CN111139257B

CN111139257B - 一种梨pmei蛋白体外表达的方法及其应用

Info

Publication number: CN111139257B
Application number: CN202010041241.6A
Authority: CN
Inventors: 吴巨友; 朱晓璇; 汤超; 王鹏; 张绍铃
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2040-01-15
Also published as: CN111139257A

Abstract

本发明公开了一种梨PMEI蛋白的体外表达纯化方法及其应用。通过设计引物克隆梨PMEI基因；构建大肠杆菌重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF；将构建的重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白重组表达菌株；对重组菌株进行蛋白诱导表达，并用镍柱亲和层析法纯化重组梨PMEI蛋白；之后，用获得的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管及拟南芥根部。通过本发明的方法，实现了梨PMEI蛋白的首次体外表达及纯化，表达效率高，纯化蛋白稳定存在且纯度完全可以满足相关实验的需要；通过重组梨PMEI蛋白对梨花粉管和拟南芥根部的处理，促进了梨花粉管和拟南芥根部的生长。

Description

一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用，具体涉及从梨花粉中克隆并纯化了一种梨PMEI蛋白，分别用该蛋白处理梨花粉管及拟南芥根部，促进了梨花粉管及拟南芥根部的生长。

背景技术

果胶是双子叶植物和除禾本科外的单子叶植物初生细胞壁的主要组成成分，也是花粉壁和花粉管壁的主要组成成分。在植物生长发育的过程中，果胶的降解和修饰需要一系列酶的参与，其中，果胶甲酯酶(pectin mthylesterases,PMEs)是果胶降解和代谢过程中一类重要的水解酶，使得甲酯化的果胶去甲酯化，从而调节胞壁的硬度和弹性。果胶甲酯酶抑制子(pectin mthylesterase inhibitors,PMEIs)是一种调控PME活性的蛋白质，能够与PME形成可逆的1:1非共价复合体，通过覆盖活性位点来抑制PME的活性。PMEI对PME的抑制作用调控了果胶的甲酯化程度，从而对细胞壁力学产生了影响。研究表明，PMEI在种子萌发、下胚轴伸长、花粉萌发和花粉管生长、果实成熟，以及应对各种生物及非生物胁迫中发挥了不可或缺的作用。分离纯化PMEI蛋白将促进对其生物学功能及作用机制的进一步研究。PMEI广泛存在于植物的各类组织和生长阶段中，但分离纯化天然的PMEI蛋白难度大，且化学合成PMEI的成本高。所以，利用基因工程技术制备重组PMEI蛋白是解决上述问题的一个有效途径。

基因工程技术制备重组蛋白的方法获得了广泛的应用。至今为止，人们已构建了多种蛋白表达***，如原核表达***、真核表达***、无细胞表达***等。大肠杆菌表达***是最常用的原核表达***，具有遗传背景简单、生化特性明确、生长速度快、经济成本低、表达水平高、产物易于分离纯化及便于工厂化生产等优点。自构建以来，众多重组蛋白已经通过大肠杆菌表达***制备出来。利用基因工程技术纯化出的PMEI蛋白去处理梨花粉管及拟南芥的根部，可以观测到其对于梨花粉管及拟南芥的根部生长的促进效用。

发明内容

本发明目的是提供一种低成本、高产率、易纯化的梨PMEI蛋白体外表达的制备方法。

本发明另一目的是提供梨PMEI蛋白在促进梨花粉管及拟南芥根部生长中的应用。

本发明的目的可以采用以下技术方案来实现：

一种梨PMEI蛋白体外表达的方法，包括以下步骤：

(1)提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增梨PMEI基因；

(2)构建梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；

(3)将步骤(2)中构建的重组质粒用热激法转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组菌株；

(4)培养步骤(3)中构建的重组大肠杆菌菌株至OD₆₀₀为0.4-0.6，低温处理后加入IPTG诱导梨PMEI蛋白的表达；

(5)纯化诱导表达的梨PMEI蛋白；

(6)重组梨PMEI蛋白的鉴定。

作为一种优选技术方案，步骤(1)中用于PCR扩增梨PMEI基因的正向引物为：5’-ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGAGAGCGTCTCAATTAGTTAGGAGTGTTTG-3’，反向引物为：5’-AGCAGAGATTACCTATCTAGACTAGATATTTAATAACTGGGAAGTAAC-3’。

进一步优选的，步骤(1)中，PCR扩增梨PMEI基因的反应体系为：ddH₂O 19μl，上下游引物各2.5μl,cDNA 1μl,2×Super Pfx MasterMix25μl；PCR反应条件为：98℃预变性3min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

进一步优选的，步骤(2)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组质粒中所使用的大肠杆菌原核表达载体为pCold-TF，梨PMEI基因***的酶切位点为Xho I和Xba I位点。作为一种详细技术方案，步骤(2)中，PCR扩增梨PMEI基因的产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收，回收产物用同源重组酶连接到经Xho I和Xba I限制性内切酶双酶切后的大肠杆菌原核表达载体pCold-TF上。

进一步优选的，步骤(4)中，所述的低温处理为于冰上静置5min，再于15℃静置40分钟，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.5mmol/L，所述诱导表达的条件为15℃，时间为24小时。诱导梨PMEI蛋白表达的详细过程为：将梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组载体按照1:50的比例接种到100ml LB液体培养基中，于37℃、220rpm震荡培养过夜，再按1:50的比例转接到300ml LB液体培养基中，于37℃、220rpm震荡培养至菌液OD₆₀₀为0.4-0.6，迅速于冰上静置5分钟，再于15℃静置40分钟；加入终浓度为0.5mmol/L的诱导剂IPTG，15℃、220rpm震荡培养,诱导表达24小时；其中，所述LB液体培养基中含有100μg/ml氨苄青霉素。

进一步优选的，步骤(5)中，纯化诱导表达的梨PMEI蛋白的详细过程为：诱导表达完成后，于4℃、10000rpm离心10分钟后弃上清，收集菌体沉淀，向沉淀中加入20ml裂解液重悬沉淀；重悬液使用超声破碎至澄清后，4℃、10000rpm离心10分钟，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨PMEI蛋白进行纯化；纯化蛋白前，用10倍柱体积的平衡缓冲液来平衡镍柱亲和层析介质；收集纯化蛋白，用截流量为30kDa的超滤管于4℃、6000rpm下进行浓缩、脱盐，-80℃保存备用；

其中，所述超声破碎法的超声功率为240w，条件为开启3s，停7s，共27分钟；

所述裂解液的配方为：140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾，50×EDTA-free protease inhibitor cocktail III，pH为7.3；

所述平衡缓冲液的配方为：500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH为7.3。

所述梨PMEI蛋白N端带有6个组氨酸标签(His-Tag)。

进一步优选的，步骤(6)中，重组梨PMEI蛋白的鉴定方法为SDS-PAGE电泳分析法。SDS-PAGE电泳分析法鉴定重组梨PMEI蛋白的具体过程为：取50μl纯化后样品，加入25μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液后，取10μl混合液进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后鉴定梨PMEI蛋白。

梨PMEI蛋白在促进梨花粉管及拟南芥根部生长中的应用。

上述的应用，用上述的方法表达的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管或拟南芥根部。测量并统计梨花粉管长度及拟南芥根部长度的变化，验证重组梨PMEI蛋白对梨花粉管及拟南芥根部生长的促进作用。为评定梨PMEI蛋白对梨花粉管及拟南芥根部生长的效用，取同时间段于未加梨PMEI蛋白的梨培养基中培养的梨花粉管和未涂布梨PMEI蛋白的MS培养基上生长的拟南芥为阴性对照，测量并统计花粉管及根部长度的变化。

作为一种优选技术方案，用重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管的过程为：取适量梨花粉于花粉培养基中，于25℃、120rpm的培养箱中暗培养1小时；加入终浓度为10mmol的重组梨PMEI蛋白，继续于25℃、120rpm的培养箱中暗培养3小时；于第2、3、4个小时测量并统计梨花粉管的长度。

其中，所述梨花粉培养基的配方为：10％蔗糖，0.01％硼酸，0.03％四水二磷酸钙，0.58％MES，10％PEG，用Tris调至pH为6.3。

作为一种优选技术方案，用重组梨PMEI蛋白处理拟南芥根部的过程为：取30μl0.1mg/ml的重组梨PMEI蛋白涂布于无抗MS培养基上；将苗龄为10天的拟南芥幼苗转移到涂布了梨PMEI蛋白的无抗MS培养基上，并将板子垂直放置；于平均温度为25℃、平均湿度为65％、光照处理/黑暗处理为16/8小时的温室中继续培养拟南芥幼苗，转移后的第2、4、6、8天测量并统计拟南芥根的长度。

其中，所述MS培养基的配方为：2％蔗糖，0.43％MS，0.75％琼脂，用KOH调至pH为5.8。

本发明梨PMEI蛋白体外表达的方法和应用实验过程包括以下步骤：

(1)梨PMEI基因的序列分析及克隆

(1.1)一种梨PMEI(Pbr003471.1)基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，蛋白质序列为SEQ ID NO:2。利用序列分析网站SignalP 4.1Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析并去除信号肽序列SEQ ID NO:3。

(1.2)根据植物总RNA提取试剂盒说明书，提取砀山酥梨花粉总RNA，用反转录试剂盒将花粉总RNA反转录为cDNA。

(1.3)引物设计及PCR反应：设计正向引物(PMEI-pCold-Xho I-F)为5’-ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGAGAGCGTCTCAATTAGTTAGGAGTGTTTG-3’(斜体为pCold-TF载体的前端同源臂，下划线为Xho I酶切位点)，反向引物(PMEI-pCold-XbaI-R)为5’-AGCAGAGATTACCTATCTAGACTAGATATTTAATAACTGGGAAGTAAC-3’

(斜体为Pcold-TF载体的后端同源臂，下划线为Xba I酶切位点)；PCR反应体系为：ddH₂O 19μl，上下游引物各2.5μl,cDNA 1μl,2×Super Pfx MasterMix25μl；PCR反应条件为：98℃预变性3min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

(1.4)PCR扩增梨PMEI基因的产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。回收产物用同源重组酶连接到经Xho I和Xba I限制性内切酶双酶切后的大肠杆菌原核表达载体pCold-TF上(参见TAKARA公司载体图谱)。

(1.5)重组表达载体PMEI-pCold-TF经苏州金唯智生物科技有限公司DNA测序验证其正确性。

(2)重组表达大肠杆菌菌株的构建

测序正确的重组表达载体PMEI-pCold-TF经热激法转化到大肠杆菌株Rosetta(DE3)中，涂布于LB固体平板(含100μg/ml氨苄青霉素)上，于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落到500μlLB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃、220rpm震荡培养4小时。菌液经PCR验证正确后，按7：3(菌液：甘油)的比率加入50％(v/v)灭菌甘油，混匀后经液氮速冻保存于-80℃冰箱。

(3)梨PMEI蛋白的诱导表达及纯化

(3.1)梨PMEI蛋白的诱导表达

将步骤(2)中保存的重组表达菌株按照1:50的体积比接种到100ml LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养过夜，按1:50再转接到300ml LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至菌液OD₆₀₀达到0.4-0.6，迅速置于冰上5分钟，再于15℃静置40分钟，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG后于15℃、220rpm震荡培养,诱导表达24小时。其中，所述LB液体培养基中含有100μg/ml氨苄青霉素。

(3.2)梨PMEI蛋白的纯化

梨PMEI蛋白的诱导表达完成后，于4℃、10000rpm离心10分钟后弃上清，收集菌体沉淀，向沉淀中加入20ml裂解液(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾，50×EDTA-free protease inhibitor cocktail III(德国默克密理博)，pH为7.3)重悬沉淀；重悬液使用超声破碎(超声功率为240w，条件为开启3s，停7s，共27分钟)至澄清后，4℃、10000rpm离心10分钟，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨PMEI蛋白进行纯化。纯化蛋白前，用10倍柱体积的平衡缓冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH为7.3)来平衡镍柱亲和层析介质；收集纯化蛋白，用超滤管(截流量为30kDa)于4℃，6000rpm下进行浓缩、脱盐。取50μl纯化后样品，加入25μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液后，取10μl混合液进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后鉴定梨PMEI蛋白，于-80℃保存备用。

(4)重组梨PMEI蛋白的应用

按照上海生工生物工程公司BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化后重组梨PMEI蛋白的蛋白浓度进行测定。用纯化后的重组梨PMEI蛋白处理砀山酥梨花粉管及哥伦比亚-0野生型拟南芥根部，测量并统计花粉管及根部长度的变化。取适量梨花粉于200μl花粉培养基中，于25℃、120rpm的培养箱中暗培养1小时后，加入终浓度为10mmol的重组梨PMEI蛋白，继续于25℃、120rpm的培养箱中暗培养3小时。第2、3、4个小时，用显微镜尼康TE 100观察花粉管长势，并用软件Image-Pro Plus 6.0测量并统计梨花粉管的长度。每组处理设置三个生物学重复，每次计测100根花粉管长度，并计算平均值。其中，所述梨花粉培养基的配方为：10％蔗糖，0.01％硼酸，0.03％四水二磷酸钙，0.58％MES，10％PEG，用Tris调至pH为6.3。

取30μl 0.1mg/ml的重组梨PMEI蛋白涂布于无抗MS培养基上；将无抗MS培养基上生长的、苗龄为10天的拟南芥幼苗转移到涂布了梨PMEI蛋白的无抗MS培养基上，并将板子垂直放置，然后于平均温度为25℃、平均湿度为65％、光照处理/黑暗处理为16/8小时的温室中继续培养拟南芥幼苗，转移后的第2、4、6、8天测量并统计拟南芥根的长度。每组处理设置三个生物学重复，每次计测50株拟南芥根的长度，并取其平均值。其中，所述MS培养基的配方为：2％蔗糖，0.43％MS，0.75％琼脂，用KOH调至pH为5.8。

为评定梨PMEI蛋白对梨花粉管及拟南芥根部生长的效用，取同时间段于未加梨PMEI蛋白的梨培养基中培养的梨花粉管和未涂布梨PMEI蛋白的MS培养基上生长的拟南芥为阴性对照，测量并统计花粉管及根部长度的变化。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用基因工程技术，首次体外表达且纯化了梨PMEI蛋白，表达效率高，纯化效果好。

(2)本发明中体外表达和纯化蛋白的方法可适用于梨中所有PMEI蛋白。

(3)本发明所表达纯化的梨PMEI蛋白在体外条件下稳定存在且具有蛋白活性，为进一步探究其在梨生长发育过程中所发挥的生物学功能提供了研究基础。

(4)本发明表达的梨PMEI蛋白能够直接在体外条件下促进砀山酥梨花粉管及哥伦比亚-0野生型拟南芥根部的生长，对梨PMEI蛋白的功能研究提供了参考。

附图说明

图1是梨PMEI蛋白序列信号肽预测示图。

图2是PCR扩增梨PMEI基因的琼脂糖凝胶电泳示图；

其中，M为DNA标准分子质量；1为PCR扩增产物。

图3是重组梨PMEI蛋白的诱导表达及纯化后SDS-PAGE示图；

其中，M为蛋白质标准分子量；1为0.5mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；2为纯化后的重组梨PMEI蛋白；3为不含IPTG诱导菌体总蛋白。

图4是重组梨PMEI蛋白对砀山酥梨花粉管生长的影响；

其中，图4a是未经处理的梨花粉管和重组梨PMEI蛋白处理3小时后梨花粉管；图4b是1-3小时内未经处理的梨花粉管和重组梨PMEI蛋白处理后梨花粉管的长度变化。

图5是重组梨PMEI蛋白对哥伦比亚-0野生型拟南芥根部生长的影响；

其中，图5a是未经处理的拟南芥的根和重组梨PMEI蛋白处理第八天时拟南芥的根；图5b是0-8天内未经处理的拟南芥的根和重组梨PMEI蛋白处理后拟南芥根的长度变化。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1：PMEI-pCold-TF重组质粒的构建与鉴定

取新鲜砀山酥梨花粉，用植物总RNA提取试剂盒提取花粉总RNA；以花粉总RNA为模板，用反转录试剂盒反转录得到花粉cDNA；如图1所示，分析并去除梨PMEI基因的信号肽序列，设计引物，并在引物两端加上载体pCold-TF的同源臂及Xba I和Xho I的酶切位点，以花粉cDNA为模板，PCR扩增PMEI基因，PCR反应体系为：ddH₂O 19μl，上下游引物各2.5μl,cDNA1μl,2×Super Pfx MasterMix25μl；PCR反应条件为：98℃预变性3min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。如图2所示，在500-750bp有一清晰的亮带，与PMEI基因长度吻合。

PCR产物使用康为世纪公司Gel extraction kit快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，得到回收后的PMEI基因；回收后的PMEI基因经同源重组酶连接到同样经过Xba I和Xho I双酶切的pCold-TF表达载体中，37℃反应30分钟，构建重组质粒PMEI-pCold-TF；通过热激法将重组质粒转化进大肠杆菌菌株DH5α，涂布于LB固体平板(含100μg/ml氨苄青霉素)上，于37℃培养16小时，挑取单菌落到500μlLB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃、220rpm震荡培养4小时，进行PCR鉴定。鉴定正确的单克隆菌株送至苏州金唯智生物科技有限公司DNA测序验证其序列正确性。测序结果表明，所获得的梨PMEI基因编码区序列与参考系列相符。重组质粒被命名为PMEI-pCold-TF。梨PMEI基因编码区序列与pCold-TF连接克隆测序结果为SEQ ID NO:1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

实施例2：梨PMEI基因在大肠杆菌中的表达

1.获得表达梨PMEI的重组表达菌株

将测序正确的单克隆菌株接种到4ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃、220rpm过夜振荡培养。次日，按照康为世纪公司的QuickPure Plasmid Mini kit快速质粒小提取试剂盒说明书提取重组质粒PMEI-pCold-TF。用热激法将1ng重组质粒PMEI-pCold-TF转化进大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)，涂布于LB平板(含100μg/ml氨苄青霉素)上筛选重组子，于37℃过夜培养，获得表达梨PMEI的基因工程菌。取所得基因工程菌的单菌落于LB平板(含100μg/ml氨苄青霉素)上划线培养，将少量划线培养菌接种于1ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养4小时，按7：3(菌液：甘油)的比率加入50％(v/v)灭菌甘油，混匀后经液氮速冻保存于-80℃冰箱，得到表达梨PMEI蛋白的重组表达菌株。

2.梨PMEI重组蛋白的表达

将保存的梨PMEI蛋白的重组表达菌株按照1:50的体积比接种到100ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、220rpm过夜振荡培养，活化重组表达菌株。再将活化后的重组表达菌株按1:50接种到300ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养，37℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6。取5ml菌液作为阴性对照，剩余菌液迅速置于冰上5分钟，再于15℃中静置40分钟，最后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，15℃、220rpm震荡培养，诱导表达24小时。取5ml表达后的菌液，4℃、10000rpm离心4分钟，收集菌体沉淀。在沉淀和阴性对照中分别加入200μl 10％SDS(10g/100ml)，混匀并沸水浴10分钟，再冰浴两分钟，之后于4℃、10000rpm离心10分钟，各取上清50μl，并加入25μl 2×蛋白上样缓冲液。各取15μl进行12％常规SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色后检测重组蛋白表达情况，结果如图3第1、2条泳道显示。

实施例3：重组梨PMEI蛋白的分离纯化及鉴定

将上述诱导表达24小时并经SDS-PAGE电泳检测正确的剩余重组表达菌液于4℃、10000rpm离心10分钟，弃上清并收集菌体沉淀，向沉淀中加入20ml裂解液(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾，50×EDTA-free protease inhibitorcocktail III(德国默克密理博)，pH为7.3)重悬沉淀；重悬液使用超声破碎(超声功率为240w，条件为开启3s，停7s，共27分钟)至澄清后，4℃、10000rpm离心10分钟，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤除去杂质，使用德国默克密理博公司的Ni-NTA琼脂糖亲和层析填料对梨PMEI蛋白进行纯化。

纯化蛋白前，用10倍柱体积的平衡缓冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH为7.3)来平衡镍柱亲和层析介质，控制流速为1ml/min；经滤膜过滤后的20ml蛋白上清样过柱纯化，控制流速为1ml/min；用20倍柱体积含40mM咪唑的清洗液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，30mM咪唑，pH 7.3)冲洗柱中杂蛋白，控制流速为1ml/min；10倍柱体积含60mM咪唑的洗脱冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，80mM咪唑，pH 7.3)洗脱柱中纯化蛋白，控制流速为1ml/min，收集洗脱液得纯化蛋白，使用超滤管(截流量为30kDa)于4℃下6000rpm进行浓缩、脱盐，最后﹣80℃保存。取少量蛋白进行SDS-PAGE电泳纯度分析，结果如图3第3条泳道所示。

实施例4：重组梨PMEI蛋白的应用

按照上海生工生物工程公司BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化后重组梨PMEI蛋白的蛋白浓度进行测定。用纯化后的重组梨PMEI蛋白处理砀山酥梨花粉管及哥伦比亚-0野生型拟南芥根部，测量并统计花粉管及根部长度的变化。取适量梨花粉于200μl花粉培养基中，于25℃、120rpm的培养箱中暗培养1小时后，加入终浓度为10mmol的重组梨PMEI蛋白，继续于25℃、120rpm的培养箱中暗培养3小时。第2、3、4个小时时，用显微镜尼康TE100观察花粉管长势，并用软件Image-Pro Plus 6.0测量并统计梨花粉管的长度。每组处理设置三个生物学重复，每次计测100根花粉管长度，并计算平均值。其中，所述梨花粉培养基的配方为：10％蔗糖(g/100ml)，0.01％硼酸(g/100ml)，0.03％四水二磷酸钙(g/100ml)，0.58％MES(g/100ml)，10％PEG(g/100ml)，用Tris调至pH为6.3。

取30μl 0.1mg/ml的重组梨PMEI蛋白涂布于无抗MS培养基上；将无抗MS培养基上生长的、苗龄为10天的拟南芥幼苗转移到涂布了梨PMEI蛋白的无抗MS培养基上，并将板子垂直放置，然后于平均温度为25℃、平均湿度为65％、光照处理/黑暗处理为16/8小时的温室中继续培养拟南芥幼苗，转移后的第2、4、6、8天测量并统计拟南芥根的长度。每组处理设置三个生物学重复，每次计测50株拟南芥根的长度，并取其平均值。其中，所述MS培养基的配方为：2％蔗糖(g/100ml)，0.43％MS(g/100ml)，0.75％琼脂(g/100ml)，用KOH调至pH为5.8。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 567

<212> DNA

<213> 梨(Pyrus spp)

<400> 1

atggcctcct caatcagtta tgcaatgttc attgcttcct tgctcttatg tctctcgtcg 60

tctccagcac catttgcaaa tgcaagagcg tctcaattag ttaggagtgt ttgcaagcaa 120

acccacgaag aattcggcta cagctatagg cagtgcgtaa aatctctttg gaaagatatt 180

ccaattagat cggcaactaa tctcaaagat cttgatatag ccattcttaa attagcagca 240

gcaaatgcag cacaaaccaa agctacgttt gaaaaagctt tcaacgccac caacaagaac 300

actaatggca cggcagctat aaagcagtgt gtagattcgt atgattttgc gttaggggct 360

ttcgtttttg cagtgcgagg ggtcaatgac ggtgacaaat cggtcaccaa aatcctcaca 420

cagacccaag atgaccttgt tcgttgccaa agagcattgg cctctgttga agttcagctt 480

cctatgccag tatcgacgac aaacttttgg gtcatgttat atagggatgt tgcattcctt 540

gttacttccc agttattaaa tatctag 567

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 梨(Pyrus spp)

<400> 2

Met Ala Ser Ser Ile Ser Tyr Ala Met Phe Ile Ala Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Ser Ser Pro Ala Pro Phe Ala Asn Ala Arg Ala Ser Gln

20 25 30

Leu Val Arg Ser Val Cys Lys Gln Thr His Glu Glu Phe Gly Tyr Ser

35 40 45

Tyr Arg Gln Cys Val Lys Ser Leu Trp Lys Asp Ile Pro Ile Arg Ser

50 55 60

Ala Thr Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Ala Ile Leu Lys Leu Ala Ala

65 70 75 80

Ala Asn Ala Ala Gln Thr Lys Ala Thr Phe Glu Lys Ala Phe Asn Ala

85 90 95

Thr Asn Lys Asn Thr Asn Gly Thr Ala Ala Ile Lys Gln Cys Val Asp

100 105 110

Ser Tyr Asp Phe Ala Leu Gly Ala Phe Val Phe Ala Val Arg Gly Val

115 120 125

Asn Asp Gly Asp Lys Ser Val Thr Lys Ile Leu Thr Gln Thr Gln Asp

130 135 140

Asp Leu Val Arg Cys Gln Arg Ala Leu Ala Ser Val Glu Val Gln Leu

145 150 155 160

Pro Met Pro Val Ser Thr Thr Asn Phe Trp Val Met Leu Tyr Arg Asp

165 170 175

Val Ala Phe Leu Val Thr Ser Gln Leu Leu Asn Ile

180 185

<210> 3

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcctcct caatcagtta tgcaatgttc attgcttcct tgctcttatg tctctcgtcg 60

tctccagcac catttgcaaa tgca 84

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggagctcg gtaccctcga gagagcgtct caattagtta ggagtgtttg 50

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcagagatt acctatctag actagatatt taataactgg gaagtaac 48

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的梨PMEI蛋白在促进梨花粉管及拟南芥根部生长中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的梨PMEI蛋白为采用以下方法制得的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管或拟南芥根部：

（1）提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物，以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增梨PMEI基因；

（2）构建梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；

（3）将步骤（2）中构建的重组质粒用热激法转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组菌株；

（4）培养步骤（3）中构建的重组大肠杆菌菌株至OD₆₀₀为0.4-0.6，低温处理后加入IPTG诱导梨PMEI蛋白的表达；

（5）纯化诱导表达的梨PMEI蛋白；

（6）重组梨PMEI蛋白的鉴定。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，用于PCR扩增梨PMEI基因的正向引物为：5’-ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGAGAGCGTCTCAATTAGTTAGGAGTGTTTG-3’，反向引物为：5’-AGCAGAGATTACCTATCTAGACTAGATATTTAATAACTGGGAAGTAAC-3’。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，PCR扩增梨PMEI基因的反应体系为：ddH₂O 19 μl，上下游引物各2.5 μl, cDNA 1μl, 2×Super Pfx MasterMix25 μl；PCR反应条件为：98 ℃预变性3 min，然后进行98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组质粒中所使用的大肠杆菌原核表达载体为pCold-TF，梨PMEI基因***的酶切位点为Xho I和Xba I位点。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述的低温处理为于冰上静置5min，再于15 ℃静置40分钟，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.5 mmol/L，所述诱导表达的条件为15 ℃，时间为24小时。

7.根据权利要求2或6所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，诱导梨PMEI蛋白表达的详细过程为：将梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组载体按照1:50的比例接种到100 ml LB液体培养基中，于37 ℃、220 rpm震荡培养过夜，再按1:50的比例转接到300 ml LB液体培养基中，于37 ℃、220 rpm震荡培养至菌液OD₆₀₀为0.4-0.6，迅速于冰上静置5分钟，再于15℃静置40分钟；加入终浓度为0.5 mmol/L的诱导剂IPTG，15 ℃、220 rpm震荡培养,诱导表达24小时；

其中，所述LB液体培养基中含有100 μg/ml氨苄青霉素。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（5）中，纯化诱导表达的梨PMEI蛋白的详细过程为：诱导表达完成后，于4 ℃、10000 rpm离心10分钟后弃上清，收集菌体沉淀，向沉淀中加入20 ml裂解液重悬沉淀；重悬液使用超声破碎至澄清后，4 ℃、10000 rpm离心10分钟，收集上清，上清经0.45 μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨PMEI蛋白进行纯化；纯化蛋白前，用10倍柱体积的平衡缓冲液来平衡镍柱亲和层析介质；收集纯化蛋白，用截流量为30 kDa的超滤管于4 ℃、6000 rpm下进行浓缩、脱盐，-80 ℃保存备用；

其中，所述超声破碎法的超声功率为240 w，条件为开启3 s，停7 s，共27分钟；

所述裂解液的配方为：140 mM氯化钠，2.7 mM氯化钾，10 mM磷酸氢二钠，1.8 mM磷酸二氢钾，50×EDTA-free protease inhibitor cocktail III，pH为7.3；

所述平衡缓冲液的配方为：500 mM氯化钠，20 mM三（羟甲基）氨基甲烷，5 mM咪唑，pH为7.3。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（6）中，重组梨PMEI蛋白的鉴定方法为SDS-PAGE电泳分析法，SDS-PAGE电泳分析法鉴定重组梨PMEI蛋白的具体过程为：取50 μl纯化后样品，加入25 μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液后，取10 μl混合液进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后鉴定梨PMEI蛋白。