CN111100813A - 一株缓解植物盐害的耐盐促生细菌jp-jh及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株缓解植物盐害的耐盐促生细菌JP‑JH及其应用，该菌株隶属于Kushneria indalinina，已于2019年12月12号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20191039。该菌株具有较强的耐盐、耐碱特性，其生长能耐受的NaCl浓度为1‑15％(w/v)，能耐受的pH值为7.0～9.0，并且无需L‑色氨酸诱导即可分泌IAA。此外，该菌株在活体状态和灭活体状态下，以及在无盐胁迫和有盐胁迫条件下，均能够对小麦的生长(叶长和地上鲜重)起到显著的促进作用，并且在有盐胁迫条件下，明显缓解了小麦盐害。因此，相比已报道的耐盐菌株，本发明所述的耐盐促生细菌JP‑JH可在菌株的培养、储存、运输和定殖等条件上合理降低要求，有利于降低生产成本、便于推广应用。

Description

一株缓解植物盐害的耐盐促生细菌JP-JH及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体来说涉及一株缓解植物盐害的耐盐促生细菌及其应用。

背景技术

盐碱地是我国中低产田的主要土壤类型，合理开发利用这些盐碱地资源，对保障我国国家粮食安全、促进农业可持续发展、改善生态环境、以及推动区域经济社会协调发展具有重要意义。盐碱地生物改良措施能够克服物理、化学、工程类改良措施的一些限制，也符合当前盐碱地绿色发展的需求。相对成熟的生物改良措施主要表现为基于植物的措施，包括种植耐盐树木(如沙枣、胡杨等)和抗盐牧草(如紫花苜蓿等)，改善土壤结构，提高土壤肥力，抑制土壤表面积盐；以及培育新的抗盐植物品种。基于微生物的措施，研究者们分离获得的能够促进植物生长的细菌大部分隶属于Halomonas属、Bacillus属、Pseudomonas属等的一些菌种，以及Kushneria属的新种phyllosphaerae和endophytica。目前，针对Kushneria indalinina的菌种局限于基因水平的***分类鉴定和基础的耐盐特性，尚未有研究指出隶属于Kushneria indalinina的菌种具有促进植物生长的能力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株缓解植物盐害的耐盐促生细菌JP-JH，该菌株具有较强的耐盐、耐碱特性，其生长能耐受的NaCl浓度为1-15％(w/v)，能耐受的pH值为7.0～9.0，并且能够分泌IAA。

本发明的另一目的在于提供一种利用耐盐促生细菌JP-JH制备的微生物菌剂或生物肥料在缓解植物盐害中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种利用耐盐促生细菌JP-JH制备的微生物菌剂或生物肥料在促进植物生长中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一株从中国河北省沧州市海兴县盐碱地碱蓬根际土壤中分离获得的耐盐促生细菌Kushneria indalinina JP-JH，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2019年12月12号，保藏编号：CCTCC M 20191039。

所述的耐盐促生细菌JP-JH，其菌落呈橘黄色突起状，菌落边缘呈微透明状。

所述的耐盐促生细菌JP-JH，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，隶属于Kushneria indalinina菌种。

所述的耐盐促生细菌JP-JH，其生长能耐受的NaCl浓度为1-15％(w/v)，能耐受的pH值为7.0～9.0。

所述的耐盐促生细菌JP-JH具备分泌IAA的能力,并且无需L-色氨酸诱导即可分泌IAA。

所述的耐盐促生细菌JP-JH，其在有盐胁迫条件下，明显缓解了小麦盐害，主要表现为小麦长势较好，叶片颜色较绿，以及小麦叶长和地上鲜重的增加。

所述的耐盐促生细菌JP-JH，其在活体状态和灭活体状态下，以及在无盐胁迫和有盐胁迫条件下，均能够对小麦的生长起到显著的促进作用，主要表现为小麦叶长或地上鲜重增加10.00％～21.48％。

本发明的优点和有益效果为：

本发明所述的耐盐促生细菌Kushneria indalinina JP-JH在活体状态和灭活体状态下，以及在无盐胁迫和有盐胁迫条件下，均能够对小麦的生长(叶长和地上鲜重)起到显著的促进作用，并且在有盐胁迫条件下，明显缓解了小麦盐害。因此，相比其它已报道的菌株，本发明所述的耐盐促生细菌JP-JH一方面可在菌株的培养、储存、运输和定殖等条件上合理降低要求，有利于降低生产成本、便于推广应用；另一方面具有较广泛的环境适应性，适用于无盐胁迫和有盐胁迫条件，包括中重度盐碱地(含盐量0.4％～1.0％)，甚至含盐量1％～15％的重度盐碱地，有利于实现一菌多用。

此外，本发明所述的耐盐促生细菌Kushneria indalinina JP-JH，具备促进植物生长和缓解植物盐害能力的优良特性，一方面为制备微生物菌剂和肥料用于促进植物生长中的应用提供资源和技术支撑，实现替代或者部分替代化学肥料的投入使用，解决由过量施用和盲目施用化学肥料造成的成本增加和一系列环境污染问题；另一方面为制备微生物菌剂和肥料用于缓解植物盐害中的应用提供资源和技术支撑，开发基于微生物的盐碱地改良生物措施，克服盐碱地改良中物理、化学和工程措施的诸多限制，同时降低培育抗盐新品种生物措施的时间成本。进而，为盐碱地改良与利用提供安全、环保、高效的生物技术支撑。

附图说明

图1是本发明耐盐促生细菌JP-JH的菌落观察图；

图2是本发明耐盐促生细菌JP-JH的16S rDNA序列***发育树；

图3是本发明耐盐促生细菌JP-JH分泌IAA的定性检测图；

图4是本发明耐盐促生细菌JP-JH缓解小麦盐害和促进小麦生长观察图；

图5是本发明耐盐促生细菌JP-JH对小麦生长(叶长)的影响；

图6是本发明耐盐促生细菌JP-JH对小麦生长(地上鲜重)的影响。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例一：耐盐促生细菌JP-JH的分离纯化

样品来源：中国河北省沧州市海兴县盐碱地碱蓬根际土壤。

LB培养基(固体)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠50g/L、琼脂20g/L，采用5M/L NaOH调节pH值后，121℃、30min高压蒸汽灭菌。

LB培养基(液体)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠50g/L，采用5M/L NaOH调节pH值后，121℃、30min高压蒸汽灭菌。

分离和纯化步骤：1)采集中国河北省沧州市海兴县盐碱地碱蓬根系，抖落根系表面土壤后装入无菌50mL离心管，加入无菌水后涡旋震荡，即得到根际土壤原液；2)静置，取适量上清液，使用无菌水依次稀释获得10^-1、10^-2和10^-3土壤悬液，分别涂布于含有5％NaCl的固体LB培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养；3)反复挑取不同形态和颜色的单菌落进行平板划线培养，分别继代培养4～5代，即可得到纯的、形态一致的单菌落。

实施例二：耐盐促生细菌JP-JH的鉴定

1)生物学特性鉴定

耐盐促生细菌JP-JH在LB培养基上菌落呈橘黄色突起状，菌落边缘呈微透明状(图1)。

2)***分类鉴定

本发明采用试剂盒TIANamp Bacteria DNA Kit(天根，北京)并按照其操作步骤提取耐盐促生细菌JP-JH基因组DNA。采用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')扩增菌株JP-JH 16S rDNA序列。PCR反应体系为50μL，其中含有10μL EasyTaq buffer、5μL dNTPs、0.5μL引物27F、0.5μL引物1492R、1.5μL DNA模板、2μL Easy Taq DNA聚合酶，最后添加无菌超纯水至50μL。PCR反应程序为：(i)94℃5min预变性；(ii)35个循环94℃1min变性，55℃1min退火，72℃1.5min延伸；(iii)最后延伸条件为72℃10min。将PCR扩增产物提交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序所得菌株JP-JH的16S rDNA如序列表SEQ NO.1所述。

通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库对测序所得序列进行同源性比对，结果显示菌株JP-JH的16S rDNA序列与Kushneria indalininastrain G6的序列相似度高达99.86％。利用MAGA 4.0构建***发育树(图2)，与Kushneriaindalinina strain G6的序列构成稳定的进化分支(bootstrap值为99)，因此，将其命名为Kushneria indalinina JP-JH。

实施例三：耐盐促生细菌JP-JH耐盐、耐碱能力的评估

挑取固体LB培养基上菌株JP-JH单菌落，接种于50mL液体LB培养基中，28℃、150r/min培养48h后，分别接种于含NaCl溶液浓度为1％、5％、10％、15％和20％，与pH值为7.0、8.0和9.0两两结合的LB固体培养基上进行划线培养，结果显示菌株JP-JH能够在NaCl浓度为1％～15％和pH值为7.0～9.0的培养基中生长。

实施例四：耐盐促生细菌JP-JH分泌吲哚乙酸(IAA)能力的定性测定

Salkowski比色液的制备：取49mL 35％HClO₄(取70％HClO₄ 25mL加水至50mL)与1mL 0.5mol/L FeCl₃(取0.811g FeCl₃溶于10mL纯水)，充分混匀即可。

将菌株JP-JH分别接种于不含L-色氨酸的1％NaCl的LB液体培养基(编号C0)，以及含终浓度为0.25mg/mL、0.50mg/mL和0.75mg/mL L-色氨酸(分别编号C1、C2和C3)的1％NaCl的LB液体培养基中，28℃、160r/min培养1d后，取适量菌悬液于无菌的透明2.0mL离心管中，同时加入等体积的Salkowski比色液，并以含1％NaCl的LB液体培养基与等体积比色液的混合溶液为空白对照(编号CK)，于室温避光放置30min后观察颜色变化的情况。结果显示，空白对照CK不显示红色，菌株JP-JH在有、无L-色氨酸诱导的条件下(C0、C1、C2和C3)，均显示明显红色(图3)，表明菌株JP-JH能够分泌IAA，并且无需L-色氨酸诱导即可分泌IAA。

实施例五：耐盐促生细菌JP-JH对小麦生长的影响

实验设置阴性对照(以H₂O表示)、阳性对照菌株JP-JH灭活体(以JHD表示；121℃、30min高压蒸汽灭菌)和实验组菌株JP-JH活体(以JHL表示)，设置NaCl溶液浓度分别为0mM、100mM和200mM，共计9个处理，每个处理重复3次(图4)。

菌液制备：挑取固体LB培养基上菌株JP-JH单菌落，接种于50mL液体LB培养基中，28℃、150r/min培养48h后(同时测定并记录菌液OD600)，按2％接种量接种于200mL液体LB培养基中，28℃、150r/min培养48h后，8000rpm、15min离心收集菌体，使用无菌水洗涤菌体2次后，使用无菌水调节菌液OD600至0.6～0.8。将所得菌液均匀地分装至2个三角瓶中，其中一份置于4℃冰箱备用(JHL)，另一份121℃、30min高压蒸汽灭菌后备用(JHD)。

小麦培养：采集非盐碱地长期不施肥农田土壤，过2mm筛后充分混匀，按照1.20kg鲜土/盆进行分装，同时测定含水率并计算干土重约为1.10kg干土/盆。按照速效氮70mg/kg、速效磷30mg/kg和速效钾90mg/kg施加底肥并浇透土壤后，种植耐盐小麦“小堰60”。每盆种植12粒种子(记作第1天)，出苗整齐后开始间苗(第5天)，使每盆保留4株小麦幼苗。培养条件为25℃、16h光照/8h黑暗(光照强度100μmol·m^-2·s^-1)。待小麦幼苗整齐茁壮时(第7天)，分别使用100mM和200mM NaCl溶液进行盐胁迫处理，并使用无菌水(0mM NaCl溶液)进行对照处理，每隔2～4天浇灌一次，持续浇灌3～5次使土壤NaCl含量分别达到约5.5g/kg和11g/kg后，停止使用NaCl溶液浇灌，并使用无菌水进行后期浇灌。同时，每次浇灌分别在小麦根围土壤接种30mL菌株JP-JH活体(JHL)和菌株JP-JH灭活体(JHD)进行促生处理，并接种无菌水(H₂O)进行对照处理。培养条件为白天25±5℃、夜间20±5℃，16h光照/8h黑暗(光照强度100μmol·m^-2·s^-1)。

培养56天后，观察、测量与数据统计分析结果：1)观察小麦的生长情况：发现添加活体菌剂(JHL)和灭活体菌剂(JHD)的小麦均比对照(H₂O)的小麦长势较好，且叶片颜色较绿(图4)；2)测量小麦的生长情况：测量并统计小麦叶长和根长、地上鲜重和干重，以及地下鲜重和干重等指标，发现在无盐胁迫(0mM)和有盐胁迫(100mM和200mM)条件下，添加活体菌剂(JHL)和灭活体菌剂(JHD)均促进了小麦生长，主要表现为小麦叶长和地上鲜重的增加(图5和图6)；3)统计学分析小麦的生长情况：采用SPSS软件基于Duncan’s法(P<0.05表示差异显著)对测量结果进行统计学分析，在100mM盐胁迫条件下，添加活体菌剂(JHL)对小麦叶长和地上鲜重具有显著的促进效果，小麦叶长和地上鲜重分别增加了10.00％和12.67％(图5和图6)；添加灭活体菌剂(JHD)对小麦地上鲜重具有显著的促进效果，小麦地上鲜重增加了19.53％(图6)。同时，在无盐胁迫(0mM)条件下，添加活体菌剂(JHL)对小麦地上鲜重具有显著的促进效果，小麦地上鲜重增加了21.48％(图6)。综上所述，本发明所述的耐盐促生细菌JP-JH在活体状态和灭活体状态下，以及在无盐胁迫和有盐胁迫条件下，均能够对小麦的生长起到显著的促进作用，这些促进作用主要表现为小麦地上部分生物量的增加，以及缓解了盐胁迫对小麦的伤害。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心

<120> 一株缓解植物盐害的耐盐促生细菌JP-JH及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> Kushneria indalinina

<400> 1

ggcatggcgc agctacacat gcagtcgagc ggtaacaggg gtagcttgct acccgctgac 60

gagcggcgga cgggtgagta atgcatgggt atctgcccgg tagtggggga taactcgggg 120

aaacccgagc taataccgca tacgtcctac gggagaaagc aggggatctt cggaccttgc 180

gctatcggat gagcccatgt cggattagct tgttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240

cgatccgtag ctggtctgag aggatgatca gccacaccgg gactgagaca cggcccggac 300

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggg ggaaccctga tccagccatg 360

ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttcgggttgt aaagcacttt cagtggggaa gaaggcatga 420

tgattaatac tcgtcatgaa ggacatcacc cacagaagaa gcaccggcta actccgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagggcg 540

cgtaggcggc ttgccaagcc ggatgtgaaa gccccgggct caacccggga acggcattcg 600

gaactggtag gctagagtgc aggagaggaa ggtggaattc ccggtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagagatcg ggaggaatac cagtggcgaa ggcggccttc tggactgaca ctgacgctga 720

ggcgcgaaag cgtgggtagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgtcgaccag ccgttggacc ccttgagggt ttggtggcgc agttaacgca ataagtcgac 840

cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctgct cttgacatcc 960

tgcgaattcc tcagagatga ggaagtgcct tcgggaacgc agagacaggt gctgcatggc 1020

tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg taacgagcgc aacccctatc 1080

cctttttgcc agcgcgtaat ggcgggaact tcagggagac tgccggtgac aaaccggagg 1140

aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgagc agggctacac acgtgctaca 1200

atggccggta caaagggttg cgaagcggcg acgtgaagcc aatcccagaa agccggcctc 1260

agtccggatc ggagtctgca actcgactcc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgtggat 1320

cagaatgcca cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 1380

gtggactgca ccagaagtgg ttagcttaac cttcgggaga gcgatcacca cggtgtcgtt 1440

gg 1442

Claims (7)

1.一株缓解植物盐害的耐盐促生细菌JP-JH，其特征在于：该菌株隶属于Kushneriaindalinina，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 20191039，保藏日期为2019年12月12号。

2.根据权利要求1所述的耐盐促生细菌，其特征在于：该菌株具有较强的耐盐、耐碱特性，其生长能耐受的NaCl浓度为1-15％(w/v)，能耐受的pH值为7.0～9.0。

3.根据权利要求1所述的耐盐促生细菌，其特征在于：该菌株具备分泌IAA的能力，并且无需L-色氨酸诱导即可分泌IAA。

4.一种能够缓解植物盐害的微生物菌剂，其特征在于：该菌剂采用权利要求1所述的耐盐促生细菌制备得到。

5.一种能够促进植物生长的微生物菌剂，其特征在于：该菌剂采用权利要求1所述的耐盐促生细菌制备得到。

6.权利要求1所述的耐盐促生细菌，或权利要求4或5所述的微生物菌剂在制备生物肥料中的应用。

7.权利要求1所述的耐盐促生细菌，或权利要求4或5所述的微生物菌剂，或权利要求6所述的生物肥料在缓解植物盐害或促进植物生长中的应用。

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