CN111117904B - 一种德巴利酵母菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于微生物防治技术领域的一种德巴利酵母菌及其应用。本发明的德巴利酵母菌DHW‑L可以作为茄科的生防菌，例如马铃薯的多种病原菌，其对病原菌的抑制效果显著，且对植物生长发育不产生影响。在防治茄科晚疫病、早疫病和立枯丝核菌病的同时，对灰霉菌、核盘菌、镰刀菌和辣椒疫霉菌等能够引起植物病害的病原菌也具有显著的抑制生长作用。

Description

一种德巴利酵母菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种德巴利酵母菌及其应用。
背景技术
马铃薯属于茄科茄属，一年生草本块茎植物，具有生长适应性强、产量高、营养丰富和药用价值高等特点，既可作为蔬菜食用，亦可作为主粮。马铃薯病害由多种病原菌造成，主要有以下几种：(1)马铃薯晚疫病是马铃薯产区发生最普遍、影响最严重的真菌性病害之一，是一种具有毁灭性的卵菌病害之一，严重时甚至造成马铃薯的绝产。晚疫病造成的危害性、防治难度及对社会影响已超过了水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害。马铃薯晚疫病的病原菌为致病疫霉(Phytophthora infesrans(Mont)de Bary)，主要危害马铃薯叶片，也能侵染地上茎和低下块茎，造成马铃薯减产和储藏期的腐烂。(2)马铃薯早疫病的病原菌为链格孢属茄链格孢菌，能够侵染块茎和叶片，叶片呈大小3-4mm的圆形或近圆形黑褐色病斑，具同心轮纹。湿度大时，病斑上生出黑色霉层病征，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。发病严重的叶片干枯脱落，田间植株成片枯黄。近年早疫病呈上升趋势，部分地区发病状况不亚于晚疫病。(3)马铃薯立枯丝核菌病的病原菌为立枯丝核菌，主要为害部位为幼芽、茎基部及块茎。幼芽染病常在出土前形成芽腐，造成缺苗现象。出土后染病初期植株下部叶片发黄，茎基形成褐色凹陷斑，大小1-6cm。病斑上或茎基部常覆有紫色菌丝层，有时茎基部及块茎生出大小不等(1-5mm)形状各异的块状或片状、散生或聚生的小菌核、轻病株症状不明显，重病株可形成立枯或顶部萎蔫或叶片卷曲。
目前化学药剂防治是预防马铃薯病害的有效手段，也是广泛采用的措施之一，在病害防治中占主要位置。然而，由于长期频繁使用化学农药，使得病菌的抗药性逐渐增强，导致防治效果降低，甚至完全失效。现在对病原菌的遗传分析也证明了晚疫病菌的群体结构发生了巨大变化。抗病育种方面，马铃薯抗病育种一般都需要较长的年限，使其利用受到一定程度的局限。运用生物防治技术来控制病害的发生逐渐成为人们关注的热点，开发能够有效抑制采后病害发生且自身没有危害的新型生物农药，逐步取代化学农药已经成为众多农业科研人员的目标。
发明内容
为此，本发明的目的是提供的一种德巴利酵母菌(Debaryomyces sp.)，菌株为DHW-L，于2019年8月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.18360。
本发明的德巴利酵母菌(Debaryomyces sp.)DHW-L，从芒果中分离得到的。
所述德巴利酵母菌(Debaryomyces sp.)DHW-L的形态学特征为：菌体细胞呈球形或椭圆形，无性繁殖为出芽，每个子囊含1-4个表面光滑的球形或半球形分生孢子，同宗配合或异宗配合；在培养基上不产生色素，菌落为白色不透明。
所述德巴利酵母菌(Debaryomyces sp.)DHW-L的生理生化特征为：多数为发酵或氧化代谢，不发酵糖类；同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木糖、山梨醇；不同化棉子糖、蜜二糖、***糖，不产生乙酸乙脂。
本发明还提供了上述德巴利酵母菌(Debaryomyces sp.)DHW-L在防治植物病害或病原菌中的应用。
本发明还提供了上述德巴利酵母菌(Debaryomyces sp.)DHW-L在制备病原菌或植物病害抑制剂中的应用。
上述应用中，所述病原菌为致病疫霉菌、茄链格孢菌、立枯丝核菌、灰霉菌、核盘菌、镰刀菌或辣椒疫霉菌。
上述应用中，所述植物病害为茄科晚疫病、茄科早疫病、立枯丝核菌病、灰霉病或菌核病。
上述应用中，所述茄科主要包括马铃薯、番茄和辣椒等。
本发明还提供了一种病原菌抑制剂，包括上述的德巴利酵母菌DHW-L或其菌液。
上述病原菌抑制剂中，所述菌液的制备方法为：将所述德巴利酵母菌活化后，进行扩大培养，然后稀释到所需浓度。
例如，用YPD液体培养基稀释到所需浓度得到菌液。
本发明还提供了一种植物病害抑制剂，包括上述的德巴利酵母菌DHW-L或其菌液。
上述植物病害抑制剂中，所述菌液的制备方法为：将所述德巴利酵母菌活化后，进行扩大培养，然后加入YPD液体培养基稀释到所需浓度所得的液体。
本发明有益效果为：
本发明的德巴利酵母菌DHW-L可以作为茄科，例如马铃薯的多种病原菌的生防菌，尤其对马铃薯病原菌的抑制效果显著，且对马铃薯生长发育不产生影响。在防治茄科晚疫病、早疫病和立枯丝核菌病的同时，对灰霉、核盘菌、镰刀菌和辣椒疫霉菌等能够引起植物病害的病原菌也具有显著的抑制生长作用。
生物材料保藏说明
分类命名：德巴利酵母菌(Debaryomyces sp.)；菌株编号：DHW-L。
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏机构简称：CGMCC；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2019年8月6日；
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18360。
附图说明
图1为本发明的德巴利酵母菌菌株平板生长图。
图2为不同浓度的德巴利酵母菌DHW-L对于致病疫霉菌的平板生长对峙实验结果；其中，CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基；DHW-L为浓度为106、105、104、103、102cfu/ml。
图3为酵母菌DHW-L菌液对致病疫霉在马铃薯块茎上的抑制作用；其中：CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基，其他依次为DHW-L浓度为104、106、108cfu/ml的酵母菌处理的马铃薯块茎。
图4为酵母菌DHW-L菌液对致病疫霉在马铃薯离体叶片上的抑制作用；其中：CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基；DHW-L为浓度为108cfu/ml的酵母菌处理的马铃薯叶片。
图5为酵母菌DHW-L对早疫病菌的平板生长对峙实验结果，其中CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基；2号为浓度为102cfu/ml的酵母菌；3号为浓度为103cfu/ml的酵母菌；4号为浓度为104cfu/ml的酵母菌；5号为浓度为105cfu/ml的酵母菌；6号为浓度为106cfu/ml的酵母菌；7号为浓度为107cfu/ml的酵母菌；8号为浓度为108cfu/ml的酵母菌。
图6为酵母菌DHW-L对丝核菌AG的平板生长对峙实验将结果；其中，CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基；2号为浓度为102cfu/ml的酵母菌；3号为浓度为103cfu/ml的酵母菌；4号为浓度为104cfu/ml的酵母菌；5号为浓度为105cfu/ml的酵母菌；6号为浓度为106cfu/ml的酵母菌；7号为浓度为107cfu/ml的酵母菌；8号为浓度为108cfu/ml的酵母菌。
图7为酵母菌DHW-L对核盘菌的平板生长对峙实验结果；其中CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基；2号为浓度为102cfu/ml的酵母菌；3号为浓度为103cfu/ml的酵母菌；4号为浓度为104cfu/ml的酵母菌；5号为浓度为105cfu/ml的酵母菌；6号为浓度为106cfu/ml的酵母菌；7号为浓度为107cfu/ml的酵母菌；8号为浓度为108cfu/ml的酵母菌。
图8为酵母菌DHW-L对灰霉菌菌的平板生长对峙实验结果；其中，CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基；2号为浓度为102cfu/ml的酵母菌；3号为浓度为103cfu/ml的酵母菌；4号为浓度为104cfu/ml的酵母菌；5号为浓度为105cfu/ml的酵母菌；6号为浓度为106cfu/ml的酵母菌；7号为浓度为107cfu/ml的酵母菌；8号为浓度为108cfu/ml的酵母菌。
图9为酵母菌DHW-L对辣椒疫霉的平板生长对峙实验结果；其中，CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基；2号为浓度为102cfu/ml的酵母菌；3号为浓度为103cfu/ml的酵母菌；4号为浓度为104cfu/ml的酵母菌；5号为浓度为105cfu/ml的酵母菌；6号为浓度为106cfu/ml的酵母菌；7号为浓度为107cfu/ml的酵母菌；8号为浓度为108cfu/ml的酵母菌。
图10为酵母菌DHW-L对镰刀菌的平板生长对峙实验结果；其中，CK为不接种酵母菌，仅YPD液体培养基；2号为浓度为102cfu/ml的酵母菌；3号为浓度为103cfu/ml的酵母菌；4号为浓度为104cfu/ml的酵母菌；5号为浓度为105cfu/ml的酵母菌；6号为浓度为106cfu/ml的酵母菌；7号为浓度为107cfu/ml的酵母菌；8号为浓度为108cfu/ml的酵母菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或成分比例上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围内。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
实施例1菌株分离纯化
将采集自广东的芒果用无菌刀片剁碎，放入已灭菌的研钵中，加入含吐温20的无菌水，反复研磨至糊状后，用无菌水分别稀释10倍、100倍和1000倍。5000rpm离心10min，取上清100μl均匀涂在RSA平板培养基，100μl/皿，每个浓度3个皿，每个样品处理共9个皿，20℃条件下培养2-3天，挑取单菌落在新的RSA平板上划线纯化，再挑取单菌落至斜面培养基上培养并保存。
采用划线稀释的方法，将酵母菌菌株的新鲜培养物分别划线接种到RSA培养平板和YPD培养平板上，置于20℃下培养，后观察培养形态和菌落特征。挑取少量酵母菌菌体放在载玻片上，滴加两滴无菌生理盐水，再盖上盖玻片，在光学显微镜下观察酵母菌的细胞形态，测量细胞大小以及增殖方式。
酵母菌在不同培养平板上的菌落形态都较类似，单细胞为卵圆形或圆形，细胞为多边芽殖。在平板上形成的菌落呈卵圆形，乳白色，表面光滑，质地均匀且粘稠，中心***较高，呈突脐状，菌落边缘较整齐。在培养基上可形成子囊孢子，细胞与其出芽接合形成子囊，一个子囊产生1-4个球形子囊抱子，菌株平板生长状态如图1所示。以上形态特征和文献中所描述的德巴利氏酵母菌的特征相似。
以酵母菌菌株的基因组DNA为模版，扩增其16S rDNA序列，PCR产物为单一条带，回收纯化后，进行DNA测序。将菌株的16SrDNA序列，与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GeneBank数据库中相应的序列进行比对分析。其16S rDNA的部分序列，如序列表中SEQ IDNO.1所示，经过对比，与德巴利氏酵母菌属具有98％的序列相似性。
实施例2德巴利氏酵母菌DHW-L对致病疫霉菌的抑制
制备发酵培养基，其方法如下：用于菌株生长的培养基为YPD培养基，其配方为10g/L酵母粉，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，固体培养基加入20g/L琼脂粉，121℃高压湿热灭菌20min，即可得到菌种生长的培养基。
菌株活化培养：将生防酵母菌接种于YPD固体培养基活化，培养条件为28-30℃，培养12-24h。
菌株扩大培养：挑出其中单菌落于YPD液体培养基中，培养条件为28～30℃，180-220r/min，振荡培养20h，将培养液以2％(V/V)比例接种100mL YPD液体培养基，28℃，220r/min振荡培养20h。
抑制剂的制备：将培养获得的发酵菌液，用YPD液体培养基稀释至所需浓度的菌液即可得到抑制剂。
一、酵母菌对致病疫霉菌的平板生长对峙实验
在直径为9cm的黑麦固体培养基中心接种直径9mm的致病疫霉菌21101菌碟，在YPD平板中心均匀涂布浓度为106、105、104、103、102cfu/ml的酵母菌菌液200μl，对扣培养。18℃培养箱黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，培养10-12d观察致病疫霉菌的生长状态，每组处理3次重复。
在12天时观察致病疫霉菌长势，结果如图2所示，发现经过酵母菌处理的致病疫霉菌菌丝的生长完全被抑制，与对照比差异显著(P<0.05)，其EC50值为1.9×104cfu/ml。
EC50值的计算方法为：以菌丝净生量计算不同质量浓度药剂对各菌株生长的抑制率。计算公式如下：
Figure GDA0002451915300000091
通过DPS软件，求得EC50值。
二、酵母菌菌液对致病疫霉在马铃薯块茎上的抑制作用
将荷兰十五马铃薯块茎消毒后在超净工作台内切成大小为3×3×1cm的小块，放置在直径为9cm的培养皿上，在马铃薯小块中心接种直径9mm的致病疫霉21101菌碟。在YPD平板中心均匀涂布浓度为104、106、108cfu/ml的生防酵母菌菌液200μl，对扣培养。18℃培养箱，16h光照/8h黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，5-7d观察致病疫霉菌的侵染状态，每组处理3次重复。
6天后观察，结果如图3所示，对照组马铃薯块茎上的菌丝布满整个块茎，并且马铃薯有组织降解，而预先经过酵母菌处理的马铃薯块茎菌丝只生长了一点，马铃薯块茎组织完好，其浓度为104cfu/ml时抑制率为29.47％，浓度为106cfu/ml时抑制率为68.07％，浓度为108cfu/ml时抑制率为85.62％。
三、酵母菌菌液对致病疫霉在马铃薯离体叶片上的抑制作用
在直径为9cm的水琼脂平板上放置两片无病菌的荷兰十五马铃薯叶片，在马铃薯叶片上喷施致浓度为50个孢子囊/μl的病疫霉21101悬浮液，在YPD平板中心均匀涂布浓度为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml的酵母菌菌液200μl，对扣培养。18℃培养箱，16h光照/8h黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，5-7d观察致病疫霉菌的侵染状态，每组处理3次重复。
结果如图4所示，未经过酵母菌处理的对照组马铃薯叶片有大面积水渍状病斑的生成，并且上面有白色菌丝分布，而经过酵母菌处理可以完全抑制致病疫霉菌在马铃薯叶片的侵染，马铃薯叶片上完好，无发病迹象经过梯度实验发现在酵母菌浓度为102cfu/ml时酵母菌还能很好的抑制晚疫病在叶片上的生长。
实施例3酵母菌DHW-L对早疫病菌的抑制
在直径为9cm的PDA培养基中心接种直径9mm茄链格孢菌菌碟，在直径为9cm的YPD平板中心均匀涂布浓度梯度为为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml的酵母菌DHW-L菌液200μl，对扣培养。25℃培养箱黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，5d观察茄链格孢菌的生长状态，每组处理3次重复。
结果如图5所示，对照组茄链格孢菌菌丝几乎长满整个平板，而经过酵母菌处理的早疫病菌菌丝相比对照组菌丝扩展直径明显小与对照，对茄链格孢菌有一定的抑制效果，其EC50值为1.8×102cfu/ml。
实施例4酵母菌DHW-L对丝核菌的抑制
在直径为9cm的PDA培养基中心接种直径9mm丝核菌AG6菌碟，在在直径为9cm的YPD平板中心均匀涂布浓度梯度为为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml的酵母菌DHW-L菌液200μl，对扣培养。25℃培养箱黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，5d观察丝核菌AG6的生长状态，每组处理3次重复。
结果如图6所示，对照组丝核菌菌丝几乎长满整个平板，而经过酵母菌处理的丝核菌菌丝相比对照组菌丝扩展直径明显小与对照，并随着浓度的增大其，抑制效果逐渐明显，EC50测定为2.4×103cfu/ml。
实施例5酵母菌DHW-L对核盘菌的抑制
在直径为9cm的PDA培养基中心接种直径9mm核盘菌菌碟，在直径为9cm的YPD平板中心均匀涂布浓度梯度为为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml的酵母菌DHW-L菌液200μl，对扣培养。25℃培养箱黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，5d观察核盘菌的生长状态，每组处理3次重复。
结果如图7所示，对照组核盘菌菌丝几乎长满整个平板，而经过酵母菌处理的核盘菌的菌丝直径随着酵母菌浓度的增大而减小，其EC50值为3.9×104cfu/ml，表明酵母菌对核盘菌有非常好的的抑制效果。
实施例6酵母菌DHW-L对灰霉菌的抑制
在直径为9cm的PDA培养基中心接种直径9mm灰霉菌菌碟，在直径为9cm的YPD平板中心均匀涂布浓度梯度为为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml的酵母菌DHW-L菌液200μl，对扣培养。25℃培养箱黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，5d观察灰霉菌的生长状态，每组处理3次重复。
结果如图8所示，对照组灰霉菌菌丝几乎长满整个平板，而经过酵母菌处理的灰霉菌菌丝直径随着酵母菌浓度的增大而减小，其EC50值为1.1×102cfu/ml，表明对灰霉菌有非常好的的抑制效果。
实施例7酵母菌DHW-L对辣椒疫霉的抑制
在直径为9cm的燕麦培养基中心接种直径9mm辣椒疫霉菌碟，在直径为9cm的YPD平板中心均匀涂布浓度梯度为为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml的酵母菌DHW-L菌液200μl，对扣培养。25℃培养箱黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，5d观察辣椒疫霉菌的生长状态，每组处理3次重复。
结果如图9所示，对照组辣椒疫霉菌菌丝几乎长满整个平板，而经过酵母菌处理的辣椒疫霉菌菌丝直径明显小于对照，相对于浓度为108cfu/ml的酵母菌，浓度为102cfu/ml的抑制效果与其相差不多，表明酵母菌对辣椒疫霉的抑制效果不受浓度影响，其EC50值为9.5×105cfu/ml，所以酵母菌对辣椒疫霉菌抑制效果显著。
实施例8酵母菌DHW-L对镰刀菌的的抑制
在直径为9cm的PDA培养基中心接种直径9mmL镰刀菌菌碟，在直径为9cm的YPD平板中心均匀涂布浓度梯度为为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml的酵母菌DHW-L菌液200μl，对扣培养。25℃培养箱黑暗培养。以YPD平板中心均匀涂布YPD液体培养基的平板作对照，5d观察镰刀菌菌的生长状态，每组处理3次重复。
结果如图10所示：对照组镰刀菌菌丝长至整个平板的2/3，而经过酵母菌处理的镰刀菌菌丝相比对照组菌丝扩展直径明显小于对照，相对于浓度为108cfu/ml的酵母菌，浓度为102cfu/ml的抑制效果与其相差不多，表明酵母菌对镰刀菌的抑制效果不受浓度影响，其EC50值为9.3×102cfu/ml，所以酵母菌对镰刀菌抑制效果显著。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种德巴利酵母菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 592
<212> DNA
<213> Debaryomyces sp.
<400> 1
ttattgcgcg gcgaaaaacc ttacacacag tgttttttgt tattacaaga actcttgctt 60
tggtctggac tagaaatagt ttgggccaga ggtttactaa actaaacttc aatatttata 120
ttgaattgtt atttatttta attgtcaatt tgttgattaa attcaaaaaa tcttcaaaac 180
tttcaacaac ggatctcttg gttctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt 240
aatatgaatt gcagattttc gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgccctttgg 300
tattccaaag ggcatgcctg tttgagcgtc atttctctct caaaccttcg ggtttggtat 360
tgagtgatac tcttagtcga actaggcgtt tgcttgaaat gtattggcat gagtggtact 420
ggatagtgct atatgacttt caatgtatta ggtttatcca actcgttgaa tagtttaatg 480
gtatatttct cggtattcta ggctcggcct tacaatataa caaacaagtt tgacctcaaa 540
tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca tatcaataaa gccggaagga ag 592

Claims (7)

1.一种德巴利酵母菌（Debaryomyces sp.）DHW-L，保藏号为CGMCC No. 18360。
2.权利要求1所述的德巴利酵母菌在防治植物病害或植物病原菌中的应用。
3.权利要求1所述的德巴利酵母菌在制备植物病原菌或植物病害抑制剂中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌为致病疫霉菌、茄链格孢菌、立枯丝核菌、灰霉菌、核盘菌、镰刀菌或辣椒疫霉菌。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于， 所述植物病害为茄科晚疫病、茄科早疫病、立枯丝核菌病、菌核病、根腐病或辣椒疫病。
6.一种病原菌抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的德巴利酵母菌或其菌液。
7.根据权利要求6所述的病原菌抑制剂，其特征在于，所述菌液的制备方法为：将所述德巴利酵母菌活化后，进行扩大培养，然后稀释到所需浓度。
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