CN111108390A - 用于诊断胃癌的组合物和使用组合物进行诊断胃癌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于诊断胃癌的组合物和一种使用该组合物进行诊断胃癌的方法。具体地，本发明的用于诊断胃癌的组合物允许通过检查体液中特异性蛋白的表达量以便早期诊断胃癌，从而能够早期治疗胃癌并有效地用于改善胃癌患者的生存率。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于诊断胃癌的组合物和一种使用该组合物进行诊断胃癌的方法。
背景技术
胃癌是世界上第四大常见的癌症，并且是导致癌症死亡的第二大主要原因。在东亚、东欧和拉丁美洲的部分地区，胃癌的发病率很高。特别是，据报道在亚洲(如韩国和日本)有许多胃癌患者，这是由于生活条件的差异所致，尤其是饮食生活的差异。韩国人每天食用的盐几乎是西方人的两倍，特别是在韩国、日本、芬兰和冰岛，人们食用咸鱼，其胃癌的发病率很高。另外，遗传因素与饮食习惯一样被认为是胃癌的风险因素。已报告在第一代胃癌患者中胃癌发病率较高。第三个风险因素是幽门螺杆菌感染。很难判断幽门螺杆菌感染与胃癌之间的因果关系是至关重要的。但是，在韩国人中，有40％至60％的消化***疾病和胃癌患者中检出幽门螺杆菌，这表明感染幽门螺杆菌的人患胃癌的可能性相对较高。因此，消除幽门螺杆菌已成为预防胃炎和胃癌的方法。
通常，具有调节正常细胞增殖的功能的基因被修饰时，就会产生癌细胞，从而产生增殖不受调控的细胞。癌细胞位于胃粘膜中的情况被分类为早期胃癌，并且发现早期胃癌患者的预后相对较好。因此，胃癌的早期诊断和治疗将有助于降低因胃癌引起的死亡率和降低癌症治疗成本。
胃癌表现出多种症状，从无症状到重度疼痛。胃癌在早期无症状，即使出现症状，大多数人也不会注意到，而且可能会忽视，因为这些症状最多就像轻微的消化不良或腹部不适一样。
迄今为止，胃癌的检测方法大多为物理方法。检测方法包括胃X射线成像(如双对比法)、压迫法和粘膜成像以及胃镜检查。在胃镜检查期间，可以直接观察胃，甚至可以检测出X射线上未出现的微小病变，并且可以在疑似患胃癌部位直接进行活检，从而提高胃癌的诊断率。然而，在检查过程中存在卫生问题和痛苦的缺点。
治疗胃癌的最佳方法是手术，手术的目的是使胃癌完全康复。切除的原则是尽可能的扩大范围，但是切除范围应考虑广泛切除的术后后果来确定。切除不仅涉及胃，还涉及周围的几个器官，因此难以保证患者的预后。另外，当胃癌已经转移至其他器官时，无法进行根治性手术，因此只能采用化疗、放疗等其他治疗方法。目前可用的抗癌药物仅对缓解症状、预防复发和延长切除后的生存时间方面具有暂时性作用。
为了克服上述问题，需要开发一种用于胃癌早期诊断的新方法，并且正在进行寻找胃癌生物标志物的研究。具体地，韩国专利号10-1438530描述了一种用于诊断胃癌的生物标志物组合物，其包含神经降压素和胆囊收缩素，以及一种使用该生物标志物组合物用于诊断的方法，韩国专利号10-0645979描述了20种胃癌基因标志物，包括CKS1B和SKB1，以及一种使用这些标志物的胃癌诊断试剂盒。筛选生物标志物和开发测量能够准确诊断胃癌的诊断标志物的试剂，是攻克胃癌的最大挑战。
为了筛选用于诊断胃癌的生物标志物，本发明人采用统计学技术，分析了胃癌患者和正常血清中蛋白的表达模式，并选择EGFR(表皮生长因子受体)、TTR(转甲状腺素蛋白)、ApoA1(载脂蛋白A1)、RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌的因子)、LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1)和D.二聚体蛋白作为生物标志物。另外，将蛋白标志物的组合用于胃癌诊断和筛选时，通过确认可以高度准确地区分胃癌患者和正常人来完成本发明。
发明内容
发明目的
本发明的目的是提供一种用于诊断胃癌的组合物和试剂盒，其包含与选择的生物标志物特异性结合的检测试剂。
本发明的另一目的是提供一种提供胃癌诊断信息的方法，其使用所述用于诊断胃癌的组合物。
技术方案
为实现上述目的，本发明提供了一种用于诊断胃癌的组合物，其包含与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物选自以下：EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
本发明还提供了一种用于诊断胃癌的试剂盒，其包含所述用于诊断胃癌的组合物。
本发明还提供了一种用于诊断胃癌的试剂盒，其包含选自引物、探针和反义核苷酸中的至少一种，所述反义核苷酸与编码生物标志物的基因的核酸序列特异性结合，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
本发明还提供了一种提供胃癌诊断信息的方法，其包括以下步骤：1)测量样品中蛋白的表达水平，所述蛋白选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体；和2)将步骤1)的蛋白表达水平与正常受试者的蛋白表达水平进行比较。
本发明还提供了一种提供胃癌诊断信息的方法，其包括以下步骤：1)测量样品中编码至少一种蛋白的基因的表达水平，所述蛋白选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体；和2)将步骤1)的基因表达水平与正常受试者的基因表达水平进行比较。
本发明还提供了一种与生物标志物特异性结合的检测试剂在制备用于诊断胃癌的组合物中的用途，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
本发明还提供了一种用于诊断胃癌的组合物在制备用于诊断胃癌的试剂盒中的用途。
另外，本发明提供了引物、探针和反义核苷酸中的至少一种在制备用于诊断胃癌的试剂盒中的用途，其中，所述反义核苷酸与编码生物标志物的基因的核酸序列特异性结合，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
有益效果
本发明的用于诊断胃癌的组合物通过确认体液中特异性蛋白的表达水平，使胃癌能够早期诊断，和使胃癌能够早期治疗，可以有效地用于提高胃癌患者的生存率。
具体实施方式
下文将详细描述本发明。
本发明提供了一种用于诊断胃癌的组合物，其包含与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体蛋白可以是由本领域已知的任何序列组成的多肽。
该多肽可以是在不影响蛋白功能的范围内，通过氨基酸残基的缺失、***、取代或其组合而具有不同序列的氨基酸的变体或片段。整体上不改变分子活性的蛋白或肽中的氨基酸交换是本领域已知的。在某些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化等进行修饰。
检测试剂可以是选自抗体、抗体片段、核酸适配体和D-肽中的任一种或多种。所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。所述抗体可以使用本领域公知的技术容易地制备。所述抗体片段可以包括抗体分子的功能片段。抗体分子的功能片段是指至少具有抗原结合功能的片段，可以是Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv等。所述核酸适配体是具有与靶分子结合活性的寡核苷酸分子，可以是RNA、DNA、修饰的寡核苷酸或其混合物，并且可以是线性或环状形式。
单克隆抗体可以使用本领域公知的杂交瘤技术或噬菌体抗体文库技术进行制备。通常，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞可以通过将癌细胞与从免疫学上合适的宿主动物(如注射抗原蛋白的小鼠)分离的免疫细胞融合进行制备。这两组的细胞融合可以使用本领域已知的方法进行，如使用聚乙二醇，并且可以通过标准的培养方法增殖产生抗体的细胞。使用有限稀释法进行亚克隆以获得均匀的细胞群，然后可以通过在体外或体内大规模培养制备能够产生抗原特异性抗体的杂交瘤细胞。通过上述方法制备的抗体可以使用如凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换色谱、亲和色谱等方法分离和纯化。
根据本领域公知的方法，可以通过将生物标志物蛋白或其片段、免疫原注射至外部宿主中来制备多克隆抗体。外部宿主可以是哺乳动物，如小鼠、大鼠、绵羊和家兔。当通过肌内、腹腔或皮下注射免疫原时，可以与佐剂共同给药以增加抗原性。然后，定期从外部宿主收集血液，以获得显示出滴度和抗原特异性提高的血清，可以从中分离和纯化抗体。
检测试剂可以是标记有检测剂的共轭物，所述检测剂如显色酶、荧光材料、放射性同位素或胶体。所述显色酶可以是过氧化物酶、碱性磷酸酶或酸性磷酸酶，并且所述荧光材料可以是荧光素羧酸(FCA)、异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素硫脲(FTH)、7-乙酰氧基香豆素-3-基、荧光素-5-基、荧光素6-基、2',7'-二氯荧光素-5-基、2',7'-二氯荧光素-6-基、二氢四甲基糖胺-4-基、四甲基罗丹明-5-基、四甲基罗丹明-6-基、4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚烯-3-乙基或4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚烯-3-乙基、Cy3、Cy5、聚L-赖氨酸-异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC)、PE(藻红蛋白)或罗丹明。
检测试剂可以进一步包括可以与检测试剂特异性结合的配体。所述配体可以是标记有检测剂的共轭物，所述检测剂如显色酶、荧光材料、放射性同位素或胶体，以及经链霉亲和素或亲和素处理的配体。
除了上述检测试剂之外，本发明的诊断组合物可以包括蒸馏水或缓冲液以稳定保持其结构。
在本发明的具体实施方式中，本发明人采用统计学技术，分析从胃癌患者和正常受试者获得的血清中蛋白的表达模式，并选择胃癌的生物标志物EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体蛋白。另外，本发明人使用这些生物标志物的组合构建分类模型，并确证该分类模型可以高度准确地将胃癌患者与正常人区分(表3-6)。
本发明还提供了一种用于诊断胃癌的试剂盒，其包含本发明的用于诊断胃癌的组合物。
所述用于诊断胃癌的组合物可以具有上述特征。例如，所述用于诊断胃癌的组合物可以包括与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
检测试剂可以具有上述特征。例如，检测试剂可以是选自抗体、抗体片段、核酸适配体和D-肽中的任一种。检测试剂可以结合至固体基质以促进后续步骤，如洗涤或分离复合物。作为固体基质，可以使用合成树脂、硝酸纤维素、玻璃基质、金属基质、玻璃纤维、微球或微珠。另外，聚酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、PVDF或尼龙可以用作合成树脂。
该试剂盒可区分检测受试者是否属于胃癌风险人群，使医疗从业人员(如医生)能够诊断胃癌，以及监控患者对治疗的反应并根据结果改变治疗。该试剂盒还可以用于鉴定在胃癌模型(如小鼠和大鼠)中体内或离体调节一种或多种标志物表达的化合物。
该用于诊断胃癌的试剂盒可以通过本领域技术人员已知的常规方法制备，并可以进一步包括缓冲液、稳定剂、非活性蛋白等。
为了检测检测试剂的量，该试剂盒通过荧光方法使用高通量筛选(HTS)***，该荧光方法通过检测作为检测剂的荧光材料的荧光或者通过放射免疫进行，所述放射免疫通过检测作为检测剂的放射性同位素的放射线进行，使用SPR(表面等离子体共振)实时测量表面等离子体共振变化，而无需标记检测物或SPRI(表面等离子体共振成像)来成像和确认SPR***。
在本发明的具体实施方式中，本发明人采用统计学技术，分析从胃癌患者和正常受试者获得的血清中蛋白的表达模式，并选择胃癌的生物标志物EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体蛋白。另外，本发明人使用这些生物标志物的组合构建分类模型，并确证该分类模型可以高度准确地将胃癌患者与正常人区分(表3-6)。
本发明还提供了一种用于诊断胃癌的试剂盒，其包含选自引物、探针和反义核苷酸中的至少一种，所述反义核苷酸与编码生物标志物的基因的核酸序列特异性结合，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
所述EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体蛋白可以具有上述特征。所述引物与编码本发明中筛选的生物标志物的基因互补，可以使用设计用于将其扩增的任何引物。
在本说明书中使用的术语“探针”是指对应于与DNA或RNA特异性结合的几个至几百个核苷酸的核酸片段，其可用于确认特定DNA或RNA的存在或不存在。该探针可以以寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针、RNA探针等形式制备，并且可以用生物素、FITC、罗丹明、DIG(洋地黄毒苷)或放射性同位素标记。
所述反义核苷酸可以具有双链或单链DNA、双链或单链RNA、DNA/RNA杂合体、DNA和RNA类似物和核苷酸、糖或骨架修饰。
所述用于诊断胃癌的试剂盒可以具有上述特征。
在本发明的具体实施方式中，本发明人采用统计学技术，分析从胃癌患者和正常受试者获得的血清中蛋白的表达模式，并选择胃癌的生物标志物EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体蛋白。另外，本发明人使用这些生物标志物的组合构建分类模型，并确证该分类模型可以高度准确地将胃癌患者与正常人区分(表3-6)。
本发明还提供了一种提供胃癌诊断信息的方法，其包括以下步骤：1)测量样品中蛋白的表达水平，所述蛋白选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体；和2)将步骤1)的蛋白表达水平与正常受试者的蛋白表达水平进行比较。
步骤1)的样品可以包括能够鉴定疾病特异性多肽的生物样品，所述疾病特异性多肽可以与正常状态(如尿液、血液、血清或血浆)区分开。具体地，样品可以是血液、血清或血浆、生物液体样品。在本发明的优选实施方式中，所述样品可以是血清。
可以使用阴离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、液相色谱、连续萃取、离心或凝胶电泳对样品进行预处理。在本发明的优选实施方式中，所述样品可以通过离心进行预处理。
步骤1)的表达水平可以通过选自Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学染色、免疫沉淀和免疫荧光法中的任一种或多种方法进行测量。此时，与对照的蛋白表达水平相比，EGFR、TTR、ApoA1和RANTES蛋白的表达水平降低，但与对照的蛋白表达水平相比，LRG1和D.二聚体蛋白的表达水平升高。
在本发明的具体实施方式中，本发明人采用统计学技术，分析从胃癌患者和正常受试者获得的血清中蛋白的表达模式，并选择胃癌的生物标志物EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体蛋白。另外，本发明人使用这些生物标志物的组合构建分类模型，并确证该分类模型可以高度准确地将胃癌患者与正常人区分(表3-6)。
本发明还提供了一种提供胃癌诊断信息的方法，其包括以下步骤：1)测量样品中编码蛋白的基因的表达水平，所述蛋白选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体；和2)将步骤1)的基因表达水平与正常受试者的基因表达水平进行比较。
步骤1)的样品可以包括能够鉴定疾病特异性核苷酸的生物样品，所述疾病特异性核苷酸可以与正常状态(如尿液、血液、血清或血浆)区分开。具体地，样品可以是血液、血清或血浆、生物液体样品。在本发明的优选实施方式中，所述样品可以是血清。
步骤1)的表达水平可以通过逆转录聚合酶链反应或实时聚合酶链反应进行测量。此时，与对照的蛋白表达水平相比，EGFR、TTR、ApoA1和RANTES蛋白的表达水平降低，但与对照的蛋白表达水平相比，LRG1和D.二聚体蛋白的表达水平升高。
在本发明的具体实施方式中，本发明人采用统计学技术，分析从胃癌患者和正常受试者获得的血清中蛋白的表达模式，并选择胃癌的生物标志物EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体蛋白。另外，本发明人使用这些生物标志物的组合构建分类模型，并确证该分类模型可以高度准确地将胃癌患者与正常人区分(表3-6)。
本发明还提供了一种与生物标志物特异性结合的检测试剂在制备用于诊断胃癌的组合物中的用途，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
所述用于诊断胃癌的组合物和检测试剂可以具有上述特征。例如，所述用于诊断胃癌的组合物可以包括与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
本发明还提供了一种用于诊断胃癌的组合物在制备用于诊断胃癌的试剂盒中的用途。
所述用于诊断胃癌的试剂盒可以包括具有上述特征的用于诊断胃癌的组合物。例如，所述用于诊断胃癌的组合物可以包括与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
另外，本发明提供了引物、探针和反义核苷酸中的至少一种在制备用于诊断胃癌的试剂盒中的用途，其中，所述反义核苷酸与编码生物标志物的基因的核酸序列特异性结合，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
所述生物标志物可以具有上述特征。另一方面，所述引物与编码根据本发明的生物标志物的基因互补，并且所述引物可以扩增所述基因。
下文将通过以下实施例详细描述本发明。
然而，以下实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的内容。
实施例1：血清获取
从首尔国立大学医院家庭医学科的458例正常受试者(男性：277例，女性：181例)获得血清。分别从启明大学东山医学中心生物库和釜山国立大学医院生物库的80例和20例胃癌患者(男：66例，女：34例)中获得血清。从正常或胃癌患者中收集外周血(5ml)，将其放入Vacutainer SST II试管(美国BD公司)中，并置于室温下。1小时后，将试管以3000g离心5分钟，取上清液以获得血清。将获得的血清保存在-80℃下直至使用。
实施例2：蛋白定量
为了筛选胃癌生物标志物候选物，首先从人体中成千上万的蛋白中选择120个蛋白标志物候选物组。然后，考虑到临床意义、易于分析、算法准确度、成本和临床病症，使用二维电泳和SELDI-TOF MS，从120个蛋白标志物候选组中选择约50个标志物。通过对350多例胃癌患者和400例正常人的结果进行统计学分析，研究了疗效。最终，选择18种蛋白，如ApoA1、ApoA2、AFP、CEA、CA125、CA19-9、TTR、B2M、CRP、CYFRA21-1、VDBP、ApoA4、PAI-1、sVCAM-1、RANTES、EGFR、LRG1和D.二聚体作为胃癌生物标志物候选物，使用实施例1的血清样品定量18种蛋白，如下以进行其统计学分析。
2-1.抗体、试剂盒和标准蛋白
使用试剂盒或下表1和2所述的抗体定量ApoA1、ApoA2、AFP、CEA、CA125、CA19-9、TTR、B2M、CRP、CYFRA21-1、VDBP、ApoA4、PAI-1、sVCAM-1、RANTES、EGFR、LRG1和D.二聚体。对于标准蛋白，RNATES蛋白购自派普泰克，sVCAM-1、EGFR和LRG1蛋白购自R&D Systems，PAI-1蛋白购自Calbiochem，VDBP蛋白购自Biodesign，以及ApoA4蛋白由本发明人制备。ApoA1和ApoA2蛋白的主要试剂和校准品购自日本积水，TTR和CRP蛋白的主要试剂和校准品购自西门子，CEA、CYFRA21-1、B2M、AFP、CA125、D.二聚体和CA19-9蛋白的主要试剂和校准品购自罗氏公司。
【表1】
抗体、试剂盒和标准蛋白的生产商
【表2】
抗体、试剂盒和标准蛋白的生产商
2-2.EGFR和LRG1蛋白的定量
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量EGFR和LRG1蛋白的血清浓度，该酶联免疫吸附测定是一种使用抗体捕获抗原和使用酶标记的抗体估计抗原量的免疫测定方法。EGFR和LRG1蛋白的检测抗体用生物素标记，并将其用于ELISA。
特别是，为了生物素化EGFR和LRG1检测抗体，将400μg抗人EGFR抗体(R&Dsystems，美国)或抗人LRG1抗体(R&D systems,美国)加入800μl PBS溶液中，并加入10mMEZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(磺基琥珀酰亚胺基-6-[生物素-酰氨基]己酸酯，赛默飞世尔科技，美国)溶液，使溶液的摩尔比为抗体的20倍，然后在室温下反应30分钟。完成生物素标记时，通过加入1L的PBS溶液重复透析3次，将其于-80℃下保存。
为了定量EGFR和LRG1蛋白，将100μl的1.0μg/ml抗人LRG-1捕获抗体(R&Dsystems，美国)或抗人EGFR捕获抗体(R&D systems，美国)加入96孔微孔板的每个孔中(Nalgene Nunc Inc.，美国)，然后在4℃反应过夜。第二天，将孔用含0.05％吐温20的PBS溶液洗涤3次，然后向每个孔中加入含5％脱脂乳的PBS溶液，随后在室温下搅拌1小时以阻断非特异性结合。用含0.05％吐温20的PBS洗涤孔3次后，将100μl EGFR或LRG1标准蛋白和100μl实施例1中获得的正常或胃癌患者血清加入板的每个孔中，在室温下反应2小时，然后洗涤3次。将通过上述方法制备的生物素标记的检测抗体以0.15μg/ml的浓度负载至板的每个孔中，并在室温下再反应1小时。反应完成后，将板洗涤3次，以0.5μg/ml的浓度向其中加入链霉亲和素-辣根-过氧化物酶(西格玛奥德里奇，美国)，然后在室温下反应30分钟。反应完成后，将板洗涤五次。为了诱导显色，将50μl的TMB(四甲基联苯胺，KPL，美国)加入板的每个孔中。15分钟后，通过向板的每个孔中加入50μl的2N硫酸以终止反应。然后，使用酶标仪(Emax，分子器件有限责任公司，美国)测量OD450。使用SoftMax Pro软件(分子器件)通过5-参数曲线拟合分析测量值。
2-3.RANTES、sVCAM-1、ApoA4、PAI-1和VDBP蛋白的定量
使用xMAP技术平台(路明克斯公司，美国)通过多重免疫测定法测量血清RANTES、sVCAM-1、ApoA4、PAI-1和VDBP蛋白的浓度。通过碳二亚胺法将与捕获抗体偶联的微球用于免疫测定。在整个过程中，微球的曝光最小。
特别地，通过涡旋混合MagPlex(路明克斯公司)微球悬浮液，然后悬浮在超声处理容器(Sonicor仪器公司，美国)中20秒。将1×106个微球转移到微管中。使用磁铁分离微球，并除去溶液。将微球用100μl蒸馏水洗涤，然后重悬于80μl的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.2)中。然后，向其中加入10μl的50mg/ml N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(赛默飞世尔科技，美国)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(赛默飞世尔科技，美国)，然后在室温下反应20分钟。此时，以10分钟的间隔混合反应物。将微球用250μl的50mM MES(pH 5.0)洗涤两次，然后重悬于100μl的50mM MES(pH 5.0)中。将10μg抗RANTES、抗sVCAM-1、抗ApoA4、抗PAI-1或抗VDBP抗体和50mM MES溶液加入羧基活化的微球中，使其最终体积为500μl，随后在室温下混合2小时。抗体结合反应完成后，将微球用500μl的PBS-TBN(含1％BSA、0.02％吐温20和0.05％叠氮化钠的PBS)洗涤两次，然后用血球计数器计数。将偶联抗体的微球以1×106的密度悬浮于500μl的PBS-TBN溶液中，并于2-8℃下避光保存。
RANTES和sVCAM-1蛋白通过多重测定进行定量(在一个孔中同时测量几种蛋白。)，ApoA4、PAI-1和VDBP蛋白通过单一测定进行定量(在一个孔中仅测定一种蛋白)。特别地，将实施例1中获得的20μl正常人和胃癌患者血清和与通过上述方法制备的抗RANTES、sVCAM-1、ApoA4、PAI-1或VDBP蛋白的捕获抗体偶联的20μl混合微球混合。将20μl的RANTES、sVCAM-1、ApoA4、PAI-1或VDBP标准蛋白或含有血清的微球混合物加入96孔微孔板的每个孔中，然后在室温下反应1小时。然后，依次加入20μl生物素标记的检测抗体以及20μl链霉亲和素R-藻红蛋白(杰克逊免疫研究)，并分别反应1小时和30分钟。反应完成后，使用微孔板清洗机(HydroFlexTM，TECAN，瑞士)用200μl/孔的PBST(含0.05％吐温20的PBS)溶液将板洗涤两次。将微球重悬于100μl的PBST(含0.05％吐温20的PBS)溶液中，并用
200TM测量荧光强度。使用Beadview软件(Upstate，美国)通过5-参数曲线拟合分析血清样品中RANTES、sVCAM-1、ApoA4、PAI-1和VDBP蛋白的浓度。
2-4.ApoA1、ApoA2、TTR、CEA、CYFRA21-1、B2M、CA125、CA19-9、CRP、D.二聚体和AFP
蛋白的定量
ApoA1、ApoA2和B2M蛋白按照使用日立7080(日立医疗公司，日本)的生产商方案通过免疫比浊法进行测量。TTR和CRP蛋白根据使用BN2***(西门子股份公司，德国)的生产商方案通过免疫比浊法测量。CEA、CYFRA21-1、CA125和CA19-9蛋白使用cobas e601(豪夫迈·罗氏有限公司，瑞士)通过电化学发光免疫分析法测量，D.二聚体蛋白使用罗氏c501(豪夫迈·罗氏有限公司，瑞士)通过电化学发光免疫分析法测量。
实施例3：胃癌生物标志物的统计学分析
通过t检验确证胃癌患者和正常受试者中18种标志物(ApoA1、ApoA2、AFP、CEA、CA125、CA19-9、TTR、B2M、CRP、CYFRA21-1、VDBP、ApoA4、PAI-1、sVCAM-1、RANTES、EGFR、LRG1和D.二聚体)的表达水平的差异显著性。对实施例2中获得的实验值进行Log10转换，并将这些值(测量数据)用于统计学分析。t检验得到的p值在0.1以下时，其被确定为显著性标志物。
【表3】
标志物的显著性
如表3所示，胃癌患者和正常受试者之间ApoA1、ApoA2、CEA、CA19-9、TTR、CRP、VDBP、RANTES、EGFR、LRG1、D.二聚体和PAI-1标志物的表达水平存在显著差异(表3)。
实施例4：测量生物标志物的贡献
使用实施例3中确定为显著标志物的ApoA1、ApoA2、CEA、CA19-9、TTR、CRP、VDBP、RANTES、EGFR、LRG1、D.二聚体或PAI-1标志物构建分类模型，并测量每个分类模型中的生物标志物的贡献。
特别地，使用逻辑回归模型构建分类模型，该逻辑回归模型如以下数学公式1所示。
[数学公式1]
在数学公式1中，X1至Xp是通过标准化在实施例3中被确定为显著标志物的每种生物标志物的测量数据而获得的值，平均值为0且分散度为1，β0至βp是未知参数。未知参数通过使用岭估计的R统计学软件包(R开发核心团队(2007).R：统计计算的语言和环境.R统计计算基础，维也纳，奥地利.ISBN 3-900051-07-0，URL http://www.R-project.org.)进行预测。岭估计的绝对值越大，则生物标志物在逻辑回归模型中的贡献越大。
结果，在分类模型中的贡献按以下顺序降低：EGFR>TTR>ApoA1>RANTES>LRG1>D.二聚体>ApoA2>VDBP>PAI-1>CEA>CRP>CA19-9。
实施例5：各种生物标志物组合的性能测量
在使用实施例4中测量的贡献除去具有低贡献的标志物的同时，测量在实施例3中被确定为显著标志物的各种生物标志物的组合的性能。
特别地，将实施例1中获得的胃癌患者和正常受试者的样品随机划分(将80％划分为训练数据，将20％划分为检测数据)。另一方面，用实施例3中确定为显著标志物的12种标志物进行了12种组合。然后，使用训练数据以与实施例4中所述相同的方式构建分类模型，并将训练数据预测为模型。重复上述步骤1000次以获得1000个AUC值。计算这些值的平均值，以确定模型如何很好地预测训练数据，并测量生物标志物各种组合的性能。
【表4】
各种生物标志物组合的性能
结果，如表4所示，在由包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体生物标志物的组合构成的分类模型中，AUC值最大。最终，选择EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体作为胃癌的生物标志物(表4)。
实施例6：测量包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合的性能
通过测量由包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合(显示在实施例5中测得的最高AUC)构成的分类模型的特异性、灵敏度和准确度以研究生物标志物的性能。特异性是正常人被判断为正常的比率，其根据以下数学公式2计算。灵敏度是癌症患者被判断为癌症的比率，其根据以下数学公式3计算。准确度是癌症患者和正常人被正确识别的比率，其根据灵敏度和特异性的平均值计算。
[数学公式2]
[数学公式3]
【表5】
包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合的性能
| 特异性 | 灵敏度 | 准确度 | 阈值 |
| 90.00％ | 91.06％ | 90.20％ | 0.1991 |
结果，如表5所示，由包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合构成的分类模型显示特异性为90％，灵敏度为91.06％，准确度为90.20％及阈值为0.1991(表5)。由此可以确证，如果分类模型的评分值大于阈值0.1991，则可以诊断为胃癌患者，如果小于0.1991，则可以诊断为正常人。
实施例7：由包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合构成的分类模型的验证
通过以下方法验证实施例5中由包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合构成的分类模型。
首先，以与<实施例1>中所述相同的方式获得血清，除了使用100例来自首尔国立大学医院家庭医学科的正常受试者、17例启明大学东山医学中心生物库的胃癌患者和80例釜山国立大学医院生物库的胃癌患者。以与<实施例2>中所述相同的方式定量EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体蛋白。然后，以与<实施例6>中所述相同的方式确定在0.1991的阈值的特异性、灵敏度和准确度。
【表6】
由包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合构成的分类模型的性能
| 阈值 | 特异性 | 灵敏度 | 准确度 |
| 0.1991 | 91.00％ | 91.75％ | 91.37％ |
结果，如表6所示，由包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合构成的分类模型显示在阈值为0.1991时，特异性为91.00％，灵敏度为91.75％，准确度为91.37％(表6)。由此确证，由包含EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体的生物标志物组合构成的分类模型可以高度准确地区分胃癌患者和正常人。
Claims (13)
1.一种用于诊断胃癌的组合物，其包含与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物选自以下：EGFR(表皮生长因子受体)、TTR(转甲状腺素蛋白)、ApoA1(载脂蛋白A1)、RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌的因子)、LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1)和D.二聚体。
2.根据权利要求1所述的用于诊断胃癌的组合物，其中，所述检测试剂选自抗体、抗体片段、核酸适配体和D-肽中的任一种或多种。
3.根据权利要求2所述的用于诊断胃癌的组合物，其中，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
4.一种用于诊断胃癌的试剂盒，其包含权利要求1所述的用于诊断胃癌的组合物。
5.一种用于诊断胃癌的试剂盒，其包含选自引物、探针和反义核苷酸中的至少一种，所述反义核苷酸与编码生物标志物的基因的核酸序列特异性结合，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
6.一种提供胃癌诊断信息的方法，其包括以下步骤：
1)测量样品中蛋白的表达水平，所述蛋白选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体；和
2)将步骤1)的蛋白表达水平与正常受试者的蛋白表达水平进行比较。
7.根据权利要求6所述的提供胃癌诊断信息的方法，其中，步骤1)的样品是尿液、血液、血清或血浆。
8.根据权利要求6所述的提供胃癌诊断信息的方法，其中，与正常受试者的表达水平相比，EGFR、TTR、ApoA1和RANTES蛋白的表达水平降低。
9.根据权利要求6所述的提供胃癌诊断信息的方法，其中，与正常受试者的表达水平相比，LRG1和D.二聚体蛋白的表达水平升高。
10.一种提供胃癌诊断信息的方法，其包括以下步骤：
1)测量样品中编码蛋白的基因的表达水平，所述蛋白选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体；和
2)将步骤1)的基因表达水平与正常受试者的基因表达水平进行比较。
11.一种与生物标志物特异性结合的检测试剂在制备所述用于诊断胃癌的组合物中的用途，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
12.权利要求1所述的用于诊断胃癌的组合物在制备用于诊断胃癌的试剂盒中的用途。
13.引物、探针和反义核苷酸中的至少一种在制备用于诊断胃癌的试剂盒中的用途，其中，所述反义核苷酸与编码生物标志物的基因的核酸序列特异性结合，所述生物标志物选自EGFR、TTR、ApoA1、RANTES、LRG1和D.二聚体。
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