CN111154686B

CN111154686B - 一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌23及其应用

Info

Publication number: CN111154686B
Application number: CN202010062921.6A
Authority: CN
Inventors: 陈三凤; 李琴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111154686A

Abstract

本发明涉及固氮微生物技术领域，具体涉及一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌23及其应用。本发明提供一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18767。该菌含有固氮酶结构基因nifH，在高浓度铵(50‑300mM)条件下能够进行高效的生物固氮，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，可在农业生产中推广使用，有效减少化肥的使用量。

Description

一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌23及其应用

技术领域

本发明涉及固氮微生物技术领域，具体涉及一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌23及其应用。

背景技术

氮素是植物生长必需的大量元素。地球表面的氮素含量丰富,但大多数以惰性氮气的形式存在于大气中,不能被生物体所利用。为了保障粮食作物及蔬菜瓜果的高产，多需大量使用化学氮肥。但长期过量施用化学氮肥，会导致土壤恶化、环境污染和产品品质下降，阻碍农业经济的可持续发展。

生物固氮是指少数原核微生物在体内固氮酶作用下，将空气中的氮气还原成铵的过程。但生物固氮的效率受环境中铵的影响，高浓度的铵抑制固氮作用。换言之，在贫瘠的土壤里，固氮微生物能充分发挥固氮作用，而在肥沃的土壤里，固氮微生物则只生长而不固氮。通常，固氮微生物只有在氨同化机制被化学或遗传改造修饰的情况下,才能在过量铵存在下表达固氮酶。几乎所有的天然固氮菌只能够在低铵条件下进行固氮。目前报道的固氮微生物在高浓度铵条件下的固氮活性均较低。获得在高浓度铵条件下能够高效固氮的微生物，使固氮微生物在贫瘠和肥沃的土壤里都能充分发挥固氮作用，对在农业生产中减少化肥的用量，具有重要的应用价值。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌23及其应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一株耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23，该菌株是从自然环境中分离得到，并于2019年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，保藏编号为CGMCC No.18767。

本发明提供的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23在LD固体培养基上菌落为圆形，凸起，表面光滑并具有完整的边缘，直径大约为0.5-1.5mm。

本发明提供的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23含有结构基因为nifH，编码该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的16S rDNA基因序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的菌剂。

本发明中，所述包含类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。所述包含类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的菌剂可以采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。

本发明的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的固氮酶活性明显高于本领域公认的类芽孢杆菌(Paenibacillus)属内固氮酶活性最高的菌株Paenibacillus durusATCC35681，因此具有更高的应用潜力。

本发明通过实验证实，类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23能够耐受50～300mM的高浓度铵，在所处环境中NH₄ ⁺的浓度达到50～300mM时仍能够保持较高的固氮酶活性、进行高效的生物固氮。

本发明提供所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23或包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的菌剂在生物固氮中的应用。

作为本发明的一种实施方式，所述生物固氮为在铵离子浓度为0～5mM的低铵浓度条件下的生物固氮。优选为铵离子浓度为0～4mM条件下的生物固氮。更优选为铵离子浓度为0～1mM条件下的生物固氮。

作为本发明的另一种实施方式，所述生物固氮为在铵离子浓度大于20mM的高铵浓度条件下的生物固氮。

上述铵离子浓度大于20mM的高铵浓度条件的铵离子浓度可为30～450mM。优选为50～400mM。更优选为50～300mM。

本发明提供所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23或包含所述类芽孢杆菌23的菌剂在肥料制备中的应用。

本发明提供一种生物肥料，其包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23或包含所述类芽孢杆菌23的菌剂。

本发明提供所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23或包含所述类芽孢杆菌23的菌剂或所述生物肥料在植物种植中的应用。

本发明提供所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23或包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的菌剂在选育固氮微生物中的应用。

上述在选育固氮微生物中的应用可为利用类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23通过诱变、基因工程改造等育种方法进行固氮微生物的选育。

本发明提供所述类芽孢杆菌23或包含所述类芽孢杆菌23的菌剂在促进植物生长或提高植物产量中的应用。

优选地，上述应用为将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23施用于所述植物。

本发明还提供一种促进植物生长或提高植物产量的方法，其为：通过对所述植物施用所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23或包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)23的菌剂促进植物生长或提高植物产量。

优选地，所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的施用可为采用所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的菌悬液浸泡种子或采用所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)23的菌悬液浇灌所述植物；或者将化肥与类芽孢杆菌23的菌悬液联合施用于所述植物。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23，该菌株在低浓度铵条件下具有优异的固氮活性，且在高浓度铵条件下能够保持较高的固氮活性、进行高效的生物固氮(该菌株在无铵条件下的固氮酶活性为6967.66nmol C₂H₄/mg protein h，在100mM高铵条件下的固氮酶活性为4600.23nmolC₂H₄/mg protein h，而现有技术中的天然固氮菌一般只能够在0～5mM NH₄ ⁺范围内才具有固氮酶活性)，打破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，使固氮微生物在贫瘠和肥沃的土壤里都能充分发挥固氮作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1菌株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23在无氮平板上的菌落形态。

图2为本发明实施例1中菌株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23的nifH和16SrDNA的扩增产物的电泳图；

图3为本发明实施例2中菌株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23在不同铵浓度条件下的固氮酶活性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1类芽孢杆菌23的分离、培养和鉴定

1、类芽孢杆菌23分离

类芽孢杆菌23分离自北京地区的高山柏根际土壤样品中。

2、类芽孢杆菌23的培养

培养基的制作：无氮液体培养基(1L)：20g蔗糖；12.06g K₂HPO₄；3.4g KH₂PO₄；0.2gMgSO₄·7H₂O；0.01g NaCl；0.01g FeCl₃；0.002g NaMoO₄·2H₂O；加H₂O定容至1L。115℃灭菌30min。LD培养基(1L)：5g酵母提取物，10g蛋白胨，2.5g NaCl。121℃灭菌20min。固体培养基的制作是在每100毫升液体培养基中加入1.5g琼脂。

将类芽孢杆菌23接种到固体或液体培养基中，30℃培养箱培养2天。类芽孢杆菌23在无氮培养基上的菌落形态如图1所示。

3、类芽孢杆菌23的鉴定

(1)细菌总DNA的提取：从菌株类芽孢杆菌23的纯培养物中提取基因组DNA，基因组提取采用细菌基因组提取试剂盒(天根公司)进行,按照试剂盒说明书进行操作。

(2)菌株的鉴定

以步骤(1)提取的细菌基因组DNA为模板，以nifH F：GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVACCCG和nifH R：CTGVGCCTTGTTYTCGCGGATSGGCATGGC为引物(其中，V代表A、G、C；Y代表C、T；S代表G、C)，PCR扩增固氮酶结构基因nifH，得到了大小约为326bp的条带。将此条带进行回收纯化后，克隆到pMD-18T载体上，蓝白斑筛选，挑白斑接种于含氨苄青霉素(Amp)抗性的液体培养基中过夜培养，提质粒，对质粒酶切验证正确后送公司进行测序。基因nifH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果在GenBank数据库的在线的BLAST比对，结果与菌株Paenibacillus sabinae T27的同源性达到99.03％。

以步骤(1)提取的细菌基因组DNA为模板，以原核生物的模式菌株大肠杆菌的16SrDNA序列设计引物(16S F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT和16S R:TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCC)，PCR扩增16S rDNA序列。结果得到了为1.5kb左右的条带，然后将此条带进行回收纯化，克隆到pMD-18T载体上，蓝白斑筛选，挑白斑接种于含氨苄青霉素(Amp)抗性的液体培养基中过夜培养，提质粒，对质粒酶切验证正确后送公司进行测序。16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示，将测序结果进行在线的BLAST比对，结果显示此菌株属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。

上述PCR的扩增体系如下：10×PCR buffer：5μL，dNTP：1.25μL，正向引物：1.25μL，反向引物：1.25μL，模板DNA：5μL，Taq DNA聚合酶：0.75μL。

上述PCR的扩增条件如下：

nifH基因的扩增：

16S rDNA的扩增：

固氮酶结构基因nifH及16S rDNA的PCR扩增产物的电泳检测结果见图2。

类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)23于2019年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，保藏编号为CGMCC No.18767。

实施例2类芽孢杆菌23在不同铵浓度条件下的固氮酶活性的测定

1、固氮酶活性测定

将实施例1获得的类芽孢杆菌23接种于5mL的LD培养基中，30℃培养过夜，按1％的接种量转接到500mL三角瓶中，30℃培养8h，然后收集菌体，并用适量不同铵浓度的培养基(测酶活的基本培养基中添加不同浓度的NH₄Cl)悬浮菌体，调整OD₆₀₀到0.4。将4mL菌液接种到厌氧培养管，用抽气装置抽出空气并充入氩气，向厌氧管中注入10％乙炔,30℃培养,每隔2h取100μL气体注入气象色谱仪测定乙烯含量。

测酶活的基本培养基(1L)为：26.3g Na₂HPO₄·12H₂O；3.4g KH₂PO₄；10μg生物素；26mg CaCl₂·2H₂O；30mg MgSO₄；0.33mg MnSO₄·H₂O；36mg柠檬酸铁；7.6mg Na₂MoO₄·2H₂O；10μg对氨基苯甲酸；0.3g谷氨酸；4g葡萄糖。谷氨酸和葡萄糖115℃灭菌30min后单独加入，其他试剂可配好后121℃灭菌20min。

2、蛋白含量的测定方法(Bradford,1976)

(1)溶液的配置

Bradford储存液：100mL 95％乙醇，200mL 88％磷酸，350mg考马斯亮蓝G250；

Bradford工作液：425mL双蒸水，15mL 95％乙醇，30mL88％磷酸，30mL Bradford储存液；滤纸过滤，保存于棕色瓶中，室温放置。可保存数周，但使用前需过滤。

(2)标准曲线的制作

取1ml Bradford工作液于试管中，分别加入8μL的0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的BSA溶液，混匀，放置3～5min，显蓝色。测定OD₅₉₅值。以加入8μL水的1mL Bradford工作液作为对照。以OD₅₉₅值为纵坐标，BSA溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。得到标准曲线方程y＝0.6.5853x-0.1067，R²是0.9986。

(3)蛋白含量检测

离心收集菌体，加200μL 0.5M的NaOH煮沸5min，再加200μL、0.5M的HCl混合均匀后离心吸取上清液8μL，加入到1mL Bradford工作液中，混匀，放置5min，显色。测定OD₅₉₅值。将OD₅₉₅值带入标准曲线方程中，计算蛋白浓度。

3、1nmol乙烯的标定

(1)准备120mL血清瓶两个，标为1#、2#瓶；

(2)将血清瓶灌满水，并用插有针头的胶塞塞好，防止气泡产生，取下胶塞，倒出100mL水(用容量瓶量取)，换上新胶塞，这样瓶中的空气体积即为100mL；

(3)向1#瓶中注射2.24mL(标准状况下为2.24mL，非标准状况下，根据PV＝nRT来计算注入量)乙烯，再从1#瓶中取出1mL气体注入2#瓶中，从2#瓶中取出100μL气体打入气相色谱仪(仪器型号HP6890)，所显示的峰面积即为1nmol乙烯的量，据此可计算出记录纸上每单位峰面积代表多少nmol乙烯。

(4)固氮酶活的计算公式为：

菌株类芽孢杆菌23在不同铵浓度条件下的固氮酶活性检测结果见图3，菌株类芽孢杆菌23在无铵(0mM)条件下具有最高的固氮活性,其固氮酶活性为6967.66nmol C₂H₄/mgprotein h；在5-20mM铵浓度条件下固氮酶活性很低；但是随着铵浓度的继续增加又恢复固氮酶活性,在100mM铵离子浓度条件下其固氮酶活性为4600.23nmol C₂H₄/mg protein h；并且在200mM铵离子浓度条件下仍能够保持较高的固氮活性,其固氮酶活性为2605.24nmolC₂H₄/mg protein h；在300mM铵离子浓度条件下的固氮酶活性为907.23nmol C₂H₄/mgprotein h。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌23及其应用

<130> KHP201110255.7

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 326

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctgtgacc ctaaagctga ctccactcgt ctgatcctga acacgaaagc tcaacaaact 60

gtacttcacc tggctgctga aatgggttcg gttgaagacc tcgaactcga agacgtagta 120

tcaaccggct ttggcgacat cctctgcgtg gagtccggcg gtccggaacc aggcgtaggc 180

tgcgcaggcc gcggtatcat cacttccatc aacttcctgg aagagcaagg cgcttacgac 240

ggtatggact tcatctccta tgacgtactc ggtgacgttg tatgcggcgg tttcgcaatg 300

cctatccgcg agaacaaagc acaaga 326

<210> 2

<211> 1537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggagt 60

attttgaaga gcttgctctt caaaatactt agcggcggac gggtgagtaa cacgtaggca 120

acctgcccct tggactggga taactaccgg aaacggtagc taataccgga taagaccttt 180

tggtgcatac cggaaggcgg aaaggcggag caatctgtca ccaggggatg ggcctgcggc 240

gcattagcta gttggtgggg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga 300

gggtgaacgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360

gggatcttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 420

tcggatcgta aagctctgtt gccagggaag aacgttctct agagtaactg ctagagaagt 480

gacggtacct gagaagaaag ccccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

ggggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggct gtttaagtct 600

ggtgtttaaa ccatgggctc aacctgtggt cgcactggaa actgggcagc ttgagtgcag 660

aagaggaaag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca 720

gtggcgaagg cgactttctg ggctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa 780

acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaggt gttaggggtt 840

tcgataccct tggtgccgaa gttaacacag taagcactcc gcctggggag tacggtcgca 900

agactgaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc agtggagtat gtggtttaat 960

tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc tctgaccgga ctagagatag 1020

tcctttcctt cgggacagag gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgact ttagttgcca gcaggtagtg 1140

ctgggcactc tagagtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1200

catcatgccc cttatggcct gggctacaca cgtactacaa tggccggtac aacgggaagc 1260

gaaaccgcga ggtggagcca atcttataaa gccggtctca gttcggattg caggctgcaa 1320

ctcgcctgca tgaagtcgga attgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380

ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttacaacac ccgaagtcgg 1440

tggggtaacc cgcaagggag ccagccgccg aaggtggggt agatgattgg ggtgaagtcg 1500

taacaaggta accaatcact agtgaattcg cggccgc 1537

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctgcgatc cvaaggccga ytcvacccg 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgvgccttg ttytcgcgga tsggcatggc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagtttgat cctggctcag aacgaacgct 30

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacggctacc ttgttacgac ttcacccc 28

Claims

1.一株耐铵固氮类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）23，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 18767。

2.包含权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）23的菌剂。

3.权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）23或权利要求2所述的菌剂在生物固氮中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物固氮为在铵离子浓度为0~5mM的低铵浓度条件下的生物固氮。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物固氮为在铵离子浓度大于20 mM的高铵浓度条件下的生物固氮。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高铵浓度条件的铵离子浓度为30~450mM。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述高铵浓度条件的铵离子浓度为50~400mM。

8.权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）23或权利要求2所述的菌剂在肥料制备中的应用。

9.一种生物肥料，其特征在于，包含权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）23或权利要求2所述的菌剂。

10.权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）23或权利要求2所述的菌剂或权利要求9所述的生物肥料在植物种植中的应用。

11.权利要求1所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）23或权利要求2所述的菌剂在选育固氮微生物中的应用。