CN111138459B - Fgfr4抑制剂的光学异构体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药化学领域，涉及一类FGFR4抑制剂的光学异构体及其应用，具体地，本发明提供式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，它们的制备方法以及含有这些光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐的药物组合物和它们用于***的用途。本发明的化合物对FGFR4具有好的抑制活性，非常有希望成为疗效更高、副作用更小的肿瘤治疗剂，

Description

FGFR4抑制剂的光学异构体及其应用

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及一类FGFR4抑制剂的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，它们的制备方法以及含有这些化合物的药物组合物和这些化合物或组合物用于***的用途。

背景技术

受体酪氨酸激酶由于其异常表达激活或基因突变，在肿瘤发生发展、侵袭转移、药物抗性等各个环节均发挥关键作用，已成为抗肿瘤药物研发的重要靶点。成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptors,FGFRs)是受体酪氨酸激酶家族的重要成员，主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4四种亚型。其配体是成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors,FGFs)。这些受体通过与FGFs和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan-Sulfate Proteoglycans，HSPGs)形成三元复合物，进而引发一系列的信号传导，参与调节生物体内的多种生理、病理过程。

FGFR家族成员(FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4)之间的氨基酸序列是高度保守的，在配体亲和力及组织分布等方面表现不同。由于基因扩增、突变、融合或配体诱导等原因，FGFR各成员持续激活，诱导肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移，促进血管生成，促进肿瘤的发生发展。FGFRs在多种肿瘤中高表达并异常激活，与肿瘤病人的不良预后密切相关，如非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、子宫内膜癌、***癌、***、结肠癌、食管癌、角质母细胞瘤、骨髓瘤、横纹肌肉瘤等。成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)是成纤维细胞生长因子受体家族中的成员，由FGFR4基因编码，FGFR4基因组结构含有18个外显子。在用FGFR1抑制剂处理过的大鼠体内观测到异位矿化，显示在软组织中有不当的钙磷沉积(Brown,AP等(2005),Toxicol.Pathol,第449-455页)。这表明选择性的抑制FGFR4来避免某些毒性是可取的。研究发现，FGFR4是FGF19(FGFR4的生理配体)唯一显示有特异性的受体，FGF19过表达可引起FGF19-FGFR4通路激活，从而引起某些肉瘤、肾细胞癌、乳癌及肝癌等癌症。对于具有FGF19基因扩增的肿瘤，FGFR4抑制剂治疗是有效的。在用FGFR1抑制剂治疗的大鼠体内观测到异位矿化，其特征是在软组织中有不当的钙磷沉积(Brown,AP等(2005),Toxicol.Pathol,第449-455页)。这表明选择性的抑制FGFR4，而不抑制FGFR的其它亚型例如FGFR1可避免药物的某些毒副作用。目前，公开了一系列FGFR4抑制剂，包括WO2015/108992、WO2015/059668、WO2015061572等中公开的化合物。但仍需开发具有更好药效，毒性更小，选择性更高的化合物。

此外，大量文献数据表明，手性药物的光学异构体具有不同的药效学、药代动力学和毒理学性质。而本申请的发明人前期通过一系列药理研究表明，本发明的FGFR4抑制剂具有良好的成药性，因此，合成其光学异构体，并对它们进行生物活性、毒性和副作用的研究，对于该类化合物的成药性研究具有重要的指导意义，值得进行深入的开发。

发明内容

本发明的一个目的是提供式I或式II所示的具有FGFR4抑制活性的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，

本发明的另一个目的是提供制备本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐的方法。

本发明的再一个目的是提供包含本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐和药学可接受的载体的组合物，以及包含本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐和另一种或多种FGFR4抑制剂的组合物。

本发明的还一个目的是提供本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐***的方法，以及本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐在制备用于***的药物中的应用。

针对上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐：

在一些实施方案中，本发明的式I或II的化合物为基本上纯的异构体形式，异构体纯度为至少60％EE。在一个具体的实施方案中，本发明的式I或II的化合物的异构体纯度为至少90％EE。在另一个具体的实施方案中，本发明的式I或II的化合物的异构体纯度为至少98％EE。在一个优选的实施方案中，本发明的式I或II的化合物的异构体纯度为至少99％EE。异构体过量值提供的是主要异构体的百分量超过与其同时存在的次要异构体的百分量的定量测量，可容易地通过本领域所建立的和公知的适当方法进行测量，例如手性高压液相色谱法(HPLC)、手性气相色谱法(GC)、使用手性位移试剂的核磁共振(NMR)等。

在一些优选的实施方案中，本发明提供式I或式II的化合物的药学上可接受的盐，其中所述盐为所述化合物与酸形成的药学上可接受的盐，所述的酸包括但不限于磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、柠檬酸、马来酸、羟基马来酸、丙酸、乙醇酸、硬脂酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、醋酸、三氟醋酸、谷氨酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸、双羟萘酸、苯甲酸、苯乙酸、谷氨酸、水杨酸、草酸、反丁烯二酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、羟基乙磺酸等。

另一方面，本发明提供本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐的制备方法，包括：

(1)、式i化合物与式ii化合物或其盐在碱性条件下反应生成式iii的化合物；

(2)、式iii化合物在常规反应条件下生成式iv化合物；

(3)、式iv化合物与式v化合物通过钯介导的耦合反应得到式vi化合物；

(4)、将式vi化合物上的硝基经还原反应还原为氨基，得到式vii化合物；

(5)、式vii化合物与式viii的化合物通过酰胺偶联反应得到式viiii的化合物；

其中，虚线

表示为

或

LG₁、LG₂代表离去基团，可以相同也可以不同，优选为卤素或磺酰氧基，更优选为Cl、Br、I；

M可以为-B(OR₁)₂、-Sn(烷基)或者-Zn-卤素-，其中R₁为H或烷基，优选为甲基；

X为卤素，优选为溴。

另一方面，本发明提供本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐的制备方法，包括：

第三方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，还包含选自下列组成的一种或多种：FGFR抑制剂、FGFR4抑制剂、PI3K抑制剂、酪氨酸蛋白酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGFR抑制剂、Bcr-Abl抑制剂、c-kit抑制剂、c-Met抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂、VEGF抗体、EGF抗体、HIV蛋白激酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂等。

可以将本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。

根据本发明，在一些实施方案中，本发明提供式A的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，

其中所述式A的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐富含式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的式A的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有基本上为纯的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在一个具体的实施方案中，本发明的式A的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有大于60％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在另一个具体的实施方案中，本发明的式A的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有大于90％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在另一个具体的实施方案中，本发明的式A的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有大于98％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在一个优选的实施方案中，本发明的式A的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有大于99％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明的式A的化合物为基本上纯的异构体形式，其基本上不含其它异构体。例如，在一个具体实施方案中，本发明的式A的化合物基本上不含式II的异构体。在另一个具体实施方案中，本发明的式A的化合物为纯的异构体形式。

第四方面，本发明提供本发明式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，式A所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐或包含它们的药物组合物在制备***的药物中的用途，优选地，用于治疗和/或预防由FGFR-4或FGF19介导的疾病或病症的方法以及在制备治疗和/或预防由FGFR-4或FGF19介导的疾病或病症的药物中的应用，其特征在于个体中FGFR-4或FGF19过度表达、FGFR4或FGF19扩增为特征。在一个优选的实施方案中，一种具有式I、式II或式III所示化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药或本发明的药物组合物治疗和/或预防肿瘤的方法和在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用，其中所述肿瘤由FGFR4介导。在一个优选的实施方案中，一种具有式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，式A所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐或包含它们的药物组合物治疗和/或预防肿瘤的方法和在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用，其中所述肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌和肉瘤。在一个具体的实施方案中，所述肝癌为肝细胞癌。FGF19水平的降低可促进胆汁酸合成，因此降低FGF19水平的化合物可用于治疗高脂血症。在一个具体的实施方案中，本发明提供式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，式A所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐或包含它们的药物组合物治疗和/或预防高脂血症的方法和在制备治疗和/或预防高脂血症的药物中的应用。

在一些实施方案中，本发明涉及一种***的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，式A所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐或包含它们的药物组合物，其中所述的肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌或者肉瘤等。

术语说明

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

本发明“光学异构体”是指分子结构完全相同，物理化学性质相近，但旋光性不同的物质。在光学活性化合物的描述中，前缀D和L或R和S用于表示与分子的手性中心有关的绝对构型。前缀(+)和(-)或d和l用于指定化合物引起的平面偏振光的旋转方向。用(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们能使平面偏振光的平面旋转。对于给定的化学结构，不同的光学活性化合物被称为立体异构体，除了彼此互为镜像之外，它们是相同的。一个具体的立体异构体也可称作对映异构体，这些异构体的混合物被称为对映异构体混合物或外消旋混合物。

在本发明中，当特定异构体在混合物的组成中超过50％时，外消旋混合物“富含”该特定异构体。“基本上不含”是指当使用本领域技术人员常规使用的传统分析方法确定时，该化合物包括少于大约10％不需要的异构体，例如不需要的异构体的量可以少于10％，例如，9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或甚至更少。含有大约95％或更多的所需异构体的富含异构体的化合物在此被称为“基本上纯的”异构体。含有大约99％或更多的所需异构体的富含异构体的化合物在此被称为“纯的”立体异构体。任何富含异构体的化合物的纯度可以使用传统的分析方法来确认。

本发明“药物组合物”是指包含任何一种本文所述的化合物，包括对应的异构体、前药、溶剂化物、药学上可接受的盐或其化学的保护形式，和一种或多种药学上可接受载体的混合物。药用组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。所述组合物通常用于制备治疗和/或预防由一种或多种激酶介导的疾病的药物。

本发明“药学上可接受的载体”是指对有机体不引起明显刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体，包含所有的溶剂、稀释剂或其它赋形剂、分散剂、表面活性剂等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规载体介质与本发明化合物不相容。可以作为药学上可接受的载体的一些实例包括，但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、以及纤维素和乙酸纤维素；麦芽、明胶等。

本发明“赋形剂”指加入到药用组合物中以进一步促进给予化合物的惰性物质。赋形剂可以包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇。

本发明“***”是指可以使肿瘤得到改善，抑制癌症的生长、发展和/或转移，或降低患肿瘤的风险，主要向所需要的人或动物给予治疗和/或预防有效量的本发明的化合物以抑制、减慢或逆转受治疗者中肿瘤的生长、发展或扩散，使肿瘤得到改善，或降低患病风险，所述的肿瘤包括癌症，例如包括膀胱癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌)、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、***、甲状腺癌、***癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系的造血肿瘤，例如包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；间充质细胞来源的肿瘤，例如包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤；髓系的造血肿瘤，例如包括急慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞白血病；中枢和周围神经***肿瘤，例如包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；和其它肿瘤，例如包括黑素瘤、***瘤、畸胎癌、骨肉瘤、色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。

本发明“药学上可接受的盐”是指本发明所述的化合物与某些酸形成的药学上可接受的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，所述的酸可选自无机酸例如磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸，有机酸例如柠檬酸、马来酸、羟基马来酸、丙酸、乙醇酸、硬脂酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、醋酸、三氟醋酸、谷氨酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸、双羟萘酸、苯甲酸、苯乙酸、谷氨酸、水杨酸、草酸、反丁烯二酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、羟基乙磺酸等。

本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子，例如氢的同位素包括氕、氚和氘，碳的同位素包括¹²C、¹³C和¹⁴C，氧的同位素包括¹⁶O和¹⁸O等。

具体实施方式

下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。

实施例1：N-(2-((1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)-5-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-乙基-2-氧代-1,2-二氢-1,6-二氮杂萘-7-基)-4-甲氧基苯基)丁-2-炔酰胺的制备

步骤1：(1R,4R)-5-(4-溴-5-甲氧基-2-硝基苯基)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷的制备

在5000ml三颈瓶中加入1-溴-4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯(176g,0.70mol)、(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐(1:1)(105g,0.77mol)，碳酸钾(291.9g,2.11mol)，3000ml N,N-二甲基甲酰胺，100℃搅拌两小时。TLC(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)显示反应完全。水洗，乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得黄色固体215.3g，收率：92.83％。ESI-MS m/z:329.06[M+H]⁺.

步骤2：(1R,4R)-5-(5-甲氧基-2-硝基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷的制备

将步骤1制得的(1R,4R)-5-(4-溴-5-甲氧基-2-硝基苯基)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷(71.45g，0.22mol)，联硼酸频那醇酯(166.0g，0.65mol)，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(15.9g，0.022mol)，醋酸钾(64.0g，0.65mol)依次加入1071mL1,4-二氧六环中，氩气置换后，100℃反应过夜。将反应液过滤，滤液旋干，柱层析得黄色固体59.1g，收率：72.2％。ESI-MS m/z:377.22[M+H]⁺.

步骤3：7-(4-((1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-3-(2,6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-乙基-1,6-萘啶-2(1H)-酮的制备

将2-氯-6-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-8-乙基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(170g，0.41mol)溶于3400mL 1,4-二氧六环和850mL水中，加入(1R,4R)-5-(5-甲氧基-2-硝基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷(170.6g，0.45mol)，四三苯基磷钯(47.7g，0.04mol)，碳酸钠(143.8g，1.36mol)，氩气保护，100℃加热搅拌2小时后，反应完成。冷却放置过夜，次日过滤得到黄色固体，溶于二氯甲烷后，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后浓缩，加入乙酸乙酯打浆后过滤，得黄色固体186.2g，收率72.1％。ESI-MS m/z:627.26[M+H]⁺.

步骤4：7-(5-氨基-4-((1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)-2-甲氧基苯基)-3-(2,6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-乙基-1,6-萘啶-2(1H)-酮的制备

将7-(4-((1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-3-(2,6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-乙基-1,6-萘啶-2(1H)-酮(124.2g，0.198mol)溶于2484mL乙醇和621mL水中，加入铁粉(111.1g，1.98mol)和氯化铵(105.1g，1.98mol)，100℃下回流反应2h。反应完成后，放置室温冷却，向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液中和，然后加入2L二氯甲烷搅拌10分钟，过滤后取有机层无水硫酸钠干燥，浓缩后加入乙酸乙酯打浆过滤得黄色固体117g，收率：99％。ESI-MS m/z:597.20[M+H]⁺.

步骤5：2-丁炔酰氯的制备

将2-丁炔酸(100g，1.20mol)加入3000mL三颈瓶中，加入1.98L二氯甲烷，30mLN,N-二甲基甲酰胺，-5℃搅拌10min后下滴加草酰氯(151.2g，1.20mol)，继续-5℃搅拌搅拌20min后，移至室温反应1.5h后备用。

步骤6：N-(2-((1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)-5-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-乙基-2-氧代-1,2-二氢-1,6-二氮杂萘-7-基)-4-甲氧基苯基)丁-2-炔酰胺的制备

将7-(5-氨基-4-((1R，4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)-2-甲氧基苯基)-3-(2,6-二氯-3-，5-二甲氧基苯基)-1-乙基-1,6-萘啶-2(1H)-酮(94.5g，0.158mol)溶于1600mL二氯甲烷，加入二异丙基乙基胺(61.5g，0.476mol)，-5℃搅拌下滴入2-炔基丁酰氯400mL(0.6mol/L，0.238mol)，搅拌15分钟，加入1L饱和碳酸氢钠水溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥旋干得深黄色固体125g，加入750mL四氢呋喃打浆后过滤，用少量乙酸乙酯洗滤饼，得黄色固体84.9g，收率80.9％。ESI-MS m/z:663.33[M+H]⁺.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ1.31(t,3H),1.88(s,2H),2.02(s,3H),3.05(d,1H),3.66(d,1H),3.80(d,1H),3.93(d,1H),3.95(s,3H),3.98(s,6H),4.30(q,2H),4.62(s,1H),4.66(s,1H),6.43(s,1H),7.01(s,1H),7.75(s,1H),7.98(s,1H),8.05(s,1H),8.91(s,1H),9.85(s,1H).

实施例2：N-(2-((1S,4S)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)-5-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-乙基-2-氧代-1,2-二氢-1,6-二氮杂萘-7-基)-4-甲氧基苯基)丁-2-炔酰胺的制备

制备方法同实施例1的制备方法，不同的是将实施例1步骤1的(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐替换成(1S,4S)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐，制得标题化合物。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ1.30(t,3H),1.87(s,2H),2.02(s,3H),3.05(d,1H),3.65(d,1H),3.80(d,1H),3.92(d,1H),3.95(s,3H),3.97(s,6H),4.29(q,2H),4.61(s,1H),4.65(s,1H),6.42(s,1H),7.01(s,1H),7.74(s,1H),7.97(s,1H),8.04(s,1H),8.91(s,1H),9.85(s,1H).ESI-MS m/z:663.33[M+H]⁺.

实施例3：N-(2-(2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)-5-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-乙基-2-氧代-1,2-二氢-1,6-二氮杂萘-7-基)-4-甲氧基苯基)丁-2-炔酰胺的制备

制备方法同实施例1的制备方法，不同的是将实施例1步骤1的(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐替换成2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐，制得标题化合物。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ1.30(t,3H),1.87(s,2H),2.02(s,3H),3.05(d,1H),3.65(d,1H),3.80(d,1H),3.91(d,1H),3.95(s,3H),3.97(s,6H),4.30(q,2H),4.61(s,1H),4.65(s,1H),6.42(s,1H),7.01(s,1H),7.74(s,1H),7.97(s,1H),8.04(s,1H),8.91(s,1H),9.86(s,1H).ESI-MS m/z:663.2[M+H]⁺.

比较例1和比较例2

参照专利申请WO2015/4108992中关于CompoundNumbers 19和27描述的方法制备比较例1(化合物A)和比较例2(化合物B)的化合物，并通过氢谱和质谱鉴定。

比较例3

化合物名称为N-((3S,4S)-3-((6-(2,6-dichloro-3,5-dimethoxyphenyl)quinazolin-2-yl)amino)tetrahydro-2H-pyran-4-yl)acrylamide(BLU-554)，参照WO2015061572中Compound 40化合物的合成方法制备，并通过氢谱和质谱鉴定。

使用以下实验例1、2和3的方法测试了化合物A、化合物B和化合物C对FGFR4激酶和FGFR1激酶的抑制活性，对人肝癌细胞株Hep3B细胞和HUH-7细胞的抑制活性，以及在小鼠中的药代动力学特征。实验结果显示，化合物A、化合物B、化合物C对FGFR4激酶和FGFR1激酶的选择性明显低于本发明的化合物，对人肝癌细胞株Hep3B细胞和HUH-7细胞的抑制活性明显弱于本发明的化合物，以及半衰期和AUC也差于本发明的化合物。

实验例1体外激酶活性评价

1实验材料

FGFR1，购自Carna，商品目录号08-133；

FGFR4，购自Carna，商品目录号08-136；

P22 peptide，购自GL Biochem，商品目录号112393；

Staurosporine9，购自Sigma，商品目录号S4400-1MG；

2实验方法

1)准备1×激酶基础缓冲液和终止缓冲液

A.1×激酶基础缓冲液：20mM HEPES、pH 7.5，0.01％Triton X-100，10mM MgCl₂，2mM DTT。

B.终止缓冲液：100mM HEPES、pH7.5，0.015％Brij-35，0.2％Coating Reagent#3，50mM EDTA。

2)准备化合物

A.配制本发明实施例的化合物以及参照化合物A、化合物B、化合物C的10mM储备液。

B.准备50×化合物溶液：以上本发明实施例的化合物和参照化合物从500μM开始，用DMSO依次3倍稀释，共10个浓度。

C.在同一块96孔板的2个空的孔中各加入100μL 100％DMSO作为无化合物和无激酶对照。标记此96孔板为来源板。

D.准备中间板：从来源板中转移10μL化合物到新的96孔板中，作为中间板；在中间板每孔中加入90μL 1×激酶缓冲液；振荡混匀10min。

3)准备实验板：从96孔中间板中，每孔转移5μL到384孔板中，2复孔。

4)激酶反应

A.准备2.5×激酶溶液：将激酶分别加入到1×基础缓冲液中。

B.准备2.5×多肽溶液：将FAM标记的多肽和ATP加到1×基础缓冲液中。

C.实验板中已含5μL化合物(10％DMSO)。

D.转移2.5×激酶溶液到实验板中：加10μL 2.5×激酶溶液到384孔实验板的各孔中。

E.室温孵育10min。

F.转移2.5×多肽溶液到实验板中：加10μL 2.5×多肽溶液到384孔实验板的各孔中。

G.激酶反应和终止：在28℃条件下孵育一定的时间；加入25μL终止缓冲液终止反应。

5)Caliper仪器读数：在Caliper仪器上读取数据。

6)拟合曲线

A.从Caliper程序中获得转化值数据。

B.将转化值转换成抑制率。

抑制率％＝(最大转化值–实际转化值)/(最大转化值–最小转化值)×100，其中“最大转化值”代表有激酶无化合物的DMSO溶媒对照，“最小转化值”代表无激酶无化合物对照。

C.采用Xlfit excel add-in 4.3.1数据处理软件计算IC₅₀值。计算公式：Y＝Bottom+(Top–Bottom)/(1+LogIC₅₀/X)×HillSlope)，结果见表1：

表1

	FGFR4激酶IC<sub>50</sub>(nM)	FGFR1激酶IC<sub>50</sub>(nM)
			化合物A	34	200
化合物B	85	-
			化合物C	13	653
实施例1	5.4	3069
			实施例2	4.6	2226

“-”表示未测

实验结果表明，本发明的化合物对FGFR4激酶具有强的抑制活性，对FGFR1激酶的抑制活性低，对FGFR4激酶和FGFR1激酶的选择性明显优于参照化合物。因此，本发明的化合物是选择性针对FGFR4的有活性优势的激酶抑制剂，可用于治疗与FGFR4激酶相关的疾病，并可能降低因对FGFR1激酶的抑制而导致的副作用。

实验例2细胞增殖抑制实验

1实验材料

1.1化合物：使用本发明实施例的化合物、化合物A、化合物C进行该实验。

1.2细胞：Hep3B细胞、HUH-7细胞，由上海药明康德新药开发有限公司提供。

1.3试剂：FBS、DMEM，培养基购于GIBCO公司；

CellTiter Glo，购于Promega公司。

1.4仪器Tecan D300e快速移液器；Biotek荧光检测仪

2实验方法

所有化合物溶于DMSO后储存于-20℃冰箱中。

Day-1：按3X10³个细胞/孔的密度将细胞加入96孔内，每孔100μl；

空白对照加入每孔100μl的培养基；其余不测试的边缘孔加入100μl的PBS；

Day 0：设置化合物加样程序，并使用Tecan D300e自动加样；

测试化合物的起始浓度为10μM，3倍稀释，9浓度，复孔；

阳性参照Staurosporine起始浓度为1μM，3倍稀释，9个浓度，复孔；

Day 3:将实验96孔板室温平衡30分钟；

在加入CTG前观察化合物溶解性和细胞状态；

每孔加入50μl CellTiter Glo试剂，10分钟后用BioTec(Luminescence)检测信号。

3数据分析：

XL-fit软件分析数据(供应商：ID Business Solution Ltd.,版本：XL fit 5.0)

计算公式：R(％)＝{1-RLU_化合物-RLU_空白}/{RLU_对照-RLU_空白}×100％，结果见表2：

表2

化合物编号	Hep3B细胞Rel_IC<sub>50</sub>(nM)	HUH-7细胞Rel_EC<sub>50</sub>(nM)
			化合物A	-	230
化合物C	40	140
			实施例1	36	51
实施例2	13	-

“-”表示未测

实验结果显示，本发明的化合物对FGFR4 DNA扩增的人肝癌细胞株HePB和HuH-7细胞的增殖具有非常好的抑制活性，部分化合物的活性远优于参照化合物，是有效的FGFR4选择性抑制剂。

实验例3药物代谢实验

1实验材料

1.1化合物

使用本发明实施例的化合物以及参照化合物A、化合物B和化合物C进行该实验。口服药物配方为10％乙醇，10％solutol，80％生理盐水溶解，制成0.5mg/ml澄清溶液，静脉药物配方为2％乙醇，2％solutol，96％生理盐水，制成0.1mg/ml澄清溶液。

1.2动物

雄性BALB/c小鼠，每组各3只，体重18-22，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。受试小鼠实验前给予2～4天的环境适应期，给药前禁食8-12h，给药2h后给水，4h后给食。

1.3试剂

甲醇(色谱纯)：Spectrum公司生产；乙腈(色谱纯)：Spectrum公司生产；其余试剂均为市售分析纯。

1.4仪器

美国AB公司API 4500型三重四级杆液质联用仪，配有电喷雾离子源(ESI)，LC-30AD双泵；SIL-30AC自动进样器；CTO-30AC柱温箱；DGU-20A3R脱气机；Analyst QSA01.01色谱工作站；Milli-Q超纯水器(Millipore Inc)；Qilinbeier Vortex-5振荡器；HITACHICF16RⅩⅡ台式高速冷冻离心机。

2实验方法

1)小鼠禁食但可自由饮水12小时后，采取0时刻空白血浆；

2)取步骤1)中的小鼠3只，灌胃(intragastric administration,I.G.)给予本发明实施例的化合物以及参照化合物10mg/kg；静脉(I.V.)给予本发明实施例的化合物以及参照化合物1mg/kg；

3)于灌胃后5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，10h，24h，从眼底静脉丛连续取血置于分布有肝素的EP管中，8000rpm/min离心5min后取上层血浆，-20℃冻存，待LC-MS/MS分析；

4)根据步骤3)所得的血药浓度-时间数据，采用WinNonlin软件求算药代动力学参数，结果见表3。

表3

“-”表示未测

实验表明，小鼠对本发明化合物的口服吸收暴露量明显高于参照化合物，半衰期长于参照化合物，可保证化合物在小鼠体内存在着更长时间的有效血药浓度。

实施例4：hERG

1：溶液及化合物的配制：

细胞外液(mM)：N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid(HEPES)10、NaCl 145、KCl 4、CaCl22、MgCl21、Glucose 10，用1N氢氧化钠调节pH至7.4；渗透压调至290-300mOsm；过滤后4℃保存。

电极内液(in mM)：KCl 120、KOH 31.25、CaCl25.374、MgCl21.75、Ethyleneglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid(EGTA)10、HEPES 10、Na2-ATP 4，用1N氢氧化钾调节pH至7.2；渗透压调至280-290mOsm；过滤后-20℃保存。

2：化合物的配制：阳性对照药盐酸阿米替林和SHC0192331先溶于100％DMSO(Sigma-Aldrich,D2650)，分别配置成30和10mM的储备溶液。实验前用DMSO将上述储备溶液稀释为各个试验浓度1000倍或者333倍的溶液，然后再用细胞外液稀释1000倍或者333倍到所需浓度。细胞外液中DMSO最终浓度为0.10％或者0.3％。

3：细胞株

稳定细胞株CHO-hERG购自AVIVA公司。在此细胞株上记录hERG电流。为了质量控制，最小的封接电阻不小于500MΩ，并且hERG电流不小于0.4nA。

4：电生理试验

采用全细胞膜片钳技术记录hERG电流。取细胞悬液加于35mm的培养皿中，置于倒置显微镜载物台上。待细胞贴壁后，用细胞外液灌流，流速为1–2mL/min。玻璃微电极由微电极拉制仪两步拉制，其入水电阻值为2-5MΩ。建立全细胞记录后，保持钳制电位为-80mV。给予电压刺激时去极化至+60mV，然后复极化至-50mV引出hERG尾电流。所有记录均在电流稳定后进行。胞外灌流给药从低浓度开始，每个浓度5-10min至电流稳定，再给下一个浓度。

5：数据采集与分析

通过Digidata 1440(Molecular Devices)和pCLAMP软件(10.2版，MolecularDevices)A/D–D/A数模转换，进行刺激发放及信号采集；膜片钳放大器(Multiclamp 700B，Molecular Devices)放大信号。

使用Clampfit(10.2版，Molecular Devices)，EXCEL(2013版，Microsoft)和GraphPad Prism进行进一步数据分析和曲线拟合。数据均以均值±标准差表示。

在数据处理中，判断对hERG的阻断效应时，将尾电流的峰值和其基线进行校正。用尾流的抑制率表示不同浓度下各化合物的作用。IC₅₀数值由Hill方程进行拟合所得：

y：I/Icontrol；max：为100％；min：为0％；[drug]：测试物浓度；nH：Hill斜率；IC₅₀：测试物的最大半数抑制浓度。

表4

化合物编号	hERG(nM)
		化合物C	3.85
实施例1	>30
		实施例2	>30

实验结果表明，本发明的实施例1、实施例2对hERG无明显的抑制作用，风险小于化合物C。

实施例5：小鼠肝分布

1实验材料

1.1化合物

使用本发明实施例的化合物以及参照化合物C进行该实验。口服药物配方为10％乙醇，20％PG，70％纯水溶解，实施例化合物制成3,10,20mg/ml澄清溶液，化合物C制成3mg/ml澄清溶液。

1.2动物

雄性BALB/c小鼠，每组各6只，体重18-22，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。受试小鼠实验前给予2～4天的环境适应期。

1.3试剂

甲醇(色谱纯)：Spectrum公司生产；乙腈(色谱纯)：Spectrum公司生产；其余试剂均为市售分析纯。

1.4仪器

美国AB公司API 4500型三重四级杆液质联用仪，配有电喷雾离子源(ESI)，LC-30AD双泵；SIL-30AC自动进样器；CTO-30AC柱温箱；DGU-20A3R脱气机；Analyst QSA01.01色谱工作站；Milli-Q超纯水器(Millipore Inc)；Qilinbeier Vortex-5振荡器；HITACHICF16RⅩⅡ台式高速冷冻离心机。

2实验方法

1)每组的小鼠6只，灌胃(intragastric administration,I.G.)给予本发明实施例的化合物以30，100，200mg/kg及参照化合物30mg/kg，一天两次，连续给予7天。

2)于第7天灌胃后2h，从眼底静脉丛连续取血置于分布有肝素的EP管中，8000rpm/min离心5min后取上层血浆，-20℃冻存，待LC-MS/MS分析；

3)于第7天灌胃后2h，解剖小鼠，取肝脏，称重匀浆，-20℃冻存，待LC-MS/MS分析。

4)LC-MS/MS分析分析血液和肝脏内的化合物浓度。

结果见表5：

表5小鼠肝分布数据

“-”表示未测

实验结果表明，在剂量为30mg/kg时，实施例1的化合物在靶组织肝脏中的浓度最高，实施例1、实施例2的化合物在靶组织肝脏中的浓度均优于化合物C。此外，在剂量为30mg/kg、100mg/kg、200mg/kg这3个剂量中，实施例1的化合物的肝血比均高于实施例2的化合物。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims (4)

1.一种式I或式II所示的光学异构体或其药学上可接受的盐的制备方法，其包括：

(1)、式i化合物与式ii化合物或其盐在碱性条件下反应生成式iii的化合物；

(2)、式iii化合物在常规反应条件下生成式iv化合物；

(3)、式iv化合物与式v化合物通过钯介导的耦合反应得到式vi化合物；

(4)、将式vi化合物上的硝基经还原反应还原为氨基，得到式vii化合物；

(5)、式vii化合物与式viii的化合物通过酰胺偶联反应得到式viiii的化合物；

其中，虚线

表示为

LG₁、LG₂代表离去基团；

M为-B(OR₁)₂、-Sn(烷基)或者-Zn-卤素-，其中R₁为H或甲基；

X为卤素。

2.根据权利要求1所述的式I或式II所示的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中所述的离去基团可以相同也可以不同，各自独立为卤素或磺酰氧基。

3.根据权利要求1所述的式I或式II所示的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中所述的离去基团可以相同也可以不同，各自独立为Cl、Br、I。

4.根据权利要求1所述的式I或式II所示的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中X为溴。