CN109232684A

CN109232684A - 17-aag葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN109232684A
Application number: CN201811301922.0A
Authority: CN
Inventors: 李红梅; 吴成柱; 戴轶群; 朱美林; 李博涵
Original assignee: BENGBU MEDICAL COLLEGE
Current assignee: BENGBU MEDICAL COLLEGE
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: CN109232684B

Abstract

本发明以17‑AAG为底物，利用糖基转移酶(YjiC)，将UDP‑glucose作为供体，通过体外酶法糖基化法制备出新型的Corylifol A糖基化衍生物17‑AAG葡萄糖苷，其结构式如式(I)所示，并研究其理化性质，证明17‑AAG葡萄糖苷的水溶性是底物17‑AAG的水溶性的10.5倍，并且对pH具有较好的稳定性；而且17‑AAG葡萄糖苷抑制Hsp90ATPase活性的IC₅₀值为131.8μmol/L；在体外对人肝癌SMMC‑7721细胞、人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞、人结肠癌SW480细胞都具有很强的抑制增殖作用，而且经裸鼠体内试验也证明17‑AAG葡萄糖苷在体内也具有显著抑制肿瘤生长的活性，给药21天时抑制率为51.8％，并且毒性低，与目前临床所用的抗肿瘤药药物相比，具有很好的临床抗肿瘤药的应用前景。

Description

17-AAG葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体是涉及一种17-AAG葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

近年来，多种恶性肿瘤发病率在世界范围内呈上升趁势，严重危害着人类健康和生命，而化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。因此，向临床提供安全、高效的抗肿瘤创新药物是当前医药工作者的重要使命。

热休克蛋白90(Hsp90)作为分子伴侣蛋白调节众多信号蛋白的构象成熟和稳定性，在细胞生长、分化、凋亡、癌变和肿瘤的发展等方面发挥着重要作用，已成为了抗肿瘤药物研发的重要靶点之一。目前，已超过200种蛋白被确定为Hsp90的客户蛋白，其中包括跨膜酪氨酸激酶受体(Her-2)、血管内皮生长因子受体、Akt、Raf-1、突变信号蛋白(v-Src、p53)、HIF-1α、MMPs等，在肿瘤发生、转移的信号通路中起重要作用。

格尔德霉素(geldanamycin)是第一个被发现的Hsp90抑制剂，最初是从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵液中分离得到的天然产物，属于苯醌安莎类抗生素。格尔德霉素作为抗肿瘤候选药物具有很强的抗肿瘤活性，但由于其肝毒性、水溶性差等缺点，限制了临床上的应用。近年来，许多学者为提高格尔德霉素的水溶性、降低其毒性和增强其生物利用度进行了比较广泛的结构改造，并取得了一定成果。如，17-AAG(Tanespimycin，格尔德霉素的类似物)的抗肿瘤活性高于格尔德霉素，而且肝毒性也大大降低，目前已经进入了III期临床试验阶段。但是17-AAG依旧存在一定的肝毒性、水溶性较差、生物利用度有限等不足。

小分子化合物的糖基化修饰，不仅可以增加化合物结构多样性，而且在功能上这些糖分子也参与了目的细胞的识别，提高化合物得水溶性，影响起生物活性。如7β-xylosyl-10-deacetyl taxol(CAS：90332-63-1)及其衍生物在保留抗肿瘤活性的同时，显著地提高了其水溶性以及对肿瘤细胞的特异选择性。目前常用的糖基化途径有化学合成法、生物合成途径工程技术、生物转化技术和体外酶法糖基化反应(in vitro enzymaticglycosylation)等。虽然体外酶法糖基化反应具有令人满意的产率与选择性，但寻找一种具有底物特异选择性的糖基转移酶是关键，糖基转移酶是糖基化的天然产物生合成途径上重要的一种酶，其主要功能是催化供体上的糖转移到非糖体(aglycon)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种17-AAG葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，利用糖基转移酶(YjiC)，将UDP-glucose作为糖供体，对底物17-AAG进行结构修饰，通过体外酶法糖基化反应制备出17-AAG葡萄糖苷，获得了令人满意的产率与选择性，并研究其理化性质，证明本发明的17-AAG葡萄糖苷不仅具有较好的水溶性和稳定性，还具有显著的抗肿瘤作用，17-AAG葡萄糖苷及其盐在制备抗肿瘤药物中具有广阔的应用前景。

为实现上述目的，本发明提供了一种17-AAG葡萄糖苷，具有如式(I)所示的结构式：

本发明的17-AAG葡萄糖苷的制备方法，具体为：

将含25mmol/L pH值为6.0～9.6的Tris-HCl、1mmol/L MgCl₂、25mg YjiC、3～6mmol/L UDP-glucose和3mmol/L 17-AAG的反应液50mL在30℃反应6～9小时；反应结束后，100℃水浴加热10分钟，消除糖基转移酶的活性，再向反应液中加入50mL乙酸乙酯对反应液进行萃取，获得乙酸乙酯提取物，经半制备高效液相精制，获得17-AAG葡萄糖苷。

本发明利用糖基转移酶(YjiC)对17-AAG的特异选择性，将UDP-glucose作为糖供体，通过体外酶反应制备出17-AAG葡萄糖苷，且制备的17-AAG葡萄糖苷不仅具有良好的水溶性和稳定性，还具有显著的抗肿瘤作用。

本发明还提供了17-AAG葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤细胞为消化***、肠胃***和生殖***部位的肿瘤细胞，特别是肝癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞。

本发明的17-AAG葡萄糖苷的水溶性比底物17-AAG的水溶性增加10.5倍，并且对pH具有更好的稳定性；17-AAG葡萄糖苷体外抑制Hsp90 ATPase活性的同时，还可有效抑制抑制人肝癌SMMC7721细胞、人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞及人结肠癌SW480细胞的增殖，并且呈现浓度依赖性，其IC₅₀值分别为5.26,6.28,28.52,6.13μmol/L。在裸鼠移植瘤模型中，显示出较好的抗肿瘤活性，具有良好的临床应用前景。

所述的17-AAG葡萄糖苷或其盐与药物赋形剂或载体组成药物组合物，药物组合物的制剂形式包括液体制剂、片剂、颗粒剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂。

附图说明

图1是17-AAG葡萄糖苷的pH稳定性。

图2是17-AAG葡萄糖苷对Hsp90顾客蛋白表达的影响。

图3是17-AAG葡萄糖苷的体内抗肿瘤活性。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明发明。

17-AAG葡萄糖苷，结构式如下：

实施例1、17-AAG葡萄糖苷的制备方法，具体为：

实验材料：

仪器：半制备高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Bruker ARX核磁共振仪(德国Bruker公司)，JMS-HX/HX110A型质谱仪(日本JEOL公司)。

试剂：乙腈、甲醇(美国Fisher公司)。

体外酶法糖基化酶反应：

将含25mmol/L pH为8.8的Tris-HCl、1mmol/L的MgCl₂、25mg YjiC、6mmol/L的UDP-glucose和3mmol/L 17-AAG的反应液50mL在30℃反应6小时，反应结束后，在100℃水浴加热10分钟，消除糖基转移酶的活性，再向反应液加入50mL乙酸乙酯对反应液进行萃取，获得乙酸乙酯提取物80mg，经半制备高效液相(Waters 2535Q system；色谱柱为Sunfire^TM prepC₁₈,10x250mm；流动相为40％乙腈；流速为4mL/min)精制，获得17-AAG葡萄糖苷20.6mg。

结构鉴定：

17-AAG葡萄糖苷为棕色固体；HR-ESI-MS m/z[M-H]^-746.3506和[M+Na]⁺770.3487，分子式为C₃₇H₅₃N₃O₁₃。另外，将17-AAG葡萄糖苷溶于DMSO-d₆，进行了核磁共振检测，17-AAG葡萄糖苷的NMR数据为：δ_H 10.18(17-NH,s),9.39(1-NH,s),7.06(1H,s,H-3),6.82(1H,s,H-19),6.54(1H,t,J＝10.2Hz,H-4),5.90(1H,m,H-27),5.74(1H,dd,J＝10.2,5.7Hz,H-5),5.45(1H,m,H-9),5.23(2H,m,H-7,H-28),5.11(1H,m,H-28),5.23,m4.54(1H,m,H-6),4.23(1H,d,J＝7.5Hz,H-1′),4.09(2H,m,H-26),3.83(m,H-6′),3.60(1H,m,H-12),3.39(m,H-6′),3.20(3H,s,12-OCH₃),3.16(3H,s,6-OCH₃),3.11(m,H-3′),3.02(1H,m,H-11),2.95(m,H-2′),2.79(m,H-4′,H-5′),2.65(1H,m,H-10),1.98(1H,m,H-14),1.91(3H,s,H-22),1.60(3H,s,H-24),1.58(2H,m,H-15),1.40(2H,m,H-13),1.03(3H,d,J＝6.8Hz,H-23),0.84(3H,d,J＝6.8Hz,H-25)；δ_C184.59(C-18),178.9(C-21),169.43(C-1),156.72(7-OCONH₂),146.11(C-17),141.34(C-20),138.34(C-5),135.74(C-27),133.86(C-2,C-8),130.36(C-3),129.16(C-9),125.92(C-4),116.18(C-28),109.06(C-16),107.56(C-19),103.46(C-1′),81.58(C-12),79.16(C-7),79.12(C-6),78.94(C-11),77.42(C-3′),76.91(C-5′),74.42(C-2′),70.98(C-4′),61.93(C-6′),56.71(12-OCH₃),56.41(6-OCH₃),46.7(C-26),37.8(C-13),33.06(C-10),33.3(C-15),30.03(C-14),21.22(C-25),16.8(C-24),14.4(C-22),12.67(C-23)。

实施例2、17-AAG葡萄糖苷的制备方法，具体为：

将含25mmol/L pH为6.0的Tris-HCl、1mmol/L的MgCl₂、25mg YjiC、6mmol/L的UDP-glucose和3mmol/L 17-AAG的反应液50mL在30℃反应9小时，反应结束后，在100℃水浴加热10分钟，消除糖基转移酶的活性，再向反应液加入50mL乙酸乙酯对反应液进行萃取，获得乙酸乙酯提取物80mg，经半制备高效液相(Waters 2535Q system；色谱柱为Sunfire^TM prepC₁₈,10x250mm；流动相为40％乙腈；流速为4mL/min)精制，获得17-AAG葡萄糖苷17.8mg。

实施例3、17-AAG葡萄糖苷的制备方法，具体为：

将含25mmol/L pH为9.6的Tris-HCl、1mmol/L的MgCl₂、25mg YjiC、3mmol/L的UDP-glucose和3mmol/L 17-AAG的反应液50mL在30℃反应9小时，反应结束后，在100℃水浴加热10分钟，消除糖基转移酶的活性，再向反应液加入50mL乙酸乙酯对反应液进行萃取，获得乙酸乙酯提取物80mg，经半制备高效液相(Waters 2535Q system；色谱柱为Sunfire^TM prepC₁₈,10x250mm；流动相为40％乙腈；流速为4mL/min)精制，获得17-AAG葡萄糖苷17.6mg。

实施例4、17-AAG葡萄糖苷的制备方法，具体为：

将含25mmol/L pH为6.0的Tris-HCl、1mmol/L的MgCl₂、25mg YjiC、3mmol/L的UDP-glucose和3mmol/L 17-AAG的反应液50mL在30℃反应6小时，反应结束后，在100℃水浴加热10分钟，消除糖基转移酶的活性，再向反应液加入50mL乙酸乙酯对反应液进行萃取，获得乙酸乙酯提取物80mg，经半制备高效液相(Waters 2535Q system；色谱柱为Sunfire^TM prepC₁₈,10x250mm；流动相为40％乙腈；流速为4mL/min)精制，获得17-AAG葡萄糖苷11.9mg。

实施例5、水溶性检测

仪器：KQ 5200B超声仪(中国昆山超声仪器有限公司)；离心机(意大利ALC公司)；HPLC(美国Dionex公司)。

试剂：乙腈、甲醇(美国Fisher公司)。

方法：取足够量17-AAG和制备的17-AAG葡萄糖苷，分别溶于装有600μL蒸馏水的1.5mL离心管中，并在室温下利用超声波辅助溶解，使其呈过饱和状态，超声波溶解40分钟后，再10000r/min离心20分钟，取上清液稀释至适当浓度，注入HPLC进行分析，并求算水溶液中化合物的浓度。

实验结果见表1：17-AAG葡萄糖苷的水中的溶解度为493.58μg/mL，是底物17-AAG的10.5倍。

表1.水溶性检测结果

实施例6、对pH的稳定性检测

仪器：Mini Dry Bath(杭州米欧仪器有限公司)。

试剂：乙腈、甲醇(美国Fisher公司)。

方法：将制备的17-AAG葡萄糖苷和底物17-AAG分别溶于200μL不同pH(6.0、7.0、8.0、8.8、9.6)的Tris-HCl缓冲液中，在室温下反应30分钟，并注入HPLC进行分析。

实验结果如图1所示：用原化合物的比率表示其稳定性，在一定的pH条件下，17-AAG经糖基化结构修饰的产物17-AAG葡萄糖苷比底物17-AAG更加稳定。

实施例7、对Hsp90的ATPase活性检测

仪器：多功能酶标仪(美国BioTek)。

方法：采用malachite green-molybdat显色反应。将高纯度的Hsp90-his融合蛋白2μmol/L置于96孔板中，每个孔加入不同浓度的化合物(17-AAG葡萄糖苷、17-AAG和格尔德霉素)和反应缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L KCl，6mmol/L MgCl₂，pH＝7.4)混匀后置于37℃反应2.5小时,每个化合物浓度设三个复孔。反应结束后加入80μL malachitegreen-molybdate溶液(CAS：68083-41-0)显色，并在波长620nm测每个孔的吸光度(A)值，并计算出化合物对Hsp90的ATPase抑制活性，以上实验重复3次。

实验结果见表2：17-AAG葡萄糖苷抑制Hsp90ATPase活性的IC₅₀值为131.8μmol/L，而阳性对照药格尔德霉素的IC₅₀值为3.2μmol/L。

表2 17-AAG葡萄糖苷抑制Hsp90 ATPase活性检测结果

	Hsp90抑制活性(IC<sub>50</sub>，μmol/L)
		17-AAG葡萄糖苷	131.8±10.5
17-AAG	31.9±2.9
		格尔德霉素	3.2±0.2

实施例8、MTT法检测17-AAG葡萄糖苷对四种肿瘤细胞增殖的影响

该实验部分通过对人肝癌SMMC7721细胞、人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW480细胞的杀伤作用进行效果评价。

(1)实验材料：

细胞株：人肝癌SMMC7721细胞、人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW480细胞来源于美国American Type Culture Collection(ATCC)公司。

仪器：二氧化碳培养箱(美国SHELL LAB公司)，多功能酶标仪(美国BioTek)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

试剂：噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；培养液、二甲基亚砜(DMSO)、0.25％胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone；96孔培养板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司。

(2)方法：

细胞培养：将四种肿瘤细胞分别接种于DMEM或RPMI1640培养液中(含10％灭活胎牛血清，100IU/l青霉素，100μg/mL链霉素)，置5％CO₂，37℃，饱和湿度环境下培养并传代。

MTT法：取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μL培养液中含有5000个细胞，于5％CO₂饱和湿度37℃培养箱中培养。培养14小时后，按不同浓度处理化合物(同时设阳性对照组，格尔德霉素20μmol/L)，每个处理3个复孔，继续培养72小时后每孔加入10μL浓度为5g/L的MTT溶液继续孵育4小时，弃去培养液，每孔加入DMSO 150μL，37℃孵育30分钟，微量振荡器振荡10分钟使结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm波长下检测每孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率(细胞存活率/％＝实验组A570nm/对照组A570nm×100％)，绘制剂量效应曲线，以上实验重复3次。

(3)实验结果见表3所示，17-AAG葡萄糖苷在体外对人肝癌SMMC-7721细胞、人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人结肠癌SW480细胞具有很强的抑制增殖作用，IC₅₀值分别为5.26、6.28、28.52、6.13μmol/L。

表3 17-AAG葡萄糖苷对四种肿瘤细胞增殖的影响

实施例9、17-AAG葡萄糖苷对人肝癌SMMC-7721细胞中Akt、HIF-1α及Hsp90蛋白表达的影响

(1)实验材料：

细胞株：人肝癌SMMC-7721细胞，来源于美国American Type Culture Collection(ATCC)公司。

仪器：二氧化碳培养箱(美国SHELL LAB公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司),凝胶成像***(美国BIO-RAD公司)；电泳仪(美国BIO-RAD公司)；倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；超速离心机(美国Beckman)。

试剂：DMEM培养液、DMSO、0.25％胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone；6孔板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司；兔抗人Akt抗体(美国Abcam公司)、兔抗人HIF-1α抗体(美国Abcam公司)、山羊抗人Hsp90α抗体(美国Stressgen公司)、β-actin(美国Santa Cruz)；二抗(中国合肥BioSharp公司)；ECL反应液(美国Santa Cruz)。

(2)方法：

将人肝癌SMMC-7721细胞按浓度为2X10⁵/mL接种于6孔板，2mL/孔，待细胞完全贴壁后处理化合物，继续培养24小时。收集培养细胞，用冰PBS清洗后，滤纸吸干液体后加入细胞裂解液，200μL/孔，置冰上30分钟，细胞刮下，转移至EP管内80℃冻存，经3次反复冻融后BCA法定量。取蛋白提取物40μg，加入5XSDS上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝燃料到达凝胶最前沿，停止电泳。

转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的Transfer buffer中。同时取适当大小的PVDF膜和4张3M滤纸，将PVDF先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一起浸于Transferbuffer中，膜的两面各垫2张3M滤纸，恒压60V，4℃层析柜中转膜2小时。

封膜：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1:500～1:1000稀释的兔抗人Akt抗体、兔抗人HIF-1α抗体、山羊抗人Hsp90α抗体(含5％脱脂奶粉的TBST，pH 7.4配制)中，在4℃过夜。TBST漂洗5分钟X 5次，再浸于1：2000稀释的二抗(含5％脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)中，在室温1小时，TBST漂洗5分钟X 4次。配制显色液(ECL A 0.5mL,ECL B 0.5mL)，放置凝胶成像***中显色分析。

(3)实验结果如图2所示，随着17-AAG葡萄糖苷浓度的增加，Akt和HIF-1α蛋白质含量显著减少。泳道1：空白对照组；泳道2：5μmol/L的17-AAG葡萄糖苷；泳道3：10μmol/L的17-AAG葡萄糖苷；泳道4：20μmol/L的17-AAG葡萄糖苷。17-AAG葡萄糖苷在5～20μmol/L浓度时剂量依赖性地抑制SMMC-7721细胞中Akt蛋白的表达，而20μmol/L给药浓度时显著抑制HIF-1α蛋白的表达。与此同时，17-AAG葡萄糖苷在5～20μmol/L浓度时，SMMC-7721细胞中Hsp90α蛋白表达量没有变化。

实施例10、17-AAG葡萄糖苷的体内抗肿瘤活性检测

(1)方法：购买BALB/c品系裸鼠、4～5周龄、体重18～20g，于蚌埠医学院实验动物中心(SPF级)进行实验。取生长状态良好的SMMC-7721细胞进行消化、离心、计数，用无菌PBS缓冲液调配成6X10⁷/mL悬液，在每只小鼠的背部经皮下注射方式，注入100μL细胞混悬液。待肿瘤细胞成功接种后，肿瘤体积达到100mm³左右时，将裸鼠分组为空白对照组、给药组(17-AAG葡萄糖苷，10mg/kg)，每组3只裸鼠，给药方式为腹腔注射，周期为3天一次，各药21天。每次给予17-AAG葡萄糖苷处理时，测定裸鼠瘤体的大小，计算公式为：瘤体积V＝1/2(LxW²)。给药21天后，将裸鼠经脊椎脱臼处死，把瘤体从裸鼠体内剥离出，用PBS清洗、滤纸擦干，拍照并称量瘤组织的重量。统计学处理：用SPSS16.0统计软件处理数据，数值是用均数±标准差表示，实验组与空白组比较用单因素方差处理及Dunnette-t检验处理，P值小于0.05时，可认为两组数据间差异具有统计学意义。

(2)实验结果如图3所示，17-AAG葡萄糖苷处理组与空白对照组比较，具有显著抑制肿瘤生长的活性，给药21天时抑制率为51.8％(P<0.05)。另外，肿瘤的大小和重量结果显示，给药组的肿瘤重量明显小于孔盖对照组(P<0.05)。

Claims

1.17-AAG葡萄糖苷，其特征在于，具有如式(I)所示的结构式：

2.权利要求1所述的17-AAG葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，具体为：

将含25mmol/L pH值为6.0～9.6的Tris-HCl、1mmol/L MgCl₂、25mg YjiC、3～6mmol/LUDP-glucose和3mmol/L 17-AAG的反应液50mL在30℃反应6～9小时；反应结束后，100℃水浴加热10分钟，消除糖基转移酶的活性，再向反应液中加入50mL乙酸乙酯对反应液进行萃取，获得乙酸乙酯提取物，经半制备高效液相精制，获得17-AAG葡萄糖苷。

3.权利要求1所述的17-AAG葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的17-AAG葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的17-AAG葡萄糖苷被配制为用于口服或注射给药。

5.根据权利要求3所述的17-AAG葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤细胞是消化***、肠胃***和生殖***部位的肿瘤细胞。

6.根据权利要求5所述的17-AAG葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞。

7.权利要求4所述的17-AAG葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的17-AAG葡萄糖苷或其盐与药物赋形剂或载体组成药物组合物，药物组合物的制剂形式包括液体制剂、片剂、颗粒剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂。