CN111138444A

CN111138444A - 一组埃博霉素b葡萄糖苷类化合物及其酶法制备与应用

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Publication number: CN111138444A
Application number: CN202010018493.7A
Authority: CN
Inventors: 李越中; 张鹏; 吴长生; 汤亚杰
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2040-01-08
Also published as: CN111138444B

Abstract

本发明公开了一组埃博霉素B葡萄糖苷类化合物，是埃博霉素B 7‑O‑β‑D葡萄糖苷、埃博霉素B 7‑O‑β‑D‑glucosyl‑(1→3)‑β‑D葡萄糖苷、埃博霉素B 7‑O‑β‑D‑glucosyl‑(1→2)‑β‑D葡萄糖苷或埃博霉素B 7‑O‑β‑D‑glucosyl‑(1→2)‑β‑D‑glucosyl‑(1→4)‑β‑D葡萄糖苷。该化合物是由埃博霉素B和UDP‑O‑β‑D‑glucose与糖基转移酶BsGT‑1的I62A突变蛋白介导糖基化反应获得。本发明还公开了所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中的应用。实验证实本发明的化合物埃博霉素B 7‑O‑β‑D葡萄糖苷在浓度为9.84μM时，对人肝癌细胞HepG2有半抑制作用；并且对正常肝细胞HL7702的毒性相比于埃博霉素B原药下降了9430倍。有望增益埃博霉素在抗肿瘤活性中的应用价值，提升社会效益和经济价值。

Description

一组埃博霉素B葡萄糖苷类化合物及其酶法制备与应用

技术领域

本发明涉及一组埃博霉素糖苷化合物及其制备与应用，尤其涉及埃博霉素B葡萄糖一糖，二糖，三糖苷化合物及其酶法制备的方法，以及该埃博霉素B葡萄糖苷化合物在制备治疗和预防肝癌的药物中的应用。属于微生物技术及其制品与应用技术领域。

背景技术

纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)属于粘球菌目，堆囊菌亚目，堆囊菌科，堆囊菌属，是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌。能够产生丰富的次级代谢产物。

埃博霉素(Epothilone)是一类16元大环内酯类化合物，目前仅来源于纤维堆囊菌。在作用机制上，尽管埃博霉素与紫杉醇都是通过聚合微管蛋白而抑制肿瘤生长，但埃博霉素对多重耐药的肿瘤细胞表现出比紫杉醇更好的抑制活性，并且具有大规模发酵生产的潜力，被认为是紫杉醇良好的替代品。该类化合物有两种主产物，分别是埃博霉素A和埃博霉素B，其结构式如下：

Epothilone结构式(R＝H，epothilone A；R＝CH₃，epothilone B)

埃博霉素的化学结构相比于紫杉醇更为简单，其包含一个16元的大内酯环、一个三元氧环、以及一个噻唑环侧链。埃博霉素的类似物结构骨架基本相同，埃博霉素B比A在大环内酯的12位碳上多了一个甲基基团，但对肿瘤细胞的抑制活性是埃博霉素A的4-10倍。2007年，埃博霉素B的类似物伊沙匹隆(Ixabepilone)被FDA批准进行乳腺癌的治疗，目前，除了伊沙匹隆外，已经有多种埃博霉素类似物进入不同的临床评估阶段，例如，帕土匹龙(Patupilone)，埃博霉素D(KOS-862),ZK-EPO以及ABJ879。尽管如此，以上报道的埃博霉素类似物具有较强的神经毒性，血液毒性或是水溶性差等问题，这使得埃博霉素临床应用时受到限制。基于此，对埃博霉素的结构进行合理的改造十分必要，因此研发相关改造的简易、绿色的(生物)化学方法尤为迫切。

由糖基转移酶催化的天然产物糖基化修饰在自然界中广泛存在，所引入的糖基往往对化合物的水溶性、稳定性、以及生物活性方面都有重要的改善作用。对于埃博霉素的糖基化修饰的报道，仅限于2010年发现的Epothiloneoside A以及2014年报道的埃博霉素A7-O-β-D葡萄糖苷(Epothilone A7-O-β-D glucoside)。然而，对于抗肿瘤活性更好的埃博霉素B的糖基化，仅有有机化学合成的galactosylated Epothilone B，或者埃博霉素B3-O-α-D***吠喃糖苷，其他类型糖基化产物尚未见报道。此外，有机化学方法合成EpothiloneB糖基化产物步骤复杂繁琐，副产物多，分离纯化困难，合成成本较高，且还存在有机化学合成方法难度大、合成条件要求高，毒性大、不绿色环保、很难做到选择性保护等缺陷。鉴于此，迫切需要找到更好的对埃博霉素B这一重要的抗肿瘤药物的糖基化修饰替代方法，并能制备出种类更为丰富的埃博霉素B糖基化产物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一组埃博霉素B葡萄糖苷类化合物及其酶法制备的方法，以及该埃博霉素B葡萄糖苷化合物在制备治疗和预防肝癌的药物中的应用。

本发明所述的一组埃博霉素B葡萄糖苷类化合物是埃博霉素B葡萄糖一糖，二糖，三糖苷化合物，其特征在于，所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物是化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D葡萄糖苷；或是化合物2：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→3)-β-D葡萄糖苷；或是化合物3：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D葡萄糖苷；或是化合物4：埃博霉素B7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D-glucosyl-(1→4)-β-D葡萄糖苷；所述化合物结构式及其连接方式和相应名称如下：

其中：所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物优选是化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D葡萄糖苷。

本发明所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物酶法制备的方法是：

以如下比例量，在50mM Tris-HCl,10mM MgCl₂的缓冲液环境下，以终浓度为10mM的埃博霉素B和终浓度为50mM的UDP-O-β-D-glucose与500μg/ml的糖基转移酶BsGT-1的I62A突变蛋白进行体外酶活反应实验，反应混合液在37±1℃孵育12±2小时，然后添加3倍体积量的甲醇终止反应，14000r/min，30min去除蛋白沉淀，对样品旋转蒸干处理，再添加甲醇重悬产物，14000r/min再次离心30min后将产物通过半制备液相进行分离纯化；色谱柱尺寸规格选YMC-Pack Pro C18,250mm×10.0mm,5μm；流动相体系：以35:65乙腈水***洗脱，埃博霉素B葡萄糖苷的出峰时间：化合物1：13.2min；化合物2：10.6min；化合物3：7.1min；化合物4：5.2min；分离后的四种化合物分别蒸干，用CD₃OD溶解，再使用UHPLC-ESI-Q-TOF高分辨质谱和核磁共振分别进行鉴定；

其中，所述的糖基转移酶BsGT-1的I62A突变蛋白是以pET28a-BsGT-1重组质粒为模板，设计突变引物F-I62A：CTTGAATgccGATCCTAAGCAAATCAGGGAGATG；R-I62A：TAGGATCggcATTCAAGGATGTATGATAGATCAATGC，通过一次PCR产生线性重组突变质粒片段，再通过重组反应环化，形成I62A突变的pET28a-BsGT-1重组质粒，经重组质粒的转化和蛋白的诱导表达获得。

上述的糖基转移酶BsGT-1(CUB50191)，其蛋白序列已经公布，其是通过提取B.subtilisJRS11基因组，设计引物(F-BamHI：CGCGGATCCATGAAAAAGTACCATATTTCGAT；R-SalI：ACGCGTCGACTTACTGCGGGACAGCGGATTTTT)，经过双酶切连接形成pET28a-BsGT-1重组质粒，由重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达获得。

上述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物酶法制备的方法中：所述埃博霉素B和UDP-O-β-D-glucose混合的摩尔比优选为1:5，其与糖基转移酶BsGT-1的I62A突变蛋白介导糖基化反应的反应混合液优选在37℃孵育12小时。

本发明所述的埃博霉素B葡萄糖苷化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中的应用。

实验证实：本发明所述的埃博霉素B葡萄糖苷化合物均对肝癌具有预防和治疗作用。其中，本发明所述的埃博霉素B葡萄糖苷化合物1在浓度为9.84μM时，对人肝癌细胞HepG2有半抑制作用；并且对正常肝细胞HL7702的毒性相比于埃博霉素B原药下降了9430倍。进一步的比较实验显示：本发明所述的化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D葡萄糖苷，对于先前报道的埃博霉素A7-O-β-D葡萄糖苷(Epothilone A7-O-β-D glucoside)对人肝癌细胞HepG2的抑制作用更强，提示本发明的化合物1在用于制备相关的药物制剂的优越性。所以，优选化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D葡萄糖苷作为针对肝癌细胞的低毒高效抑制剂的候选药物，或者作为有效成分用于制备预防和治疗肝癌相关的药物制剂。

本发明公开了一组埃博霉素B葡萄糖苷类化合物及其酶法制备的方法，制备过程中通过温和的酶法合成，不需要有机合成中繁琐的化学反应，一步实现埃博霉素葡萄糖苷的转化；所有糖基化反应过程均在体外进行，避开了体内合成途径中可能存在负调控体系；体外糖基化修饰参与反应的化合物少，有利于原料的重新利用以及新产物的分离纯化；糖基化反应的转化效率高；酶作为一种温和的催化剂，具备很强的可塑性，在酶中引入突变，在某种程度上改变了蛋白原有的活性，使酶有了新特性和新功能，有利于产物的多样性，在本发明中，产物埃博霉素B糖苷有不同的糖苷连接形式，突变的酶具备了一定的选择性，而这种选择性在化学合成中很难做到，并且形成的不同的埃博霉素葡萄糖苷衍生物也增加了埃博霉素糖苷家族的多样性。随着癌症和耐药细菌的日益肆虐，临床上对作用靶点新颖、抑菌活性高的新型抗癌药物的需求也日益迫切。本发明所获得的新颖埃博霉素B葡萄糖苷有望增益其在抗肿瘤活性中的应用价值，从而产生良好的社会效益和经济价值。

附图说明

图1：糖基转移酶BsGT-1对埃博霉素B糖基化修饰反应液的HPLC分析色谱图

其中，四种埃博霉素B葡萄糖苷的出峰时间：化合物1：13.2min；化合物2：10.6min；化合物3：7.1min；化合物4：5.2min；埃博霉素B标准品(Epothilone B)出峰时间，28.4min。

图2：化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D葡萄糖苷的高分辨质谱图，准分子离子峰[M+H]⁺为m/z 670.3131。

图3：化合物2：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→3)-β-D葡萄糖苷的高分辨质谱图，准分子离子峰[M+H]⁺为m/z 832.5618。

图4：化合物3：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D葡萄糖苷的高分辨质谱图，准分子离子峰[M+H]⁺为m/z 832.5627。

图5：化合物4：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D-glucosyl-(1→4)-β-D葡萄糖苷的高分辨质谱图，准分子离子峰[M+H]⁺为m/z 994.4121。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

本发明使用的试剂、质粒、菌株、细胞、或实验器材均为市售产品。

实施例1埃博霉素糖基转移酶BsGT-1重组质粒的获取，构建I62A突变的重组质粒，表达I62A突变蛋白，以及埃博霉素B葡萄糖苷的制备

发明人实验筛选确定了能够高效糖基化埃博霉素B的糖基转移酶BsGT-1(CUB50191)，其蛋白序列已经公布。获取埃博霉素糖基转移酶BsGT-1重组质粒并表达获得糖基转移酶BsGT-1的方法是：

通过提取B.subtilis JRS11基因组DNA获取编码糖基转移酶BsGT-1的基因片段，设计双酶切引物(F-BamHI：CGCGGATCCATGAAAAAGTACCATATTTCGAT；R-SalI：ACGCGTCGACTTACTGCGGGACAGCGGATTTTT)，采用

Max Super-Fidelity DNAPolymerase高保真聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)，反应体系：B.subtilis JRS11基因组DNA0.5μl；2×Phanta MaxBuffer 25μl；dNTP Mix(10mM each)1μl；F-BamHI(10μM)2μl；R-SalI(10μM)2μl；PhantaMax Super-Fidelity DNAPolymerase 1μl；无菌水加至50μl。PCR的产物切胶回收，并与pET28a质粒同时使用限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切，37℃，4h。酶切后的PCR片段和pET28a质粒线性片段重新切胶回收，而后使用T4 DNA连接酶按照PCR产物:质粒片段摩尔比1:5，16℃，过夜连接，而后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆摇菌后测序，测序正确的确定为pET28a-BsGT-1重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达获得糖基转移酶BsGT-1。

发明人将糖基转移酶BsGT-1的第62位异亮氨酸突变成丙氨酸(I62A)，利用构建I62A突变的重组质粒，表达糖基转移酶BsGT-1的I62A突变蛋白。本发明在糖基转移酶BsGT-1引入突变的方法是：

选用MutExpressIIFastMutagenesisKitV2，设计突变引物

F-I62A：CTTGAATgccGATCCTAAGCAAATCAGGGAGATG；

R-I62A：TAGGATCggcATTCAAGGATGTATGATAGATCAATGC，

利用

MaxSuper-FidelityDNAPolymerase高保真酶以重组质粒pET28a-BsGT-1为模板进行PCR，形成线性片段，反应体系：重组质粒pET28a-BsGT-1DNA0.5μl；2×Phanta MaxBuffer 25μl；dNTP Mix(10mM each)1μl；F-I62A(10μM)2μl；R-I62A(10μM)2μl；Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μl；无菌水加至50μl。而后用DpnI进行去甲基化处理(37℃，1h)，除去体系中的模板重组质粒(减少假阳性的产生)，而后通过重组酶ExnaseII完成重组环化，并进行进一步测序验证。对测序正确的确定为I62A突变的pET28a-BsGT-1重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)，并将转化子转接到20ml添加卡那霉素(终浓度为40μg/ml)的LB培养基上，200r/min，于37℃培养12个小时，而后将20ml种子液分别转接到1000ml的LB培养基上(添加100μl，浓度为40mg/ml的卡那霉素)，37℃扩大培养，当OD值到达0.6-0.8时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，而后转入16℃摇床，200r/min，培养24个小时，并于4℃，8000r/min离心5min，收集菌体。收集的菌体用100ml的Tris-HCl缓冲液(50mM Tris–HCl,pH 7.5)重悬，重悬的细胞放置于冰水混合物中进行超声破碎5min(超声破碎5S，停顿10S)，将超声破碎后的细胞离心(12000r/min,4℃进行30min)，分离上清和沉淀，而后SDS-PAGE检测突变蛋白的表达情况。

本发明使用镍填料对I62A突变蛋白进行纯化，将超声破碎后的上清加入到预先用缓冲液(50mM Tris–HCl,pH 7.5)平衡好的镍填料中，而后在4℃环境下，过夜孵育12小时，而后，将孵育后的混合液加入纯化柱中，待填料自然沉降，经过缓冲液的冲洗和平衡后，用不同浓度咪唑的Tris-HCl缓冲液(20mM,50mM,100mM,150mM,200mM and 250mM咪唑，50mMTris-HCl，pH 7.5)分别洗脱到1.5ml离心管中，而后收集蛋白并用SDS-PAGE检测。将收集的纯化蛋白用30kDa的超滤管去除咪唑并浓缩，将浓缩后的蛋白(I62A突变蛋白)样品进行下一步糖基化反应。

利用分离纯化的糖基转移酶BsGT-1的I62A突变蛋白催化产生制备埃博霉素B葡萄糖苷化合物，制备方法及反应条件是：

4ml的体外酶活反应体系分别包括糖基转移酶BsGT-1的I62A突变蛋白(500μg/ml)，Tris-HCl缓冲液(50mM Tris-HCl,10mM MgCl₂)，埃博霉素B(终浓度10mM，溶于DMSO，约20mg)以及UDP-O-β-D-glucose(终浓度50mM,溶于水，约122mg)进行体外酶活实验。反应混合液在37℃孵育12个小时，然后添加3倍体积量的甲醇终止反应，14000r/min，30min去除蛋白沉淀，对样品旋转蒸干处理，再添加甲醇重悬产物，14000r/min再次离心30min后将产物通过半制备液相进行分离纯化。

以上埃博霉素B葡萄糖苷的制备利用YMC色谱柱(YMC-Pack Pro C18,250mm×10.0mm,5μm)，流动相体系：乙腈水***洗脱(35:65)，四种埃博霉素B葡萄糖苷的出峰时间：化合物1：13.2min；化合物2：10.6min；化合物3：7.1min；化合物4：5.2min。分离后的四种化合物分别蒸干，用CD₃OD溶解，再使用UHPLC-ESI-Q-TOF高分辨质谱和核磁共振分别进行鉴定。

实施例2化合物1的结构鉴定

依据图2，UHPLC-ESI-Q-TOF高分辨质谱给出化合物1的准分子离子峰[M+H]⁺为m/z670.3131，从而确证1为埃博霉素B的单葡萄糖苷。同时，单糖也可以从化合物1的核磁共振氢谱(¹H NMR)和碳谱(¹³C NMR)上加以确证。HMBC谱中，H-7与C-1'相关及H-1'与C-7相关，从而确定葡萄糖基连接在埃博霉素B大环内酯骨架的7位羟基。糖上端基质子H-1'和H-2'之间的较大耦合常数(J_1',2'＝7.8Hz)以及端基质子偏高场的化学位移值4.46ppm，揭示了糖基供体和埃博霉素B受体是通过β-D葡萄糖苷键连接的。因此，化合物1为EpothiloneB 7-O-β-Dglucoside，其具体核磁数据归属见表1。

表1.化合物1的核磁数据归属

实施例3化合物2的结构鉴定

依据图3，高分辨质谱给出化合物2的准分子离子峰[M+H]⁺为m/z832.5618，预测其为埃博霉素B的双葡萄糖苷。化合物2的二级质谱给出碎片离子峰m/z 670.3120和508.2615，以及核磁共振氢谱(¹H NMR)和碳谱(¹³C NMR)给出明显的两个糖的信号，进一步验证2为埃博霉素B的双葡萄糖苷。同样，HMBC和糖端基质子耦合常数分析(J_1',2'＝7.8Hz)，确定双糖基与埃博霉素B通过7-O-β-D葡萄糖苷键相连。至于双糖内部的β-1,3-葡萄糖苷键连接方式，主要通过二维核磁共振实验加以确定，包括HSQC、HMBC、COSY和NOESY。具体来讲，端基质子耦合常数分析(J_1”,2”＝7.2Hz)和相对高场质子化学位移(δ_H 4.60)证明末端糖基为β-D葡萄糖。利用HSQC和COSY谱归属每个糖基碳上直接相连的氢。在HMBC谱中，出现3'位与1”位的关键碳-氢相关，证明两个葡萄糖残基的连接顺序为1,3-葡萄糖苷键。同时，与埃博霉素B直接相连的葡萄糖残基上3'位碳的化学位移86.8ppm明显向低场移动，也证明该位置被第二个葡萄糖残基取代。因此，化合物2为Epothilone B7-O-β-D-glucosyl-(1→3)-β-D glucoside，核磁数据归属见表2。

表2.化合物2的核磁数据归属。

实施例4化合物3的结构鉴定

依据图4，UHPLC-ESI-Q-TOF高分辨质谱给出化合物3的准分子离子峰[M+H]⁺为m/z832.5627，以及通过二级质谱碎片分析，预测3为埃博霉素B的双葡萄糖苷，也即为2的同分异构体。对比化合物3和2的核磁共振氢谱(¹H NMR)和碳谱(¹³C NMR)，可以确认3与2的区别仅在于双糖基团。进一步通过HMBC谱对比分析这两个化合物的双糖基团，发现3中的双糖通过1,2-葡萄糖苷键连接，而这个连接顺序也可以从向低场偏移的2'位碳化学位移82.0ppm得到验证。因此，化合物3为Epothilone B 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D glucoside，核磁数据归属见表3。

表3.化合物3的核磁数据归属。

实施例5化合物4的结构鉴定

依据图5，UHPLC-ESI-Q-TOF高分辨质谱给出化合物4的准分子离子峰[M+H]⁺为m/z994.4121，预测其为埃博霉素B的三葡萄糖苷。化合物4的二级质谱给出碎片离子峰m/z832.3765、670.3271和508.2744，以及核磁共振氢谱(¹H NMR)和碳谱(¹³C NMR)给出明显的三个糖的端基碳和氢信号，进一步证明4为埃博霉素B的三葡萄糖苷。三个糖端基氢信号的耦合常数均为7.8Hz，且化学位移值均在相对高场的4.60ppm附近，证明三个糖均通过β-D葡萄糖苷键相连。HMBC谱中，H-7与C-1'相关及H-1'与C-7相关，从而确定三糖基连接在埃博霉素B大环内酯骨架的7位羟基。三个糖内部的连接顺序和位置由HSQC、HMBC、COSY和NOESY来确定。具体来讲，COSY谱中H-1'与H-2'相关，以及HSQC谱中确定与H-2'直接相连的C-2'化学位移(δ_C82.5)明显向低场偏移，从而证明与与埃博霉素B直接相连的第一个葡萄糖与中间第二个葡萄糖通过1,2-葡萄糖苷键连接。至于第二个葡萄糖与末尾第三个葡萄糖的1,4-葡萄糖苷键连接顺序的判定，主要基于HMBC谱中的H-6”与向化学位移低场偏移的C-4”(δ_C79.6)相关，H-1”'与C-4”相关，以及H-4”与C-1”'相关。因此，化合物4为EpothiloneB 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D-glucosyl-(1→4)-β-D glucoside，核磁数据归属见表4。

表4.化合物4的核磁数据归属。

实施例6埃博霉素B葡萄糖苷的抗肿瘤活性测试

筛选方法：四氮唑盐(methyl-thiazol-tetozolium，MTT)还原法

细胞株：HepG2人肝癌和正常肝细胞HL7702

作用时间：48小时

实验方法:

胰酶消化对数生长期的细胞，加一定量培养液终止反应后离心收集细胞，并用1ml培液基重悬细胞。另取一支无菌排枪枪槽，将细胞悬液与新鲜培养液充分混匀并加入到96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)。将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，贴壁生长，至细胞单层铺满96孔底板，分别加入浓度梯度的四种埃博霉素B葡萄糖苷化合物，每孔100μl，设平行实验复孔4个。5％CO₂，37℃孵育48小时，吸出上清，PBS洗2-3遍后，而后加入100μl的MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT培养基)，继续培养4h，弃上清，PBS洗2-3遍后，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪OD 492nm处测量各孔的吸光值。

分别在不同药物浓度下测得四种埃博霉素B葡萄糖苷化合物对人肝癌HepG2的抑制率：

化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D葡萄糖苷对人肝癌HepG2的抑制率分别为3.40％(0.01μM)，4.02％(0.1μM)，13.19％(1μM)，29.23％(5μM)，62.26％(20μM)，83.08％(100μM)，83.38％(200μM)；

化合物2：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→3)-β-D葡萄糖苷对人肝癌HepG2在100μM的抑制率为42.69％(100μM)，其IC₅₀值被认为大于100μM；

化合物3：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D葡萄糖苷对人肝癌HepG2的抑制率分别为2.14％(0.01μM)，11.50％(0.1μM)，20.95％(1μM)，40.17％(5μM)，55.83％(20μM)，83.87％(100μM)，89.07％(200μM)，84.87％(500μM)；

化合物4：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D-glucosyl-(1→4)-β-D葡萄糖苷对人肝癌HepG2的抑制率分别为3.40％(0.01μM)，4.02％(0.1μM)，13.19％(1μM)，29.23％(5μM)，62.26％(20μM)，83.08％(100μM)，83.38％(200μM)。

对此，发明人通过非线性拟合曲线求得四种埃博霉素B葡萄糖苷化合物对人肝癌细胞HepG2的IC₅₀值以及对正常肝细胞抑制的IC₅₀值如表5和表6：

表5.埃博霉素B葡萄糖苷对人肝癌细胞HepG2的IC₅₀值

表6.埃博霉素B葡萄糖苷对人正常肝细胞HL7702的IC₅₀值

结论：从表5可以看出，埃博霉素B葡萄糖苷化合物1在浓度为9.84μM(10^-6M)时，对肝癌细胞HepG2有半抑制作用，活性高于埃博霉素A7-O-β-D葡萄糖苷(Epothilone A7-O-β-D glucoside)并且从表6可以看出，化合物1对正常肝细胞HL7702的毒性相比于埃博霉素B原药下降了9430倍。所以该化合物可望作为针对肝细胞等肿瘤细胞的低毒高效抑制剂的候选药物。

Claims

1.一组埃博霉素B葡萄糖苷类化合物，其特征在于，所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物是化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D葡萄糖苷；或是化合物2：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→3)-β-D葡萄糖苷；或是化合物3：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D葡萄糖苷；或是化合物4：埃博霉素B 7-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D-glucosyl-(1→4)-β-D葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的埃博霉素B葡萄糖苷类化合物，其特征在于：所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物是化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D葡萄糖苷。

3.权利要求1或2所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物酶法制备的方法，步骤是：

4.根据权利要求3所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物酶法制备的方法，其特征在于：所述埃博霉素B和UDP-O-β-D-glucose混合的摩尔比为1:5，其与糖基转移酶BsGT-1的I62A突变蛋白介导糖基化反应的反应混合液在37℃孵育12小时。

5.权利要求1或2所述埃博霉素B葡萄糖苷类化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中的应用。