATCATCGGTTTACATGACACATCTAAAACAACTGU ；
⑧肺炎链球菌（简称SP）的特异序列：
GTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCT
TGTTAGAGAATAATCCCACTCTTCTTGCGGTCGATCGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTTTGGCAAGTAGCGATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCCAGCAATTCAAGTGTTCGCGGAGCGGTAAACGATTTGTTGGCTAAGTGGCATCAAGATTATGGTCAGGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAAAAATCACGGCTCACAGCATGGAACAACTCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGAAAAGACAGGGAATTCTC ；
⑨肺炎支原体( 简称MP) 的特异序列：
TGCCATCTACCCGCGCTTAACCCCGTGAACGTATCGTAACACGAGCTTTTCCTCCCTCCCCCTCACGGGTGAAAATCCCGGGGCGTGGGCCTTAGTGCGCGACAACAGCGCTAAGGGCATCACTGCCGGCAGTGGCAGTCAACAAACCACGTATGAACCCACCCGAACCGAAGCGGCTTTGACCGCATCAACCACCTTTGCGTTACGCCGGTATGACCTCGCCGGGCGCGCCTTATACGACCTCGATTTTTCGAAGTTAAACCCGCAAACGCCCACGCGCGACCAAACCGGGCAGATCAC；
⑩肺炎衣原体( 简称CP) 的特异序列：
TTTATTTCCGTGTCGTCCAGCCATTTTATCTCCAACTTGAAGTTTTCTCTTAGAGGCAACGTAGACTTTAACTTGGCGAATGACACCATGATCTAAATCTGCATCTCCCTCACGAATATGCTCAACT ；
⑾肺炎克雷伯菌( 简称KP) 的特异序列：
CTGGATCTGACCCTGCAGTACCAGGGTAAAAACGAAGGCCGTGAAGCGAAGAAACAGAACGGCGACGG ；
⑿鲍曼不动杆菌( 简称AB) 的特异序列：
AACCAACACGCTTCACTTCCTTAGACATGAGCTCAAGTCCAATACGACGAGCTAAATCTTGATAAACTGGAA
TAGCGGAAGCTTTCATGGCATCGCCTAGGGTCATGTCCTTTTCCCATTCTGGGAATAACCTTTTTTTACCATCCCACTTAAATACTTCTGTGGTGGTTGCCTTATGGTGCTCAAGGCCGATCAAAGCATTAAGCATTTTGAAGGTCGAAGCAGGTACATACTCGGTCGAAGCACGA ；
⒀铜绿假单胞菌( 简称PA) 的特异序列：
GGCGTGGGTGTGGAAGTCGCCTTGCAGTGGAACGACAGCTTCAACGAGAACCTGCTCTGCTTCACCAACAAC
ATCCCGCAGCGTGACGGCGGTACCCACCTGGCCGGTTTCCGTTCGGCGCTGACGCGTAACCTGAACAACTACATCGAGGCCGAAGGCCTGGCGAAGAAGTTCAAGATCGCCAC ；
⒁嗜麦芽窄食单胞菌（简称SM）的特异序列：
CAGCCTGCGAAAAGTATCGGGGAGCTGGCAACAAGCTTTGATCCGGTAATGTCCGAATGGGGAAACCCACCC
GCTTGCGGGTATCCTGCAGTGAATACATAGCTGCTGGAAGCGAACCTGGTGAACTGAAATATCTAAGTAACCAGAGGAAAAGAAATCAACCGAGATTCCGTAAGTAGCGACGAGCGAACGCGGACTAGCCCTTAAGCTGATTTGGTTCTAGGAAAACACTCTGGAAAGAGTGGCCATAGAAGGTGATAGCCCTGTATCTGAAAGGGCCATTTCAGTGAAGACGAGTAGGGCGGGGCACGTGAAACCCTGTCTGAACATGGGGGGACCATCCTCCAAGGCTAAATACTACTGACCGACCGATAGTGAACCAGTACCGTGAGGGAAAGGCGAAAAGAACCCCGGAGAGGGGAGTGAAATAGAACCTGAAACCGTGTGCGTACAAGCAGTAGGAGCTCCGCAAGGAGTGACTGCGTACCTTTTGTATAATGGGTCAGCGACTTACTGTTCGTGGCAAGCTTAA ；
⒂嗜肺军团菌（简称LP）的特异序列：
TGGGGCTTGCAATGTCAACAGCAATGGCTGCAACCGATGCCACATCATTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTTAAAAATCAAGGCATAGATGTTAATCCGGAAGCAATGGCTAAAGGCATGCAAGACGCTATGAGTGGCGCTCAATTGGCTTTAACCGAACAGC。
2）根据上述特异性序列，运用生物信息学软件，并经过大量的筛选和改造设计后最终获得了本发明的多重RPA检测用引物群，引物见表1。
表1 本申请的多重RPA检测用引物群
Figure 878735DEST_PATH_IMAGE001
表1中的HCMV-F、AD-F、PIV1-F、PIV2-F、PIV3-F、RSV–F、SA-F、SP-F、MP-F、CP-F、KP-F、AB-F、PA-F、SM-F、LP-F 中的“-F”均指相应病原的5’端生物素修饰的上游引物，而HCMV-R、AD- R、PIV1- R、PIV2- R、PIV3- R、RSV –R、SA- R、SP- R、MP- R、CP- R、KP- R、AB- R、PA-R、SM- R、LP-R中的“-R”指的是相应病原的5’端氨基修饰的下游引物。
（二）呼吸道病原多重RPA检测试剂，其含有上述的引物群中的所有上游引物、引物-微球偶联体、游离的四种脱氧单核苷酸（简称“dNTP”）、酶、单链结合蛋白、藻红蛋白（简称“SA-PE”）、缓冲液和ATP，所述酶主要由重组酶和DNA聚合酶组成，使用时，提取待测样品中的DNA作为核酸模板，并与上述所有的检测试剂一次性全部混合在一起后，再进行RPA扩增。其中该步骤中所述的引物-微球偶联体包含15种病原的引物-微球偶联体，每种病原的引物-微球偶联体的制备方法为：将100nmol的下游引物分别与1ng带有不同颜色的微球以及浓度为25mM、pH6.0的2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液混合，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应2h，然后用牛血清白蛋白溶液封闭，最后用吐温-20溶液洗涤，得到引物-微球偶联体；与不同病原下游引物偶联结合的微球的颜色各不相同。获得的15种病原的引物-微球偶联体分别为：HCMV-R微球1、ADV-R微球2、PIV1-R微球3、PIV2-R微球4、PIV3-R微球5、RSV-R微球6、SA-R微球7、SP-R微球8、MP-R微球9、CP-R微球10、KP-R微球11、AB-R微球12、PA-R微球13、SM-R微球14、LP-R微球15。
使用时，采用本发明的引物群及采用本发明的引物群制得的多重RPA检测试剂建立RPA扩增体系，RPA扩增体系的具体组成见表2：
表2
Figure 264717DEST_PATH_IMAGE002
反应条件：将反应体系加入PCR 管中，PCR 管放入Biometra T personal PCR 仪中，将温度设置为37～42℃，反应时间设置为10~20min，进行RPA扩增反应。
（三）检测结果
1）检测仪器及参数设置：将反应完毕的扩增产物，使用Luminex200液相芯片扫描仪进行磁珠识别和信号读取，利用软件对结果进行自动判读。
2）结果判定：可产生某种病原菌相应颜色的微球，荧光值≥200 时，为阳性；荧光值＜150 为阴性；荧光值在150～200 之间时，样品需重复试验，若荧光值≥150 的样品判定为阳性，若荧光值＜150的样品判定为阴性。
3）灵敏度评价
样品DNA提取液的来源见下表3：
表3
Figure 513295DEST_PATH_IMAGE003
分别提供上述15 种样品DNA/RNA提取液的100/μL、101/μL、102/μL、103/μL、104/μL 5个稀释度，检测时，样品DNA/RNA提取液的添加量为1 uL。并以5个稀释度的病原DNA 提取液（即待测样品DNA）作为DNA 模板，采用本申请的试剂盒进行检测，读取荧光值，确定急性呼吸道传染病液态芯片检测方法检测各种病原的灵敏度。现将各种病原的荧光值读取数据列出如下表4：
表4
Figure 174084DEST_PATH_IMAGE004
由表4可知，急性呼吸道传染性疾病病原浓度均在103/μL（即106/mL）可检测到荧光值≥200（即最低检测限为106fu/ml）。其最低检测限均低于2008 年第7 版《内科学》中所公布的痰定量培养分离的致病菌或条件致病菌可认定为急性呼吸道疾病的最低检测限：107cfu/ml。因此，本发明的最低检测限较低，灵敏度高，满足检测急性呼吸道疾病的需求。
同时，以人工合成质粒为核酸模板（核酸模板包括携带HCMV扩增序列的质粒、携带AD扩增序列的质粒、携带PIV1扩增序列的质粒、携带PIV2扩增序列的质粒、携带PIV3扩增序列的质粒、携带RSV扩增序列的质粒、携带SA扩增序列的质粒、携带SP扩增序列的质粒、携带MP扩增序列的质粒、携带CP扩增序列的质粒、携带KP扩增序列的质粒、携带AB扩增序列的质粒、携带PA扩增序列的质粒、携带SM扩增序列的质粒共15种质粒），模拟待检测样本，并按照以下过程进行引物验证：将人巨细胞病毒、腺病毒、副流感病毒1 型、副流感病毒2 型、副流感病毒3 型、呼吸道合胞病毒、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜肺军团菌的引物对与15种病原的扩增片段一一对应组合，进行15重扩增效果的验证（见下表9）。
4）特异度评价，又称真阴性率评价，即非急性呼吸道传染性的病原，按照该检测方法的标准被正确地判为非本次感染的病原百分比。在对灵敏度进行检测时发现（见下表5）：非本次致病菌，荧光值在150 以下，检测都为阴性，因此，本申请的试剂盒的特异度为100％。
表5
Figure 191719DEST_PATH_IMAGE005
5）重复性好，当病原菌浓度为1×104/μL 时，对每种病原菌的检测重复三次，其结果如下表6：
表6
Figure 483023DEST_PATH_IMAGE006
由表6可看出，变异系数为0.05~0.11，对于多种病原菌同步检测来说，变异系数越小，重复性越好。
5）模拟标本检测：
本申请人提供模拟标本1～4，其中，模拟标本1～4的组成分别为（见下表7）：
表7
模拟标本 所含病原
1 SA+AB+SP+SM+ADV+PIV3
2 KP+CP+SM+MP+RSV
3 SA+SP+SM+RSV+PIV2+HCMV
4 SA+AB+CP+SP+MP+ADV+PIV1
现列出模拟标本1~4 的检测结果，见下表8：
表8
Figure 15635DEST_PATH_IMAGE007
鉴于临床样本中病原的种类通常最多也就5种，所以，本申请人提供了同时含有5~7种病原的模拟样本进行检测，并且，由表7和表8可看出，本发明可针对含有5种以上急性呼吸道传染性疾病病原的阳性样本进行多重同步检测，且检测结果的特异性高，检测结果准确，完全能够满足临床检测需求。在此基础上，可以进一步推定：本发明针对含有7种以上急性呼吸道传染性疾病病原的阳性样本也是可以进行多重同步检测的。
对比例
对比例与上述实施例的不同之处仅在于：其引物群的15 对引物的碱基序列见下表9：
表9
Figure 417798DEST_PATH_IMAGE008
本发明的引物群中引物序列是针对对比例1的引物序列进行改造获得的。
本申请人在采用对比例1的引物群制作RPA检测试剂和试剂盒对人工合成的15种分别对应携带15种病原菌扩增序列的质粒进行15重检测验证时，发现：对比例1的试剂盒的检测灵敏度非常低。本申请人推测其原因可能是：微球上的引物的空间位阻作用，使得引物与模板的结合率太低，从而导致引物的扩增效率低、检测的灵敏度差。因此，本申请人对微球上的引物进行了特殊改造以增加引物对模板的结合效率。为了实现这个目的，对整个反应体系做如下优化：在保持引物组中上游引物不变的情况下，仅对对比例1中的下游引物进行改造，选择在下游引物的5’端添加相应的多个与扩增片段互补的碱基（即“锚定序列”，表1中下划线序列代表“锚定序列”），同时还对下游引物上的部分碱基进行了修饰（表1中加粗的碱基为修饰碱基）。
对比例和实施例的15重检测验证结果见下表10：
表10 对比例与实施例的检测结果比较
Figure 352256DEST_PATH_IMAGE009
为了增加微球表面引物的扩增效果，同时不降低引物的特异性，本申请人通过在引物的5’端增加一段序列，用于增加引物和模板结合的效率，起到“锚定序列”捕获模板的作用；同时，在扩增引物中的5’端碱基进行Spacer 18修饰，来限制“锚定序列”被扩增，避免带来该引物特异性的下降。通过上述对比例1与实施例的检测结果比较，我们也可以看出，本申请的引物群有效提高了RPA的扩增效果，从而提高了检测的灵敏度，同时也未造成特异性的下降。
通常来说，适用于液态芯片***检测的微球的编码技术主要有荧光编码、蚀刻条形码等方法。因此，本发明的微球可以是蚀刻条形码的微球，也可以是荧光编码的微球。
另外，本发明的RPA多重检测流程只需要55min，而现有的PCR多重检测流程则需要300min以上，见下表11。本发明的引物群以及采用此引物群制备的RPA检测试剂以及试剂盒，能够在不降低检测性能的基础上，提前4个小时得到检测结果。
表11
Figure 983437DEST_PATH_IMAGE010
通过上表11可以看出，本发明的引物群以及采用此引物群制备的RPA检测试剂以及试剂盒，一方面最明显的变化就是缩短了检测时间；另一方面，减少人工操作步骤，人工操作步骤的简化可以减少人力消耗，减少人为误差。
以上实施例仅为本发明的较佳实施例，不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，在本发明的技术方案的基础上所做的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 福建省立医院、福建省疾病预防控制中心、上海透景生命科技股份有限公司
<120> 呼吸道病原多重RPA检测用引物群、检测试剂及试剂盒
<130> DS-P19567
<141> 2020-01-21
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggtacgggc tgcaggtaaa gtgcgatcaa gaacg 35
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttttttttc gtgcttttta gcctcttttt ttttttgcag ctgcgtcacg ggtctagccg 60
gccataatca c 71
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcggagtac ctgagccccg ggctggtgca gttcg 35
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttttttttt cgtcgtgcgt aggcgctttt ttttttaccg tggggtttct aaacttgtta 60
ttcaggctga 70
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatgagact acagattact cgagtgaagg tata 34
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttttttttt tagaaaaagg atggtcattt ttttttaagt tatatcttca tttttgtatc 60
gatgagatt 69
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caactgatct agctgaactg agacttgctt tcta 34
<210> 8
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttttttttt caactgcagg attgattttt ttttttttgg cccattgccc tgttgtattt 60
ggaagagata t 71
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acagataggg ataataactg taaactcaga ct 32
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttttttttt agtgctagag aacatgtttt ttttttcttc ctattgtcat ttatgttaaa 60
agtatgaga 69
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcctcacttc tccagtgtag tattaggcaa tgct 34
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttttttttt aatcacacca ttttcttttt ttttttttga gttgttcagc atatgccttt 60
gctgcatcat ata 73
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaaaaatct tagaattaat ggaagctgta gatactt 37
<210> 14
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttttttttc aacagtacca cgaccagttt ttttttttga atacgtcctc aactggcatc 60
atgaatggtt tgt 73
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgtgctccga tgacttatag tattgatttg cctggtt 37
<210> 16
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tttttttttt ccaacaaatc gtttaccttt ttttttttcc gcgaacactt gaattgctgg 60
ggtcttcca 69
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcgctaaggg catcactgcc ggcagtggca gtcaac 36
<210> 18
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tttttttttc gaggtcgtat aaggcttttt ttttttcgcc cggcgaggtc ataccggcgt 60
aacgcaaagg tgg 73
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gccattttat ctccaacttg aagttttctc ttaga 35
<210> 20
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tttttttttt tatttccgtg tcgtcctttt tttttttgcc attttatctc caacttgaag 60
ttttctctta ga 72
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctggatctga ccctgcagta ccagggtaaa aac 33
<210> 22
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tttttttttg ctcgctgatt atcatgtttt tttttttgcg gttggccgat catgtttggc 60
ctgatcctct ctgcg 75
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agctcaagtc caatacgacg agctaaatct tgat 34
<210> 24
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttttttttta tttaagtggg atggtttttt tttttttatt cccagaatgg gaaaaggaca 60
tgaccctagg c 71
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cttcaacgag aacctgctct gcttcaccaa caac 34
<210> 26
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttttttttt cggcctcgat gtagttgttt ttttttttca ggttacgcgt cagcgccgaa 60
cggaaaccgg cc 72
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agcgacgagc gaacgcggac tagcccttaa gctgat 36
<210> 28
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tttttttttt ctcgtcttca ctgaaatgtt tttttttttc cctttcagat acagggctat 60
caccttctat ggccac 76
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcaatggctg caaccgatgc cacatcatta gct 33
<210> 30
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tttttttttt acatctatgc cttgattttt ttttttcccc aaatcggcac caatgctata 60
agacaactta 70

Claims (5)

1.呼吸道病原多重RPA检测用RPA引物群，其特征在于：该引物群由15 对引物中的至少5对组成，所述的15对引物的核苷酸序列分别为：
人巨细胞病毒（简称：HCMV）
HCMV-F：5'biotin–CGGTACGGGCTGCAGGTAAAGTGCGATCAAGAACG 3'、
HCMV-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTCGTGCTTTTTAGCCTCTTTTTTTTTTTGCAGCTGCG
TCACGGGTCTAGCCGGCCATAATCAC 3'；
②腺病毒（简称ADV）
ADV-F：5'biotin –CTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTCG 3'、
ADV-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCGTCGTGCGTAGGCGCTTTTTTTTTTACCGTGGGGTT
TCTAAACTTGTTATTCAGGCTGA 3'；
副流感病毒1 型（简称：PIV1）
PIV1-F：5'biotin –AAATGAGACTACAGATTACTCGAGTGAAGGTATA 3'、
PIV1-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTTAGAAAAAGGATGGTCATTTTTTTTTAAGTTATATCT
TCATTTTTGTATCGATGAGATT 3'；
副流感病毒2 型（简称：PIV2）
PIV2-F：5'biotin –CAACTGATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTCTA 3'、
PIV2-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCAACTGCAGGATTGATTTTTTTTTTTTTGGCCCAT
TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGATAT 3'；
⑤副流感病毒3 型（简称：PIV3）
PIV3-F1：5'biotin –ACAGATAGGGATAATAACTGTAAACTCAGACT 3'、
PIV3-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTAGTGCTAGAGAACATGTTTTTTTTTTCTTCCTATTGT
CATTTATGTTAAAAGTATGAGA 3'；
⑥呼吸道合胞病毒（简称：RSV）
RSV-F：5'biotin –TCCTCACTTCTCCAGTGTAGTATTAGGCAATGCT 3'、
RSV-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTAATCACACCATTTTCTTTTTTTTTTTTTGAGTTGTTCA
GCATATGCCTTTGCTGCATCATATA 3'；
⑦金黄色葡萄球菌（简称：SA）
SA-F：5'biotin –GAAAAAATCTTAGAATTAATGGAAGCTGTAGATACTT 3'、
SA-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTCAACAGTACCACGACCAGTTTTTTTTTTTGAATACGTC
CTCAACTGGCATCATGAATGGTTTGT 3'；
⑧肺炎链球菌（简称：SP）
SP-F：biotin – CGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTT 3'、
SP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCCAACAAATCGTTTACCTTTTTTTTTTTCCGCGAACA
CTTGAATTGCTGGGGTCTTCCA 3'；
⑨肺炎支原体（简称：MP）
MP-F：5'biotin– GCGCTAAGGGCATCACTGCCGGCAGTGGCAGTCAAC 3'、
MP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTCGAGGTCGTATAAGGCTTTTTTTTTTTCGCCCGGCGAG
GTCATACCGGCGTAACGCAAAGGTGG 3'；
⑩肺炎支原体（简称：MP）
CP-F：5'biotin–GCCATTTTATCTCCAACTTGAAGTTTTCTCTTAGA 3'、
CP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTTATTTCCGTGTCGTCCTTTTTTTTTTTGCCATTTTATCT
CCAACTTGAAGTTTTCTCTTAGA 3'；
⑾肺炎克雷伯菌（简称：KP）
KP-F：5'biotin–CTGGATCTGACCCTGCAGTACCAGGGTAAAAAC 3'、
KP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTGCTCGCTGATTATCATGTTTTTTTTTTTGCGGTTGGCC
GATCATGTTTGGCCTGATCCTCTCTGCG 3'；
⑿鲍曼不动杆菌（简称：AB）
AB-F：5'biotin–AGCTCAAGTCCAATACGACGAGCTAAATCTTGAT 3'、
AB-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTATTTAAGTGGGATGGTTTTTTTTTTTTTATTCCCAGAATG
GGAAAAGGACATGACCCTAGGC 3'；
⒀铜绿假单胞菌（简称：PA）
PA-F：5'biotin–CTTCAACGAGAACCTGCTCTGCTTCACCAACAAC、
PA-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCGGCCTCGATGTAGTTGTTTTTTTTTTTCAGGTTACG
CGTCAGCGCCGAACGGAAACCGGCC 3'；
⒁嗜麦芽窄食单胞菌（简称：SM）
SM-F：5'biotin–AGCGACGAGCGAACGCGGACTAGCCCTTAAGCTGAT 3'、
SM-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTCTCGTCTTCACTGAAATGTTTTTTTTTTTCCCTTTCA
GATACAGGGCTATCACCTTCTATGGCCAC 3'；
⒂嗜肺军团菌（简称：LP）
LP-F：5'biotin–GCAATGGCTGCAACCGATGCCACATCATTAGCT 3'
LP-R：5'NH2-C6-TTTTTTTTTTACATCTATGCCTTGATTTTTTTTTTTCCCCAAATCGG
CACCAATGCTATAAGACAACTTA 3'。
2.呼吸道病原多重RPA检测试剂，其含有如权利要求1所述的呼吸道病原多重RPA检测用RPA引物群中的所有上游引物、引物-微球偶联体、游离的四种脱氧单核苷酸（简称“dNTP”）、酶、单链结合蛋白、藻红蛋白（简称“SA-PE”）、缓冲液和ATP，所述引物-微球偶联体包括由如权利要求1所述的呼吸道病原多重RPA检测用RPA引物群中的各个下游引物分别与带有不同检测标记的微球一一对应偶联形成的至少5种引物-微球偶联体，所述酶主要由重组酶和DNA聚合酶组成。
3.呼吸道病原多重RPA检测试剂的使用方法，包括以下步骤：将提取得到的待测样品中的DNA和RNA中的任一种作为核酸模板，并与权利要求2所述的呼吸道病原多重RPA检测试剂一次性全部混合在一起后，再进行RPA扩增，最后采用液态悬浮芯片***对扩增产物进行检测。
4.根据权利要求3所述的一种呼吸道病原多重RPA检测试剂的使用方法，其特征在于：RPA扩增时反应温度为37～42℃，反应时间为10~20min。
5.一种含有如权利要求2所述的呼吸道病原多重RPA检测试剂的试剂盒。
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