CN111139243B

CN111139243B - 一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因及其应用方法

Info

Publication number: CN111139243B
Application number: CN201911188658.9A
Authority: CN
Inventors: 张静文; 李佳文; 杨勇; 张颖
Original assignee: Hainan Normal University
Current assignee: Hainan Normal University
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: CN111139243A

Abstract

本发明公开了一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因及其应用方法，该基因具有促进植物开花的特性。本发明首次从分子生物学的角度来初步了解红榄李的成花诱导机理，为以后通过目的基因在红榄李中的过量表达或抑制其表达来调节开花时间打下基础，对于从分子水平阐明红榄李濒危具有重要的意义。

Description

一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因及其应用方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

据NOAA模型预测结果，到了2020年，全球地表温度将比1986到2005年平均温度至少高出0.5℃，地球多个地区还会伴随一种极端气候-冷热不均的现象，但全球总体温度是在升高。高温下，植物会出现早花、叶片变薄变小、下胚轴伸长生长等现象，这些生物学现象统称为热形态建成(thermomorphogenesis)。目前，关于热形态建成的研究广受关注，但这一调控途径的各组分仍有待鉴定，其潜在的作用机理仍需要作进一步深入的研究。

濒危红树植物红榄李(Lumnitzera littorea(Jack.)Voigt)，为使君子科(Combretaceae)榄李属(Lumnitzera Wild.)植物，主要分布在热带地区，由于生境的破坏，成为《国际湿地公约》濒危物种。在我国，红榄李仅分布于海南陵水和三亚，目前仅存11株野生种，且均处于老龄或接近老龄林阶段，林下无幼苗发育(钟才荣等，2011；张颖等，2017)。红榄李数量的急剧减少，与其花粉活力低下、胚发育异常及种子败育严重等生物因素相关(张颖等，2017；王文卿和王瑁，2007)。由此可见，红榄李生长过程中出现的成花不稳定，严重影响着红榄李种子的状态，导致生殖困难。因此，红榄李成花相关研究成为关注热点。

调查表明，红榄李生境均温为25℃，为嗜热窄分布种，因此，温度是限制其分布的重要因素之一。高温下，红榄李演化出很强的适应周围生境的能力，尤其是关于热形态的建成。热形态建成有利于植物降低自身温度，更好地适应高温环境。目前已发现与植物光敏色素phyB相互作用的转录因子PIF4在植物热形态建成中起到核心的调控作用，也鉴定出多个负调控因子通过抑制PIF4的活性来调控热形态建成。但关于红榄李如何在高温下进行热形态建成的分子机制尚不清楚，尤其是对开花调控机制的研究。

植物的MADS-box基因最早是作为花器官特征决定基因在拟南芥和金鱼草中鉴定出来的，其后的研究发现这些基因在植物成花转变、花分生组织决定、雌雄配子体发育以及果实成熟等过程发挥重要调节作用。目前，多项研究表明，MADS-box基因可通过响应环境温度的变化影响植物的开花时间。FLM-β为开花抑制因子FLOWERING LOCUS M(FLM)的选择性剪接体，低温环境下，FLM-β转录水平提高，抑制植物开花；FLM-β与SHORT VEGETATIVEPHASE(SVP)相互作用时，SVP在高温下降解，减少SVP-FLM-β阻遏复合物的丰度，从而促进植物开花(Lee JH,Ryu HS,Chung KS,Posé D,Kim S,Schmid M,Ahn JH.Regulation oftemperature-responsive flowering by MADS-box transcription factorrepressors.Science.2013，342(6158):628-632.)。FLOWERING LOCUS C(FLC)是一种编码MADS-box的转录因子，该蛋白是一种开花抑制因子，它和FRIGIDA(FRI)是春化途径所必需的。FRI能够上调FLC的表达，使其达到阻止开花的有效水平(Koornneefet al.,1994；Searleet al.,2006)。研究表明FLC影响高温下生物钟的周期：低表达的FLC与昼夜节律缩短有关，高表达的FLC与昼夜节律延长有关；这可能影响植物发育的许多方面[47,48]。此外，在从22℃转变到27℃后，许多温度反应基因改变了flc-3突变体的表达水平，这表明FLC可能在高温下调控其他基因的转录水平。MADS box转录因子不仅可调控植物花期，同时亦可影响植物的育性。小麦TaMS-MADS box在A3017品种的育性转换关键时期(花粉发育的单核期～二核期)呈上调表达,且在不育条件下的表达量高于同时期可育条件下的表达量。采用BSMV-VIGS技术,在可育温度条件下,有效地沉默了TaMS-MADS box在A3017穗部的表达。沉默植株出现部分花药瘦小、不开裂等不育性状,自交结实率降低。

目前，已经从多种植物中克隆到MADS-box基因，MADS-box关键基因的转录活性受温度控制，这使得开花与季节变化同步。此外，MADS-box基因在调节生长温度升高的发育反应中有潜在作用。因此，研究温度如何调节MADS-box基因的转录，有助于深入了解温度的季节性波动如何影响植物的发育。植物育种家可利用温度响应MADS-box基因的自然变异来培育适应高温的作物品种。然而，作为一种嗜热窄分布的濒危物种，红榄李中MADS-box基因响应高温环境促进植物热形态建成的分子机制尚不明确。因此，红榄李LlMADS11基因的克隆和鉴定，成花诱导机理研究，为以后通过目的基因在红榄李中的过量表达或抑制其表达来调节开花时间打下基础，从分子生物学的角度解析红榄李LlMADS11在植物热形态建成的机制，对于耐热品质的作物培育将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明通过从红榄李基因组中分离得到一个促进植物开花基因LlMADS11。将分离得到的LlMADS11基因构建植物表达载体并导入拟南芥中，获得转基因材料，通过转基因拟南芥显示，LlMADS11已成功***到拟南芥中，并在转录水平检测到该基因的表达，通过对转基因后代的表型检测，温和高温下出现早花、下胚轴伸长及叶片变小等生理现象，表明LlMADS11促进植物热形态建成，还可影响花器官的发育。

本发明采取的技术方案如下：

一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述LliMADS11基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其含有MADS家族的结构域。

一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因的应用方法，所述LliMADS11基因与pBinGlyRed载体相连后得到重组质粒，通过冻融法转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，转基因拟南芥的莲座叶比野生型拟南芥平均少11个叶片，转基因拟南芥的开花时间显著提前。

进一步的，转LliMADS11基因拟南芥的花器官发育受到影响，包括雌蕊、雄蕊、花瓣。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明发现一个新的MADS-box基因LliMADS11，通过克隆该基因，研究该基因在拟南芥热形态建成中的作用，通过表达该基因，可以人工创造早熟材料，这对耐热品质的作物培育将具有非常重要的意义。

附图说明

图1为LlMADS11基因克隆过程电泳图。

图2为LlMADS11的核苷酸序列与氨基酸序列。

图3为LlMADS11含有MADS家族典型的结构域。

图4为LlMADS11基因在转基因株系中的表达分析。

图5为LlMADS11基因在拟南芥中超表达后开花的表型与莲座叶数量统计其中，A：野生型拟南芥，B：OX-LlMADS11过表达株系。

图6为OX-LlMADS11过表达株系中小花形态结构,其中，A：野生型拟南芥小花形态,B：OX-LlMADS11过表达株系小花的雌雄蕊及花瓣出现变异。

图7为OX-LlMADS11过表达株系中叶片表型，其中，A：野生型拟南芥与OX-LlMADS11过表达株系叶片正面，B：叶片背面。

具体实施方式

具体实施方式：

下面实施过程中，若无特别的说明，所用方法均为常规的方法，所用材料和试剂来自商业化渠道。

实施例1：

LlMADS11基因的克隆方法及序列分析

上述LlMADS11基因的克隆方法及序列分析，包括如下步骤。

S1：红榄李RNA的提取及检测以红榄李的叶片为材料，RNA的提取采用北京艾德莱生物科技有限公司多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒(具体方法参照说明书)。

红榄李总RNA质量和完整性检测：取5μL RNA溶液稀释至100μL，用紫外核酸蛋白检测仪测定260、280和230nm的光吸收值并计算A260nm/A280nm比值；同时取5μL RNA样品用1％的琼脂糖胶电泳检测总RNA的完整性。当A260/A280的比值介于1.8-2.0之间时，28S和18S rRNA条带清晰且亮度比值在1.5-2之间时，RNA样品合格后用于下一步实验。

S2：cDNA第一链的合成取1μg提取好的总RNA样品用于合成第一链cDNA，反应体系20μL，引物采用Oligo(dT)18，具体操作参照RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit(Thermo Fermentas)说明书进行。反转录体系如下：

混液放置42℃反应1h；70℃反应5min。反应结束后，将cDNA稀释5倍作为PCR扩增的模板。

S3：引物设计根据红榄李花组织转录组测序得到的相关基因序列及NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上其他植物同源基因的序列比对，依据引物设计的基本原则，用Primer Premier 5.0软件设计包括起始密码子和终止密码子的特异引物用于扩增LlMADS11基因全长序列，扩增所用引物为如下：

LlMADS11-F:ACGGGGGACTGAATTCATGGGTCGAACTCGTGGAAAG

LlMADS11-R:CCGCCTCGAGCCCGGGCTATCTTGGGTCCCCCTTTGCT

S4：目的基因片段的扩增和回收以cDNA作为模板，采用

Max试剂盒(南京诺唯赞)进行PCR扩增反应，反应体系50μL。

50μL PCR反应程序如下：

PCR反应程序为：95℃预变性3min，接着95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，进行35个循环，最后彻底延伸5min。将PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测并回收。

S5：载体连接、转化和阳性克隆鉴定将目的DNA片段和经EcoR I和Xma I双酶切的pBinGlyRed载体骨架通过同源重组的方式连接，采用热激发转化大肠杆菌感受态DH5α，经菌落PCR鉴定的阳性斑，送至广州天一生物技术有限公司测序，测序结果与参考序列进行比对，测序结果证实得到的为LlMADS11基因的全长。LlMADS11基因的具体克隆过程电泳图如图1，其ORF框的核苷酸序列和氨基酸序列见图2所示。

S6：LlMADS11基因的序列分析LlMADS11基因的ORF框为522bp，编码174个氨基酸组成的蛋白，蛋白质分子量为19.45KDa，等电点为9.16。在NCBI数据库中进行保守序列分析，结果显示LlMADS11属于MADS家族，含有MADS家族典型的结构域，如图3所示。

实施例2：

LlMADS11基因在调控植物热形态建成中的应用方法：

1.LlMADS11基因过表达植物株系的获得

将实施例1中所得到的含有目的基因LlMADS11的质粒通过冻融法转入农杆菌感受态GV3101，在含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的平板上进行培养2-3天，用LlMADS11特异的引物进行PCR扩增，目的片段大小一致的，在28℃YEB的培养基中活化菌种，采用蘸花法转化拟南芥Col-0。侵染三次，等到种子成熟收获。在绿色的荧光灯下利用过滤绿光的眼镜挑选红色的种子即为阳性的转基因种子。种植T1代，在T1代取叶片用CTAB法提取基因组DNA，用LlMADS11特异的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，片段大小与参考序列一致的即为阳性转基因植株，结果表明，LlMADS11基因成功转入拟南芥中，收获T1代种子保存。

2.转基因拟南芥后代中LlMADS11基因的表达水平分析和开花时间表型观察

将LlMADS11转基因株系命名为OX-LlMADS11，共获得19株独立株系。将转基因株系和野生型拟南芥同时播种于培养间。抽薹后收集花蕾，每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用冻存管收集，迅速置于液氮中，-80℃保存。

提取RNA并进行反转录，得到的cDNA稀释后进行RT-PCR的实验，验证外源基因LlMADS11的表达量。采用SYBR green法和2^-ΔΔCt法进行荧光定量分析，引物序列(基因和内参序列)如下:

LlMADS11 FP:GAGTGCAAGAACAACAACCA

LlMADS11 RP:TAACGTCTGAGAGCCCAAAA

U6FP：ACATCCGATAAAATTGGAACGA

U6RP：TTTTTTTGGACCATTTCTCGAT

反应体系如下：

qRT-PCR反应程序为：95℃预变性30sec，95℃10sec，60℃30sec，40个循环。如图4所示，结果分析表明OX-LlMADS11过表达转基因株系中目标基因LlMADS11的表达量均显著高于野生型拟南芥。

选取表达量高的OX-LlMADS11-11和OX-LlMADS11-13株系，与野生型拟南芥同时种植于培养间28℃，抽薹时统计转基因株系和野生型拟南芥的莲座叶数量。统计结果显示：OX-LlMADS11过表达株系的莲座叶数量显著少于野生型，表明转基因株系提早抽薹开花，如图5所示。同时，OX-LlMADS11过表达株系的叶片显著变小，叶柄伸长，出现早花生理现象，表明LlMADS11促进拟南芥热形态建成。

由于红榄李LlMADS11基因属于MADS-box家族，该家族基因一般参与花器官的发育，本研究对转基因株系的小花形态进行了观察。通过显微观察发现，OX-LlMADS11株系的雌蕊、雄蕊、花瓣出现了不同程度的变异，如图6所示。同时，还发现转基因株系的叶片形态由狭长向椭圆转变，如图7所示。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

<110> 海南师范大学

<120> 一种从红榄李中分离出的调节基因及其应用方法

<140> 2019111886589

<141> 2019-11-28

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> Lumnitzera littorea

<400> 1

atgggtcgaa ctcgtggaaa gctggcattg aaatttattc aaaacaagag tgcaagaaca 60

acaaccattg cgaaaagaaa aatgaatctc atgaaaaagg ctcatgaaat ttcggtatta 120

tgtggagtag atacatgtgc gattgtttat gatggctctg attcacaatg tcctgagacc 180

tggccaccaa accggaacga ggtcgagctt accatcgatg gatatctgtg tggatccaag 240

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aaggagattg atagtcagat ggcaaaagtg cgattggaga gtctggaggt taaagatttc 360

agcaaagagg aactggaatc catctctttg actctggatc agaagattga aatggcaaag 420

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cagtccatgc ctcctttgca agcaaagggg gacccaagat ag 522

<210> 2

<211> 173

<212> PRT

<213> Lumnitzera littorea

<400> 2

Met Gly Arg Thr Arg Gly Lys Leu Ala Leu Lys Phe Ile Gln Asn Lys

1 5 10 15

Ser Ala Arg Thr Thr Thr Ile Ala Lys Arg Lys Met Asn Leu Met Lys

20 25 30

Lys Ala His Glu Ile Ser Val Leu Cys Gly Val Asp Thr Cys Ala Ile

35 40 45

Val Tyr Asp Gly Ser Asp Ser Gln Cys Pro Glu Thr Trp Pro Pro Asn

50 55 60

Arg Asn Glu Val Glu Leu Thr Ile Asp Gly Tyr Leu Cys Gly Ser Lys

65 70 75 80

Ala Gly Lys Val Arg Val Lys Arg Thr Phe Gly Leu Ser Asp Val Ile

85 90 95

Glu Asn Gln Lys Lys Glu Ile Asp Ser Gln Met Ala Lys Val Arg Leu

100 105 110

Glu Ser Leu Glu Val Lys Asp Phe Ser Lys Glu Glu Leu Glu Ser Ile

115 120 125

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Lys Ile Glu Met Ala Lys Lys Arg Leu Glu

130 135 140

Leu Leu Glu Thr Ser Ser Ser Ser Glu Arg Met Pro Ser Ser Val Trp

145 150 155 160

Gln Ser Met Pro Pro Leu Gln Ala Lys Gly Asp Pro Arg

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgggggact gaattcatgg gtcgaactcg tggaaag 37

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<212> DNA

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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序列表

Claims

1.一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因，其特征在于：所述LliMADS11基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示，其含有MADS家族的结构域。

3.根据权利要求1或2中所述的一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因的应用方法，其特征在于：所述LliMADS11基因与 pBinGlyRed载体相连后得到重组质粒，通过冻融法转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，转基因拟南芥的莲座叶比野生型拟南芥平均少11个叶片，转基因拟南芥的开花时间显著提前。

4.根据权利要求3所述的一种从红榄李中分离出的LliMADS11基因的应用方法，其特征在于：转LliMADS11基因拟南芥的花器官发育受到影响，包括雌蕊、雄蕊、花瓣。