CN111154786A

CN111154786A - 调控植物种子萌发与幼苗生长的基因及其编码蛋白与应用

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Publication number: CN111154786A
Application number: CN202010083141.XA
Authority: CN
Inventors: 王倩; 刘好宝; 安璐璐; 史素娟; 徐方正; 毛静静
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-02-08
Filing date: 2020-02-08
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-02-08
Also published as: CN111154786B

Abstract

本发明公开了一种调控植物种子萌发与幼苗生长的基因及其编码蛋白与应用。本发明的发明人从普通烟草(Nicotiana tabacum)栽培品种中烟100中鉴定获得NtCIPK23基因，所述NtCIPK23基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并通过转基因技术证明过量表达NtCIPK23能够加快烟草种子萌发速率、促进幼苗生长，敲除该基因则延缓幼苗萌发速率，抑制幼苗生长。利用本发明，可通过调节CIPK23的表达水平控制植物种子的萌发速率和出土整齐度，采用基因工程手段获得CIPK23基因适度表达、出土率一致的转基因作物。本发明符合可持续发展农业要求，对于培育早生快发、出土整齐的经济作物等具有重要的实用价值和市场前景。

Description

调控植物种子萌发与幼苗生长的基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种调控植物种子萌发与幼苗生长的基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

钙离子(Ca²⁺)是植物细胞中普遍存在的第二信使，当植物受到外界刺激后，胞内Ca²⁺的浓度发生时空特异性变化，形成钙信号。在这种钙信号会被钙感受器所感知，进行信号转导到下游效应蛋白，引起植物细胞的生理生化反应，从而参与到植物的生长发育及胁迫应答等过程)。类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL(Calci-neurin B-like protein)是其中一类钙感受器蛋白，能够高效地与Ca²⁺结合，并引起构象变化，通过与靶蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase) 结合形成CBL-CIPK复合体实现钙信号的转导。CIPK是植物特有的一类丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，该家族蛋白结构保守，具有N端激酶催化结构域和C端调节结构域，并通过C端的NAF/FISL 模块与CBL结合来发挥作用。研究已证明拟南芥中的CBL-CIPK网络在调节钠离子、钾离子和硝酸根离子在质膜(PM)或液泡膜中的运输中起着重要作用。在拟南芥中，CBL和CIPK家族基因的一些成员也被确定参与生长素和脱落酸(ABA)信号传导，以及拟南芥中的许多其他发育过程。

目前，多个来自不同植物物种的CIPK基因家族成员已被分离并得以进行功能研究，包括拟南芥、水稻、玉米、小麦和大豆等。其中，拟南芥AtCIPK23及其同源基因(以后统称为CIPK23) 是研究较为深入的成员之一，研究表明，该基因多数通过调节离子吸收转运，参与植物响应非生物和生物胁迫过程。在拟南芥中，低钾情况下，植物利用AtCBL1/9-AtCIPK23-AKT1和 AtCBL1-AtCIPK23-AtHAK5通路，通过促进钾通道或转运体的转运能力促进K⁺的吸收。相似的通路也在水稻和葡萄中有报道。在外部高NO₃ ^-浓度下，通过AtCBL1/9-AtCIPK23-AtCHL1和 AtCBL9-AtCIPK23-AtNRT2.1通路，植物抑制对NO₃ ^-的吸收转运。而在外部低硝NO₃ ^-条件下，植物通过AtCBL1/9-AtCIPK23-AtCHL1途径促进调控NO₃ ^-的转运，从而间接调节种子的萌发。当拟南芥根暴露于高铵NH₄ ⁺条件下时，AtCIPK23可以通过磷酸化作用导致高亲和力铵转运蛋白 AMT1的变构失活，并抑制NH₄ ⁺转运，从而保护植物免受NH₄ ⁺毒性。在高镁(Mg²⁺)胁迫条件下，AtCBL2/3与AtCIPK3/9/23/29相互作用，将Mg²⁺螯合到液泡中并保护植物免受Mg²⁺的毒性。在干旱胁迫下AtCIPK23可以通过控制阴离子和K⁺平衡来调节气孔关闭。除上述非生物逆境外，CIPK23蛋白还被发现参与植物响应生物胁迫反应。在木薯中，MeCBL1/9-MeCIPK23积极调节植物对黄单胞菌属木薯属的防御反应。

尽管CIPK23在拟南芥及其他植物中已进行了深入研究，茄科作物中CIPK23的研究极为有限。同时，目前尚无CIPK23参与植物正常生长发育的报道。大多数茄科作物是重要的经济作物，包括马铃薯、番茄、茄子、烟草等，具有很高的经济价值。因此，挖掘并研究CIPK23在调控茄科作物生长发育过程中的功能，并加以利用，具有很好的科学意义和潜在的经济价值。

发明内容

本发明提出一种调控植物种子萌发与幼苗生长的基因及其编码蛋白与应用，本发明的针对目前CIPK23在茄科作物生长发育过程中的功能尚无报道的现状，提供了其在促进植物种子萌发与幼苗生长的功能，并拓展其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种调控植物种子萌发与幼苗生长的基因，所述基因为烟草NtCIPK23基因，所述基因的核苷酸为：A)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或B)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列或C)在严格条件下与 SEQ ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％ SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

进一步，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，将烟草NtCIPK23基因的重组表达载体导入所述受体植物中，得到转基因植物。

优选的，重组表达载体中启动蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

优选的，所述重组表达载体为现有的植物表达载体或其它衍生植物表达载体构建。

优选的，所述重组表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。

优选的，所述重组表达载体包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。

优选的，所述重组表达载体中加入增强型或组成型或组织特异型或诱导型启动子。

优选的，所述重组表达载体中加入了可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶基因或发光化合物的基因或具有抗性的抗生素标记物基因或抗化学试剂标记基因。

优选的，过量表达NtCIPK23加快烟草种子萌发速率、促进幼苗生长，敲除该基因则延缓幼苗萌发速率，抑制幼苗生长。

将所述NtCIPK23蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交，选育植物种子的萌发速率提高和出苗时间缩短的植物品种。

该蛋白的应用：

a)提高植物种子的萌发速率和出苗速度；

b)过量表达NtCIPK23加快烟草种子萌发速率、促进幼苗生长，敲除该基因则延缓幼苗萌发速率，抑制幼苗生长。

为培育植物种子的萌发速率提高和出苗时间缩短的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入烟草NtCIPK23基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子的萌发速率提高和出苗时间缩短。

向受体植物中导入烟草NtCIPK23基因的具体方法为：将烟草NtCIPK23基因的重组表达载体导入所述受体植物中。

所述重组表达载体为现有的植物表达载体或其它衍生植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。

植物表达载体具体为pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pBI121、pBin19、 pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pORE-Cas9、pYLCRISPR/cas9-MT、pCas9gRNA7、pCas9gRNA7-GFP或其它衍生植物表达载体。

所述植物表达载体包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。

所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。

使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin 启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。

翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，重组表达载体中启动蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述NtCIPK23基因***pCHF3载体的多克隆位点 SmaI和SalI之间后得到的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述NtCIPK23基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明的有益效果为：本发明的NtCIPK23基因是植物种子萌发和幼苗生长的正调节子。本发明可通过调节NtCIPK23基因表达水平控制植物种子的萌发速率和出苗速度，通过基因工程手段获得NtCIPK23基因不同表达水平、不同萌发速率和出苗整齐的转基因作物。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物种子萌发和幼苗生长机制、改良遗传特性、提高幼苗出土整齐度等方面具有重要的实用价值和市场前景。过量表达NtCIPK23能够加快烟草种子萌发速率、促进幼苗生长，敲除该基因则延缓幼苗萌发速率，抑制幼苗生长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为NtCIPK23的蛋白序列分析。(a)NtCIPK23与AtCIPK23的氨基酸序列比对。相同的氨基酸显示为黑色背景。(b)不同植物来源的CIPK23蛋白***发育分析。

图2为NtCIPK23的表达模式分析。(a)NtCIPK23启动子顺式作用元件示意图。顺式作用元件由在线软件PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测。不同的颜色和形状代表不同的顺式作用元件。图中的数字表示预测元件的数量。“+”和“-”分别代表正义链和反义链。(b)在不同萌发阶段的ProNtCIPK23::GUS转基因植物的GUS染色。

图3为不同NtCIPK23表达水平的烟草材料的种子萌发表型(a)外源NtCIPK23在不同烟草材料中的表达水平。(b)ZY100和ntcipk23的序列比对。“-”表示核苷酸缺失。(c)烟草材料的萌发。(d)烟草材料的萌发率。所有数据均以平均值±SE(n＝3)表示，并使用one-wayANOVA对其进行了分析，其中显著性已显示在上方(*P<0.05)。

图4为不同烟草材料子叶面积的表型和数据分析。(a)不同烟草材料的子叶。(b)分析不同烟草材料的子叶面积。根据one-way ANOVA，不同的小写字母(a和b)表示在P<0.05时有显著差异。

图5为不同烟草材料中下胚轴的表型和数据分析。(a，b)不同烟草材料在光照下的下胚轴表型。(c)在光暗条件下对NtCIPK23的定量分析。(d，e)在黑暗条件下不同烟草材料的下胚轴表型。播种6天后，在黑暗条件下(用铝纸包裹)下取样。不同的小写字母表示显著差异，P<0.05被认为具有统计学意义。

图6为不同烟草材料幼苗出土分析实验。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中用到的限制性内切酶均为Takara产品。

实施例1、含有NtCIPK23蛋白激酶基因的表达载体的构建

1.NtCIPK23蛋白激酶基因的表达载体的构建所用引物

用于克隆NtCIPK23CDS序列的引物：

NtCIPK23-1F：GGCATGGGTTCAAGATCAAATAATGG

NtCIPK23-1R：CGCTCGCCTAACCATCTTTTAC

用于克隆NtCIPK23启动子序列的引物：

NtCIPK23pro-1F：AAGCTTGAGGCTTCTGCTGGTTGGAG

NtCIPK23pro-1R：GGATCCCTACCTCCAAACTTTCTATTTCTTACAG

用于NtCIPK23-CRISPR/Cas9载体的构建的引物：

NtCIPK23CR-1Target-1F：GATTGTGATGTAGGGAGGACCCTTG

NtCIPK23CR-1Target-1R：AAACCAAGGGTCCTCCCTACATCA

NtCIPK23pro-用于构建pBI101-ProNtCIPK23::GUS载体的引物：

NtCIPK23pro-2F-HindⅢ：CCCAAGCTTGAGGCTTCTGCTGGTTGGAG

2R-BamHI：CGGGATCCCTACCTCCAAACTTTCTATTTCTTACAG

2.本研究采用同源克隆的方法。通过利用已知拟南芥AtCIPK23的CDS序列进行同源比对，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获得一个CDS序列全长为1353bp的CIPK 家族基因，且与AtCIPK23同源性较高(图1a,b)，为NtCIPK23(GenBankNo.XM_016594430.1)，设计了相应的引物对NtCIPK23-1F/NtCIPK23-1R。此外为了克隆启动子，根据数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)的Ntab-TN90_scaffold36089，设计了相应的引物对 NtCIPK23pro-1F/NtCIPK23pro-1R。以中烟100的mRNA为模板，进行基因扩增，克隆出NtCIPK23 的基因片段及其启动子，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。将NtCIPK23及其启动子的PCR 产物与pMD19-T连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性单克隆，进行测序。经过序列比对，获得与原序列一致的单克隆，摇菌并提取该单克隆质粒，得到中间载体，将其分别命名为pMD19-T-NtCIPK23和pMD19-T-ProNtCIPK23。

3.为了获得NtCIPK23的过表达载体，用SmaⅠ/SalⅠ消化pMD19-T-NtCIPK23(反向***) 质粒，将酶切后的目的片段连接到SmaⅠ/SalⅠ消化的pCHF3中。使用引物对NtCIPK23CR-1Target-1F/NtCIPK23CR-1Target-1R，通过重叠PCR合成NtCIPK23的sgRNA序列，然后将sgRNA表达盒***BsaⅠ消化的pORE-Cas9二元载体中，生成NtCIPK23-CRISPER/Cas9 载体。pBI101-ProNtCIPK23::GUS载体的构建是通过使用引物对NtCIPK23pro-2F-HindⅢ /NtCIPK23pro-2R-BamHⅠ。用HindⅢ和BamHⅠ消化PCR产物，并将其克隆到HindⅢ/BamH Ⅰ消化的pBI101载体中。所有PCR产物的克隆均经测序验证，重组质粒经限制性酶切分析证实。

实施例2、含有NtCIPK23基因转化及转基因植株的筛选

1.NtCIPK23基因转化及转基因植株的筛选所用引物

用于NtCIPK23过表达材料的阳性鉴定：

NtCIPK23-1F：GGCATGGGTTCAAGATCAAATAATGG

pCHF3-R：ATTCTGGTGTGTGCGCAATG

用于NtCIPK23启动子转基因材料的阳性鉴定：

pBI101-F：CCGATTCATTAATGCAGCTG

NtCIPK23pro-2R：GGATCCCTACCTCCAAACTTTCTATTTCTTACAG

用于NtCIPK23 CRISPR/Cas9转基因材料的阳性鉴定：

pORE-F：TTAGGTTTACCCGCCAATA

NtCIPK23CR-1Target-1R：AAACCAAGGGTCCTCCCTACATCA

用于NtCIPK23编辑位点的检测：

NtCIPK23-1-UTR2F：ACAAGAGGATGGGATTTGT

NtCIPK23-1-145R：ATCACCAGTTTCAACATTCC

用于qPCR中的NtCIPK23扩增：

NtCIPK23-qF：CCACTGACTATGAATGCTTT

NtCIPK23-qR：GCGCCCACTCTTCTCCCCA

用于RT-PCR和qPCR中的NtL25扩增：

NtL25-qF：CAAAAGTTACATTCCACCG

NtL25-qR：TTTCTTCGTCCCATCAGGC

用于RT-PCR中检测外源NtCIPK23的表达水平：

NtCIPK23-qF：CCACTGACTATGAATGCTTT

pCHF3-Allcheck：GATGATACGAACGAAAGCTCTGC

2.为了获得NtCIPK23过表达株系和NtCIPK23启动子转基因植物，将pCHF3-NtCIPK23载体和pBI101-ProNtCIPK23::GUS载体分别转化到根癌农杆菌EHA105中，然后通过农杆菌介导的方法分别导入到普通烟中烟100(ZY00)中。通过基因组PCR和RT-PCR和GUS染色证实了阳性的转基因植物。通过在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS培养基育苗筛选转基因株系，获得第三代纯合系。为了获得NtCIPK23的基因敲除材料，使用相同的方法将NtCIPK23-CRISPER/Cas9质粒导入普通烟中烟100(ZY00)中。使用引物对 pORE-F/NtCIPK23CR-1Target-1R通过PCR初步筛选出阳性的C0幼苗。提取阳性幼苗的基因组 DNA，并使用引物对NtCIPK23-1-UTR2F/NtCIPK23-1-145R扩增具有编辑位点的片段。将PCR产物克隆到pMD19-T载体中，并且通过多个克隆(克隆数≥80)的测序来确认基因编辑情况。通过严格的自交单独获得每个C0编辑的幼苗的种子，进一步经过测序循环(克隆数≥80)确认每个C1单个植物的编辑情况。通过测序将所有编辑位点完全相同的C1幼苗的种子确认为NtCIPK23的基因敲除材料(ntcipk23)，并用于实验中。

实施例3、GUS染色实验观察

将ProNtCIPK23::GUS转基因种子灭菌并播种在1/2MS培养基上。四天后，胚根突破了种皮，发芽并开始取样。选择不同萌发时期的幼苗进行GUS组织化学染色(胚根的暴露过程，下胚轴的延伸过程，子叶的延伸阶段，两片真叶的出苗阶段以及两片真叶的生长期)。将样品完全浸没在GUS染色溶液(LEAGENE Lot.1127A19)中，并在37℃下孵育24小时。之后，用乙醇将样品的叶绿素完全去除，以进行显微镜观察。结果如图2b，GUS染色分析表明，NtCIPK23 在种子萌发阶段表达并受到调控，该基因可能在下胚轴的延长和子叶的扩展中发挥重要作用。

实施例4、不同NtCIPK23表达水平植物材料种子萌发分析实验

以普通烟中烟100(ZY00)及实施例2得到的C1代纯合敲除材料和单拷贝***的T3代 NtCIPK23转基因纯合株系OE15和OE25为实验材料。将各实验材料的种子播种在铺在蛭石上的湿润滤纸上，每种实验材料播种80-100粒，在25±1℃温度下恒定光照下培养，培养期间保证滤纸的湿润。播种4天后，当子叶开始突破种皮，直到所有种子完成发芽的那一天，每天计算萌发率。与ZY100相比，ntcipk23的萌发时间显著延迟，而对萌发率没有明显影响(图 3c，d)；ZY100和过表达株系之间的萌发时间和萌发均无明显差异(图3c，d)。结果表明，在正常生长条件下，NtCIPK23在种子萌发过程中发挥了积极作用。

实施例5、不同NtCIPK23表达水平植物材料幼苗生长分析实验

1.以普通烟中烟100(ZY00)及实施例2得到的C1代纯合敲除材料和单拷贝***的T3 代NtCIPK23转基因纯合株系OE15和OE25为实验材料。将各实验材料的种子播种在蛭石上，每种实验材料播种80-100粒，在25±1℃温度下恒定光照下培养，培养期间保证蛭石的湿润。与ZY100相比，过表达株系具有较大的子叶，而ntcipk23的子叶则较小(图4a)。当子叶完全伸展并开始出现真叶时，测量每种材料的子叶面积。NtCIPK23过表达株系的子叶面积显着大于ZY100，而ntcipk23的面积则略小(图4b)。数据表明NtCIPK23过表达促进了烟草幼苗的子叶扩张。NtCIPK23可能在烟草幼苗的子叶扩展过程中发挥积极作用。

2.以普通烟中烟100(ZY00)及实施例2得到的C1代纯合敲除材料和单拷贝***的T3 代NtCIPK23转基因纯合株系OE15和OE25为实验材料。将各实验材料的种子播种在蛭石上，每种实验材料播种80-100粒，在25±1℃温度下恒定光照下培养，培养期间保证蛭石的湿润。结果发现在恒定光照下，两个过表达株系的下胚轴长度最长，其次是ZY100，而nicipk23突变体的下胚轴最短，这表明NtCIPK23在下胚轴伸长中具有促进作用(图5a，b)。

不同材料在黑暗条件下(用铝纸包裹)下培养，通过qRT-PCR研究了光对NtCIPK23表达的影响(图5c)。结果表明，黑暗处理下胚轴中NtCIPK23的表达较高，是光照下的十倍，暗示NtCIPK23的表达可能受到光的抑制而在黑暗中被上调，并且该基因可能参与下胚轴的生长。在黑暗条件下进行了发芽实验，发现在ntcipk23和ZY100之间观察到的下胚轴长度差异比在光照下更明显，这意味着在黑暗中NtCIPK23表达上调促进了下胚轴伸长(图5d，e)。与此同时，NtCIPK23过表达株的下胚轴长度也明显长于ZY100(图5d，e)。以上说明NtCIPK23在下胚轴伸长过程中起正调控作用。

实施例6、不同NtCIPK23表达水平植物材料幼苗出土分析实验

以普通烟中烟100(ZY00)及实施例2得到的C1代纯合敲除材料和单拷贝***的T3代 NtCIPK23转基因纯合株系OE15和OE25为实验材料。将各实验材料的种子播种在基质上，上面覆盖一层蛭石，每种实验材料播种80-100粒，在温度为25℃±1℃，相对湿度为60±5％和光照条件为16小时光照/8小时黑暗的周期下生长。结果发现，在烟苗小十字期，ntcipk23的长势明显弱于对照ZY100，而2种过表达材料的长势略优于对照(图6)。

综上所述，本发明中从烟草中克隆得到的CIPK23可以促进种子萌发和幼苗生长。当种子播种到田间时，子叶出土植物下胚轴快速伸长，将子叶和胚芽送出土面,进行光合作用。出苗迅速，均匀一致，保证全苗、壮苗和作物的田间密度，为增产打下良好基础，这正是农业生产所需要的。通过基因工程手段获得CIPK23基因适度表达、出土整齐的转基因作物。本发明符合可持续发展农业要求，对于培育早生快发、出土整齐的经济作物等具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 调控植物种子萌发与幼苗生长的基因及其编码蛋白与应用

<130> 20200208

<141> 2020-02-08

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1353

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacu

<400> 1

atgggttcaa gatcaaataa tggaagtggg aggactagag tgggaaggta tgatgtaggg 60

aggacccttg gggagggtac ttttgcaaag gtcaaatttg caaggaatgt tgaaactggt 120

gataatgttg ccattaagat tcttgataaa gagaaggtca tgaagcacaa gatgatcggt 180

cagattaaac gggaaatatc aaccatgaaa cttataagac accccaatgt tatccgaatg 240

tatgaggtca tggccagcaa gtcgaagata tatattgttt tggaatttgt tactggtggc 300

gaactgtttg acaaaattgc tagtagaggt aggctgaaag aagatgaagc aagaaaatac 360

tttcagcaac ttataaatgc agttgactac tgtcatagta gaggtgtatt ccacagagac 420

ctcaagcctg aaaacttgtt gctggatgca aatagtgttc ttaaagtttc ggattttgga 480

ctgagtgcgc tgcctcagca agttcgcgaa gatggactac tacatacaac atgtggaaca 540

ccaaattatg tggctcccga ggtgatcaac aataaaggtt atgatggagc taaggctgac 600

ctgtggtcat gtggtgtaat cctttttgta cttatggctg gttatttgcc ttttgaggag 660

tcaaatctct tggcactata taagaagata cataaagctg aatttacatg tccaccctgg 720

ttttcctcta gtgcgaagaa actaatcaaa agaatcttgg atcccaatcc acagacgcgc 780

atcacatttt ccgaggtcat tgagaacgag tggttcaaga aagggtatcg tccacctgtt 840

tttgagcagg cagatgttag tcttgatgat gtgaatgcta tttttagtga atctgctgac 900

tcttcgaatc ttgttgtgga gagacggcat gaacggcctt ctgcaccact gactatgaat 960

gcttttgagc ttatttcaac ttctcagggt ctcaatctca gttctctgtt tgaaaagcaa 1020

atggggctag tcaaaaggga gacaagattt acatcgagat gtcctgcgaa tgaaattgtc 1080

tcaaaaattg aagaagctgc tgtacctttg ggcttcaatg tgaggaaaaa taactacaag 1140

attaagcttc atggggagaa gagtgggcgc aaaggtcatt tatccgttgc aaccgagatt 1200

tacgaggtgg caccttcact atacatggtt gagcttcgca aggctggagg agataccttg 1260

gaatttcaca agttttacaa gaacctgtct accggattga aagacattgt gtggcaactg 1320

ggggaaggag gagaggaagt aaaagatggt tag 1353

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacu

<400> 2

Met Gly Ser Arg Ser Asn Asn Gly Ser Gly Arg Thr Arg Val Gly Arg

1 5 10 15

Tyr Asp Val Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gly Thr Phe Ala Lys Val Lys

20 25 30

Phe Ala Arg Asn Val Glu Thr Gly Asp Asn Val Ala Ile Lys Ile Leu

35 40 45

Asp Lys Glu Lys Val Met Lys His Lys Met Ile Gly Gln Ile Lys Arg

50 55 60

Glu Ile Ser Thr Met Lys Leu Ile Arg His Pro Asn Val Ile Arg Met

65 70 75 80

Tyr Glu Val Met Ala Ser Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Val Leu Glu Phe

85 90 95

Val Thr Gly Gly Glu Leu Phe Asp Lys Ile Ala Ser Arg Gly Arg Leu

100 105 110

Lys Glu Asp Glu Ala Arg Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Ile Asn Ala Val

115 120 125

Asp Tyr Cys His Ser Arg Gly Val Phe His Arg Asp Leu Lys Pro Glu

130 135 140

Asn Leu Leu Leu Asp Ala Asn Ser Val Leu Lys Val Ser Asp Phe Gly

145 150 155 160

Leu Ser Ala Leu Pro Gln Gln Val Arg Glu Asp Gly Leu Leu His Thr

165 170 175

Thr Cys Gly Thr Pro Asn Tyr Val Ala Pro Glu Val Ile Asn Asn Lys

180 185 190

Gly Tyr Asp Gly Ala Lys Ala Asp Leu Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu

195 200 205

Phe Val Leu Met Ala Gly Tyr Leu Pro Phe Glu Glu Ser Asn Leu Leu

210 215 220

Ala Leu Tyr Lys Lys Ile His Lys Ala Glu Phe Thr Cys Pro Pro Trp

225 230 235 240

Phe Ser Ser Ser Ala Lys Lys Leu Ile Lys Arg Ile Leu Asp Pro Asn

245 250 255

Pro Gln Thr Arg Ile Thr Phe Ser Glu Val Ile Glu Asn Glu Trp Phe

260 265 270

Lys Lys Gly Tyr Arg Pro Pro Val Phe Glu Gln Ala Asp Val Ser Leu

275 280 285

Asp Asp Val Asn Ala Ile Phe Ser Glu Ser Ala Asp Ser Ser Asn Leu

290 295 300

Val Val Glu Arg Arg His Glu Arg Pro Ser Ala Pro Leu Thr Met Asn

305 310 315 320

Ala Phe Glu Leu Ile Ser Thr Ser Gln Gly Leu Asn Leu Ser Ser Leu

325 330 335

Phe Glu Lys Gln Met Gly Leu Val Lys Arg Glu Thr Arg Phe Thr Ser

340 345 350

Arg Cys Pro Ala Asn Glu Ile Val Ser Lys Ile Glu Glu Ala Ala Val

355 360 365

Pro Leu Gly Phe Asn Val Arg Lys Asn Asn Tyr Lys Ile Lys Leu His

370 375 380

Gly Glu Lys Ser Gly Arg Lys Gly His Leu Ser Val Ala Thr Glu Ile

385 390 395 400

Tyr Glu Val Ala Pro Ser Leu Tyr Met Val Glu Leu Arg Lys Ala Gly

405 410 415

Gly Asp Thr Leu Glu Phe His Lys Phe Tyr Lys Asn Leu Ser Thr Gly

420 425 430

Leu Lys Asp Ile Val Trp Gln Leu Gly Glu Gly Gly Glu Glu Val Lys

435 440 445

Asp Gly

450

Claims

1.一种调控植物种子萌发与幼苗生长的基因，其特征在于，所述基因为烟草NtCIPK23基因，所述基因的核苷酸为：A)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或B)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列或C)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

2.根据权利要求1所述的基因编码的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的基因编码的蛋白的应用，其特征在于：将烟草NtCIPK23基因的重组表达载体导入所述受体植物中，得到转基因植物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：重组表达载体中启动蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体为现有的植物表达载体或其它衍生植物表达载体构建。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体中加入增强型或组成型或组织特异型或诱导型启动子。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体中加入了可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶基因或发光化合物的基因或具有抗性的抗生素标记物基因或抗化学试剂标记基因。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：过量表达NtCIPK23加快烟草种子萌发速率、促进幼苗生长，敲除该基因则延缓幼苗萌发速率，抑制幼苗生长。