CN111116614A - 免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物及其白蛋白纳米制剂及制备方法 - Google Patents

免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物及其白蛋白纳米制剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物化学和药物制剂领域，涉及一种免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物及其白蛋白纳米制剂的制备方法；本发明中由脂肪酸酐分别与吲哚胺2,3‑双加氧酶抑制剂NLG919的羟基和紫杉烷类化合物的羟基通过酯键缩合反应链接得到所述链接物，将该链接物制备成白蛋白纳米制剂，利用纳米制剂对肿瘤的增强渗透和滞留效应，递送该链接物至肿瘤。所述递送至肿瘤细胞的链接物，作为NLG919和紫杉烷类化合物的前药，经酯酶水解成NLG919和紫杉烷类化合物，实现这两种药物共同递送至肿瘤细胞的目的。NLG919通过抑制IDO与紫杉烷类化疗实现协同***的效果。

Description

免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物及其白蛋白纳米制剂及 制备方法
技术领域
本发明属于药物化学和药物制剂领域，涉及一种免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物及其白蛋白纳米制剂及制备方法，该链接物制备成白蛋白纳米制剂，利用纳米制剂对肿瘤的增强渗透和滞留效应，递送该链接物至肿瘤，与紫杉烷类化疗实现协同***的效果。
背景技术
近年来，恶性肿瘤的发病率急剧上升，死亡率高。世界卫生组织的数据显示，每年新增癌症患者中有36％为中国人，恶性肿瘤已经成为影响中国人寿命的一大顽疾。传统的抗肿瘤药物(如紫杉醇、阿霉素等)具有较强的毒性作用。化疗抑制肿瘤生长，也伴随着肿瘤的耐药与复发。
现有技术公开了白蛋白在血浆中大量存在，其等电点为4.7-4.9，是一种酸性蛋白，易溶于水，在pH4-9之间是稳定的。人血清白蛋白是人体中含量最丰富的蛋白，由于其天然的结构、生物可降解、无毒、生物相容性高等优点，现已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准临床应用，被视为一种理想的药物运输载体。
紫杉烷类化合物包括紫杉醇和多烯紫杉醇对多种肿瘤均具有较强的抗肿瘤活性，通过强化微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，导致形成稳定的非功能性微管束，从而抑制细胞的有丝***和增殖。但由于水溶性较差，大大限制其在肿瘤治疗中的应用。紫杉烷类化合物与血清白蛋白亲和力高，以人血清白蛋白作为载体制备的紫杉醇白蛋白纳米悬液(商品名Abraxane)已在2005年被FDA批准上市。
IDO是一种重要的调节蛋白，参与形成肿瘤免疫抑制性微环境，促进肿瘤细胞生长。IDO在多种肿瘤组织中均有较高的表达，是色氨酸经犬尿酸途径分解代谢的限速酶，催化必需氨基酸色氨酸降解，使其代谢物的积累，从而导致细胞周期停滞和效应T细胞死亡，增加调节性T细胞数量。免疫调节因子NLG919是一种IDO抑制剂，减少色氨酸的代谢，使效应T细胞执行其正常功能，杀死肿瘤细胞。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物及其白蛋白纳米制剂，以实现与紫杉烷类化疗协同***的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物及其白蛋白纳米制剂及制备方法，制得的白蛋白纳米制剂能实现与紫杉烷类化疗协同***的效果。
本发明合成了一种NLG919与紫杉烷的共价链接物；该链接物是利用脂肪酸酐将免疫调节因子IDO抑制剂NLG919与紫杉烷类化合物通过酯键缩合反应得到的；进一步将该链接物制备成白蛋白纳米制剂，利用纳米制剂对肿瘤的增强渗透和滞留效应，递送该链接物至肿瘤；递送至肿瘤细胞的所述链接物，作为NLG919和紫杉烷类化合物的前药，经酯酶水解成NLG919和紫杉烷类化合物，能实现上述两种药物共同递送至肿瘤细胞的目的；所述NLG919通过抑制IDO从而减少其对效应T细胞的抑制，与紫杉烷类化疗达到协同***的效果。
具体的，
本发明提供了NLG919与紫杉醇的共价链接物，其特征在于，利用脂肪酸酐与NLG919的羟基缩合得到脂肪酸化NLG919，再与紫杉醇或多烯紫杉醇的羟基通过酯键缩合反应得到共价链接物。
更具体的，本发明所述链接物为由脂肪酸化的NLG919的羧基与紫杉醇或多西紫杉醇的2’位羟基通过酯键缩合反应得到的化合物，该类链接物结构如通式I所示，
Figure BDA0001851227970000031
Figure BDA0001851227970000032
m,n＝0-10；R5＝H,-CH3,-C2H5或-C3H7
通式I。
本发明所述链接物的合成方法，具体步骤如下：
Figure BDA0001851227970000033
合成路线1
a.NLG919的脂肪酸化：
选用脂肪酸酐，以吡啶、二氯甲烷、THF、DMF或DMSO为溶剂，在加热条件下反应得到脂肪酸化NLG919；优选地，所述的引入条件为NLG919与脂肪酸酐在吡啶溶液中，加热至60℃反应48小时；
b.紫杉烷化合物与脂肪酸化NLG919的酯化反应：
常用的缩合剂有二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯等；优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺。
本发明所述的NLG919与紫杉醇的共价链接物，其特征在于，利用脂肪酸酐与NLG919的羟基缩合得到脂肪酸化NLG919，再与紫杉醇或多烯紫杉醇的羟基通过酯键缩合反应得到；
所述链接物是由脂肪酸化的NLG919的羧基与紫杉醇或多西紫杉醇的7位羟基通过酯键缩合反应得到的化合物；该类链接物结构如通式III所示：
Figure BDA0001851227970000041
Figure BDA0001851227970000042
m,n＝0-10；R5＝H,-CH3,-C2H5,或-C3H7
通式III
所述链接物的合成方法，包括步骤：
Figure BDA0001851227970000043
合成路线2
a.紫杉烷化合物2’位羟基的保护：
选用羟基保护剂有三异丙基硅基、三乙基硅基、二苯基叔丁基硅基、叔丁基二甲基氯甲烷等；优选地，所述的保护剂为叔丁基二甲基氯甲烷；
b.保护后的紫杉烷化合物与脂肪酸化的NLG919的酯化反应：
常用的缩合剂有二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐
酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯等；优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺；
c.选择性的脱去紫杉烷化合物结构中2’位羟基的保护基：
反应条件，优选地，四丁基氟化铵和THF，室温。
本发明所述的NLG919与紫杉醇的共价链接物，利用脂肪酸酐与NLG919的羟基缩合得到脂肪酸化NLG919，再与紫杉醇或多烯紫杉醇的羟基通过酯键缩合反应得到；
所述链接物是由脂肪酸化的NLG919的羧基与紫杉醇或多西紫杉醇的2’和7位，或2’和10’位，或2’、7和10’位羟基通过酯键缩合反应得到的化合物；该类链接物结构如通式IV所示：
Figure BDA0001851227970000051
Figure BDA0001851227970000052
m,n＝0-10；R5＝H,-CH3,-C2H5,或-C3H7
通式IV
该类链接物的合成方法，包括步骤：
Figure BDA0001851227970000061
合成路线3
a.2’位保护的紫杉烷化合物与脂肪酸化NLG919的酯化反应：
常用的缩合剂有二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯等；优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺。
本发明所述的NLG919与紫杉醇的共价链接物，其特征在于，利用脂肪酸酐与NLG919的羟基缩合得到脂肪酸化NLG919，再与紫杉醇或多烯紫杉醇的羟基通过酯键缩合反应得到；
所述链接物是由脂肪酸化的NLG919的羧基与紫杉醇或多西紫杉醇的7和10’位羟基通过酯键缩合反应得到的化合物；该类链接物结构如通式V所示：
Figure BDA0001851227970000071
Figure BDA0001851227970000072
m,n＝0-10；R5＝H,-CH3,-C2H5,或-C3H7
通式V
该类链接物的合成方法，具体步骤如下：
Figure BDA0001851227970000073
合成路线4
a.紫杉烷化合物与脂肪酸化NLG919的酯化反应：
常用的缩合剂有二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯等；优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺；
b.选择性的脱去紫杉烷化合物结构中2’位羟基的保护基：
反应条件，优选地，四丁基氟化铵和THF，室温。
本发明采用以上所述的NLG919与紫杉烷类化合物的共价链接物，具体地，是上述化合物中的任一种，制备白蛋白纳米制剂；
所述白蛋白纳米制剂通过下述技术方案制成：
所述制剂中含有所述的链接物和白蛋白；所述的链接物与白蛋白的质量比为1:6-1:20；优选地，质量比为1:9-1:15；
所述的白蛋白是人血清白蛋白、重组人血清白蛋白和牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物；优选地，所述的白蛋白是人血清白蛋白。
上述含有所述链接物的白蛋白纳米制剂的制备方法，包括步骤：
(1)将白蛋白溶解于水中；
(2)将所述的链接物溶解于有机溶剂中；
(3)将步骤(1)的水溶液与步骤(2)的有机溶液混合均匀，得到白色乳液；
(4)将白色乳液高压均质，使粒径控制在50-1000nm；
(5)将乳液(4)减压去除有机溶剂。
作为优选，上述制备方法还包括将步骤(5)所获得的纳米制剂溶液进行脱水的步骤；优选地，所述的脱水处理为冷冻干燥；
优选地，步骤(1)中所述的白蛋白水溶液浓度为0.5％-5％(w/v)，优选为1％-2％(w/v)；
优选地，步骤(2)中的链接物与步骤(2)中的总蛋白的比例为1:9-1:15；
优选地，步骤(2)中的有机溶剂与步骤(1)中的水的比例为1:20-1:50；
优选地，步骤(2)中的有机溶剂由疏水性有机溶剂和亲水性有机溶剂混合而成；所述的疏水性有机溶剂可以是氯仿、二氯甲烷或两种的混合溶剂；所述的亲水性有机溶剂可以为无水乙醇、甲醇、丙二醇或其中两种或三种的混合溶剂；有机溶剂与步骤(1)中水溶液的比例为1:20-1:50；
优选地，步骤(4)中所述的高压均质，压力范围为10000psi--20000psi，循环次数为10-20次。
以下结合附图详细说明本发明的实施方案。
附图说明
图1荷黑色素瘤C57雌鼠静脉给药后的生存曲线；第0天接种肿瘤细胞，第6天开始治疗。(n＝10，p<0.01)。
图2荷黑色素瘤C57雌鼠静脉给药后的体重对时间的变化曲线图；n＝10，第0天接种肿瘤细胞，第6天开始治疗。
图3荷乳腺癌细胞BALB/c雌鼠静脉给药后的生存曲线；第0天接种肿瘤细胞，第6天开始治疗。(n＝10，p<0.01)。
图4荷乳腺癌细胞BALB/c雌鼠静脉给药后的体重对时间的变化曲线图；n＝10，第0天接种肿瘤细胞，第6天开始治疗。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明和解释本发明，但不作为本发明的限制。
实施例1：合成化合物4
合成路线5
Figure BDA0001851227970000091
反应试剂和条件：
a.戊二酸酐、无水吡啶，60℃反应48小时
b.紫杉醇、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷，室温过夜；实施例1中化合物2(脂肪酸化NLG919)的合成：
将NLG919(0.1g)和戊二酸酐(0.2g)置于50mL茄型瓶中，加入5mL无水吡啶溶解，60℃搅拌反应48小时；TLC检测反应进行。待反应完成后，冷却至室温。减压除去吡啶，剩余物用二氯甲烷溶解，经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝60：1)得到化合物2为白色固体,0.11g(产率：80％)。
核磁分析：1H NMR(400MHz,cdcl3)δ13.01(m,1H),7.86–7.76(m,1H),7.55(d,J＝6.9Hz,1H),7.38(m,2H),7.28(d,J＝2.5Hz,1H),7.21–7.16(m,1H),5.55–5.32(m,1H),3.73(m,1H),2.27–1.93(m,7H),1.90-1.71(m,6H),1.37(t,J＝11.1Hz,1H),1.11(m,5H).
质谱分析ESI-MS m/z[M-H]-；C23H28N2O4计算值：395.2；实测值：395.4实施例1中化合物4的合成：
向50mL茄型瓶中，依次加入化合物2(0.1g)、紫杉醇(化合物3，0.22g)、二环己基碳二亚胺(77mg)、4-二甲氨基吡啶(4mg)，用12mL无水二氯甲烷溶解。室温搅拌反应过夜；反应完毕后，旋干溶剂，剩余物重新溶于二氯甲烷，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝80：1)得到化合物1为白色固体,0.15g(产率：49％)。
核磁分析：1H NMR(400MHz,cdcl3)δ8.15(d,J＝6.6Hz,2H),7.74(d,J＝7.5Hz,1H),7.67(d,J＝9.5Hz,2H),7.59(dd,J＝10.0,6.7Hz,1H),7.49(m,5H),7.43–7.29(m,9H),7.20(m,2H),6.31(d,J＝18.3Hz,1H),6.23(t,J＝9.0Hz,1H),5.98(d,J＝9.9Hz,1H),5.70(d,J＝6.4Hz,1H),5.58–5.47(m,1H),5.09–4.90(m,3H),4.45(dt,J＝13.3,8.7Hz,1H),4.32(d,J＝8.3Hz,1H),4.23(t,J＝7.9Hz,1H),3.82(d,J＝7.0Hz,1H),2.61–2.40(m,7H),2.36(d,J＝7.1Hz,1H),2.31(m,2H),2.23(d,J＝8.5Hz,5H),2.15–1.99(m,3H),1.95(s,3H),1.93–1.84(m,5H),1.76–1.70(m,4H),1.51–1.39(m,1H),1.37(s,1H),1.24(m,5H),1.17(m,6H).。
质谱分析ESI-MS m/z[M+H]+C70H77N3O17计算值：1232.5；实测值：1232.2。
实施例2：制备及评价含有化合物4的白蛋白纳米制剂
将人血清白蛋白溶解于水中混合均匀，蛋白浓度为1.5％(w/v)，称取30g 1.5％白蛋白水溶液(w/v)于50mL烧杯中。称取30.0mg化合物4，溶解于有机溶剂(氯仿：无水乙醇＝85:15)中，药物用量比蛋白用量为1:15，有机溶剂与蛋白水溶液中的水的比例为1:44；高速搅拌，制备粗乳，得到白色乳液；将白色乳液在20000psi压力下均质，使粒径控制在50-200nm；将获得的化合物4白蛋白纳米粒溶液旋转蒸发，去除有机溶剂后，用0.22μm的无菌滤膜过滤。冷冻干燥，得到化合物4的白蛋白纳米粒的冻干粉末；所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表1所示，
表1
Figure BDA0001851227970000111
体内药效学评价：按本实施例所述方法制备化合物4白蛋白纳米制剂；
肿瘤模型建立：6～8周C57雌鼠，皮下接种B16-OVA细胞(5×105个细胞/只小鼠)。待肿瘤体积到50毫米3时，随机平均分为四组(化合物4白蛋白纳米制剂组、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组)，每组10只，分别静脉注射化合物4白蛋白纳米制剂、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液、紫杉醇白蛋白纳米制剂、NLG919及磷酸盐缓冲液，给药剂量为含有10mg紫杉醇/kg，含有NLG919量为2.56mg/kg。每3天给药1次，共给药5次；作生存曲线和体重对时间的变化曲线；如图1所示，化合物4白蛋白纳米制剂组、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组的中位数生存时间分别为：35天、27天、25天、22天和21天；结果表明，化合物4白蛋白纳米制剂组比单纯的紫杉醇白蛋白纳米制剂、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液有更好的抗肿瘤效果；如图2所示，给药5次后未造成小鼠体重的减轻，证实化合物4白蛋白纳米制剂的毒性低；
体内药效学评价：按本实施例所述方法制备化合物4白蛋白纳米制剂。肿瘤模型建立：6～8周BALB/c雌鼠，皮下接种4T1细胞(5×105个细胞/只小鼠)；待肿瘤体积到50毫米3时，随机平均分为四组(化合物4白蛋白纳米制剂组、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组)，每组10只，分别静脉注射化合物4白蛋白纳米制剂、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液、紫杉醇白蛋白纳米制剂、NLG919及磷酸盐缓冲液，给药剂量为含有10mg紫杉醇/kg，含有NLG919量为2.56mg/kg。每3天给药1次，共给药5次。作生存曲线和体重对时间的变化曲线；如图3所示，化合物4白蛋白纳米制剂组、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组的中位数生存时间分别为：45天、38天、35天、33天和22天。结果表明，化合物4白蛋白纳米制剂组比单纯的紫杉醇白蛋白纳米制剂、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液有更好的抗肿瘤效果。如图4所示，给药5次后未造成小鼠体重的减轻，证实化合物4白蛋白纳米制剂的毒性低。
实施例3：化合物7的合成
合成路线6
Figure BDA0001851227970000121
反应试剂和条件：
a.辛二酸酐、无水吡啶，60℃反应48小时
b.多西紫杉醇、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷，室温过夜；
实施例3中化合物5(脂肪酸化NLG919)的合成：
将NLG919(0.1g)和辛二酸酐(0.23g)置于50mL茄型瓶中，加入5mL无水吡啶溶解，60℃搅拌反应48小时。TLC检测反应进行。待反应完成后，冷却至室温。减压除去吡啶，剩余物用二氯甲烷溶解，经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝60：1)得到化合物5为白色固体,0.13g(产率：87％)。
实施例3中化合物7的合成：
向50mL茄型瓶中，依次加入化合物5(0.1g)、多西紫杉醇(化合物6，0.19g)、二环己基碳二亚胺(75mg)、4-二甲氨基吡啶(6mg)，用15mL无水二氯甲烷溶解。室温搅拌反应过夜。反应完毕后，旋干溶剂，剩余物重新溶于二氯甲烷，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝80：1)得到化合物7为白色固体,0.17g(产率：59％)。
实施例4：含有化合物7的白蛋白纳米制剂的制备及评价
将牛血清白蛋白溶解于水中混合均匀，蛋白浓度为2.0％(w/v)，称取30g 2.0％白蛋白水溶液(w/v)于50mL烧杯中。称取45.0mg化合物7，溶解于有机溶剂(二氯甲烷：无水乙醇＝90:10)中，药物用量比蛋白用量＝1:13，有机溶剂与蛋白水溶液中的水的比例为1:50。高速搅拌，制备粗乳，得到白色乳液；将白色乳液在18000psi压力下均质，使粒径控制在50-500nm；将获得的化合物7白蛋白纳米粒溶液旋转蒸发，去除有机溶剂后，用0.22μm的无菌滤膜过滤。冷冻干燥，得到化合物7的白蛋白纳米粒的冻干粉末。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表2所示。
表2
Figure BDA0001851227970000131
体内药效学评价：按本实施例所述方法制备化合物7白蛋白纳米制剂。肿瘤模型建立：6～8周C57雌鼠，皮下接种B16-OVA细胞(5×105个细胞/只小鼠)。待肿瘤体积到50毫米3时，随机平均分为四组(化合物7白蛋白纳米制剂组、多西紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、多西紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组)，每组10只，分别静脉注射化合物7白蛋白纳米制剂、多西紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液、多西紫杉醇白蛋白纳米制剂、NLG919及磷酸盐缓冲液，给药剂量为含有10mg紫杉醇/kg，含有5.11mgNLG919/kg。每3天给药1次，共给药5次。结果显示，化合物7白蛋白纳米制剂组、多西紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、多西紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组的中位数生存时间分别为：35.5天、27.5天、26天、24天和20天。结果表明，化合物7白蛋白纳米制剂组比单纯的多西紫杉醇白蛋白纳米制剂、多西紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液有更好的抗肿瘤效果。给药5次后，化合物7白蛋白纳米制剂未造成小鼠体重的减轻，证实化合物7白蛋白纳米制剂的毒性低。
实施例5：化合物10的合成
合成路线7
Figure BDA0001851227970000141
反应试剂和条件：
a.叔丁基二甲基氯甲烷、干燥二氯甲烷，室温5小时。
b.紫杉醇、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷，室温过夜
c.四丁基氟化铵、THF、室温3小时。
化合物8的合成：
将紫杉醇(化合物3，0.5g)置于50mL茄型瓶中，加入15mL无水二氯甲烷溶解，然后逐滴加入0.3mL叔丁基二甲基氯甲烷。室温搅拌反应5小时。TLC检测反应进行。待反应完成后，减压除去溶剂及未反应的叔丁基二甲基氯甲烷，剩余物用二氯甲烷溶解，经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100：1)得到化合物8为白色固体,0.40g(产率：70％)。
化合物9的合成：
向50mL茄型瓶中，依次加入化合物2(0.1g)、化合物8(0.25g)、二环己基碳二亚胺(63mg)、4-二甲氨基吡啶(5mg)，用10mL无水二氯甲烷溶解。室温搅拌反应过夜。反应完毕后，旋干溶剂，剩余物重新溶于二氯甲烷，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝80：1)得到化合物9为白色固体,0.21g(产率：62％)。
化合物10的合成：
将化合物9(0.1g)溶于6mL无水THF中,加入四丁基氟化铵，室温搅拌3小时，旋除溶剂，剩余物重新溶于二氯甲烷，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝80：1)得到化合物10为白色固体,63mg(产率：72％)。
实施例6：含有化合物10的白蛋白纳米制剂的制备及评价
将重组人血清白蛋白溶解于水中混合均匀，蛋白浓度为1.0％(w/v)，称取30g1.0％白蛋白水溶液(w/v)于50mL烧杯中。称取30.0mg化合物10，溶解于有机溶剂(氯仿：丙二醇＝85:15)中，药物用量比蛋白用量＝1:10，有机溶剂与蛋白水溶液中的水的比例为1:40。高速搅拌，制备初乳，得到白色乳液；将白色乳液在18000psi压力下均质，使粒径控制在50-200nm；将获得的化合物10白蛋白纳米粒溶液旋转蒸发，去除有机溶剂后，用0.22μm的无菌滤膜过滤。冷冻干燥，得到化合物10的白蛋白纳米粒的冻干粉末。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表3所示；
表3
Figure BDA0001851227970000151
实施例7：化合物12、13和14的合成
合成路线8
Figure BDA0001851227970000161
反应试剂和条件：
a.二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷，室温48小时
实施例7中化合物11、12和13的合成
向50mL茄型瓶中，依次加入化合物5(1.72g)、化合物7(0.50g)、二环己基碳二亚胺(0.81g)、4-二甲氨基吡啶(50mg)，用30mL无水二氯甲烷溶解。室温搅拌反应过夜。反应完毕后，旋干溶剂，剩余物重新溶于二氯甲烷，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100:1-60：1)依次分离得到化合物11为白色固体,0.19g(产率：28％)，化合物12为白色固体,51mg(产率：8％)以及化合物13为白色固体,25mg(产率：3％)。
实施例8：含有化合物11的白蛋白纳米制剂的制备及评价
将人血清白蛋白溶解于水中混合均匀，蛋白浓度为1.5％(w/v)，称取30g 1.5％白蛋白水溶液(w/v)于50mL烧杯中。称取30.0mg化合物11，溶解于有机溶剂(氯仿：无水乙醇＝85:15)中，药物用量比蛋白用量＝1:15，有机溶剂与蛋白水溶液中的水的比例为1:45。高速搅拌，制备初乳，得到白色乳液；将白色乳液在18000psi压力下均质，使粒径控制在50-200nm；将获得的化合物11白蛋白纳米粒溶液旋转蒸发，去除有机溶剂后，用0.22μm的无菌滤膜过滤。冷冻干燥，得到化合物11的白蛋白纳米粒的冻干粉末。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表4所示。
表4
Figure BDA0001851227970000171
体内药效学评价：按本实施例所述方法制备化合物11白蛋白纳米制剂。肿瘤模型建立：6～8周C57雌鼠，皮下接种B16-OVA细胞(5×105个细胞/只小鼠)。待肿瘤体积到50毫米3时，随机平均分为四组(化合物11白蛋白纳米制剂组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组)，每组10只，分别静脉注射化合物8白蛋白纳米制剂、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂、NLG919及磷酸盐缓冲液，给药剂量为含有10mg多烯紫杉醇/kg，含有5.40mg NLG919/kg。每3天给药1次，共给药5次。结果显示，化合物11白蛋白纳米制剂组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液和对照组的中位数生存时间分别为：36天、27.5天、25天、23天和21天。结果表明化合物11白蛋白纳米制剂组比单纯的多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液有更好的抗肿瘤效果。给药5次后，化合物11白蛋白纳米制剂未造成小鼠体重的减轻，证实化合物11白蛋白纳米制剂的毒性低。
实施例9：含有化合物12的白蛋白纳米制剂的制备及评价
将人血清白蛋白溶解于水中混合均匀，蛋白浓度为1.5％(w/v)，称取30g 1.5％白蛋白水溶液(w/v)于50mL烧杯中。称取45.0mg化合物12，溶解于有机溶剂(氯仿：无水乙醇＝86:14)中，药物用量比蛋白用量＝1:10，有机溶剂与蛋白水溶液中的水的比例为1:44。高速搅拌，制备初乳，得到白色乳液；将白色乳液在18000psi压力下均质，使粒径控制在50-300nm；将获得的化合物12白蛋白纳米粒溶液旋转蒸发，去除有机溶剂后，用0.22μm的无菌滤膜过滤。冷冻干燥，得到化合物12的白蛋白纳米粒的冻干粉米。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表5所示，
表5
Figure BDA0001851227970000181
体内药效学评价：按本实施例所述方法制备化合物12白蛋白纳米制剂。肿瘤模型建立：6～8周C57雌鼠，皮下接种B16-OVA细胞(5×105个细胞/只小鼠)。待肿瘤体积到50毫米3时，随机平均分为四组(化合物12白蛋白纳米制剂组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液和对照组)，每组10只，分别静脉注射化合物12白蛋白纳米制剂、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液、多烯醇白蛋白纳米制剂、NLG919及磷酸盐缓冲液，给药剂量为含有10mg多烯紫杉醇/kg，含有2.70mg NLG919/kg。每3天给药1次，共给药5次。结果显示，化合物12白蛋白纳米制剂组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919溶液组和对照组的中位数生存时间分别为：33天、26.5天、25天、22天和20天。结果表明，化合物12白蛋白纳米制剂组比单纯的多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液有更好的抗肿瘤效果。给药5次后，化合物12白蛋白纳米制剂未造成小鼠体重的减轻，证实化合物12白蛋白纳米制剂的毒性低。
实施例10：含有化合物13的白蛋白纳米制剂的制备及评价
将人血清白蛋白溶解于水中混合均匀，蛋白浓度为1.5％(w/v)，称取30g 1.5％白蛋白水溶液(w/v)于50mL烧杯中。称取30.0mg化合物13，溶解于有机溶剂(氯仿：无水乙醇＝87:13)中，药物用量比蛋白用量＝1:15，有机溶剂与蛋白水溶液中的水的比例为1:44。高速搅拌，制备初乳，得到白色乳液；将白色乳液在20000psi压力下均质，使粒径控制在50-200nm；将获得的化合物13白蛋白纳米粒溶液旋转蒸发，去除有机溶剂后，用0.22μm的无菌滤膜过滤。冷冻干燥，得到化合物13的白蛋白纳米粒的冻干粉末。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表6所示，
表6
Figure BDA0001851227970000191
体内药效学评价：按本实施例所述方法制备化合物13白蛋白纳米制剂。肿瘤模型建立：6～8周C57雌鼠，皮下接种B16-OVA细胞(5×105个细胞/只小鼠)。待肿瘤体积到50毫米3时，随机平均分为四组(化合物13白蛋白纳米制剂组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组)，每组10只，分别静脉注射化合物13白蛋白纳米制剂、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂、NLG919及磷酸盐缓冲液，给药剂量为含有10mg多烯紫杉醇/kg，含有8.10mg NLG919/kg。每3天给1次药，共给药5次。结果显示，化合物13白蛋白纳米制剂组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组的中位数生存时间分别为：39天、27.5天、25天、23天和21天。结果表明，化合物13白蛋白纳米制剂组比单纯的多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液有更好的抗肿瘤效果。给药5次后，化合物13白蛋白纳米制剂未造成小鼠体重的减轻，证实化合物13白蛋白纳米制剂的毒性低。
实施例11：化合物15的合成
合成路线9
Figure BDA0001851227970000201
反应试剂和条件：
a.紫杉醇、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷，室温过夜；
b.四丁基氟化铵、THF、室温3小时。
实施例11中化合物14的合成
向50mL茄型瓶中，依次加入化合物2(0.1g)、化合物9(0.41g)、二环己基碳二亚胺(80mg)、4-二甲氨基吡啶(5mg)，用10mL无水二氯甲烷溶解。室温搅拌反应过夜。反应完毕后，旋干溶剂，剩余物重新溶于二氯甲烷，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝80：1)依次分离得到化合物11为白色固体,0.25g(产率：58％)。
实施例11中化合物15的合成
将化合物14(0.2g)溶于8mL无水THF中,加入四丁基氟化铵，室温搅拌3小时。旋除溶剂，剩余物重新溶于二氯甲烷，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1)得到化合物15为白色固体,0.13g(产率：72％)。
实施例12：含有化合物15的白蛋白纳米制剂的制备及评价
将人血清白蛋白溶解于水中混合均匀，蛋白浓度为1.5％(w/v)，称取30g 1.5％白蛋白水溶液(w/v)于50mL烧杯中。称取30.0mg化合物15，溶解于有机溶剂(氯仿：无水乙醇＝87:13)中，药物用量比蛋白用量＝1:15，有机溶剂与蛋白水溶液中的水的比例为1:44。高速搅拌，制备初乳，得到白色乳液；将白色乳液在20000psi压力下均质，使粒径控制在50-200nm；将获得的化合物15白蛋白纳米粒溶液旋转蒸发，去除有机溶剂后，用0.22μm的无菌滤膜过滤。冷冻干燥，得到化合物15的白蛋白纳米粒的冻干粉末。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表7所示，
表7
Figure BDA0001851227970000211
体内药效学评价：按本实施例所述方法制备化合物15白蛋白纳米制剂。肿瘤模型建立：6～8周C57雌鼠，皮下接种B16-OVA细胞(5×105个细胞/只小鼠)。待肿瘤体积到50毫米3时，随机平均分为5组(化合物15白蛋白纳米制剂组、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组)，每组10只，分别静脉注射化合物15白蛋白纳米制剂、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液、紫杉醇白蛋白纳米制剂、NLG919及磷酸盐缓冲液，给药剂量为含有10mg紫杉醇/kg，含有8.10mg NLG919/kg。每3天给1次药，共给药5次。结果显示，化合物15白蛋白纳米制剂组、紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液组、紫杉醇白蛋白纳米制剂组、NLG919水溶液组和对照组的中位数生存时间分别为：43天、26天、24天20天和19天。结果表明，化合物15白蛋白纳米制剂组比单纯的多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂、多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂与NLG919的混合液有更好的抗肿瘤效果。给药5次后，化合物15白蛋白纳米制剂未造成小鼠体重的减轻，证实化合物15白蛋白纳米制剂的毒性低。

Claims (12)

1.一种免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物，其特征在于，所述的免疫调节因子是吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂NLG919；所述的紫杉烷是紫杉烷类化合物选自紫杉醇或多烯紫杉醇；所述的共价链接物是由脂肪酸酐分别与NLG919的羟基和紫杉烷类化合物的羟基通过酯键缩合反应链接得到的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药；
其结构通式包括紫杉烷和不同碳链长度的脂肪酸化NLG919，结构如通式I所示：
Figure FDA0001851227960000011
Figure FDA0001851227960000012
R2,R3,R4＝H,
Figure FDA0001851227960000013
m,n＝0-10；R5＝H,-CH3,-C2H5或-C3H7
其中，
R1是苯基或叔丁氧基；
R2,R3,R4中至少有一个基团含有酯化的NLG919，m和n是0-10；
R5是氢，甲基，乙基或丙基。
2.按权利要求1所述的免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物链接物，其特征在于，所述的共价链接物通过脂肪酸酐与NLG919的羟基缩合得到脂肪酸化NLG919，再与紫杉醇或多烯紫杉醇的羟基(2’位、或7位、或10位、或7位和10位、或2’位和7位、或2’位和10位、或2’位和7位和10位)缩合得到。
3.按权利要求1所述免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物链接物的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
合成路线1
Figure FDA0001851227960000021
其中，R1,R5同上述权利要求1中的一致，m和n是0-10；
所述合成路线1中的试剂和条件包括：
a.NLG919的脂肪酸化：
选用脂肪酸酐，以吡啶、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，在加热条件下反应得到脂肪酸化NLG919；优选地，所述的引入条件为NLG919与脂肪酸酐在吡啶溶液中，加热至60℃反应48小时；
b.紫杉烷化合物与脂肪酸化NLG919的酯化反应：
采用的缩合剂为二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯等；优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺。
4.按权利要求1所述免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物链接物的制备方法，其特征在于合成路线如下：
合成路线2
Figure FDA0001851227960000031
其中，R1,R5同上述权利要求1中的一致，m和n是0-10；
所述合成路线2中的试剂和条件包括：
a.紫杉烷化合物2’位羟基的保护：
选用羟基保护剂：三异丙基硅基、三乙基硅基、二苯基叔丁基硅基、叔丁基二甲基氯甲烷；优选地，所述的保护剂为叔丁基二甲基氯甲烷；
b.保护后的紫杉烷化合物与脂肪酸化的NLG919的酯化反应：
采用缩合剂：二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺；
c.选择性的脱去紫杉烷化合物结构中2’位羟基的保护基：
反应条件：四丁基氟化铵和THF，室温。
5.按权利要求1所述免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物链接物的制备方法，其特征在于合成路线如下：
合成路线3
Figure FDA0001851227960000041
其中，R1,R5同上述权利要求1中的一致，m和n是0-10；
所述合成路线3中的试剂和条件包括：
a.紫杉烷化合物与脂肪酸化NLG919的酯化反应：
采用缩合剂：二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺。
6.按权利要求1所述免疫调节因子与紫杉烷的共价链接物链接物的制备方法，其特征在于合成路线如下：
合成路线4
Figure FDA0001851227960000051
其中，R1,R5同上述权利要求1中的一致，m和n是0-10；
所述合成路线4中的试剂和条件包括：
a.紫杉烷化合物与脂肪酸化NLG919的酯化反应：
采用缩合剂：二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；优选地，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺；
b.选择性的脱去紫杉烷化合物结构中2’位羟基的保护基：
反应条件为：四丁基氟化铵和THF，室温。
7.一种白蛋白纳米制剂，其特征在于，由权利要求1所述的链接物和白蛋白组成。
8.按权利要求7所述的白蛋白纳米制剂，其特征在于，所述链接物与白蛋白的质量比为1:6-1:20。
9.按权利要求7所述的白蛋白纳米制剂，其特征在于，所述白蛋白纳米制剂其粒径为50-1000nm。
10.按权利要求7所述的白蛋白纳米制剂，其特征在于，所述白蛋白选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白和牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物。
11.按权利要求7所述的白蛋白纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将白蛋白溶解于水中；
(2)将上述权利要求1、2、3、4、5和6中任一所述链接物溶解于有机溶剂中；
(3)将步骤(1)的水溶液与步骤(2)的有机溶液混合均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液高压均质；
(5)将步骤(4)得到的产物减压去除有机溶剂。
12.按权利要求11所述的白蛋白纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述白蛋白水溶液浓度为0.5％-5％w/v。
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