CN111094577A - 携带转基因的重组腺病毒 - Google Patents

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Abstract

本文公开的是具有***到两个病毒转录单元之间的一个或多个核苷酸序列的重组腺病毒、包含该重组腺病毒的制剂和使用该重组腺病毒的治疗方法。在一些实施方式中，所述一个或多个核苷酸序列被***到IX‑E2***位点和/或L5‑E4***位点中。

Description

携带转基因的重组腺病毒
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月26日提交的美国临时专利申请第62/511,822号的优先权和权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
关于序列表的陈述
与本申请相关的序列表以文本文件形式代替纸质拷贝提供，其在此通过引用加入到说明书中。包含序列表的文本文件的名称为EPRX_002_01WO_SeqList_ST25.txt。文本文件为约128KB，于2018你那5月29日创建，并且经由EFS-Wbe电子提交。
发明领域
本文所述的发明大体上涉及病毒学、病毒疗法和分子生物学领域。
背景技术
使用病毒疗法以治疗诸如癌症的包括采用带有治疗基因或转基因的选择性复制病毒。在被开发作为病毒治疗剂的多种感染性病毒物种中，腺病毒已成为最重要之一，这不仅是因为它们对正常的非转化细胞具有最小毒性，还因为它们的基因组包含多个内源基因，容易操作，所述操作通常采取缺失内源基因和***内源基因的方式。这种操作的缺点是大多数内源基因缺失或外源基因添加减慢或减弱了病毒的复制和感染潜力。(Larson etal.,Oncotarget,6(24):19976-89(2015))
携带转基因的病毒在这些区域中的复制效率降低(诸如在溶瘤性病毒用于治疗癌症的情况中)是不理想的，其损害了病毒在肿瘤中繁殖和感染相邻癌细胞的能力，减少了感染细胞中病毒基因组拷贝的数量，因此有可能减少治疗性转基因的转录和增加产生病毒所需的生产培养的大小。因此，需要一种新的方法以改善重组腺病毒在靶标细胞或组织中(诸如在肿瘤中)高水平复制的能力，从而将靶标细胞或组织迅速变为用于生产特定外源基因产物的“工厂”。
通常，为使溶瘤性病毒表达两种或更多种独立的蛋白质或多肽链，需要使用多于一种病毒载体或在两个转基因之间使用连接子，诸如内部核糖体进入位点(IRES)。两种方法都有显著缺点。两种或更多种病毒载体可能无法都在单一细胞或组织中良好表达。如本领域所知，IRES下游的序列的表达水平比序列上游低得多(Mizuguchi et al.,Mol.Ther.1(4):376-82(2000))。另外，非内源的连接子具有免疫原性。因此，需要更有效的病毒载体以表达在单一病毒中表达多于一种肽链。
发明内容
本发明部分基于以下发现：具有***到病毒基因组的两个病毒转录单元之间的一个或多个核苷酸序列的重组腺病毒可在靶标细胞或组织中有效地复制和表达核苷酸序列，不会显著影响病毒的溶瘤性活性。本发明的载体可有利地用于需要相同水平的两个或更多个转基因时或者用于表达来自双联蛋白的完全天然的链。
在一个方面，本发明提供了一种包含***到***位点中的核苷酸序列的重组腺病毒，其中所述***位点位于第一病毒转录单元的终止密码子和第二病毒转录单元的终止密码子之间，其中与第一病毒转录单元的起始位点距离第二病毒转录单元的终止密码子相比，第一病毒转录单元的终止密码子更靠近第二病毒转录单元的终止密码子，其中与第二病毒转录单元的起始位点距离第一病毒转录单元的终止密码子相比，第二病毒转录单元的终止密码子更靠近第一病毒转录单元的终止密码子和其中在***核苷酸序列之前，在第一病毒转录单元和第二病毒转录单元之间没有病毒转录单元。
在某些实施方式中，第一病毒转录单元是腺病毒IX基因和第二病毒转录单元是腺病毒IVa2基因。在某些实施方式中，第一病毒转录单元是腺病毒纤维基因，第二病毒转录单元是腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7。在某些实施方式中，重组腺病毒是5型腺病毒(Ad5)。在某些实施方式中，重组腺病毒是35型腺病毒(Ad35)。
在某些实施方式中，核苷酸序列被***到IX-E2***位点。在某些实施方式中，IX-E2***位点位于腺病毒IX基因的终止密码子和腺病毒IVa2基因的终止密码子之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的约4029到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029到4050位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4050到4070位的核苷酸之间，或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4070到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的约3899到3970位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899到3920位的核苷酸之间，对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3920到3940位的核苷酸之间，或对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3940到3970位的核苷酸之间。
在某些实施方式中，核苷酸序列被***到L5-E4***位点。在某些实施方式中，L5-E4***位点位于腺病毒纤维基因的终止密码子和腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的终止密码子之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32800位的核苷酸之间，Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32800到32820位的核苷酸之间，Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32820到32840位的核苷酸之间，Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32840到32860位的核苷酸之间，Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32860到32880位的核苷酸之间，Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32880到32900，或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的约32901到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的约31799到31821位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的31799到32810位的核苷酸之间，或对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的32810到31821位的核苷酸之间。
在某些实施方式中，前述重组腺病毒进一步包含***到E1b-19K***位点、E3***位点或E4***位点中的核苷酸序列。在某些实施方式中，E1b-19K***位点位于Elb-19K的起始位点和Elb-55K的起始位点之间。在某些实施方式中，E1b-19K***位点位于Elb-19K的起始位点和Elb-19K的终止密码子之间。在某些实施方式中，E3***位点位于腺病毒pVIII基因的终止密码子和腺病毒纤维基因的起始位点之间。
在某些实施方式中，本发明提供了一种包含***到IX-E2***位点中的第一核苷酸序列和***到L5-E4***位点中的第二核苷酸序列的重组腺病毒。
在某些实施方式中，第一核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的约4029到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029到4050位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4050到4070位的核苷酸之间，或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4070到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的约3899到3970位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899到3920位的核苷酸之间，对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3920到3940位的核苷酸之间，或对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3940到3970位的核苷酸之间。
在某些实施方式中，第二核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第二核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32800位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32800到32820位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32820到32840位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32840到32860位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32860到32880位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32880到32900位的核苷酸之间，或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的约32901到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第二核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的约31799到31821位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第二核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的31799到32810位的核苷酸之间，或对应于Ad35基因组(SEQID NO:41)的32810到31821位的核苷酸之间。
在某些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列包含至少一个转基因。在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含启动子，其中转基因可操作地连接到启动子。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)转基因；(iv)第二聚腺苷酸化信号；和(v)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列(包含一个或多个转基因)***到第一聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号之间。在一些实施方式中，一个或多个转基因***到第一聚腺苷酸化信号和第三聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向上。
在某些实施方式中，核苷酸序列被***到L5-E4***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是纤维(L5)基因的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到IX-E2***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是IX基因的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)转基因；(v)第三聚腺苷酸化信号；和(vi)第四聚腺苷酸化信号和转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列(包含一个或多个转基因)***到第一聚腺苷酸化信号和第四聚腺苷酸化信号之间。在一些实施方式中，一个或多个转基因***到第一聚腺苷酸化信号和第四聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向上。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向上。
在某些实施方式中，核苷酸序列被***到L5-E4***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是纤维(L5)基因的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列被***到IX-E2***位点中，第一聚腺苷酸化信号是IX基因的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，启动子是泛素启动子、组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
在某些实施方式中，IX-E2***位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸的缺失。在某些实施方式中、L5-E4***位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含共有Kozak序列。在某些实施方式中，重组腺病毒包含编码腺病毒死亡蛋白(ADP)的核苷酸序列的部分或完全缺失。
在某些实施方式中，前述重组腺病毒进一步包含***到E1b-19K***位点、E3***位点或E4***位点中的核苷酸序列。在某些实施方式中，E1b-19K***位点位于Elb-19K的起始位点和Elb-55K的起始位点之间。在某些实施方式中，E1b-19K***位点位于Elb-19K的起始位点和Elb-19K的终止密码子之间。在某些实施方式中，E3***位点位于腺病毒pVIII基因的终止密码子和腺病毒纤维基因的起始位点之间。
在某些实施方式中，E1b-19K***位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约100至约305，约100至约300，约100至约250，约100至约200，约100至约150，约150至约305，约150至约300，约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E1b-19K***位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约200个核苷酸(例如，202个核苷酸)的缺失。在某些实施方式中，E1b-19K***位点包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的核苷酸1714-1917的缺失，或第一治疗性转基因***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的1714和1917位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一治疗性转基因***到CTGACCTC(SEQ ID NO:3)和TCACCAGG(SEQ ID NO:2)之间，例如，重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO:3)、第一治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO:2)。
在某些实施方式中，E3***位点包含约500至约3185，约500至约3000，约500至约2500，约500至约2000，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约3185，约1000至约3000，约1000至约2500，约1000至约2000，约1000至约1500，约1500至约3185，约1500至约3000，约1500至约2000，约2000至约3185，约2000至约3000，约2000至约2500，约2500至约3185，约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E3***位点位于E3-10.5K的终止密码子和E3-14.7K的终止密码子之间。在某些实施方式中，E3***位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含约500至约1551，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约1551，约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E3***位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含约1050个核苷酸的缺失，例如，E3***位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含1063个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E3***位点包含对应于Ad5 dl309 E3缺失的缺失。在某些实施方式中，E3***位点包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的核苷酸29773-30836的缺失，或第二治疗性转基因***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的29773到30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中，E3***位点包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的核苷酸29119-30622的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含具有功能性Pea3结合位点的缺失的E1a启动子。例如，病毒可包含对应于E1a起始位点上游的约-300至约-250的核苷酸的缺失，或对应于E1a起始位点上游的约-305至-255的核苷酸的缺失的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的195-244的核苷酸的缺失和/或E1a启动子包含序列GGTGTTTTGG(SEQ ID NO:4)。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含可操作地连接到基因的修饰的基于TATA框的启动子和/或可操作地连接至基因的修饰的基于CAAT框的启动子，其中修饰的基于TATA框的启动子缺乏功能性TATA框并允许基因在过度增殖细胞中的选择性表达，其中修饰的基于CAAT框的启动子缺乏功能性CAAT框并允许基因在过度增殖细胞中的选择性表达。
在某些实施方式中，其中修饰的基于TATA框的启动子是早期基因启动子。在某些实施方式中，修饰的基于TATA框的启动子是E1a启动子，E1b启动子或E4启动子。在某些实施方式中，修饰的基于TATA框的启动子是E1a启动子。
在某些实施方式中，修饰的基于TATA框的启动子中所包含的修饰包括整个TATA框的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于E1a启动子的-27至-24，-31至-24，-44至+54，或-146至+54的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于Ad5基因组(SEQID NO:1)的472至475，468至475，455至552，或353至552的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：CTAGGACTG(SEQ ID NO:5)，AGTGCCCG(SEQ ID NO:44)，和/或TATTCCCG(SEQ ID NO:45)。
在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子是早期基因启动子。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子是E1a启动子，E1b启动子或E4启动子。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子是E1a启动子。
在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰包括整个CAAT框的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于E1a启动子的-76至-68的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的423至431的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：TTCCGTGGCG(SEQ ID NO:46)。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的477至484的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，***的核苷酸序列包含含有第一转基因的第一核苷酸序列和包含第二转基因的第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过连接子隔开。在某些实施方式中，连接子编码可由一种蛋白酶或多种蛋白酶切割的肽。在某些实施方式中，连接子编码内部核糖体进入位点(IRES)或自切割2A肽。IRES可例如选自下组：脑心肌炎病毒IRES，手足口病病毒IRES和脊髓灰质炎病毒IRES。在某些实施方式中，其中核苷酸序列被***到IX-E2***或L5-E4***位点中，其中重组腺病毒进一步包含第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包含***到E1b-19K***位点、E3***位点或E4***位点中的第三转基因。
在某些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的一个或多个包含一个或多个转基因。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码单体，二聚，三聚，四聚或多聚蛋白质或其部分。在某些实施方式中，转基因、第一转基因和/或第二转基因中的一个或多个编码具有治疗活性的RNA。在某些实施方式中，转基因、第一转基因和/或第二转基因中的一个或多个编码包含至少一个结合结构域的融合蛋白。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码免疫调节分子。在某些实施方式中，免疫调节分子是共刺激配体/细胞因子或细胞因子受体。在某些实施方式中，免疫调节分子选自下组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-7、IL-10、IL-10trap、IL-10R、IL-12A/p35、IL-12B/p40、IL-15、IL-15受体融合蛋白、IL-23A/p19、IL24、IL-27、IL-33、IL-35、IL-15、IL-15受体融合蛋白、TGF-β、TGF-βtrap、IL-10trap、VEGF、吲哚胺-2,3-二氧合酶(IDO)、诱导型T细胞共刺激配体(ICOS-L)、CD80、CD137L、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ或GM-CSF、GITR配体(GITRL)、OX40配体(OX40L)、CD40配体(CD40L)、药物诱导型CD40(iCD40)、CD154、CD70、CD86、CD137、CD137L、BORIS/CTCFL、TNFSF9、FGF、ICAM、足糖萼蛋白、其功能片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码抗原结合分子。在某些实施方式中，抗原结合分子是抗PD-1抗体、抗TGF-β抗体、抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体或其功能片段。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码抗原或该抗原的配体。在某些实施方式中，抗原选自下组：CAIX、CEA、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD80、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染细胞抗原、4-1BB、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erbB2、erbB3、erbB4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、KRAS、HPV E6、E7、BING-4、EphA3、钙激活氯离子通道-2、细胞周期蛋白B1、9D7、Ep-CAM、PRAME、SSX-2、不成熟层粘连蛋白受体、叶酸受体-a、端粒酶、酪氨酸酶、黑色素-A、NY-ESO-1、GD2、GD3、hTERT、IL13R-a2、x-轻链、KDR、LeY、LI细胞粘附分子、MAGE-A1、MAGE-A3、MART1、MART2、MUC1、间皮素、HER-2/neu、EGFRvIII、NKG2D配体、NY-ES0-1、gp100、TRP-1/-2、TRP-1/-2、P多肽、MC1R、***特异性抗原、BRAF、雄激素受体、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、p53、TGF-βRII、T细胞受体、癌胚抗原、5T4、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、WT-1、其功能片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码毒素。在某些实施方式中，毒素是假单胞菌外毒素、蓖麻毒素或白喉毒素。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码酶。在某些实施方式中，酶选自下组：β-葡糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、酯酶、金属蛋白酶、松弛素、胶原酶、链激酶、精氨酸酶、NOS-2、其片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码细胞周期控制剂、生长因子、抗凝剂、前药激活基因、肿瘤抑制基因、凋亡基因、抗血小板剂、凝血因子、囊性纤维化跨膜传导调控(CFTR)蛋白质、其片段，或其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码血管抑素、内皮抑素、乙酰胆碱、DKK1/Wnt、Ox40L、GITRL、分泌鞭毛蛋白、胸苷激酶、其功能片段，或其衍生物。
在某些实施方式中，重组腺病毒是溶瘤性的。在某些实施方式中，重组腺病毒选择性地在过度增殖细胞中复制。在某些实施方式中，重组腺病毒选择性地表达转基因在过度增殖细胞中。在某些实施方式中，过度增殖细胞是肿瘤细胞。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核苷酸序列，其包含任何前述重组腺病毒序列，任选地其中核苷酸序列是cDNA。在另一方面，本发明提供了一种分离的载体，其包含所述腺病毒核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了一种分离的细胞，其包含所述腺病毒核苷酸序列或所述载体。
在另一方面，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞暴露于有效量的任何前述重组腺病毒以抑制肿瘤细胞的增殖。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者的病症的方法。在一些实施方式中，病症是癌症。所述方法包括对受试者施用有效量的本文所述的重组腺病毒以治疗受试者的癌症疾病。
在另一方面，本发明提供了一种抑制需要其的受试者的肿瘤生长的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒以抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，肿瘤选自下组：黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、***肿瘤、***、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺肿瘤、肾细胞癌、***肿瘤、胃食管肿瘤、结直肠肿瘤、睾丸肿瘤、***、卵巢肿瘤、肝细胞癌、胆管癌、脑肿瘤、子宫内膜肿瘤、神经内分泌肿瘤、默克细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤、和胰腺肿瘤。
在另一方面，本发明提供了一种治疗需要其的受试者的疾病或病症的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒。在某些实施方式中，疾病或病症选自下组：感染、糖尿病性视网膜病、银屑病、类风湿性关节炎、子宫内膜异位症、黄斑变性病症和良性生长障碍、诸如***肥大和脂肪瘤、血管病、心血管病、肝硬化、***病、肿瘤、血管病变、溃疡病变、炎症、血栓形成和新生内膜形成。
在某些实施方式中，受试者是哺乳动物。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，受试者是儿童。在某些实施方式中，受试者是成人。
在某些实施方式中，重组腺病毒通过以下方式施用：肌内、静脉内、动脉内、瘤内、皮内、吸入、透皮、局部、滴眼、鼻内、透肌肉和/或直肠施用。
在某些实施方式中，前述方法进一步包括对受试者施用选自下组的一种或多种治疗：手术，放疗，化疗，免疫疗法，激素疗法和病毒疗法。
在某些实施方式中，前述方法进一步包含对受试者施用一种或多种检查点调节剂。在某些实施方式中，免疫检查点调节剂是选自下组的一种或多种分子的抑制剂、拮抗剂或激动剂：PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4、TIGIT、LAG3、Tim3、BTLA、CD160、GITR、KIR、4-1BB和CTLA4。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含任何前述重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。
在另一方面，本发明提供了一种用于腺病毒的制剂，其包含：
任何前述重组腺病毒中的一种或多种；
至少一种缓冲剂；
至少一种张力修饰剂；
至少一种糖或至少一种稳定剂或二者；和
其中制剂的pH在约7.0和约9.0范围内。
在某些实施方式中，任何前述制剂的摩尔渗透压浓度为约200mOs/L至约800mOs/L。在某些实施方式中，任何前述制剂的重组腺病毒浓度为约1x 107vp/mL至1x 1013vp/mL。
通过以下附图、详细描述和权利要求来说明本发明的这些和其他方面和优点。
附图说明
参考以下附图可更全面地理解本发明。
图1是描绘人Ad5基因组结构的图表。在该图上方，基因组以直线表示，其长度标记为距常规左端的kbp。粗箭头表示早期和晚期转录单元(分别为黑色和灰色)。空心框表示主要的内含子。E4基因以直线标度放大，长度为bp。初级转录物显示为5’至3’方向的黑色箭头，每种可能编码的蛋白质显示为空心框；其编码区域被内含子序列分开的蛋白质显示为由线连接的框。
图2描绘了用病毒TAV-(E1B-19K)mGMCSF或TAV-(L5-E4)mGMCSF感染的或保持为未感染对照的A549、ADS-12和WI-38细胞的小鼠GMCSF表达水平。小鼠GMCSF表达在其条件培养基中测量。
图3描绘了用病毒TAV IX-WT L5-空、TAV IX-WT L5-IL7、TAV IX-WT L5-GMCSF或TAV IX-GMCSF L5-IL7感染的A549细胞的GMCSF表达水平。GMCSF表达在条件培养基中测量。与从L5-E4表达和表达相比，在从IX-E2表达盒表达GMCSF时可见更高表达。
图4描绘了IX-E2***位点的初始设计和修订设计。
图5描绘感染A549细胞的病毒(TAV-Δ19k、TAV-hIL12-弗林蛋白酶、TAV-TAV-IXrL5-空、WT-IXrL5-hIL12或TAV-IXrL5-hIL12)，其一式三份，并且在感染后4天用结晶紫染色(将活细胞染色为紫色)。
图6描绘了用病毒(TAV-Δ19k、TAV-hIL12-弗林蛋白酶、TAV-TAV-IXrL5-空、WT-IXrL5-hIL12或TAV-IXrL5-hIL12)感染的A549细胞的IL-12表达水平。将A549细胞一式三份用所示病毒感染，在感染后4天用ELISA测量条件培养基中的IL12。
图7描绘了用TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5SV40wt)KozakmGMCSF(标记为SV40wt)或TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF(标记为hEF1A)感染的A549细胞的IL-17和GMCSF表达水平。
图8描绘了用ADP基因完整的[TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF，标记为+ADP]或缺失的[TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF-ΔADP，标记为ΔADP]感染的A549细胞的IL-17和GMCSF表达水平。在感染后的指定时间收集条件培养基，并以ELISAs测量GMCSF。
图9描绘了用以下病毒感染的A549细胞中的CD80、CD137L和ICAM1染色：[TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1，标记为IRES]，[TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1，标记为19K-IX-5]，或对照病毒[TAV-(19k)空-(IX)空-(L5)空，标记为空]。
图10描绘了用以下病毒感染的HT29细胞中的CD80、CD137L和ICAM1染色：[TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1，标记为IRES]，[TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1，标记为19K-IX-5]，或对照病毒[TAV-(19k)空-(IX)空-(L5)空，标记为空]。
图11描绘了用以下病毒感染的ADS12细胞中的CD80、CD137L和ICAM1染色：[TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1，标记为IRES]，[TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1，标记为19K-IX-5]，或对照病毒[TAV-(19k)空-(IX)空-(L5)空，标记为空]。
图12描绘了用以下病毒感染的F244细胞中的CD80、CD137L和ICAM1染色：[TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1，标记为IRES]，[TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1，标记为19K-IX-5]，或对照病毒[TAV-(19k)空-(IX)空-(L5)空，标记为空]。
图13描绘了在MOI为5时病毒TAV-IX5-空(标记为“空”)和TAV-IX5-mIL12(标记为“mIL12”)在A549细胞中的溶瘤性活性。在感染后的指定日将孔用结晶紫染色。
图14是病毒TAV-IX5-mIL12的转基因表达。在MOI为5的情况下将A549细胞用TAV-IX5-空(标记为“空”)或TAV-IX5-mIL12(标记为“mIL12”)感染，在感染后5日收集条件培养基并将其用于ELISA中以测量异二聚小鼠IL-12。使用TAV-IX5-mIL12病毒表达高水平的小鼠IL-12，而对照TAV-IX5-空病毒则否。柱状图表示一式三份样品的meIL-12水平，误差线表示标准偏差。
详细描述
本发明部分基于以下发现：具有***到病毒基因组的两个病毒转录单元之间的一个或多个核苷酸序列的重组腺病毒能有效地在靶标细胞或组织中复制和表达核苷酸序列。
I.重组腺病毒
腺病毒是由核衣壳和双链线性DNA基因组组成的非包膜的二十面体病毒。腺病毒利用宿主的复制机制在哺乳动物细胞核中复制。术语“腺病毒”是指腺病毒属中的任何病毒，包括但不限于人、牛、绵羊、马、犬、猪、鼠和猿猴腺病毒亚属。特别地，人腺病毒包括A-F亚属以及其各个血清型，各个血清型和A-F亚属包括但不限于人腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11a和Ad11p)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型。术语牛腺病毒包括但不限于牛腺病毒1、2、3、4、7和10型。术语犬腺病毒包括但不限于犬1(病毒株CLL、Glaxo、RI261、Utrect、Toronto 26-61)和2型。术语马腺病毒包括但不限于马1和2型。术语猪腺病毒包括但不限于猪3和4型。
在一些实施方式中，提供的是来源于人腺病毒5型和35型的重组病毒。术语“病毒载体”和“病毒”在本文中可互换地用于表示不具有蛋白合成或能量产生机制的任何专性胞内寄生物。
腺病毒复制周期有两个阶段：早期阶段，在此阶段中表达转录单元E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4。由这些转录单元内的基因编码的蛋白质主要参与病毒转录调控，病毒DNA复制，以及抑制对感染的宿主反应。L1-L5转录单元在病毒复制周期的晚期转录，并且主要编码构成病毒衣壳的部件或参与衣壳组装的蛋白质。L1-L5转录单元主要由主要晚期启动子表达。
成熟腺病毒体的一般结构在不同腺病毒物种之间是保守的。腺病毒衣壳由三种主要蛋白质(II、III和IV)和五种次要蛋白质(VI、VIII、IX、IIIa和IVa2)组成。本文所用的“IVa2基因”是指编码IVa2蛋白、其修饰形式和/或片段的基因。本文所用的“IX基因”是指编码IX蛋白、其修饰形式和/或片段的基因。
在图1中显示了Ad5基因组的示意图和E4基因的细节。来自E4的初级转录物经受二择一的拼接事件，并预期其编码7种不同多肽：ORF1、ORF2、ORF3、ORF3/4、ORF4、ORF5、ORF6和ORF6/7。(Leppard et al.,Journal ofgeneral Virology,78:2131–8(1997))“ORF”在本文中用于表示多肽或编码多肽的核苷酸序列，其修饰形式和/或片段。
此外，纤维蛋白(也称为蛋白质IV或SPIKE)形成了从二十面体衣壳的每个定点伸出的刺突。本文所用的“纤维基因”是指编码纤维蛋白的基因(也称为L5基因)，其修饰形式和/或片段。
A.***位点
在一个方面，本发明提供了一种包含***到***位点中的核苷酸序列的重组腺病毒，其中***位点位于第一病毒转录单元的终止密码子和第二病毒转录单元的终止密码子之间，其中与第一病毒转录单元的起始位点距离第二病毒转录单元的终止密码子相比，第一病毒转录单元的终止密码子更靠近第二病毒转录单元的终止密码子，其中与第二病毒转录单元的起始位点距离第一病毒转录单元的终止密码子相比，第二病毒转录单元的终止密码子更靠近第一病毒转录单元的终止密码子。在一些实施方式中，第一病毒转录单元和第二病毒转录单元在腺病毒基因组之间彼此邻近，例如，在***核苷酸序列之前，在第一病毒转录单元和第二病毒转录单元之间没有病毒转录单元。
本文所用的术语“病毒转录单元”是指从病毒基因组中的转录起始位点延伸到转录终止位点的核苷酸序列的线性序列。病毒转录单元可为天然的，修饰的，或其片段。术语“病毒转录单元”和“病毒基因”在本文中可互换使用。
在某些实施方式中，重组腺病毒是人腺病毒。在一些实施方式中，重组腺病毒是人腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或91型。在一些实施方式中，重组腺病毒是5型腺病毒(Ad5)或35型腺病毒(Ad35)。
在某些实施方式中，第一病毒转录单元是腺病毒IX基因，第二病毒转录单元是腺病毒IVa2基因。在某些实施方式中，第一病毒转录单元是腺病毒纤维基因，第二病毒转录单元是腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7。
在某些实施方式中，***位点是IX-E2***位点。在某些实施方式中，IX-E2***位点位于腺病毒IX基因的终止密码子和腺病毒IVa2基因的终止密码子之间。在某些实施方式中，核苷酸序列***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029到4050位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4051到4070位的核苷酸之间，或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4071到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899到3970位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899到3920位的核苷酸之间，对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3920到3940位的核苷酸之间，或对应于Ad35基因组(SEQ IDNO:41)的3940到3970位的核苷酸之间。
在一些实施方式中，IX-E2***位点与应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029到4093的核苷酸具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。在一些实施方式中，IX-E2***位点与对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899到3970的核苷酸具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。
在某些实施方式中，***位点是L5-E4***位点。在某些实施方式中，L5-E4***位点位于腺病毒纤维基因的终止密码子和腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的终止密码子之间。在某些实施方式中，核苷酸序列***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32800位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32801到32820位位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32821到32840位位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32841到32860位位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32861到32880位位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32881到32900，或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32901到32916位位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的31799到31821位位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的31799到32810位位的核苷酸之间，或对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的32810到31821位位的核苷酸之间。
在一些实施方式中，L5-E4***位点与对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32916的核苷酸具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。在一些实施方式中，L5-E4***位点与对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的31799到31821的核苷酸具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。
在IX-E2***位点和/或L5-E4***位点中具有外源氨基酸序列***的重组腺病毒先前未见描述。与在正常细胞中相比，这样的重组腺病毒出乎意料地在肿瘤细胞中显示了极好的肿瘤选择性表达。在一个方面，本发明提供了一种表达天然蛋白的方法。在另一方面，本发明提供了一种表达诸如二聚或多聚蛋白之类的天然结构的方法。
在另一方面，本发明提供了一种在靶细胞中表达两种或更多种治疗性转基因的方法。所述方法包括将细胞暴露于有效量的本文所述的重组病毒以表达靶转基因。
在某些实施方式中，核苷酸序列包含至少一个转基因。在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含启动子，其中转基因可操作地连接到启动子。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)转基因；(iv)第二聚腺苷酸化信号；和(v)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列被***到第一聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列***到L5-E4***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是纤维(L5)基因的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列***到IX-E2***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是IX基因的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)转基因；(v)第三聚腺苷酸化信号；和(vi)第四聚腺苷酸化信号和转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列被***到第一聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列***到L5-E4***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是纤维(L5)基因的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列***到IX-E2***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是IX基因的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
术语“启动子”在本文中以其一般含义用于表示包含DNA调控序列的核苷酸区域，其中调控序列来源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’-方向)编码序列的转录的基因。
“可操作地连接”是指如下的元件排列：其中所述的组件被构造成使得执行其通常的功能。因此，可操作地连接至编码序列的控制元件能够影响编码序列的表达。控制元件无需与编码序列连续，只要其起到指导表达的作用即可。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可存在中断未翻译但仍在转录的序列，并且启动子序列仍然可被视为“可操作地连接”至编码序列。
在某些实施方式中，启动子是泛素启动子、组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
在一些实施方式中，转基因可操作地连接至泛素启动子，诸如βAct启动子、EF1启动子、EGR1启动子、eIF4A1启动子、FerH启动子、FerL启动子、GAPDH启动子、GRP78启动子、GRP94启动子、HSP70启动子、β-Kin启动子、PGK-1启动子、ROSA启动子、泛素B启动子、SV40启动子或CMV启动子。在一个实施方式中，高水平的组成型表达将是理想的。可用的组成型启动子的实例包括但不限于：逆转录病毒劳斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)，巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)(参见，例如，Boshart et al,细胞,41:521-530(1985))，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子(Invitrogen)。由外源供给的化合物调控的诱导型启动子也是可用的，并且包括，锌诱导的羊金属硫因(MT)启动子，***(Dex)-诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，T7聚合酶启动子***(WO 98/10088)；昆虫蜕皮素启动子(No etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))，四环素-阻遏***(Gossen et al,Proc.Natl.Acad Sci.USA,89:5547-5551(1992))，四环素-诱导***(Gossen et al,Science.268:1766-1769(1995)，也见Harvey et al,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))，RU486-诱导***(Wang et al,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang et al,Gene Ther.,4:432-441(1997))，以及雷帕霉素-诱导***(Magari et al,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在本文背景下可用的其它类型的诱导型启动子是通过特定的生理状态(例如，温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)调控的那些。
在另一实施方式中，将使用用于转基因的天然启动子。当理想的是转基因的表达应模仿天然表达时，天然启动子可能是优选的。当必须暂时地或发展地以组织特异性方式或响应于特定转录刺激地调控转基因的表达时，可使用天然启动子。在进一步的实施方式中，其它天然表达控制元件(诸如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列)也可用于模拟天然表达。
转基因的另一个实施方式包括可操作地连接至组织特异性启动子的转基因，所述组织特异性启动子诸如B29启动子(B细胞)，CD14启动子(单核细胞)，CD43启动子(白细胞和血小板)，CD45启动子(造血细胞)，CD68启动子(巨噬细胞)，结蛋白启动子(肌肉)，弹性蛋白酶-1启动子(胰腺泡细胞)，内皮糖蛋白启动子(内皮细胞)，内皮糖蛋白启动子(内皮细胞)，Flt-1启动子(内皮细胞)，GFAP启动子(星形胶质细胞)，GPIIb启动子(巨核细胞)，ICAM-2启动子(内皮细胞)，小鼠INF-β启动子(造血细胞)，Mb启动子(肌肉)，NphsI启动子(足细胞)，OG-2启动子(成骨质细胞，成牙质细胞)，SP-B启动子(肺)，SYN1启动子(神经元)，WASP启动子(造血细胞)，SV40/bAlb启动子(肝)或SV40/hAlb启动子(肝)。组织特异性启动子在特定类型的细胞或组织中有活性。例如，如果希望在骨骼肌中表达，应使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼肌α-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶的启动子以及具有高于天然启动子的活性的合成肌肉启动子(参见Li et al.,Nat.Biotech.,17:241-245(1999))。组织特异性启动子的实例对于以下是已知的：肝(白蛋白，Miyatake et al.J.Virol.71:5124-32(1997)；乙肝病毒核心启动子，Sandig et al.,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot et al.,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))，骨钙蛋白(Stein et al.,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))，骨涎蛋白(Chen et al.,J.Bone Miner.Rep.,11:654-64(1996))，淋巴细胞(CD2,Hansal et al.,J.Immumnol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体链)，神经元诸如神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(Andersen et al.,细胞.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))，神经丝轻链基因(Piccioli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))，以及神经特异性vgf基因(Piccioli et al.,Neuron.15:373-84(1995))，等等。
转基因的另一个实例包括可操作地连接至肿瘤特异性启动子的转基因，所述肿瘤特异性启动子诸如AFP启动子(肝细胞癌)，CCKAR启动子(胰腺癌)，CEA启动子(上皮癌)，c-erbB2启动子(乳腺癌和胰腺癌)，COX-2启动子(肿瘤)，E2F-1启动子(肿瘤)，HE4启动子(肿瘤)，LP启动子(肿瘤)，MUC1启动子(癌细胞)，PSA启动子(***和***癌)，生存素启动子(肿瘤)，TRP1启动子(黑素细胞和黑素瘤)，Tyr启动子(黑素细胞和黑素瘤)，CXCR4启动子(肿瘤)或AFP/hAFP启动子(肝细胞癌)。肿瘤特异性启动子特异性地在肿瘤细胞中有活性。
在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含共有Kozak序列。在某些实施方式中，重组腺病毒包含编码腺病毒死亡蛋白(ADP)的核苷酸序列的部分或完全缺失。
在某些实施方式中，本发明提供了一种重组腺病毒，其包含***到IX-E2***位点中的第一核苷酸序列和***到L5-E4***位点中的第二核苷酸序列。这些实施方式使腺病毒能表达两种或更多种独立的外源转基因。这种方法相对于表达包含由自切割连接子将其连接在一起的两个转基因的融合蛋白的腺病毒具有某些优势，因为切割的连接子可能是潜在免疫原性的。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)包含第一转基因的第一核苷酸序列；(iv)连接子；(v)包含第二转基因的第二核苷酸序列；(vi)第二聚腺苷酸化信号；和(vii)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)包含第一转基因的第一核苷酸序列；(v)连接子；(vi)包含第二转基因的第二核苷酸序列；(vii)第三聚腺苷酸化信号；和(viii)第四聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。
在某些实施方式中，IX-E2***位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，L5-E4***位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含***到E1b-19K***位点、E3***位点或E4***位点中的核苷酸序列。在某些实施方式中，E1b-19K***位点位于Elb-19K的起始位点和Elb-55K的起始位点之间。在某些实施方式中，E3***位点位于腺病毒pVIII基因的终止密码子和腺病毒纤维基因(L5)的起始位点之间。在某些实施方式中，E4***位点位于腺病毒E4基因的ORF1的起始密码子到ORF6/7的终止密码子之间。
在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含***到IX-E2***位点中的第一核苷酸序列和***到E1b-19K***位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含***到IX-E2***位点中的第一核苷酸序列和***到E3***位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含***到IX-E2***位点中的第一核苷酸序列和***到E4***位点中的第二核苷酸序列。
在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含***到L5-E4***位点中的第一核苷酸序列和***到E1b-19K***位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含***到L5-E4***位点中的第一核苷酸序列和***到E3***位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含***到L5-E4***位点中的第一核苷酸序列和***到E4***位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含***到IX-E2***位点中的第一核苷酸序列和***到L5-E4***位点中的第二核苷酸序列以及***到E1b-19K***位点、E3***位点或E4***位点中的第三核苷酸序列。
腺病毒Elb-19k基因主要用作抗凋亡基因，并且是细胞抗凋亡基因BCL2-2的同系物。由于在子代病毒粒子成熟之前宿主细胞死亡将会限制病毒复制，Elb-19k作为El盒的一部分表达以防止成熟前细胞死亡，从而允许感染进行和得到成熟病毒体。因此，在某些实施方式中，提供了包含Elb-19K***位点的重组病毒，例如，腺病毒具有***到Elb-19K***位点中的外源核苷酸序列。在某些实施方式中，***位点位于Elb-19K的起始位点和Elb-19K的终止密码子之间。
在某些实施方式中，E1b-19K***位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约100至约305，约100至约300，约100至约250，约100至约200，约100至约150，约150至约305，约150至约300，约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E1b-19K***位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约200个核苷酸(例如，202个核苷酸)的缺失。在某些实施方式中，E1b-19K***位点包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的核苷酸1714-1917的缺失，或者编码转基因的外源核苷酸序列***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的1714和1917位的核苷酸之间。在某些实施方式中，编码转基因的外源核苷酸序列***到CTGACCTC(SEQ ID NO:3)和TCACCAGG(SEQ ID NO:2)之间，例如，重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO:3)、编码转基因的外源核苷酸序列和TCACCAGG(SEQ ID NO:2)。在某些实施方式中，E1b-19K***位点包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的核苷酸1611-2153或1611-1915的缺失。
在某些实施方式中，E1b-19K***位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约100至约305，约100至约300，约100至约250，约100至约200，约100至约150，约150至约305，约150至约300，约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E1b-19K***位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约200个核苷酸(例如，202个核苷酸)的缺失。在某些实施方式中，E1b-19K***位点包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的核苷酸1714-1917的缺失，或第一治疗性转基因***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的1714和1917位位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一治疗性转基因***到CTGACCTC(SEQ ID NO:3)和TCACCAGG(SEQ ID NO:2)之间，例如，重组腺病毒以5’至3’的方向包含，CTGACCTC(SEQ IDNO:3)、第一治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO:2)。
在某些实施方式中，E3***位点包含约500至约3185，约500至约3000，约500至约2500，约500至约2000，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约3185，约1000至约3000，约1000至约2500，约1000至约2000，约1000至约1500，约1500至约3185，约1500至约3000，约1500至约2000，约2000至约3185，约2000至约3000，约2000至约2500，约2500至约3185，约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E3***位点位于E3-10.5K的终止密码子和E3-14.7K的终止密码子之间。在某些实施方式中，E3***位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含约500至约1551，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约1551，约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸缺失。在某些实施方式中，E3***位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含约1050个核苷酸的缺失，例如，E3***位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含1063个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E3***位点包含对应于Ad5 dl309 E3缺失的缺失。在某些实施方式中，E3***位点包含对应于Ad5基因组(SEQID NO:1)的核苷酸29773-30836的缺失，或第二治疗性转基因***到对应于Ad5基因组(SEQID NO:1)的29773到30836位位的核苷酸之间。在某些实施方式中，E3***位点包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的核苷酸27199-30622的缺失。
在某些实施方式中，E4***位点包含E4基因的任一个ORF，即，位于ORF1的起始密码子到ORF6/7的终止密码子之间。例如，核苷酸序列可***到E4 ORF1和/或E4 ORF2。在某些实施方式中，可缺失部分或整个E4区域。在某些实施方式中，在任何前述病毒中，重组腺病毒进一步包含E4缺失。在某些实施方式中，E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点(即，编码E4-ORF6/7的起始密码子的核苷酸序列，例如，对应于SEQ ID NO:1的核苷酸34075-34077)到右侧反向末端重复序列(ITR；例如，对应于SEQ ID NO:1的核苷酸35836-35938)之间。在某些实施方式中，E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点和E4-ORF1的起始位点(即，编码E4-ORF1的起始密码子的核苷酸序列，例如，对应于SEQ ID NO:1的核苷酸35524-35526)之间。在某些实施方式中，E4缺失包含位于E4-ORF6/7的起始位点和E4-ORF1的起始位点之间的核苷酸序列的缺失。在某些实施方式中，E4缺失包含约500至约2500，约500至约2000，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约2500，约1000至约2000，约1000至约1500，约1500至约2500，约1500至约2000，或约2000至约2500个核苷酸缺失。在某些实施方式中，E4缺失在邻近E4-ORF6/7的起始位点处包含约250至约1500，约250至约1250，约250至约1000，约250至约750，约250至约500，from 500至约1500，约500至约1250，约500至约1000，约500至约750，from 750至约1500，约750至约1250，约750至约1000，约1000至约1500或约1000至约1250个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E4缺失在邻近E4-ORF6/7的起始位点处包含约1450个核苷酸的缺失，例如，E4缺失在邻近E4-ORF6/7的起始位点处包含约1449个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E4缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的核苷酸34078-35526或34083-35541的缺失。在某些实施方式中，E4缺失包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的核苷酸33004-34422或31827-34415的缺失。
B.修饰的转录控制区域
先前开发的溶瘤性病毒包括在PCT公开第WO2010/101921号中被称为TAV-255的溶瘤性血清型5腺病毒(Ad5)，其在正常细胞中转录减弱，但在癌细胞中转录活性。据信TAV-255载体实现这种肿瘤选择定的机理是通过针对转录因子Pea3和E2F的三个转录因子(TF)结合位点的靶向缺失，所述转录因子Pea3和E2F是调控E1a腺病毒表达的蛋白质，E1a是在病毒进入宿主细胞之后通过结合到特定DNA序列而最早转录的基因。这三种Pea3和E2F缺失在生长停滞的正常细胞中减弱复制，但在恶性细胞中则否，表明这些DNA序列仅可用于癌细胞转录调控和生长。
在某些实施方式中，任何前述重组腺病毒包含修饰的E1a调控序列。在某些实施方式中，重组腺病毒包含具有功能性Pea3结合位点的缺失的E1a启动子。例如，病毒可包含对应于E1a起始位点上游约-300至约-250的核苷酸的缺失或对应于E1a起始位点上游-305至-255的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的195-244的核苷酸的缺失，和/或E1a启动子包含序列GGTGTTTTGG(SEQ ID NO:4)。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含可操作地连接至基因的修饰的基于TATA框的启动子和/或可操作地连接至基因的修饰的基于CAAT框的启动子，其中修饰的基于TATA框的启动子缺乏功能性TATA框并允许基因在过度增殖细胞中的选择性表达，其中修饰的基于CAAT框的启动子缺乏功能性CAAT框并允许基因在过度增殖细胞中的选择性表达。
在某些实施方式中，其中修饰的基于TATA框的启动子是早期基因启动子。在某些实施方式中，修饰的基于TATA框的启动子是E1a启动子，E1b启动子或E4启动子。在某些实施方式中，修饰的基于TATA框的启动子是E1a启动子。
在某些实施方式中，修饰的基于TATA框的启动子中所包含的修饰包括整个TATA框的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含E1a启动子的对应于-27至-24，-31至-24，-44至+54或-146至+54的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于Ad5基因组(SEQID NO:1)的472至475，468至475，455至552，或353至552的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的477至484的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：CTAGGACTG(SEQ ID NO:5)，AGTGCCCG(SEQ ID NO:44)，和/或TATTCCCG(SEQ ID NO:45)。
在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子是早期基因启动子。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子是E1a启动子，E1b启动子或E4启动子。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子是E1a启动子。
在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰包括整个CAAT框的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于E1a启动子的-76至-68的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的423至431的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：TTCCGTGGCG(SEQ ID NO:46)。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的477至484的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，本发明提供了一种表达两种治疗性转基因的方法，当表达时，产生单个多肽链，其在转录后被切割为两个多肽链。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含如下的核苷酸序列：其包含含有第一转基因的第一核苷酸序列和包含第二转基因的第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过连接子隔开。在某些实施方式中，连接子编码可由一种蛋白酶或多种蛋白酶切割的肽。在某些实施方式中，连接子编码内部核糖体进入位点(IRES)。IRES可例如选自下组：脑心肌炎病毒IRES，手足口病病毒IRES，和脊髓灰质炎病毒IRES。在某些实施方式中，核苷酸序列***到IX-E2***位点或L5-E4***位点中，其中重组腺病毒进一步包含***到E1b-19K***位点、E3***位点或E4***位点中的第三核苷酸序列。
在某些实施方式中，病毒具有对调控序列或启动子的一个或多个修饰。对调控序列或启动子的修饰包含与调控序列或启动子的野生型序列相比的缺失、取代或添加的一个或多个核苷酸。
在一个实施方式中，调控序列或启动子的修饰包括修饰转录因子结合位点的序列以减少对转录因子的亲和力，例如，通过缺失其一部分或者向结合位点中***单个点突变。在某些实施方式中，额外的修饰调控序列在癌细胞中增强表达，但在正常细胞减表达。
Ela调控序列包含针对转录因子Pea3的五个结合位点，被称为Pea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和Pea3 V，其中Pea3 I是最接近Ela起始位点的Pea3结合位点，Pea3 V是最远的。Ela调控序列还包含针对转录因子E2F的结合位点，在这里称为E2F I和E2F II，其中E2F I是最接近Ela起始位点的E2F结合位点，E2F II是更远的。从Ela起始位点，结合位点如下排列：Pea3 I、E2F I、Pea3 II、E2F II、Pea3 III、Pea3 IV和Pea3 V。
在一个实施方式中，这七个结合位点或功能性结合位点中的至少一个缺失。如本文所用，“功能性结合位点”是指能够结合到相应的结合伴侣(例如，转录因子)的结合位点，例如，具有相应的野生型结合位点序列的结合活性的至少100％，至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，或至少40％的结合位点。如本文所用，“非功能性结合位点”是指具有例如相应的野生型结合位点序列的结合活性的少于30％，少于20％，少于10％，或0％的结合位点。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含具有功能性Pea3结合位点的缺失的E1a启动子，例如，缺失整个Pea3结合位点。如本文所用，“功能性Pea3结合位点”是指能够结合到其相应的转录因子(例如，Pea3)的Pea3结合位点，例如，具有相应的野生型Pea3结合位点序列的Pea3结合活性的至少100％，至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，或至少40％的Pea3结合位点。如本文所用，“非功能性Pea3结合位点”是指具有相应的野生型Pea3结合位点序列的Pea3结合活性的例如少于30％，少于20％，少于10％，或0％的Pea3结合位点。测定Pea3结合位点是否结合到Pea3的检测方法在本领域中已知。示例性的结合检测方法包括电泳迁移率变动分析，染色质免疫共沉淀分析，和DNA酶足迹分析。
在一个实施方式中，缺失了至少一个Pea3结合位点或功能性Pea3结合位点。缺失的Pea3结合位点可以是Pea3 I，Pea3 II，Pea3 III，Pea3 IV，和/或Pea3 V。在一个实施方式中，缺失的Pea3结合位点是Pea3 II，Pea3III，Pea3 IV，和/或Pea3 V。在另一实施方式中，缺失的Pea3结合位点是Pea3 IV和/或Pea3 V。在另一实施方式中，缺失的Pea3结合位点是Pea3 II和/或Pea3 III。在另一实施方式中，缺失的Pea3结合位点是Pea3 II和Pea3III。在另一实施方式中，Pea3 I结合位点或功能性Pea3 I结合位点被保留。
在一个实施方式中，缺失了至少一个E2F结合位点或功能性E2F结合位点。在另一实施方式中，至少一个E2F结合位点或功能性E2F结合位点被保留。在一个实施方式中，保留的E2F结合位点是E2F I和/或E2F II。在另一实施方式中，保留的E2F结合位点是E2F II。在另一实施方式中，总缺失基本由Pea3 II，Pea3 III，Pea3 IV，和/或Pea3 V中的一个或多个组成。在一个实施方式中，病毒具有位于E1a起始位点上游-305至-255的50个碱基对区域的缺失，例如，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的195-244，在下文中称为TAV-255缺失。在某些实施方式中，TAV-255缺失导致包含序列GGTGTTTTGG(SEQ ID NO:4)的启动子。
在一个实施方式中，重组腺病毒具有与溶瘤性血清型5腺病毒(Ad5)中相同或相似的E1a修饰，其在PCT公开第WO2010101921号和美国公开第20160017294A1号中被称为TAV-255，上述每篇文献通过引用以其整体并入本文。据信TAV-255载体实现这种肿瘤选择定的机理是通过针对转录因子Pea3和E2F的三个转录因子(TF)结合位点的靶向缺失，所述转录因子Pea3和E2F是调控E1a腺病毒表达的蛋白质，E1a是在病毒进入宿主细胞之后通过结合到特定DNA序列而最早转录的基因。这三种Pea3和E2F缺失在生长停滞的正常细胞中减弱复制，但在恶性细胞中则否，表明这些DNA序列仅可用于癌细胞转录调控和生长。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含具有一个或多个功能性Pea3结合位点缺失的E1a启动子。在某些实施方式中，缺失包含对应于E1a起始位点上游约-300至约-250的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，其中缺失包含对应于E1a起始位点上游-305至-255的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的195-244的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，E1a启动子包含序列GGTGTTTTGG(SEQ ID NO:4)。
在一个实施方式中，重组腺病毒包含一个或多个Pea3转录结合位点缺失，但没有E1A区域中的一个或多个E2F转录结合位点缺失。在其它实施方式中，重组腺病毒包含一个或多个E2F转录结合位点缺失，但没有E1A区域中的一个或多个Pea3转录结合位点缺失。
在某些实施方式中，重组溶瘤性腺病毒包含可操作地连接至基因的修饰的基于TATA框的启动子，其中修饰的基于TATA框的启动子缺乏功能性TATA框并允许基因在过度增殖和/或非生长停滞细胞中的选择性表达。如本文所用，“功能性TATA框”是指能够结合到TATA框结合蛋白(TBP)的TATA框，例如，具有相应的野生型TATA框序列的TBP结合活性的至少100％，至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，或至少40％的TATA框。如本文所用，“非功能性TATA框”是指例如具有相应的野生型TATA框序列的TBP结合活性的少于30％，少于20％，少于10％，或0％的TATA框。用于检测TBP是否结合到TATA框的检测方法在本领域中已知。示例性的结合检测方法包括电泳迁移率变动分析，染色体免疫共沉淀分析和DNA酶足迹分析。
如本文所用，“修饰的TATA框”是指相对于野生型TATA框序列具有缺失、取代或添加的一个或多个核苷酸的TATA框。
例如，病毒可包含对应于E1a起始位点上游-29至-26，-33至-26，-44至+52或-148至+52的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的353-552的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，TATA框缺失导致包含如下序列的E1a启动子：CTAGGACTG(SEQ ID NO:5)，AGTGCCCG(SEQ ID NO:44)，和/或TATTCCCG(SEQ ID NO:45)。
在某些实施方式中，重组溶瘤性腺病毒包含可操作地连接至基因的修饰的基于CAAT框的启动子，其中修饰的基于CAAT框的启动子缺乏功能性CAAT框并允许基因在过度增殖和/或非生长停滞细胞中的选择性表达。基于TATA框的启动子和基于CAAT框的启动子可为相同启动子(例如，Ad5 E1a启动子)或可为不同启动子。
如本文所用，“CAAT框”是指能够结合到C/EBP或NF-Y蛋白的核苷酸序列。CAAT框通常包含共有序列GG(T/C)CAATCT。
如本文所用，“修饰的CAAT框”是指相对于野生型CAAT框序列具有缺失、取代或添加的一个或多个核苷酸的CAAT框。
如本文所用，“功能性CAAT框”是指能够结合到C/EBP或NF-Y蛋白的CAAT框，例如，具有相应的野生型CAAT框序列的C/EBP或NF-Y结合活性的至少100％，至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，或至少40％的CAAT框。如本文所用，“非功能性CAAT框”是指例如具有相应的野生型CAAT框序列的C/EBP或NF-Y结合活性的少于30％，少于20％，少于10％，或0％的CAAT框。用于检测C/EBP或NF-Y蛋白是否结合到CAAT框的尖峰方法在本领域中已知。示例性的结合检测方法包括电泳迁移率变动分析，染色体免疫共沉淀分析和DNA酶足迹分析。
如本文所用，“基于CAAT框的启动子”是指包含的CAAT框任何基因启动子。
如本文所用，“修饰的基于CAAT框的启动子”是指相对于野生型的基于CAAT框的启动子通过缺失、取代或添加一个或多个核苷酸来修饰的基于CAAT框的启动子。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰包括野生型的基于CAAT框的启动子序列的一个或多个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰由野生型的基于CAAT框的启动子序列的一个或多个核苷酸的缺失组成。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰包括野生型的基于CAAT框的启动子序列整个CAAT框的缺失。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰由野生型的基于CAAT框的启动子序列的整个CAAT框的缺失组成。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰包括整个基于CAAT框的启动子的缺失。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰由整个基于CAAT框的启动子的缺失组成。在某些实施方式中，修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰不包含添加单独的功能性启动子序列或用其取代。
编码病毒基因的核酸可通过常规转染或转化技术加入到质粒中和引入宿主细胞中。具体的生产和纯化条件将取决于所采用的病毒和生产***而不同。对于腺病毒，产生病毒粒子的传统方法是共转染，然后是后续的穿梭质粒(通常包含腺病毒基因组的一小部分，并任选地包含潜在的转基因表达盒)与腺病毒辅助质粒(包含整个腺病毒基因组的大部分)的体内重组。另一种生产腺病毒的技术包括利用细菌人工染色体(BAC)***，利用包含互补腺病毒序列的两个质粒在recA+细菌菌株中进行体内细菌重组，以及酵母人工染色体***(YAC)***.
在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒是溶瘤性病毒，例如，显示肿瘤选择性复制和/或病毒介导的溶解的病毒。在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒显示了治疗性转基因在过度增殖细胞(例如，癌细胞、肿瘤细胞)中相对于非过度增殖细胞的选择性表达。在某些实施方式中，治疗性转基因在非过度增殖细胞中的表达为基因在过度增殖细胞中的表达的约90％，约80％，约70％，约60％，约50％，约40％，约30％，约20％，约10％，或约5％。在某些实施方式中，病毒显示治疗性转基因在非过度增殖细胞中没有可检测的表达。治疗性转基因表达可通过本领域已知的任何合适方法测定，例如，我们stern blot或ELISA。过度增殖细胞可为癌细胞，例如，癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、***癌、肺癌、胃肠道癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、甲状腺癌、间皮瘤、肝癌、肾癌、皮肤癌、头颈部癌或脑癌细胞。
C.转基因
本文所公开的重组腺病毒包括***到任何前述***位点(例如，IX-E2***位点、L5-E4***位点、E1b-19K***位点、E3***位点中或E4***位点)中的一个或多个外源核苷酸序列。
在某些实施方式中，核苷酸序列包含至少一个转基因。在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含启动子，其中转基因可操作地连接到启动子。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)转基因；(iv)第二聚腺苷酸化信号；和(v)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列被***到第一聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列***到L5-E4***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是L5转录单元的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是E4转录单元的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列***到IX-E2***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是IX转录单元的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)转基因；(v)第三聚腺苷酸化信号；和(vi)第四聚腺苷酸化信号和转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列被***到第一聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列***到L5-E4***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是L5转录单元的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是E4转录单元的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列***到IX-E2***位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是IX转录单元的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含核苷酸序列包含含有第一转基因的第一核苷酸序列和包含第二转基因的第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过连接子隔开。
在某些实施方式中，核苷酸序列以5’到3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)包含第一转基因的第一核苷酸序列；(iv)连接子；(v)包含第二转基因的第二核苷酸序列；(vi)第二聚腺苷酸化信号；和(vii)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列以5’到3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)包含第一转基因的第一核苷酸序列；(v)连接子；(vi)包含第二转基因的第二核苷酸序列；(vii)第三聚腺苷酸化信号；和(viii)第四聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。
在某些实施方式中，连接子编码可由一种蛋白酶或多种蛋白酶切割的肽。在某些实施方式中，连接子编码内部核糖体进入位点(IRES)或自切割2A肽。IRES可例如选自下组：脑心肌炎病毒IRES，手足口病病毒IRES和脊髓灰质炎病毒IRES。在某些实施方式中，其中核苷酸序列被***到IX-E2***位点或L5-E4***位点中，其中重组腺病毒进一步包含***到E1b-19K***位点、E3***位点或E4***位点中的第三核苷酸序列。
在某些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的一个或多个包含一个或多个转基因。
在某些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的一个或多个包含：
a)转录起始区；
b)包含转基因的核苷酸序列，其中转基因在转录起始区的转录控制下；和
c)转录种植区。
在一些实施方式中，转录起始区包含启动子。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码单体，二聚，三聚，四聚或多聚蛋白质或其部分。在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码具有治疗活性的RNA。在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码包含至少一个结合结构域的融合蛋白。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码免疫调节分子。在某些实施方式中，免疫调节分子是共刺激配体，细胞因子或细胞因子受体在某些实施方式中，免疫调节分子选自下组：IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-7，IL-10，IL-10trap，IL-10R，IL-12A/p35，IL-12B/p40，IL-15，IL-23A/p19，IL-24，IL-27，IL-33，IL-35，IL-15，IL-15受体融合蛋白，TGF-β，TGF-βtrap，IL-10trap，VEGF，VEGFtrap，吲哚胺-2,3-二氧合酶(IDO)，诱导型T细胞共刺激配体(ICOS-L)，CD80，CD137L，TNF-α，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，GM-CSF，GITR配体(GITRL)，OX40配体(OX40L)，CD40配体(CD40L)/CD154，CD70，CD86，CD137，CD137L，BORIS/CTCFL，骨形态发生蛋白(BMP)，TNFSF9，FGF，ICAM，足糖萼蛋白，其功能片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因编码以N-末端到C-末端的方向包含以下部分的融合蛋白：细胞因子受体胞外结构域的可溶部分；氨基酸连接子；免疫球蛋白(Ig)铰链区；和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域。在一些实施方式中，细胞因子受体是TGFβII型(TβRII)受体。
在某些实施方式中，编码CD80或其功能性片段的核苷酸序列被***到IX-E2***位点中，和编码CD137L或其功能性片段的核苷酸序列被***到L5-E4***位点。在某些实施方式中，编码CD137L或其功能性片段的核苷酸序列被***到IX-E2***位点中，编码CD80或其功能性片段的核苷酸序列被***到L5-E4***位点中。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含编码IL-12A/p35或其功能性片段的核苷酸序列、编码IL-12B/p40或其功能性片段的核苷酸序列和编码IFN-α或其功能性片段的核苷酸序列。这些核苷酸序列可被***到IX-E2***位点、L5-E4***位点、E1b-19K***位点、E3***位点和/或E4***位点中。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和/或第二转基因中的一个或多个编码抗原结合分子。在某些实施方式中，抗原结合分子是抗PD-1抗体、抗TGF-β抗体、抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体或其功能片段。示例性的抗PD-1抗体包括纳武单抗(Bristol-MyersSquibb Co.)，派姆单抗(
Figure BDA0002357991160000361
Merck&Co.)和阿特朱单抗(原MPDL3280A)，MEDI4736，Avelumab和PDR001。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码抗原或该抗原的配体。在某些实施方式中，抗原选自下组：CAIX，CEA，CD5，CD7，CD10，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，CD38，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD80，CD133，CD135(Flt3)，Flt3I，CD138，巨细胞病毒(CMV)感染细胞抗原，4-1BB，EGP-2，EGP-40，EpCAM，erbB2，erbB3，erbB4，FBP，胎儿乙酰胆碱受体，KRAS，HPV E6，E7，BING-4，EphA3，钙激活氯离子通道-2，细胞周期蛋白B1，9D7，SAP-1，PRAME，SSX-2，不成熟层粘连蛋白受体，叶酸受体-a，端粒酶，酪氨酸酶，黑色素-A，NY-ESO-1，GD2，GD3，hTERT，IL13R-a2，x-轻链，KDR，LeY，LI细胞粘附分子，MAGE-A1，MAGE-A3，MART1，MART2，MUC1，间皮素，HER-2/neu，EGFRvIII，NKG2D配体，NY-ES0-1，gp100，TRP-1/-2，TRP-1/-2，P多肽，MC1R，***特异性抗原，BRAF，雄激素受体，β-连环蛋白，BRCA1/2，CDK4，CML66，纤连蛋白，p53，TGF-βRII，T细胞受体，癌胚抗原，5T4，PSCA，PSMA，ROR1，TAG-72，VEGF-R2，WT-1，其功能片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码毒素。在某些实施方式中，毒素是假单胞菌外毒素，蓖麻毒素或白喉毒素。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码酶。在某些实施方式中，酶选自下组：β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，羧肽酶，β-内酰胺酶，酯酶，金属蛋白酶，松弛素，胶原酶，链激酶，精氨酸酶，NOS-2，其片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码细胞周期控制剂，生长因子，抗凝剂，前药激活基因，肿瘤抑制基因，凋亡基因，抗血小板剂，凝血因子，囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)蛋白质，其片段，或其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码血管抑素，内皮抑素，乙酰胆碱，DKK1/Wnt，Ox40L，GITRL，分泌鞭毛蛋白，胸苷激酶，其功能片段，或其衍生物。
II.治疗方法
在另一方面，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞暴露于有效量的任何前述重组腺病毒以抑制肿瘤细胞的增殖。
在另一方面，本发明提供了一种抑制需要其的受试者的肿瘤生长的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒以抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，肿瘤是HER2/neu阳性的肿瘤，并且其中重组腺病毒包含具有不多于一个功能性Pea3结合位点缺失的E1a启动子。在一些实施方式中，HER2/neu阳性的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌或非小细胞肺癌(NSCLC)。
在某些实施方式中，肿瘤选自下组：黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、***肿瘤、***、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺肿瘤、肾细胞癌、***肿瘤、胃食管肿瘤、结直肠肿瘤、睾丸肿瘤、***、卵巢肿瘤、肝细胞癌、胆管癌、脑肿瘤、子宫内膜肿瘤、神经内分泌肿瘤、默克细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤和胰腺肿瘤。
本文公开的重组腺病毒可用于治疗多种医学适应症，例如，癌症。如本文所用，“治疗(treat、treating和treatment)”表示受试者(例如，人)的疾病的治疗。这包括：(a)抑制疾病，即，停滞其发展；和(b)缓解疾病，即，引起疾病状态的逆转。如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指通过本文所述方法和组合物治疗的生物体。这样的生物体优选包括但不限于：哺乳动物(例如，鼠、猿猴、马、牛、猪、犬、猫等)，更优选包括人。
在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的过度增殖疾病的方法。所述方法包括对受试者施用有效量的本文所述的重组病毒以治疗受试者的过度增殖疾病。受试者在某些实施方式中，过度增殖疾病选自下组：癌症、动脉硬化、类风湿性关节炎、银屑病、狼疮、特发性肺纤维化、硬皮病和硬化症。在某些实施方式中，过度增殖疾病是癌症。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括对受试者施用有效量的本文所述的重组腺病毒以治疗受试者的癌症。
癌症的实例包括实体肿瘤、软组织肿瘤、造血***肿瘤和转移病变。造血***肿瘤的实例包括：白血病，急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，B-细胞、T-细胞或FABALL，急性髓细胞性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，例如，转化型CLL，弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)，滤泡性淋巴瘤，毛细胞白血病，骨髓增生异常综合征(MDS)，淋巴瘤，霍奇金氏病，恶性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，或Richter’s综合征(Richter’s转化)。实体肿瘤的实例包括恶性肿瘤，例如，肉瘤，腺癌，以及多种器官***的癌症，诸如影响头颈部(包括咽部)，甲状腺，非(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))，乳腺，淋巴，胃肠道(例如，口、食管、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)，生殖器和泌尿生殖道(例如，肾，尿道上皮，膀胱，卵巢，子宫，宫颈，子宫内膜，***，睾丸)，CNS(例如，神经或神经胶质细胞，例如，成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如，黑素瘤)的那些癌症。
在某些实施方式中，癌症选自黑素瘤，皮肤鳞状细胞癌，基底细胞癌，头颈部癌，乳腺癌，***肿瘤，***，非小细胞肺癌，间皮瘤，小细胞肺癌，肾细胞癌，***癌，胃食管癌，结直肠癌，睾丸癌，膀胱癌，卵巢癌，肝细胞癌，胆管癌，脑癌，子宫内膜癌，神经内分泌癌和胰腺癌.
在某些实施方式中，癌症选自鼻炎癌，基底细胞癌，滑膜癌，肝细胞癌，肾癌，***癌，黑素瘤，肺癌，肠癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，脑癌，喉癌，口腔癌，肝癌，骨癌，胰腺癌，绒毛癌，胃泌素瘤，神经内分泌瘤，嗜铬细胞瘤，泌乳素瘤，T-细胞白血病/淋巴瘤，神经瘤，希佩尔-林道病，佐林格-埃利森综合征，肾上腺癌，***肿瘤，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，脑癌，少突神经胶质瘤，成神经细胞瘤，脑膜瘤，几岁肿瘤，骨癌，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，未知原发未知的癌症，良性肿瘤，胃肠道良性肿瘤，纤维肉瘤，乳腺癌，佩吉特氏病，***，结直肠癌，直肠癌，食道癌癌，胆囊癌，头部肿瘤，咽部肿瘤，颈部肿瘤，肾癌，威尔姆氏瘤，肝癌，卡波济氏肉瘤，***癌，肺癌，睾丸癌，霍奇金氏病，非霍奇金氏淋巴瘤，口腔癌，皮肤癌，间皮瘤，多发性骨髓瘤，卵巢癌，内分泌胰腺癌，胰高血糖素瘤，胰腺癌，副甲状腺癌，***癌，脑垂体肿瘤，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，甲状腺癌，滋养层癌，***，子宫癌，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，听神经瘤，蕈样肉芽肿，胰岛瘤，类癌瘤综合征，生长抑素瘤，牙龈癌，心脏癌，唇癌，脑膜癌，口癌，神经癌，颚癌，腮腺癌，腹膜癌，舌咽癌，胸膜癌，唾液腺癌，舌癌和扁桃体癌。
在一些方面，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞暴露于有效量的任何前述重组腺病毒。
在另一方面，本发明提供了一种抑制需要其的受试者的肿瘤生长的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒。在某些实施方式中，肿瘤选自下组：黑素瘤，皮肤鳞状细胞癌，基底细胞癌，头颈部肿瘤，乳腺肿瘤，***肿瘤，***，非小细胞肺癌，间皮瘤，小细胞肺肿瘤，肾细胞癌，***肿瘤，胃食管肿瘤，结直肠肿瘤，睾丸肿瘤，***，卵巢肿瘤，肝细胞癌，胆管癌，脑肿瘤，子宫内膜肿瘤，神经内分泌肿瘤，默克细胞癌，胃肠道间质瘤，肉瘤，和胰腺肿瘤。
在另一方面，本发明提供了一种治疗需要其的受试者的疾病或病症的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒在某些实施方式中，疾病或病症选自下组：感染，糖尿病性视网膜病，银屑病，类风湿性关节炎，子宫内膜异位症，黄斑变性病症和良性生长障碍，诸如***肥大和脂肪瘤，血管病，心血管病，感染，肝硬化，***病，肿瘤，血管病变，溃疡病变，炎症，血栓形成，和新生内膜形成。
在某些实施方式中，受试者是哺乳动物。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，受试者是儿童。在某些实施方式中，受试者是成人.
在某些实施方式中，重组腺病毒通过肌内、静脉内、动脉内或瘤内注射施用。在某些实施方式中，重组腺病毒通过皮内、吸入、透皮、局部、滴眼、鼻内、透粘膜和直肠施用来施用。
在某些实施方式中，前述重组腺病毒与选自下组的一种或多种治疗组合施用给受试者：手术，放疗，化疗，免疫疗法，激素疗法和病毒疗法。
在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒与酪氨酸激酶抑制剂(例如，埃罗替尼)组合施用。
在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒与一种或多种检查点调节剂组合施用。在某些实施方式中，免疫检查点调节剂是选自下组的一种或多种分子的抑制剂、拮抗剂或激动剂：PD-1，PD-L1，PD-L2，2B4，TIGIT，LAG3，Tim3，BTLA，CD160，GITR，KIR，4-1BB，和CTLA4。在一些实施方式中，免疫检查点调节剂是以下的抗体：PD-1，PD-L1，PD-L2，2B4，TIGIT，LAG3，Tim3，BTLA，CD160，GITR，KIR，4-1BB，和/或CTLA4。示例性的抗PD-1抗体包括纳武单抗(Bristol-Myers Squibb Co.)，派姆单抗(
Figure BDA0002357991160000401
Merck&Co.)和阿特朱单抗(原MPDL3280A)，MEDI4736，Avelumab和PDR001。
药物制剂优选地为无菌的。可通过任何合适的方法实施灭菌，流入，通过无菌过滤膜过滤。当组合物被冻干时，可在冻干和复液之前或之后进行过滤灭菌。
如本文所用，术语“有效量”是指足以引起有益或理想结果的活性组分的量(例如，本发明的重组病毒的量)。有效量可在一次或多次施用、应用或剂量中施用，而且并非意图限制于特定制剂或施用途径。
在某些实施方式中，活性组分的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg范围内，例如，1mg/kg至100mg/kg，1mg/kg至10mg/kg。在某些实施方式中，重组病毒的治疗有效量在如下范围内：102-1015空斑形成单位(pfus)，例如，102-1010，102-105，105-1015，105-1010或1010-1015空斑形成单位。施用量将取决于诸如以下的变量：要被治疗的疾病或适应症的类型和程度，患者的总体健康，抗体的体内效力，药物制剂，以及施用途径。初始剂量可被增加到上限水平之外以迅速达到所需的血液水平或组织水平。可替代地，初始剂量可以小于最佳剂量，并且在治疗过程中每日剂量可逐渐增加。可对人的剂量进行优化，例如在设计为从0.5mg/kg进行到20mg/kg的常规I期剂量递增研究中。给药频率可根据以下因素而不同：诸如施用途径、剂量、病毒的血清半衰期和要被治疗的疾病。示例性的给药频率是每日1次，每周1次，和每两周1次。一种施用途径是肠胃外，例如，静脉输注。基于病毒的药物的配制在本领域一般技术范围内。在某些实施方式中，重组病毒被冻干，并且随后在施用时在缓冲盐水中复液。
如本文所用，术语“组合”施用被理解为表示在受试者患病过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，使得对患者的治疗效果在某个时间点上重叠。在某些实施方式中，当第二种治疗的递送开始时，第一种治疗的递送仍在发生，以使得在施用上存在重叠。这在本文中有时称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方式中，由于组合给药，治疗更有效。例如，与如果在不存在第一种治疗的情况下施用第二种治疗所看到的相比，或者与使用第一种治疗所看到的类似情况相比，第二种治疗更有效，例如，使用更少的第二种治疗可看到相同的效果，或者第二种治疗更大程度地减少症状。在某些实施方式中，递送使得与递送一种治疗而不存在另一种的情况下所看到的相比更多地减少了症状或与病症相关的其他参数。两种治疗的效果可部分加成、完全加成或大于加成。递送可使得所递送的第一种治疗的作用在递送第二种时仍然可检测到。
III.药物组合物/制剂
本公开还提供了一种药物组合物，其包含任何前述重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。如本文所用，“可药用载体”表示与合理的利益/风险比相称的适合用于接触人和动物的组织而没有过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或适应症的缓冲剂、载体和赋形剂。载体在与制剂的其他成分相容的意义上应当是“可接受的”，并且对接受者无害。可药用载体包括于药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和延迟吸收剂等。.
包含本文公开的重组腺病毒的药物组合物和制剂可被配制为与其意图施用的途径相容。施用途径的实例是肌内、静脉内、动脉内或瘤内、皮内、吸入、透皮、局部、透粘膜和直肠施用。
在一个方面，本公开提供了用于稳定和存储重组腺病毒的腺病毒制剂。在一些实施方式中，本发明提供了一种用于腺病毒的制剂，其包含：
一种或多种任何前述重组腺病毒；
至少一种缓冲剂；
至少一种张力修饰剂；
至少一种糖或至少一种稳定剂或二者；和
其中制剂的pH在约7.0至约9.0之间。
在某些实施方式中，稳定剂是甘油。在某些实施方式中，稳定剂是约2％至约5％(v/v)。
在某些实施方式中，缓冲剂是Tris(包括Tris-HCl和/或单-Tris)、TES、HEPES、四水合番木鳖碱、EPPS、三甲基甘氨酸或组氨酸。在某些实施方式中，缓冲剂的浓度为约1mM至约30mM。
在一些实施方式中，张力修饰剂是MgCl2、MnCl2、CaCl2、ZnCl2、NaCl或KCl。在一个实施方式中，张力修饰剂是NaCl。在一个实施方式中，张力修饰剂的浓度为约0.1mM至约5mM。在一个实施方式中，张力修饰剂的浓度为约10mM至约250mM。在一个实施方式中，张力修饰剂的浓度为约25mM至约100mM。在一个实施方式中，张力修饰剂的浓度为约25mM。
在某些实施方式中，制剂包含第一张力修饰剂和第二张力修饰剂，其中第一张力修饰剂是一价阳离子，和其中第二张力修饰剂是二价阳离子。在某些实施方式中，一价阳离子是NaCl或KCl。在某些实施方式中，二价阳离子是MgCl2、MnCl2、CaCl2或ZnCl2。在某些实施方式中，张力修饰剂或二价阳离子的浓度为约0.1mM至约5mM。
在一些实施方式中，糖是蔗糖或海藻糖。在一个实施方式中，糖是蔗糖。在一个实施方式中，糖的重量比体积百分比为约2％至约8％。在一个实施方式中，糖的重量比体积百分比为约3％至约5％。在一个实施方式中，糖的重量比体积百分比为约5％。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个非离子表面活性剂。在某些实施方式中，非离子表面活性剂是聚山梨糖醇-80或聚山梨糖醇-40。在一个实施方式中，非离子表面活性剂的浓度为约0.001％至约1％。在一个实施方式中，非离子表面活性剂的浓度为约0.02％。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个自由基氧化抑制剂。在某些实施方式中，自由基氧化抑制剂是EDTA。在一个实施方式中，自由基氧化抑制剂的浓度为约0.01mM至约5mM。在一个实施方式中，自由基氧化抑制剂的浓度为约0.05mM至约2mM。在一个实施方式中，自由基氧化抑制剂的浓度为约0.1mM。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个冷冻保护剂。在某些实施方式中，冷冻保护剂是EtOH。在一些实施方式中，冷冻保护剂的浓度是约0.01％至5％。在一些实施方式中，冷冻保护剂的浓度是约0.1％至2％。在一个实施方式中，冷冻保护剂的浓度为约0.5％。
在一些实施方式中，制剂的摩尔渗透压浓度为约200mOs/L至约800mOs/L。在一些实施方式中，制剂的摩尔渗透压浓度为约300mOs/L至约600mOs/L。在一些实施方式中，制剂的摩尔渗透压浓度为约400mOs/L至约500mOs/L。
在某些实施方式中，重组溶瘤性腺病毒在任何前述制剂的浓度为约1x107vp/mL至1x 1013vp/mL。
在某些实施方式中，制剂包含约20mM Tris、约25mM NaCl、约2.5％甘油，并且其中制剂的pH为约8.0。在某些实施方式中，制剂包含约20mM Tris、约25mM NaCl、约3-5％蔗糖，并且其中制剂的pH为约8.0。在某些实施方式中，制剂包含约10mM Tris、约75mM NaCl、约5％蔗糖、约0.02％聚山梨糖醇-80、约1mM MgCl2、约0.1mM EDTA、约0.5％EtOH，并且其中制剂的pH为约8.0。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个免疫佐剂。在某些实施方式中，免疫佐剂选自：1)明矾，2)皂苷，3)非离子聚合物表面活性剂s，4)单磷酰脂质A，5)胞壁酰二肽，和6)细胞因子。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一种染料。在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个可逆型蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，可逆型蛋白酶抑制剂是L3/p23半胱氨酸蛋白酶的抑制剂。在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含抗氧化剂。在某些实施方式中，抗氧化剂是维生素A、维生素C、维生素E、维生素B6、维生素B12、叶酸(folic acid)或叶酸盐(folate)。
应理解除非从上下文和使用另有理解，表达“至少一个”独立地包含在该表达之后阐述的客体中的每一个以及所述客体中两个或多个的各种组合。除非从上下文中另有理解，与三个或更多个客体相关联的表达“和/或”应理解为具有相同含义。
除非从上下文中另有理解，使用术语“包含(include,includes,including)”、“具有(has,having)”或“含有(contain,contains,containing)”，包括其语法上的等同形式，通常应被理解为开放式和非限制式的，例如，不排除其他未述及的元件或步骤。
除非另有说明，否则在定量值之前使用术语“约”时，本发明还包含该特定定量值本身。如本文所用，除非另有说明或推断，术语“约”是指与标称值相差±10％。
应理解，只要本发明保持可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序就无关紧要。而且，两个或多个步骤或动作可同时进行。
在本文中使用任何和所有实例或示例性的语言，例如，“诸如”或“包括”仅旨在更好地说明本发明，并且除非要求，其不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何非要求保护的要素对于实施本发明必不可少。
实施例
以下工作实施例是说明性的，并且并非旨在限制，本领域技术人员将会容易理解可实施其他实施方式。
实施例1
示例性的IX-E2***位点的核苷酸序列(根据NCBI参考序列AC_000008.1(SEQ IDNO:1)的核苷酸4029至4093编号)如下。腺病毒IX基因的终止密码子(左侧的“TAA”；SEQ IDNO:8)和腺病毒IVa2基因的终止密码子(右侧的“TTA”；SEQ ID NO:9)以下划线示出。
TAAAACATAAATAAAAAACCAGACTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGTGTCTTGCTGTCTTTA(SEQID NO:6)
实施例2
示例性的L5-E4***位点的核苷酸序列(根据NCBI参考序列AC_000008.1(SEQ IDNO:1)的核苷酸32785到32916编号)如下。腺病毒纤维基因的终止密码子(左侧的“TAA”；SEQID NO:8)和腺病毒E4基因的ORF6/7的终止密码子(右侧的“TCA”；SEQ ID NO:10)以下划线示出。
TAAAGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTGTTTATTTTTCAATTGCAGAAAATTTCAAGTCATTTTTCATTCAGTAGTATAGCCCCACCACCACATAGCTTATACAGATCACCGTACCTTAATCAAACTCA(SEQ ID NO:7)
实施例3
为产生带有克隆到L5-E4位点中的表达盒中的转基因的病毒，通过向L5-E4位点***带有SV40启动子和具有***的SwaI限制性内切位点(“ATTTAAAT”SEQ ID NO:11)的终止子的表达盒来修饰带有腺病毒核苷酸序列(其包含RIDα、RIDβ和E3区域中14.7k基因和E4区域中ORF1-ORF4基因的缺失)的质粒。该修饰的核苷酸序列从L5转录单元的聚腺苷酸化信号(“AATAAA”SEQ ID NO:12)到E4转录单元的聚腺苷酸化信号(“TTTATT”SEQ ID NO:13)为：
SEQ ID NO:14[L5初始空]
AATAAAGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATTTAAATAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGTGTTTATT
在SEQ ID NO:14中，L5和E4转录单元的聚腺苷酸化信号和SwaI限制性内切位点的核苷酸以下划线示出。
随后将编码小鼠GMCSF的转基因克隆到SwaI位点，产生以下序列：
SEQ ID NO:15[L5初始mGMCSF]
Figure BDA0002357991160000461
在SEQ ID NO:15中，L5和E4转录单元的聚腺苷酸化信号和SwaI限制性内切位点的残余核苷酸以下划线示出，编码小鼠GMCSF的转基因以粗体示出。
产生带有以下修饰的病毒TAV-(L5-E4)mGMCSF(相比于腺病毒5型的dl309病毒株)：Ela启动子的TAV-255缺失以提供癌细胞中的选择性复制，病毒E1B-19K基因5’端的缺失(其不会延伸到病毒E1B-55K基因中)，E3RIDα、RIDβ和14.7k基因的缺失(SEQ ID NO:15序列)和E4 ORF1-ORF4基因的缺失。
为检测mGMCSF表达：A549细胞(人癌细胞系)、ADS-12细胞(小鼠癌细胞系)和WI38细胞(人正常细胞系)用TAV-(L5-E4)mGMCSF在MOI(感染复数)为5的情况下感染。作为对照，将另外的细胞在不感染的情况下培养或用病毒TAV-(E1B-19K)mGMCSF感染，所述病毒TAV-(E1B-19K)mGMCSF相比于腺病毒5型的dl309病毒株带有以下修饰：Ela启动子的TAV-255缺失和复制E1B-19K基因的5’端而不破坏E1B-55K基因的mGMCSF基因。在感染后4天，在ELISA中使用条件培养基以测量小鼠GMCSF表达。结果在图2中显示：两种病毒均在A549细胞给出高水平表达，在ADS-12细胞中给出中等水平表达，在WI38细胞中低水平表达。
实施例4
为研究IX-E2位点处的表达盒***，最初，我们***了带有巨细胞病毒立即早期启动子(CMV启动子)和牛生长激素转录终止子(BGH终止子)的表达盒，该表达盒在启动子和终止子之间包含NotI限制性内切位点(“GCGGCCGC”SEQ ID NO:16)以有利于转基因的***。其从IX聚腺苷酸化信号(“AATAAA”SEQ ID NO:12)到E2转录单元的聚腺苷酸化信号(“TTTATT”SEQ ID NO:13)的核苷酸序列为：
SEQ ID NO:17[IX初始空]
AATAAAAAACCAGACTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGTGTCTTGCTGTCTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGCGGCCGCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGTTTATT
IX和E2转录物的聚腺苷酸化信号和NotI限制性内切位点以下划线示出。
病毒TAV IX-WT L5-空携带Ela启动子的TAV-255缺失、IX-E2位点中的野生型病毒序列和序列SEQ ID NO:14(L5-E4位点中的空表达盒)。病毒TAV IX-WT L5-IL7携带克隆到SEQ ID NO:14的L5-E4盒中的Ela启动子的TAV-255缺失、IX-E2位点中的野生型病毒序列和序列SEQ ID NO:18(参见下文，大写字母表示小鼠IL-7基因，小写字母表示来自L5-E4表达盒的侧翼核苷酸，所述L5-E4表达盒包括带下划线的来自SwaI限制性内切位点的残留核苷酸)。
SEQ ID NO:18[L5 mIL7]
gctttgcaaagatttATGTTCCATGTTTCTTTTAGATATATCTTTGGAATTCCTCCACTGATCCTTGTTCTGCTGCCTGTCACATCATCTGAGTGCCACATTAAAGACAAAGAAGGTAAAGCATATGAGAGTGTACTGATGATCAGCATCGATGAATTGGACAAAATGACAGGAACTGATAGTAATTGCCCGAATAATGAACCAAACTTTTTTAGAAAACATGTATGTGATGATACAAAGGAAGCTGCTTTTCTAAATCGTGCTGCTCGCAAGTTGAAGCAATTTCTTAAAATGAATATCAGTGAAGAATTCAATGTCCACTTACTAACAGTATCACAAGGCACACAAACACTGGTGAACTGCACAAGTAAGGAAGAAAAAAACGTAAAGGAACAGAAAAAGAATGATGCATGTTTCCTAAAGAGACTACTGAGAGAAATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGAAGGGCAGTATATAAaaataacttgtttattgcag
病毒TAV IX-WT L5-GMCSF携带Ela启动子的TAV-255缺失，IX-E2位点中的野生型病毒序列和克隆到SEQ ID NO:14的L5-E4盒中的序列SEQ ID NO:19(大写字母表示小鼠GMCSF基因，小写字母代表来自L5-E4表达盒的侧翼核苷酸，所述L5-E4表达盒带下划线的来自SwaI限制性内切位点的核苷酸)。该病毒携带野生型小鼠GMCSF，并且不是在SEQ ID NO:15中所示的病毒TAV-(L5-E4)mGMCSF中使用的小鼠GMCSF的密码子优化形式。
SEQ ID NO:19[L5 wt mGMCSF]
gctttgcaaagatttATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAATGAaaataacttgtttattgcag
病毒TAV IX-GMCSF L5-IL7携带Ela启动子的TAV-255缺失，克隆到SEQ ID NO:17的IX-E2盒中的序列SEQ ID NO:20(大写字母表示小鼠GMCSF基因，小写字母代表IX-E2表达盒的侧翼核苷酸，所述IX-E2表达盒的包含带下划线的来自NotI限制性内切位点残留核苷酸)，和如所描绘SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:14中克隆到L5-E4盒中的小鼠IL-7。小鼠的GMCSF序列在病毒TAV IX-WT L5-GMCSF和TAV IX-GMCSF L5-IL7中相同，但是***到一个病毒的IX-E2表达盒和另一个病毒的L5-E4表达盒中。
SEQ ID NO:20[IX wt mGMCSF]
atagggagacccgcggccATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAATGAggcc gctgtgccttctagt
为检测这些病毒的转基因表达，将A549细胞在MOI为5的情况下用病毒感染，在4天后收集条件培养基并用在用于IL-7和GMCSF的ELISAs中。用于GMCSF的ELISA显示了由CMV启动子驱动的IX-E2位点的盒中的表达显著高于由SV40驱动的L5-E4位点的盒中的表达，如图3所示。
实施例5
在初始IX-E2设计的病毒中(图4)，我们猜想可通过阻断CMV启动子在与预期相反的方向驱动转录的任何可能性来进一步优化病毒生长(Seila et al.,Science.(2008)322(5909):1849-51)。我们因此改进了该位点中的***物，以使得***物的5’和3’端均包含聚腺苷酸化信号，该信号针对多腺苷酸转录物，既从正常病毒基因进入***片段，又从***片段向正常病毒基因延伸。参见图4中改进的IX-E2设计。
改进型***物的核苷酸序列从IX转录物的聚腺苷酸化信号到E2转录物的聚腺苷酸化信号是：
SEQ ID NO:21[IX改进空]
AATAAAATACACCTTTTTTCGATTGTACGTATTTTTATTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGCG GCCGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAAAACCAGACTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGTGTCTTGCTGTCTTTATT
每个正向聚腺苷酸化信号(“AATAAA”SEQ ID NO:12)和反向腺苷酸化信号(“TTTATT”SEQ ID NO:13)以及NotI位点(“GCGGCCGC”SEQ ID NO:16)，以下划线示出。携带具有改进型IX-E2设计的表达盒比带有初始IX-E2设计的病毒更有效率地生长。
实施例6
病毒TAV-IXrL5-空携带病毒E1A启动子中的TAV-255缺失，SEQ ID NO:21(改进型IX-E2设计的空表达盒)，和SEQ ID NO:14(L5-E4位点中的空表达盒)。病毒TAV-IXrL5-hIL12携带病毒E1A启动子中的TAV-255缺失，编码改进型IX-E2表达盒中的人IL12A链的基因(在SEQ ID NO:22中描绘)，和编码L5-E4表达盒中的人IL12B链的基因(在SEQ ID NO:23描绘)。在SEQ ID NO:22中，每个正向聚腺苷酸化信号(“AATAAA”SEQ ID NO:12)和反向聚腺苷酸化信号(“TTTATT”SEQ ID NO:13)以及NotI位点的残留核苷酸以下划线示出，和编码人IL12A链的基因以粗体示出。在SEQ ID NO:23中，L5和E4转录单元的聚腺苷酸化信号和SwaI限制性内切位点的残留核苷酸以下划线示出，和编码人IL12B链的基因以粗体示出。SEQ IDNO:22[IX改进hIL12A]
Figure BDA0002357991160000501
Figure BDA0002357991160000511
SEQ ID NO:23[L5初始hIL12B]
Figure BDA0002357991160000512
产生与TAV-IXrL5-hIL12相同的基因组结构的病毒WT-IXrL5-hIL12，不同之处在于其携带野生型E1A启动子而不是携带Ela启动子的TAV-255缺失。这些病毒中的每个还具有E3 RIDα、RIDβ和14.7k基因的缺失和E4 ORF1-ORF4基因的缺失。
为比较这种设计方法与将IL12整合到溶瘤性腺病毒中的另一种策略，我们检测了携带编码通过被携带在E1B-19K位点中的弗林蛋白酶切割位点连接的人IL12A和IL12B链的基因的腺病毒(氨基酸RAKR；SEQ ID NO:24)。当通过细胞合成融合蛋白时，弗林蛋白酶位点在RAKR序列的最后一个R和下一个氨基酸(成熟IL12A的第一个氨基酸)之间通过Golgi中的弗林蛋白酶被切割。我们先前发现使用弗林蛋白酶切割位点作为连接子导致异二聚IL12蛋白质的高水平表达。该融合基因(字母大写)的核苷酸序列、用于克隆的侧翼SalI和XhoI限制性内切位点(以下划线示出)和表明在腺病毒基因组中的***位点的腺病毒核苷酸(小写字母)是：
SEQ ID NO:25[hIL12弗林蛋白酶]
atctgacctcgtcgacATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTCGTGCTAAGCGAAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAATAActcgagtcaccaggcg
病毒TAV-hIL12-弗林蛋白酶携带Ela启动子的TAV-255缺失和E1B-19K区域中的SEQ ID NO:25。对照病毒TAV-Δ19k携带Ela启动子的TAV-255缺失和E1B-19K区域的缺失。
为检测溶瘤性活性和IL12表达，A549细胞用TAV-Δ19k、TAV-hIL12-弗林蛋白酶、TAV-TAV-IXrL5-空和TAV-IXrL5-hIL12在MOI为5的情况下一式三份地感染。在感染后4天，收集条件培养基，并在ELISA中测量IL12，其仅检测组装的IL12A-IL12B异二聚体，和剩余的细胞用用结晶紫染色。如图5中所示，TAV-hIL12-弗林蛋白酶的溶解略少于相应的对照病毒TAV-Δ19k，这与在将转基因***到E1B-19K区域中时我们的一般经验是相符的，而TAV-IXrL5-hIL12与TAV-IXrL5-空和TAV-Δ19k的溶解相同。这证明了在IX-E2和L5-E4区域***表达盒对病毒适应度有最小影响，并且在这方面可由于将转基因***E1B-19K区域中。
如图6所示，TAV-hIL12-弗林蛋白酶比使用IX-E2和L5-E4盒的病毒表达更高水平的IL12。这表明两个表达盒中的至少一个可能不是最佳的，并且促使进一步研究以改进涉及。然而，从TAV-hIL12-弗林蛋白酶产生的IL12蛋白质在IL12B链的C-末端包含非天然RAKR序列(剩余的弗林蛋白酶识别位点)，这可能会导致不理想的体内效果，诸如针对转基因或针对天然IL12的免疫原性，但由TAV-IXrL5-hIL12产生的IL12的优点在于其是全天然的。
实施例7
基于观察到的L5-E4盒相比于IX-E2盒的相对低的表达，我们假设L5-E4盒是IL-12异二聚体低表达的诱因。我们改进L5-E4区域以在两端包含双向聚腺苷酸化信号，类似于对IX-E2区域所用的方法。
将核苷酸序列SEQ ID NO:26克隆到L5-E4区域，示出L5和E4转录物在5’和3’端的聚腺苷酸化信号，所有聚腺苷酸化信号s和SwaI限制性内切位点以下划线示出。
SEQ ID NO:26[L5改进SV40]
AATAAAAGGTTTATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATTTAAATAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTGTTTATT
制备病毒TAV-(IXr)空-(L5r)空，使其带有E1a启动子中的TAV-255缺失，如SEQ IDNO:21中所示的在IX-E2区域中没有转基因的改进型IX-E2盒，如SEQ ID NO:26所示的在L5-E4区域中没有转基因的改进型L5-E4盒。
病毒TAV-(IXr)mIL7-(L5r)mGMCSF包含：Ela启动子的TAV-255缺失，如SEQ ID NO:21所示的带有如SEQ ID NO:20所示的克隆到NotI位点中的小鼠GMCSF基因的改进型IX-E2盒，和如SEQ ID NO:18所示的带有如SEQ ID NO:19所示的克隆到SwaI位点中的小鼠IL-7基因的改进型L5-E4盒。
病毒TAV-(IXr)mGMCSF-(L5r)mIL7包含：Ela启动子的TAV-255缺失，如SEQ ID NO:21所示的带有如SEQ ID NO:27所示的克隆到NotI位点中的小鼠IL-7基因的改进型IX-E2盒，和如SEQ ID NO:26所示的带有如SEQ ID NO:19所示的克隆到SwaI位点中小鼠GMCSF基因的改进型L5-E4盒。因此，病毒TAV-(IXr)mGMCSF-(L5r)mIL7和TAV-(IXr)mIL7-(L5r)mGMCSF的区别仅在于IL-7和GMCSF的基因被***到哪个位点中：改进型IX-E2或改进型L5-E4位点。
SEQ ID NO:27[IX mIL7]
atagggagacccgcggccATGTTCCATGTTTCTTTTAGATATATCTTTGGAATTCCTCCACTGATCCTTGTTCTGCTGCCTGTCACATCATCTGAGTGCCACATTAAAGACAAAGAAGGTAAAGCATATGAGAGTGTACTGATGATCAGCATCGATGAATTGGACAAAATGACAGGAACTGATAGTAATTGCCCGAATAATGAACCAAACTTTTTTAGAAAACATGTATGTGATGATACAAAGGAAGCTGCTTTTCTAAATCGTGCTGCTCGCAAGTTGAAGCAATTTCTTAAAATGAATATCAGTGAAGAATTCAATGTCCACTTACTAACAGTATCACAAGGCACACAAACACTGGTGAACTGCACAAGTAAGGAAGAAAAAAACGTAAAGGAACAGAAAAAGAATGATGCATGTTTCCTAAAGAGACTACTGAGAGAAATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGAAGGGCAGTATATAAggccgctgtgccttctagt
为检测这些病毒的转基因表达，A549细胞用每种病毒在MOI为5的情况下一式三份地感染。4日后收集条件培养基，并在ELISAs中测量GMCSF和IL-7。对于IL-7和GMCSF二者，在改进型IX-E2位点中携带基因的病毒的表达均高于在改进型L5-E4位点中携带基因的表达。这证实了先前的发现，即在IX-E2处使用CMV启动子表达盒与在L5-E4处使用SV40启动子的表达盒相比表达更高水平，其不受将L5-E4位点改进为包含双向聚腺苷酸化信号的影响。
实施例8
我们接下来研究进一步改进L5-E4位点中的启动子。最初使用的SV40启动子在主要转录起始位点具有G(在野生型SV40序列中)到T(在L5-E4***物中)的点突变，由此我们产生了如SEQ ID NO:28中所示的核苷酸变回野生型G的L5-E4***物，先前突变的核苷酸、聚腺苷酸化信号和SwaI限制性内切位点以下划线示出。我们还研究了使用不同启动子和产生了人EF1A启动子而不是SV40启动子的L5-E4***物。SEQ ID NO:29示出了使用人EF1A启动子的L5-E4***物，从来自L5转录物的聚腺苷酸化信号到E4的聚腺苷酸化信号显示，其中聚腺苷酸化信号和SwaI限制性内切位点以下划线示出。
SEQ ID NO:28[L5改进SV40 wt空]
AATAAAAGGTTTATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATTTAAATAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTGTTTATT
SEQ ID NO:29[L5改进EF1A空]
AATAAAAGGTTTATTAGGCGGCCTCCCCGTCACCACCCCCCCCAACCCGCCCCGACCGGAGCTGAGAGTAATTCATACAAAAGGACTCGCCCCTGCCTTGGGGAATCCCAGGGACCGTCGTTAAACTCCCACTAACGTAGAACCCAGAGATCGCTGCGTTCCCGCCCCCTCACCCGCCCGCTCTCGTCATCACTGAGGTGGAGAAGAGCATGCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAATTTAAA TAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTGTTTATT
为检测这些改进的L5-E4中的表达盒，我们产生了携带在IX-E2位点中的小鼠IL-7基因和在新的L5-E4位点中的小鼠GMCSF基因的病毒。在IX-E2位点中使用的小鼠IL-7基因通过如下方式修饰：在靠近具有可被加工为聚腺苷酸化信号的序列AATAAA的基因的3’末端的两个区域中引入沉默突变以导致表达减少，替换不改变编码蛋白质序列但将消除内部AATAAA序列的同义序列；SEQ ID NO:30示出了带有编码IL-7的核苷酸(大写)和突变(以下划线示出)的核苷酸序列，以及带有来自NotI(以下划线示出)的残留核苷酸的IX-E2盒(小写字母)的侧翼核苷酸。为尝试改进小鼠GMCSF基因在L5-E4位点中的表达，将共有Kozak序列(核苷酸GCCACC)包含在SwaI位点的残留核苷酸和GMCSF基因的起始密码子之间；SEQ IDNO:31示出了带有小鼠GMCSF基因和Kozak序列(大写)的核苷酸序列，Kozak序列以下划线示出，带有来自SwaI位点的残留核苷酸的L5-E4盒(小写)的侧翼核苷酸以下划线示出。
SEQ ID NO:30[mIL7 no poly-A]
atagggagacccgcggccATGTTCCATGTTTCTTTTAGATATATCTTTGGAATTCCTCCACTGATCCTTGTTCTGCTGCCTGTCACATCATCTGAGTGCCACATTAAAGACAAAGAAGGTAAAGCATATGAGAGTGTACTGATGATCAGCATCGATGAATTGGACAAAATGACAGGAACTGATAGTAATTGCCCGAATAATGAACCAAACTTTTTTAGAAAACATGTATGTGATGATACAAAGGAAGCTGCTTTTCTAAATCGTGCTGCTCGCAAGTTGAAGCAATTTCTTAAAATGAATATCAGTGAAGAATTCAATGTCCACTTACTAACAGTATCACAAGGCACACAAACACTGGTGAACTGCACAAGTAAGGAAGAAAAAAACGTAAAGGAACAGAAAAAGAATGATGCATGTTTCCTAAAGAGACTACTGAGAGAAATCAAAACTTGTTGGAACAAAATTTTGAAGGGCAGTATATAAggccgctgtgccttctagt
SEQ ID NO:31[mGMCSF Kozak]
atttGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAATGAaaataacttgtttattgcag
病毒TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5SV40wt)KozakmGMCSF包含：Ela启动子的TAV-255缺失，如SEQ ID NO:21所示的改进型IX-E2***物(其具有如SEQ ID NO:30所示的克隆到NotI位点中的小鼠IL-7基因，所述小鼠IL-7具有在可能的内部聚腺苷酸化位点处的同义突变)，和带有野生型SV40启动子的L5-E4***物(其如SEQ ID NO:28所示的克隆到SwaI位点中的包含共有Kozak序列的小鼠GMCSF基因)。病毒TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF包含：Ela启动子的TAV-255缺失，如SEQ ID NO:21所示的改进型IX-E2***物(其具有如SEQID NO:3所示的克隆到NotI位点中的小鼠IL-7基因，所述小鼠IL-7基因在可能的内部聚腺苷酸化位点处具有同义突变)，和带有如SEQ ID NO:29所示的人EF1A启动子的L5-E4***物(其带有如SEQ ID NO:31所示的克隆到SwaI位点中的包含共有Kozak序列的小鼠GMCSF基因)。
为检测这些病毒的转基因表达，A549细胞用两种病毒在MOI为5的情况下一式三份地感染。4天后，收集条件培养基并用于ELISAs中以测量IL-7和GMCSF表达。结果在图7中显示。人EF1A启动子具有中等较高的表达，并且被选择用于进一步开发。通过如下方式将病毒TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF制备为用于小鼠实验的药物剂：在SF-BMAdR281细胞(来源于A549细胞)的无血清悬浮液培养物中倍增病毒，溶解细胞，用色谱纯化病毒，并在缓冲剂(包含25mM NaCl，20mM Tris，2.5％甘油，pH为8)中透析。由此制备的病毒的病毒粒子浓度为5.8x 1011vp/ml，感染滴度为3.0x 1010IU/ml。
实施例9
我们进一步研究了缺失腺病毒死亡蛋白(ADP)是否能改善转基因的表达。ADP在病毒复制晚期表达，并且溶解宿主细胞以释放子代病毒体，因此其移除可允许细胞存活并在其被杀死之前更久地表达转基因。SEQ ID NO:32中显示了在TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF病毒中使用E3 RIDα、RIDβ和14.7K缺失的背景下的ADP基因的核苷酸序列，其中核苷酸编码ADP大写，E3 RIDα、RIDβ和14.7K缺失的位点显示为连字符，侧翼腺病毒核苷酸小写。为产生ΔADP缺失，缺失SEQ ID NO:32中带下划线的核苷酸。
SEQ ID NO:32[ADP]
Gaaaatgccttaatttactaagttacaaagctaatgtcaccactaactgctttactcgctgcttgcaa aacaaattcaaaaagttagcattataattagaataggatttaaaccccccggtcatttcctgctcaataccattcc cctgaacaattgactctatgtgggatatgctccagcgctacaaccttgaagtcaggcttcctggatgtcagcatct gactttggccagcacctgtcccgcggatttgttccagtccaactacagcgacccaccctaacagagATGACCAACA CAACCAACGCGGCCGCCGCTACCGGACTTACATCTACCACAAATACACCCCAAGTTTCTGCCTTTGTCAATAACTG GGATAACTTGGGCATGTGGTGGTTCTCCATAGCGCTTATGTTTGTATGCCTTATTATTATGTGGCTCATCTGCTGC CTAAAGCGCAAACGCGCCCGACCACCCATCTATAGTCCCATCATTGTGCTACACCCAAACAATGATGGAATCCATA GATTGGACGGACTGAAACACATGTTCTTTTCTCTTACAGTATGAtaataaaaaaaaataataaagca
用与TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF相同的基因组创建病毒TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF-ΔADP，不同之处在于其还包含ADP基因的核苷酸缺失，如SEQ ID NO:32中下划线所示。
为检测ADP缺失是否导致更长期和更高的转基因表达，A549细胞用TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF和TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF-ΔADP在MOI为5的情况下感染，在感染后每三日收集条件培养基以在ELISA中测量IL-7和GMCSF。结果在图8中显示。在两种病毒之间没有令人信服的转基因表达水平差异，尽管在试验过程中观察到细胞并且细胞死亡延迟约3天(在用TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF感染之后)到约9天(在用TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF-ΔADP感染之后)。因此尽管在该试验中可溶性细胞因子的表达没有被增强，但是对于一些应用(诸如在感染细胞的表面上表达共刺激分子)，缺失ADP可能是有利的，因为细胞能存活更久，并且其表面上的共刺激分子能长时间激活靶细胞。
实施例10
我们随后使用IX-E2和L5-E4位点作为表达三种转基因的病毒的设计的一部分：共刺激分子CD80和CD137L和粘附分子ICAM1。我们先前创建了携带这些转基因中的全部三种而不是病毒E1B-19K基因的5’端的病毒，并且在三种转基因中的每个之间均具有IRES。E1B-19K区域中的该病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO:33中显示，其具有5’侧翼腺病毒核苷酸序列和用于克隆的SalI限制性内切位点(小写)，小鼠CD80(大写)，来自脑心肌炎病毒的IRES(小写)，小鼠CD137L(大写)，来自手足口病病毒的IRES(小写)，小鼠ICAM1(大写)和包括用于克隆的XhoI限制性内切位点的3’侧翼腺病毒核苷酸序列。该病毒，TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1，包含：Ela启动子的TAV-255缺失，E1B-19K位点中的SEQ ID NO:33，和E3区域ADP、RIDα、RIDβ和14.7K基因以及E4区域ORF1-4基因的缺失。
SEQ ID NO:33[Costim IRES]
atctgacctcgtcgacATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGTGGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTGCTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACGACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCTCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAAAAACCCCCAGAAGACCCTCCTGATAGCAAGAACACACTTGTGCTCTTTGGGGCAGGATTCGGCGCAGTAATAACAGTCGTCGTCATCGTTGTCATCATCAAATGCTTCTGTAAGCACAGAAGCTGTTTCAGAAGAAATGAGGCAAGCAGAGAAACAAACAACAGCCTTACCTTCGGGCCTGAAGAAGCATTAGCTGAACAGACCGTCTTCCTTTAGtaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatATGGACCAGCACACACTTGATGTGGAGGATACCGCGGATGCCAGACATCCAGCAGGTACTTCGTGCCCCTCGGATGCGGCGCTCCTCAGAGATACCGGGCTCCTCGCGGACGCTGCGCTCCTCTCAGATACTGTGCGCCCCACAAATGCCGCGCTCCCCACGGATGCTGCCTACCCTGCGGTTAATGTTCGGGATCGCGAGGCCGCGTGGCCGCCTGCACTGAACTTCTGTTCCCGCCACCCAAAGCTCTATGGCCTAGTCGCTTTGGTTTTGCTGCTTCTGATCGCCGCCTGTGTTCCTATCTTCACCCGCACCGAGCCTCGGCCAGCGCTCACAATCACCACCTCGCCCAACCTGGGTACCCGAGAGAATAATGCAGACCAGGTCACCCCTGTTTCCCACATTGGCTGCCCCAACACTACACAACAGGGCTCTCCTGTGTTCGCCAAGCTACTGGCTAAAAACCAAGCATCGTTGTGCAATACAACTCTGAACTGGCACAGCCAAGATGGAGCTGGGAGCTCATACCTATCTCAAGGTCTGAGGTACGAAGAAGACAAAAAGGAGTTGGTGGTAGACAGTCCCGGGCTCTACTACGTATTTTTGGAACTGAAGCTCAGTCCAACATTCACAAACACAGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTCTCTCTTGTTTTGCAAGCAAAGCCTCAGGTAGATGACTTTGACAACTTGGCCCTGACAGTGGAACTGTTCCCTTGCTCCATGGAGAACAAGTTAGTGGACCGTTCCTGGAGTCAACTGTTGCTCCTGAAGGCTGGCCACCGCCTCAGTGTGGGTCTGAGGGCTTATCTGCATGGAGCCCAGGATGCATACAGAGACTGGGAGCTGTCTTATCCCAACACCACCAGCTTTGGACTCTTTCTTGTGAAACCCGACAACCCATGGGAATGAggtttccacaactgataaaactcgtgcaacttgaaactccgcctggtctttccaggtctagaggggttacactttgtactgtgctcgactccacgcccggtccactggcgggtgttagtagcagcactgttgtttcgtagcggagcatggtggccgtgggaactcctccttggtgacaagggcccacggggccgaaagccacgtccagacggacccaccatgtgtgcaaccccagcacggcaacttttactgcgaacaccaccttaaggtgacactggtactggtactcggtcactggtgacaggctaaggatgcccttcaggtaccccgaggtaacacgggacactcgggatctgagaaggggattgggacttctttaaaagtgcccagtttaaaaagcttctacgcctgaataggcgaccggaggccggcgcctttccattacccactactaaatccATGGCTTCAACCCGTGCCAAGCCCACGCTACCTCTGCTCCTGGCCCTGGTCACCGTTGTGATCCCTGGGCCTGGTGATGCTCAGGTATCCATCCATCCCAGAGAAGCCTTCCTGCCCCAGGGTGGGTCCGTGCAGGTGAACTGTTCTTCCTCATGCAAGGAGGACCTCAGCCTGGGCTTGGAGACTCAGTGGCTGAAAGATGAGCTCGAGAGTGGACCCAACTGGAAGCTGTTTGAGCTGAGCGAGATCGGGGAGGACAGCAGTCCGCTGTGCTTTGAGAACTGTGGCACCGTGCAGTCGTCCGCTTCCGCTACCATCACCGTGTATTCGTTTCCGGAGAGTGTGGAGCTGAGACCTCTGCCAGCCTGGCAGCAAGTAGGCAAGGACCTCACCCTGCGCTGCCACGTGGATGGTGGAGCACCGCGGACCCAGCTCTCAGCAGTGCTGCTCCGTGGGGAGGAGATACTGAGCCGCCAGCCAGTGGGTGGGCACCCCAAGGACCCCAAGGAGATCACATTCACGGTGCTGGCTAGCAGAGGGGACCACGGAGCCAATTTCTCATGCCGCACAGAACTGGATCTCAGGCCGCAAGGGCTGGCATTGTTCTCTAATGTCTCCGAGGCCAGGAGCCTCCGGACTTTCGATCTTCCAGCTACCATCCCAAAGCTCGACACCCCTGACCTCCTGGAGGTGGGCACCCAGCAGAAGTTGTTTTGCTCCCTGGAAGGCCTGTTTCCTGCCTCTGAAGCTCGGATATACCTGGAGCTGGGAGGCCAGATGCCGACCCAGGAGAGCACAAACAGCAGTGACTCTGTGTCAGCCACTGCCTTGGTAGAGGTGACTGAGGAGTTCGACAGAACCCTGCCGCTGCGCTGCGTTTTGGAGCTAGCGGACCAGATCCTGGAGACGCAGAGGACCTTAACAGTCTACAACTTTTCAGCTCCGGTCCTGACCCTGAGCCAGCTGGAGGTCTCGGAAGGGAGCCAAGTAACTGTGAAGTGTGAAGCCCACAGTGGGTCGAAGGTGGTTCTTCTGAGCGGCGTCGAGCCTAGGCCACCCACCCCGCAGGTCCAATTCACACTGAATGCCAGCTCGGAGGATCACAAACGAAGCTTCTTTTGCTCTGCCGCTCTGGAGGTGGCGGGAAAGTTCCTGTTTAAAAACCAGACCCTGGAACTGCACGTGCTGTATGGTCCTCGGCTGGACGAGACGGACTGCTTGGGGAACTGGACCTGGCAAGAGGGGTCTCAGCAGACTCTGAAATGCCAGGCCTGGGGGAACCCATCTCCTAAGATGACCTGCAGACGGAAGGCAGATGGTGCCCTGCTGCCCATCGGGGTGGTGAAGTCTGTCAAACAGGAGATGAATGGTACATACGTGTGCCATGCCTTTAGCTCCCATGGGAATGTCACCAGGAATGTGTACCTGACAGTACTGTACCACTCTCAAAATAACTGGACTATAATCATTCTGGTGCCAGTACTGCTGGTCATTGTGGGCCTCGTGATGGCAGCCTCTTATGTTTATAACCGCCAGAGAAAGATCAGGATATACAAGTTACAGAAGGCTCAGGAGGAGGCCATAAAACTCAAGGGACAAGCCCCACCTCCCTGActcgagtcaccaggcg
我们发现与IRES未启动翻译的基因相比，IRES之后的基因表达通常较差，因此我们研究了使用IX-E2和L5-E4位点作为替代策略。我们产生了病毒TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1，该病毒携带在E1B-19K位点中的小鼠CD80(如SEQ ID NO:34所示)(CD80基因大写，侧翼腺病毒序列和限制性内切位点小写)(其使用Bsu36I限制性内切位点而不是其他病毒中所用的SalI和XhoI限制性内切位点)，SEQ ID NO:21的在IX-E2位点中的小鼠CD137L基因(其带有***到NotI位点的CD137L基因，如SEQ ID NO:35所示)(CD137L基因大写，侧翼表达盒序列和残留的NotI限制性内切位点小写)，和SEQ ID NO:29的在L5-E4位点中的小鼠ICAM1基因(其带有***到SwaI位点中的ICAM1基因，如SEQ ID NO:36所示)(ICAM1基因大写，侧翼表达盒序列和残留的SwaI位点小写)。该病毒还包含：Ela启动子的TAV-255缺失，E3区域ADP、RIDα、RIDβ和14.7K基因的缺失，和E4区域ORF1-4基因的缺失。
SEQ ID NO:34[19k mCD80]
atctgacctcATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGTGGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTGCTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACGACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCTCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAAAAACCCCCAGAAGACCCTCCTGATAGCAAGAACACACTTGTGCTCTTTGGGGCAGGATTCGGCGCAGTAATAACAGTCGTCGTCATCGTTGTCATCATCAAATGCTTCTGTAAGCACAGAAGCTGTTTCAGAAGAAATGAGGCAAGCAGAGAAACAAACAACAGCCTTACCTTCGGGCCTGAAGAAGCATTAGCTGAACAGACCGTCTTCCTTTAGtcaggtgaatctgggtcacc
SEQ ID NO:35[IX mCD137L]
atagggagacccgcggccATGGACCAGCACACACTTGATGTGGAGGATACCGCGGATGCCAGACATCCAGCAGGTACTTCGTGCCCCTCGGATGCGGCGCTCCTCAGAGATACCGGGCTCCTCGCGGACGCTGCGCTCCTCTCAGATACTGTGCGCCCCACAAATGCCGCGCTCCCCACGGATGCTGCCTACCCTGCGGTTAATGTTCGGGATCGCGAGGCCGCGTGGCCGCCTGCACTGAACTTCTGTTCCCGCCACCCAAAGCTCTATGGCCTAGTCGCTTTGGTTTTGCTGCTTCTGATCGCCGCCTGTGTTCCTATCTTCACCCGCACCGAGCCTCGGCCAGCGCTCACAATCACCACCTCGCCCAACCTGGGTACCCGAGAGAATAATGCAGACCAGGTCACCCCTGTTTCCCACATTGGCTGCCCCAACACTACACAACAGGGCTCTCCTGTGTTCGCCAAGCTACTGGCTAAAAACCAAGCATCGTTGTGCAATACAACTCTGAACTGGCACAGCCAAGATGGAGCTGGGAGCTCATACCTATCTCAAGGTCTGAGGTACGAAGAAGACAAAAAGGAGTTGGTGGTAGACAGTCCCGGGCTCTACTACGTATTTTTGGAACTGAAGCTCAGTCCAACATTCACAAACACAGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTCTCTCTTGTTTTGCAAGCAAAGCCTCAGGTAGATGACTTTGACAACTTGGCCCTGACAGTGGAACTGTTCCCTTGCTCCATGGAGAACAAGTTAGTGGACCGTTCCTGGAGTCAACTGTTGCTCCTGAAGGCTGGCCACCGCCTCAGTGTGGGTCTGAGGGCTTATCTGCATGGAGCCCAGGATGCATACAGAGACTGGGAGCTGTCTTATCCCAACACCACCAGCTTTGGACTCTTTCTTGTGAAACCCGACAACCCATGGGAATGAggccgctgtgccttctagt
SEQ ID NO:36[L5 mICAM1]
cgccagaacacatttATGGCTTCAACCCGTGCCAAGCCCACGCTACCTCTGCTCCTGGCCCTGGTCACCGTTGTGATCCCTGGGCCTGGTGATGCTCAGGTATCCATCCATCCCAGAGAAGCCTTCCTGCCCCAGGGTGGGTCCGTGCAGGTGAACTGTTCTTCCTCATGCAAGGAGGACCTCAGCCTGGGCTTGGAGACTCAGTGGCTGAAAGATGAGCTCGAGAGTGGACCCAACTGGAAGCTGTTTGAGCTGAGCGAGATCGGGGAGGACAGCAGTCCGCTGTGCTTTGAGAACTGTGGCACCGTGCAGTCGTCCGCTTCCGCTACCATCACCGTGTATTCGTTTCCGGAGAGTGTGGAGCTGAGACCTCTGCCAGCCTGGCAGCAAGTAGGCAAGGACCTCACCCTGCGCTGCCACGTGGATGGTGGAGCACCGCGGACCCAGCTCTCAGCAGTGCTGCTCCGTGGGGAGGAGATACTGAGCCGCCAGCCAGTGGGTGGGCACCCCAAGGACCCCAAGGAGATCACATTCACGGTGCTGGCTAGCAGAGGGGACCACGGAGCCAATTTCTCATGCCGCACAGAACTGGATCTCAGGCCGCAAGGGCTGGCATTGTTCTCTAATGTCTCCGAGGCCAGGAGCCTCCGGACTTTCGATCTTCCAGCTACCATCCCAAAGCTCGACACCCCTGACCTCCTGGAGGTGGGCACCCAGCAGAAGTTGTTTTGCTCCCTGGAAGGCCTGTTTCCTGCCTCTGAAGCTCGGATATACCTGGAGCTGGGAGGCCAGATGCCGACCCAGGAGAGCACAAACAGCAGTGACTCTGTGTCAGCCACTGCCTTGGTAGAGGTGACTGAGGAGTTCGACAGAACCCTGCCGCTGCGCTGCGTTTTGGAGCTAGCGGACCAGATCCTGGAGACGCAGAGGACCTTAACAGTCTACAACTTTTCAGCTCCGGTCCTGACCCTGAGCCAGCTGGAGGTCTCGGAAGGGAGCCAAGTAACTGTGAAGTGTGAAGCCCACAGTGGGTCGAAGGTGGTTCTTCTGAGCGGCGTCGAGCCTAGGCCACCCACCCCGCAGGTCCAATTCACACTGAATGCCAGCTCGGAGGATCACAAACGAAGCTTCTTTTGCTCTGCCGCTCTGGAGGTGGCGGGAAAGTTCCTGTTTAAAAACCAGACCCTGGAACTGCACGTGCTGTATGGTCCTCGGCTGGACGAGACGGACTGCTTGGGGAACTGGACCTGGCAAGAGGGGTCTCAGCAGACTCTGAAATGCCAGGCCTGGGGGAACCCATCTCCTAAGATGACCTGCAGACGGAAGGCAGATGGTGCCCTGCTGCCCATCGGGGTGGTGAAGTCTGTCAAACAGGAGATGAATGGTACATACGTGTGCCATGCCTTTAGCTCCCATGGGAATGTCACCAGGAATGTGTACCTGACAGTACTGTACCACTCTCAAAATAACTGGACTATAATCATTCTGGTGCCAGTACTGCTGGTCATTGTGGGCCTCGTGATGGCAGCCTCTTATGTTTATAACCGCCAGAGAAAGATCAGGATATACAAGTTACAGAAGGCTCAGGAGGAGGCCATAAAACTCAAGGGACAAGCCCCACCTCCCTGAaaataacttgtttattgcag
为测试这两种病毒的表达：A549细胞、HT29细胞、ADS12细胞和F244细胞在MOI为3的情况下用TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1、TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1或对照病毒TAV-(19k)空-(IX)空-(L5)空(其具有与TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1相同的结构但没有转基因)感染。2天后，对CD80、CD137L和ICAM1进行细胞染色，结果显示在图9-图12中。尽管当在IRESes之后在TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1中表达时CD137L和ICAM1基因的表达较差，但具有TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1的IX-E2和L5-E4位点稳健表达那些基因。
实施例11
尽管上述实验使用了基于人腺病毒5型的腺病毒，其他腺病毒具有类似结构并且具有与上述IX-E2和L5-E4位点相同的明确可鉴定位点。例如，人腺病毒35型在IX-E2位点中具有如SEQ ID NO:37中所示的序列，并且具有在L5-E4位点中具有如SEQ ID NO:38中所示的序列，其中在每个序列中聚腺苷酸化信号以下划线示出。
SEQ ID NO:37[Ad35 wt IX-E2]
AATAAAAAAAATTCCAGAATCAATGAATAAATAAACGAGCTTGTTGTTGATTTAAAATCAAGTGTTTTT ATT
SEQ ID NO:38[Ad35 wt L5-E4]
AATAAAGTTTAAGTGTTTTTATT
为测定表达盒是否可被***到这些位点中，IX-E2位点用与SEQ ID NO:39中所示的腺病毒5型改进型IX-E2位点相同的序列修饰(表达盒被***到腺病毒5型的相反方向，所以小写字母的侧翼病毒序列常规标注的反向互补，如SEQ ID NO:37中所示)，并且L5-E4位点用与SEQ ID NO:40所示的带有EF1A启动子的腺病毒5型中所用的相同序列来修饰。携带位点IX-E2和L5-E4中那两种表达盒以及缺失E3 RIDα、RIDβ和14.7K基因和E4 ORF1-4基因的腺病毒35型被补救，证明这些位点可用于***腺病毒的其他血清型的表达盒中。将表达盒***面向彼此的带有多核苷酸化位点的两个相邻的转录单元的种类原则上不限于腺病毒，并且也有可能应用于其他病毒。
SEQ ID NO:39[Ad35 IX-E2盒]
tcgagatcggtggtccagggcataccgtgcgcgaaaaatgaaataaaATACACCTTTTTTCGATTGTACGTATTTTTATTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGCGGCCGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAaacacttgattttaaatcaacaacaagctcgtttatttat
SEQ ID NO:40[Ad35 L5-E4盒]
tttcttttcttacattacagaagacgacaactaaaataaaAGGTTTATTAGGCGGCCTCCCCGTCACCACCCCCCCCAACCCGCCCCGACCGGAGCTGAGAGTAATTCATACAAAAGGACTCGCCCCTGCCTTGGGGAATCCCAGGGACCGTCGTTAAACTCCCACTAACGTAGAACCCAGAGATCGCTGCGTTCCCGCCCCCTCACCCGCCCGCTCTCGTCATCACTGAGGTGGAGAAGAGCATGCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAATTTAAATAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAaataaagtttaagtgtttttatttaaaatcacaaaattcg
实施例12
我们使用了改进型IX-E2和L5-E4位点以产生携带小鼠IL12A和IL12B基因的病毒以用作临床前试验中的模型。将小鼠IL12A的基因克隆到带有如SEQ ID NO:21中所示的改进型IX-E2位点的NotI限制性内切位点以产生SEQ ID NO:42的序列，带有NotI限制性内切位点的残留核苷酸以下划线示出。将小鼠IL12B的基因克隆到带有SEQ ID NO:29中所示的EF1A启动子的表达盒的L5-E4位点的SwaI限制性内切位点中以产生SEQ ID NO:43的序列，SwaI限制性内切位点的残留核苷酸以下划线示出。
SEQ ID NO:42
CTATAGGGAGACCCGCGGCCATGTGTCAATCACGCTACCTCCTCTTTTTGGCCACCCTTGCCCTCCTAAACCACCTCAGTTTGGCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGACATCACACGGGACCAAACCAGCACATTGAAGACCTGTTTACCACTGGAACTACACAAGAACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAGAGACTTCTTCCACAACAAGAGGGAGCTGCCTGCCCCCACAGAAGACGTCTTTGATGATGACCCTGTGCCTTGGTAGCATCTATGAGGACTTGAAGATGTACCAGACAGAGTTCCAGGCCATCAACGCAGCACTTCAGAATCACAACCATCAGCAGATCATTCTAGACAAGGGCATGCTGGTGGCCATCGATGAGCTGATGCAGTCTCTGAATCATAATGGCGAGACTCTGCGCCAGAAACCTCCTGTGGGAGAAGCAGACCCTTACAGAGTGAAAATGAAGCTCTGCATCCTGCTTCACGCCTTCAGCACCCGCGTCGTGACCATCAACAGGGTGATGGGCTATCTGAGCTCCGCCTGAGGCCGCTGTGCCTTCTAGTT
SEQ ID NO:43
TTGCCGCCAGAACACAATTTATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGGTGTCTCCACTCATGGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCTAGAAATAACTTGTTTATTGCAG
产生携带以下的病毒TAV-IX5-空：Ela启动子的TAV-255缺失，没有SEQ ID NO:21中所示的转基因的IX-E2表达盒，和没有SEQ ID NO:29中所示的转基因的L5-E4表达盒。产生携带以下的病毒TAV-IX5-mIL12：Ela启动子的TAV-255缺失，包含SEQ ID NO:42的小鼠IL12A基因的IX-E2表达盒，和包含SEQ ID NO:43的小鼠IL12B基因的L5-E4表达盒。
为检测这些病毒的溶瘤作用，将A549细胞用TAV-IX5-空或TAV-IX5-mIL12病毒在MOI为5的情况下感染，或保持为未感染对照，在感染后每2天用结晶紫将孔看色。如图13所示，空对照病毒和携带小鼠IL-12的病毒均在4-6天内溶解。
为检测转基因表达，将A549细胞用TAV-IX5-空或TAV-IX5-mIL12病毒在MOI为5的情况下一式三份地表达，在感染后4天收集条件培养基以测量小鼠IL-12，使用ELISA，仅检测同时具有小鼠IL12A和小鼠IL12B链的异二聚体。如图14所示，TAV-IX5-mIL12诱导了IL-12异二聚体的高水平表达。
人腺病毒5，全基因组
NCBI参考序列：AC_000008.1(SEQ ID NO:1)
>AC_000008.1人腺病毒5，全基因组
CATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGACTTTGACCGTTTACGTGGAGACTCGCCCAGGTGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCGCGTTCCGGGTCAAAGTTGGCGTTTTATTATTATAGTCAGCTGACGTGTAGTGTATTTATACCCGGTGAGTTCCTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGTAGAGTTTTCTCCTCCGAGCCGCTCCGACACCGGGACTGAAAATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCATAAGGTGTAAACCTGTGATTGCGTGTGTGGTTAACGCCTTTGTTTGCTGAATGAGTTGATGTAAGTTTAATAAAGGGTGAGATAATGTTTAACTTGCATGGCGTGTTAAATGGGGCGGGGCTTAAAGGGTATATAATGCGCCGTGGGCTAATCTTGGTTACATCTGACCTCATGGAGGCTTGGGAGTGTTTGGAAGATTTTTCTGCTGTGCGTAACTTGCTGGAACAGAGCTCTAACAGTACCTCTTGGTTTTGGAGGTTTCTGTGGGGCTCATCCCAGGCAAAGTTAGTCTGCAGAATTAAGGAGGATTACAAGTGGGAATTTGAAGAGCTTTTGAAATCCTGTGGTGAGCTGTTTGATTCTTTGAATCTGGGTCACCAGGCGCTTTTCCAAGAGAAGGTCATCAAGACTTTGGATTTTTCCACACCGGGGCGCGCTGCGGCTGCTGTTGCTTTTTTGAGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCCATCTGAGCGGGGGGTACCTGCTGGATTTTCTGGCCATGCATCTGTGGAGAGCGGTTGTGAGACACAAGAATCGCCTGCTACTGTTGTCTTCCGTCCGCCCGGCGATAATACCGACGGAGGAGCAGCAGCAGCAGCAGGAGGAAGCCAGGCGGCGGCGGCAGGAGCAGAGCCCATGGAACCCGAGAGCCGGCCTGGACCCTCGGGAATGAATGTTGTACAGGTGGCTGAACTGTATCCAGAACTGAGACGCATTTTGACAATTACAGAGGATGGGCAGGGGCTAAAGGGGGTAAAGAGGGAGCGGGGGGCTTGTGAGGCTACAGAGGAGGCTAGGAATCTAGCTTTTAGCTTAATGACCAGACACCGTCCTGAGTGTATTACTTTTCAACAGATCAAGGATAATTGCGCTAATGAGCTTGATCTGCTGGCGCAGAAGTATTCCATAGAGCAGCTGACCACTTACTGGCTGCAGCCAGGGGATGATTTTGAGGAGGCTATTAGGGTATATGCAAAGGTGGCACTTAGGCCAGATTGCAAGTACAAGATCAGCAAACTTGTAAATATCAGGAATTGTTGCTACATTTCTGGGAACGGGGCCGAGGTGGAGATAGATACGGAGGATAGGGTGGCCTTTAGATGTAGCATGATAAATATGTGGCCGGGGGTGCTTGGCATGGACGGGGTGGTTATTATGAATGTAAGGTTTACTGGCCCCAATTTTAGCGGTACGGTTTTCCTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTCTATGGGTTTAACAATACCTGTGTGGAAGCCTGGACCGATGTAAGGGTTCGGGGCTGTGCCTTTTACTGCTGCTGGAAGGGGGTGGTGTGTCGCCCCAAAAGCAGGGCTTCAATTAAGAAATGCCTCTTTGAAAGGTGTACCTTGGGTATCCTGTCTGAGGGTAACTCCAGGGTGCGCCACAATGTGGCCTCCGACTGTGGTTGCTTCATGCTAGTGAAAAGCGTGGCTGTGATTAAGCATAACATGGTATGTGGCAACTGCGAGGACAGGGCCTCTCAGATGCTGACCTGCTCGGACGGCAACTGTCACCTGCTGAAGACCATTCACGTAGCCAGCCACTCTCGCAAGGCCTGGCCAGTGTTTGAGCATAACATACTGACCCGCTGTTCCTTGCATTTGGGTAACAGGAGGGGGGTGTTCCTACCTTACCAATGCAATTTGAGTCACACTAAGATATTGCTTGAGCCCGAGAGCATGTCCAAGGTGAACCTGAACGGGGTGTTTGACATGACCATGAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACATATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTTAAAACATAAATAAAAAACCAGACTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGTGTCTTGCTGTCTTTATTTAGGGGTTTTGCGCGCGCGGTAGGCCCGGGACCAGCGGTCTCGGTCGTTGAGGGTCCTGTGTATTTTTTCCAGGACGTGGTAAAGGTGACTCTGGATGTTCAGATACATGGGCATAAGCCCGTCTCTGGGGTGGAGGTAGCACCACTGCAGAGCTTCATGCTGCGGGGTGGTGTTGTAGATGATCCAGTCGTAGCAGGAGCGCTGGGCGTGGTGCCTAAAAATGTCTTTCAGTAGCAAGCTGATTGCCAGGGGCAGGCCCTTGGTGTAAGTGTTTACAAAGCGGTTAAGCTGGGATGGGTGCATACGTGGGGATATGAGATGCATCTTGGACTGTATTTTTAGGTTGGCTATGTTCCCAGCCATATCCCTCCGGGGATTCATGTTGTGCAGAACCACCAGCACAGTGTATCCGGTGCACTTGGGAAATTTGTCATGTAGCTTAGAAGGAAATGCGTGGAAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGACCTCCAAGATTTTCCATGCATTCGTCCATAATGATGGCAATGGGCCCACGGGCGGCGGCCTGGGCGAAGATATTTCTGGGATCACTAACGTCATAGTTGTGTTCCAGGATGAGATCGTCATAGGCCATTTTTACAAAGCGCGGGCGGAGGGTGCCAGACTGCGGTATAATGGTTCCATCCGGCCCAGGGGCGTAGTTACCCTCACAGATTTGCATTTCCCACGCTTTGAGTTCAGATGGGGGGATCATGTCTACCTGCGGGGCGATGAAGAAAACGGTTTCCGGGGTAGGGGAGATCAGCTGGGAAGAAAGCAGGTTCCTGAGCAGCTGCGACTTACCGCAGCCGGTGGGCCCGTAAATCACACCTATTACCGGGTGCAACTGGTAGTTAAGAGAGCTGCAGCTGCCGTCATCCCTGAGCAGG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人腺病毒35，全基因组
NCBI参考序列：AC_000019.1(SEQ ID NO:41)
CATCATCAATAATATACCTTATAGATGGAATGGTGCCAATATGTAAATGAGGTGATTTTAAAAAGTGTGGGCCGTGTGGTGATTGGCTGTGGGGTTAACGGTTAAAAGGGGCGGCGCGGCCGTGGGAAAATGACGTTTTATGGGGGTGGAGTTTTTTTGCAAGTTGTCGCGGGAAATGTTACGCATAAAAAGGCTTCTTTTCTCACGGAACTACTTAGTTTTCCCACGGTATTTAACAGGAAATGAGGTAGTTTTGACCGGATGCAAGTGAAAATTGCTGATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGTTTTTCTGAATAATGTGGTATTTATGGCAGGGTGGAGTATTTGTTCAGGGCCAGGTAGACTTTGACCCATTACGTGGAGGTTTCGATTACCGTGTTTTTTACCTGAATTTCCGCGTACCGTGTCAAAGTCTTCTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTAGGGTATTTATACCTCAGGGTTTGTGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCTGCGCCGGCAGTTTAATAATAAAAAAATGAGAGATTTGCGATTTCTGCCTCAGGAAATAATCTCTGCTGAGACTGGAAATGAAATATTGGAGCTTGTGGTGCACGCCCTGATGGGAGACGATCCGGAGCCACCTGTGCAGCTTTTTGAGCCTCCTACGCTTCAGGAACTGTATGATTTAGAGGTAGAGGGATCGGAGGATTCTAATGAGGAAGCTGTGAATGGCTTTTTTACCGATTCTATGCTTTTAGCTGCTAATGAAGGATTAGAATTAGATCCGCCTTTGGACACTTTCAATACTCCAGGGGTGATTGTGGAAAGCGGTACAGGTGTAAGAAAATTACCTGATTTGAGTTCCGTGGACTGTGATTTGCACTGCTATGAAGACGGGTTTCCTCCGAGTGATGAGGAGGACCATGAAAAGGAGCAGTCCATGCAGACTGCAGCGGGTGAGGGAGTGAAGGCTGCCAATGTTGGTTTTCAGTTGGATTGCCCGGAGCTTCCTGGACATGGCTGTAAGTCTTGTGAATTTCACAGGAAAAATACTGGAGTAAAGGAACTGTTATGTTCGCTTTGTTATATGAGAACGCACTGCCACTTTATTTACAGTAAGTGTGTTTAAGTTAAAATTTAAAGGAATATGCTGTTTTTCACATGTATATTGAGTGTGAGTTTTGTGCTTCTTATTATAGGTCCTGTGTCTGATGCTGATGAATCACCATCTCCTGATTCTACTACCTCACCTCCTGATATTCAAGCACCTGTTCCTGTGGACGTGCGCAAGCCCATTCCTGTGAAGCTTAAGCCTGGGAAACGTCCAGCAGTGGAGAAACTTGAGGACTTGTTACAGGGTGGGGACGGACCTTTGGACTTGAGTACACGGAAACGTCCAAGACAATAAGTGTTCCATATCCGTGTTTACTTAAGGTGACGTCAATATTTGTGTGAGAGTGCAATGTAATAAAAATATGTTAACTGTTCACTGGTTTTTATTGCTTTTTGGGCGGGGACTCAGGTATATAAGTAGAAGCAGACCTGTGTGGTTAGCTCATAGGAGCTGGCTTTCATCCATGGAGGTTTGGGCCATTTTGGAAGACCTTAGGAAGACTAGGCAACTGTTAGAGAGCGCTTCGGACGGAGTCTCCGGTTTTTGGAGATTCTGGTTCGCTAGTGAATTAGCTAGGGTAGTTTTTAGGATAAAACAGGACTATAAACAAGAATTTGAAAAGTTGTTGGTAGATTGCCCAGGACTTTTTGAAGCTCTTAATTTGGGCCATCAGGTTCACTTTAAAGAAAAAGTTTTATCAGTTTTAGACTTTTCAACCCCAGGTAGAACTGCTGCTGCTGTGGCTTTTCTTACTTTTATATTAGATAAATGGATCCCGCAGACTCATTTCAGCAGGGGATACGTTTTGGATTTCATAGCCACAGCATTGTGGAGAACATGGAAGGTTCGCAAGATGAGGACAATCTTAGGTTACTGGCCAGTGCAGCCTTTGGGTGTAGCGGGAATCCTGAGGCATCCACCGGTCATGCCAGCGGTTCTGGAGGAGGAACAGCAAGAGGACAACCCGAGAGCCGGCCTGGACCCTCCAGTGGAGGAGGCGGAGTAGCTGACTTGTCTCCTGAACTGCAACGGGTGCTTACTGGATCTACGTCCACTGGACGGGATAGGGGCGTTAAGAGGGAGAGGGCATCCAGTGGTACTGATGCTAGATCTGAGTTGGCTTTAAGTTTAATGAGTCGCAGACGTCCTGAAACCATTTGGTGGCATGAGGTTCAGAAAGAGGGAAGGGATGAAGTTTCTGTATTGCAGGAGAAATATTCACTGGAACAGGTGAAAACATGTTGGTTGGAGCCAGAGGATGATTGGGCGGTGGCCATTAAAAATTATGCCAAGATAGCTTTGAGGCCTGATAAACAGTATAAGATCAGTAGACGGATTAATATCCGGAATGCTTGTTACATATCTGGAAATGGGGCTGAGGTGGTAATAGATACTCAAGACAAGACAGTTATTAGATGCTGCATGATGGATATGTGGCCTGGAGTAGTCGGTATGGAAGCAGTCACTTTTGTAAATGTTAAGTTTAGGGGAGATGGTTATAATGGAATAGTGTTTATGGCCAATACCAAACTTATATTGCATGGTTGTAGCTTTTTTGGTTTCAACAATACCTGTGTAGATGCCTGGGGACAGGTTAGTGTACGGGGGTGTAGTTTCTATGCGTGTTGGATTGCCACAGCTGGCAGAACCAAGAGTCAATTGTCTCTGAAGAAATGCATATTCCAAAGATGTAACCTGGGCATTCTGAATGAAGGCGAAGCAAGGGTCCGTCACTGCGCTTCTACAGATACTGGATGTTTTATTTTAATTAAGGGAAATGCCAGCGTAAAGCATAACATGATTTGTGGTGCTTCCGATGAGAGGCCTTATCAAATGCTCACTTGTGCTGGTGGGCATTGTAATATGCTGGCTACTGTGCATATTGTTTCCCATCAACGCAAAAAATGGCCTGTTTTTGATCACAATGTGTTGACCAAGTGCACCATGCATGCAGGTGGGCGTAGAGGAATGTTTATGCCTTACCAGTGTAACATGAATCATGTGAAAGTGTTGTTGGAACCAGATGCCTTTTCCAGAATGAGCCTAACAGGAATCTTTGACATGAACACGCAAATCTGGAAGATCCTGAGGTATGATGATACGAGATCGAGGGTGCGCGCATGCGAATGCGGAGGCAAGCATGCCAGGTTCCAGCCGGTGTGTGTAGATGTGACCGAAGATCTCAGACCGGATCATTTGGTTATTGCCCGCACTGGAGCAGAGTTCGGATCCAGTGGAGAAGAAACTGACTAAGGTGAGTATTGGGAAAACTTTGGGGTGGGATTTTCAGATGGACAGATTGAGTAAAAATTTGTTTTTTCTGTCTTGCAGCTGACATGAGTGGAAATGCTTCTTTTAAGGGGGGAGTCTTCAGCCCTTATCTGACAGGGCGTCTCCCATCCTGGGCAGGAGTTCGTCAGAATGTTATGGGATCTACTGTGGATGGAAGACCCGTTCAACCCGCCAATTCTTCAACGCTGACCTATGCTACTTTAAGTTCTTCACCTTTGGACGCAGCTGCAGCCGCTGCCGCCGCCTCTGTCGCCGCTAACACTGTGCTTGGAATGGGTTACTATGGAAGCATCGTGGCTAATTCCACTTCCTCTAATAACCCTTCTACACTGACTCAGGACAAGTTACTTGTCCTTTTGGCCCAGCTGGAGGCTTTGACCCAACGTCTGGGTGAACTTTCTCAGCAGGTGGCCGAGTTGCGAGTACAAACTGAGTCTGCTGTCGGCACGGCAAAGTCTAAATAAAAAAAATTCCAGAATCAATGAATAAATAAACGAGCTTGTTGTTGATTTAAAATCAAGTGTTTTTATTTCATTTTTCGCGCACGGTATGCCCTGGACCACCGATCTCGATCATTGAGAACTCGGTGGATTTTTTCCAGAATCCTATAGAGGTGGGATTGAATGTTTAGATACATGGGCATTAGGCCGTCTTTGGGGTGGAGATAGCTCCATTGAAGGGATTCATGCTCCGGGGTAGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAACAAGGTCGCAGTGCATGGTGTTGCACAATATCTTTTAGAAGTAGGCTGATTGCCACAGATAAGCCCTTGGTGTAGGTGTTTACAAACCGGTTGAGCTGGGAGGGGTGCATTCGAGGTGAAATTATGTGCATTTTGGATTGGATTTTTAAGTTGGCAATATTGCCGCCAAGATCCCGTCTTGGGTTCATGTTATGAAGGACTACCAAGACGGTGTATCCGGTACATTTAGGAAATTTATCGTGCAGCTTGGATGGAAAAGCGTGGAAAAATTTGGAGACACCCTTGTGTCCTCCGAGATTTTCCATGCACTCATCCATGATAATAGCAATGGGGCCGTGGGCAGCGGCGCGGGCAAACACGTTCCGTGGGTCTGACACATCATAGTTATGTTCCTGAGTTAAATCATCATAAGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGCGTACCAGATTGGGGTATGAATGTTCCTTCGGGCCCCGGAGCATAGTTCCCCTCACAGATTTGCATTTCCCAAGCTTTCAGTTCTGAGGGTGGAATCATGTCCACCTGGGGGGCTATGAAGAACACCGTTTCGGGGGCGGGGGTGATTAGTTGGGATGATAGCAAGTTTCTGAGCAATTGAGATTTGCCACATCCGGTGGGGCCATAAATAATTCCGATTACAGGTTGCAGGTGGTAGTTTAGGGAACGGCAACTGCCGTCTTCTCGAAGCAAGGGGGCCACCTCGTTCATCATTTCCCTTACATGCATATTTTCCCGCACCAAATCCATTAGGAGGCGCTCTCCTCCTAGTGATAGAAGTTCTTGTAGTGAGGAAAAGTTTTTCAGCGGTTTTAGACCGTC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参考文献的引入
本文所提到的每篇专利文献和科学论文的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
等效范围
本发明可以其他具体形式实施而不背离其精神或基本特征。因此前述实施方式被认为在所有方面都是说明性的，而非限制本文所述发明。本发明的范围因此由所附权利要求而不是前述说明书表明，并且进入权利要求的含义和等效范围内的所有变化均意图涵盖其中。
序列表
<110> EpicentRx, Inc.
Larson, Christopher
Oronsky, Bryan
Reid, Tony R.
<120> 携带转基因的重组腺病毒
<130> EPRX-002/01WO 330096-2019
<150> US 62/511,822
<151> 2017-05-26
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35938
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 1
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480
tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540
tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600
aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660
tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720
cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780
gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca 840
cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900
ccttgtaccg gaggtgatcg atcttacctg ccacgaggct ggctttccac ccagtgacga 960
cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg 1020
caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg 1080
ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga 1140
tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa 1200
gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 1260
ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 1320
cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 1380
ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 1440
gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 1500
cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga 1560
ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt 1620
gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg 1680
cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat 1740
ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg 1800
tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg 1860
gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac 1920
caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct 1980
gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg 2040
agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac 2100
aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag 2160
cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga 2220
gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga 2280
gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg 2340
gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc 2400
gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc 2460
tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt 2520
ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga 2580
tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg 2640
agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg 2700
tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg 2760
gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta 2820
acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct 2880
gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg 2940
aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct 3000
ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat 3060
gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc 3120
tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata 3180
acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc 3240
aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc 3300
tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 3360
gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc 3420
tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt 3480
ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg 3540
tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg 3600
ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 3660
gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc 3720
ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 3780
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actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 3900
acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt 3960
ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca 4020
atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 4080
cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt 4140
cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 4200
acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 4260
gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt 4320
ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt 4380
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tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag 4500
tgtatccggt gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact 4560
tggagacgcc cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg 4620
gcccacgggc ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt 4680
ccaggatgag atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg 4740
gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg 4800
ctttgagttc agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg 4860
gggtagggga gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc 4920
cggtgggccc gtaaatcaca cctattaccg ggtgcaactg gtagttaaga gagctgcagc 4980
tgccgtcatc cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt 5040
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caaagttttt caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa 5160
gcagttccag gcggtcccac agctcggtca cctgctctac ggcatctcga tccagcatat 5220
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acgggccagg gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac 5340
ggtgaagggg tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct 5400
ggtgctgaag cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt 5460
gtcatagtcc agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc 5520
gccgcacgag gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga 5580
ttccggggag taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca 5640
ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt 5700
cttacctctg gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc 5760
cccgtataca gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag 5820
aaactcggac cactctgaga caaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg 5880
ggaggggtag cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat 5940
gtcgccctct tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg 6000
tgttcctgaa ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc 6060
atcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctgaaaag cgggcatgac 6120
ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 6180
ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcatccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc 6240
aagcttggtg gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc aacttggcga tggagcgcag 6300
ggtttggttt ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc 6360
gcgcgcaacg caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ccaggtgcac 6420
gcgccaaccg cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag 6480
gcgctcgttg gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagggggtc 6540
tagctgcgtc tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc 6600
gtcgaagtag tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc 6660
aagcgcgcgc tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga 6720
ggcgtacatg ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt 6780
agggtagcat cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg 6840
agcgaggagg tcgggaccga ggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agactatctg 6900
cctgaagatg gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctggc 6960
gtctgtgaga cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac 7020
cagctcggcg gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc 7080
atacttatcc tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 7140
tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta 7200
gaactggttg acggcctggt aggcgcagca tcccttttct acgggtagcg cgtatgcctg 7260
cgcggccttc cggagcgagg tgtgggtgag cgcaaaggtg tccctgacca tgactttgag 7320
gtactggtat ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt 7380
gcgctttttg gaacgcggat ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc 7440
cgcgcgaggc ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt 7500
aattacctgg gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg atgttgtggc ccacaatgta 7560
aagttccaag aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat tttttaagtt cctcgtaggt 7620
gagctcttca ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc cagtctgcaa gatgagggtt 7680
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ggtcctaaac tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgg 7800
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aggctcatct ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc 7920
ccccatccaa gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg 7980
cgagccgatc gggaagaact ggatctcccg ccaccaattg gaggagtggc tattgatgtg 8040
gtgaaagtag aagtccctgc gacgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaaacgtgc 8100
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cacaaggaag cagagtggga atttgagccc ctcgcctggc gggtttggct ggtggtcttc 8220
tacttcggct gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcggac 8280
caccacgccg cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac 8340
aacatcgcgc agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg 8400
gagctcctgc aggtttacct cgcatagacg ggtcagggcg cgggctagat ccaggtgata 8460
cctaatttcc aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg 8520
cggcgcgact acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg ggggtgtcct tggatgatgc 8580
atctaaaagc ggtgacgcgg gcgagccccc ggaggtaggg ggggctccgg acccgccggg 8640
agagggggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcagga gctggtgctg cgcgcgtagg 8700
ttgctggcga acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa tctggcgcct ctgcgtgaag 8760
acgacgggcc cggtgagctt gagcctgaaa gagagttcga cagaatcaat ttcggtgtcg 8820
ttgacggcgg cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg agttgtcttg ataggcgatc 8880
tcggccatga actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc cgcgtccggc tcgctccacg 8940
gtggcggcga ggtcgttgga aatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc 9000
tcgttccaga cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc 9060
tgcgcgagat tgagctccac gtgccgggcg aagacggcgt agtttcgcag gcgctgaaag 9120
aggtagttga gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgtcgc 9180
aacgtggatt cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc 9240
acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg ttaactcctc ctccagaaga 9300
cggatgagct cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa aggctacagg ggcctcttct 9360
tcttcttcaa tctcctcttc cataagggcc tccccttctt cttcttctgg cggcggtggg 9420
ggagggggga cacggcggcg acgacggcgc accgggaggc ggtcgacaaa gcgctcgatc 9480
atctccccgc ggcgacggcg catggtctcg gtgacggcgc ggccgttctc gcgggggcgc 9540
agttggaaga cgccgcccgt catgtcccgg ttatgggttg gcggggggct gccatgcggc 9600
agggatacgg cgctaacgat gcatctcaac aattgttgtg taggtactcc gccgccgagg 9660
gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag 9720
tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggcggcg gtcggggttg 9780
tttctggcgg aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg 9840
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ccccaggctt cgttttgaca tcggcgcagg tctttgtagt agtcttgcat gagcctttct 9960
accggcactt cttcttctcc ttcctcttgt cctgcatctc ttgcatctat cgctgcggcg 10020
gcggcggagt ttggccgtag gtggcgccct cttcctccca tgcgtgtgac cccgaagccc 10080
ctcatcggct gaagcagggc taggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc 10140
acctgcgtga gggtagactg gaagtcatcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg 10200
ttgatggtgt aagtgcagtt ggccataacg gaccagttaa cggtctggtg acccggctgc 10260
gagagctcgg tgtacctgag acgcgagtaa gccctcgagt caaatacgta gtcgttgcaa 10320
gtccgcacca ggtactggta tcccaccaaa aagtgcggcg gcggctggcg gtagaggggc 10380
cagcgtaggg tggccggggc tccgggggcg agatcttcca acataaggcg atgatatccg 10440
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cggacgcggt tccagatgtt gcgcagcggc aaaaagtgct ccatggtcgg gacgctctgg 10560
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ggcactcttc cgtggtctgg tggataaatt cgcaagggta tcatggcgga cgaccggggt 10680
tcgagccccg tatccggccg tccgccgtga tccatgcggt taccgcccgc gtgtcgaacc 10740
caggtgtgcg acgtcagaca acgggggagt gctccttttg gcttccttcc aggcgcggcg 10800
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ccgtcatgca agaccccgct tgcaaattcc tccggaaaca gggacgagcc ccttttttgc 11040
ttttcccaga tgcatccggt gctgcggcag atgcgccccc ctcctcagca gcggcaagag 11100
caagagcagc ggcagacatg cagggcaccc tcccctcctc ctaccgcgtc aggaggggcg 11160
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gggcgcgagc tgcggcatgg cctgaatcgc gagcggttgc tgcgcgagga ggactttgag 11460
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accgcatacg agcagacggt gaaccaggag attaactttc aaaaaagctt taacaaccac 11580
gtgcgtacgc ttgtggcgcg cgaggaggtg gctataggac tgatgcatct gtgggacttt 11640
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gtgcagcaca gcagggacaa cgaggcattc agggatgcgc tgctaaacat agtagagccc 11760
gagggccgct ggctgctcga tttgataaac atcctgcaga gcatagtggt gcaggagcgc 11820
agcttgagcc tggctgacaa ggtggccgcc atcaactatt ccatgcttag cctgggcaag 11880
ttttacgccc gcaagatata ccatacccct tacgttccca tagacaagga ggtaaagatc 11940
gaggggttct acatgcgcat ggcgctgaag gtgcttacct tgagcgacga cctgggcgtt 12000
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cgcgagctga tgcacagcct gcaaagggcc ctggctggca cgggcagcgg cgatagagag 12120
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ggaaagcgac atcggggtaa agtttgacac ccgcaacttc agactggggt ttgaccccgt 14820
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cgcccccgct gcgcaacccg aggtcgagaa gcctcagaag aaaccggtga tcaaacccct 15300
gacagaggac agcaagaaac gcagttacaa cctaataagc aatgacagca ccttcaccca 15360
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cgtgcccgtg cgcacccgcc ccccgcgcaa ctagattgca agaaaaaact acttagactc 16500
gtactgttgt atgtatccag cggcggcggc gcgcaacgaa gctatgtcca agcgcaaaat 16560
caaagaagag atgctccagg tcatcgcgcc ggagatctat ggccccccga agaaggaaga 16620
gcaggattac aagccccgaa agctaaagcg ggtcaaaaag aaaaagaaag atgatgatga 16680
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gaaaaatcaa aataaaaagt ctggactctc acgctcgctt ggtcctgtaa ctattttgta 18000
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tattgaaaat catggaactg aagatgaact tccaaattac tgctttccac tgggaggtgt 20100
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tcagacacca tccccagtac agggacagga ctatagctga gcttcttaga attctttaat 30060
tatgaaattt actgtgactt ttctgctgat tatttgcacc ctatctgcgt tttgttcccc 30120
gacctccaag cctcaaagac atatatcatg cagattcact cgtatatgga atattccaag 30180
ttgctacaat gaaaaaagcg atctttccga agcctggtta tatgcaatca tctctgttat 30240
ggtgttctgc agtaccatct tagccctagc tatatatccc taccttgaca ttggctggaa 30300
acgaatagat gccatgaacc acccaacttt ccccgcgccc gctatgcttc cactgcaaca 30360
agttgttgcc ggcggctttg tcccagccaa tcagcctcgc cccacttctc ccacccccac 30420
tgaaatcagc tactttaatc taacaggagg agatgactga caccctagat ctagaaatgg 30480
acggaattat tacagagcag cgcctgctag aaagacgcag ggcagcggcc gagcaacagc 30540
gcatgaatca agagctccaa gacatggtta acttgcacca gtgcaaaagg ggtatctttt 30600
gtctggtaaa gcaggccaaa gtcacctacg acagtaatac caccggacac cgccttagct 30660
acaagttgcc aaccaagcgt cagaaattgg tggtcatggt gggagaaaag cccattacca 30720
taactcagca ctcggtagaa accgaaggct gcattcactc accttgtcaa ggacctgagg 30780
atctctgcac ccttattaag accctgtgcg gtctcaaaga tcttattccc tttaactaat 30840
aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta aaatcagtta gcaaatttct gtccagttta 30900
ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag ctctggtatt gcagcttcct cctggctgca 30960
aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca gtttcctcct gttcctgtcc atccgcaccc 31020
actatcttca tgttgttgca gatgaagcgc gcaagaccgt ctgaagatac cttcaacccc 31080
gtgtatccat atgacacgga aaccggtcct ccaactgtgc cttttcttac tcctcccttt 31140
gtatccccca atgggtttca agagagtccc cctggggtac tctctttgcg cctatccgaa 31200
cctctagtta cctccaatgg catgcttgcg ctcaaaatgg gcaacggcct ctctctggac 31260
gaggccggca accttacctc ccaaaatgta accactgtga gcccacctct caaaaaaacc 31320
aagtcaaaca taaacctgga aatatctgca cccctcacag ttacctcaga agccctaact 31380
gtggctgccg ccgcacctct aatggtcgcg ggcaacacac tcaccatgca atcacaggcc 31440
ccgctaaccg tgcacgactc caaacttagc attgccaccc aaggacccct cacagtgtca 31500
gaaggaaagc tagccctgca aacatcaggc cccctcacca ccaccgatag cagtaccctt 31560
actatcactg cctcaccccc tctaactact gccactggta gcttgggcat tgacttgaaa 31620
gagcccattt atacacaaaa tggaaaacta ggactaaagt acggggctcc tttgcatgta 31680
acagacgacc taaacacttt gaccgtagca actggtccag gtgtgactat taataatact 31740
tccttgcaaa ctaaagttac tggagccttg ggttttgatt cacaaggcaa tatgcaactt 31800
aatgtagcag gaggactaag gattgattct caaaacagac gccttatact tgatgttagt 31860
tatccgtttg atgctcaaaa ccaactaaat ctaagactag gacagggccc tctttttata 31920
aactcagccc acaacttgga tattaactac aacaaaggcc tttacttgtt tacagcttca 31980
aacaattcca aaaagcttga ggttaaccta agcactgcca aggggttgat gtttgacgct 32040
acagccatag ccattaatgc aggagatggg cttgaatttg gttcacctaa tgcaccaaac 32100
acaaatcccc tcaaaacaaa aattggccat ggcctagaat ttgattcaaa caaggctatg 32160
gttcctaaac taggaactgg ccttagtttt gacagcacag gtgccattac agtaggaaac 32220
aaaaataatg ataagctaac tttgtggacc acaccagctc catctcctaa ctgtagacta 32280
aatgcagaga aagatgctaa actcactttg gtcttaacaa aatgtggcag tcaaatactt 32340
gctacagttt cagttttggc tgttaaaggc agtttggctc caatatctgg aacagttcaa 32400
agtgctcatc ttattataag atttgacgaa aatggagtgc tactaaacaa ttccttcctg 32460
gacccagaat attggaactt tagaaatgga gatcttactg aaggcacagc ctatacaaac 32520
gctgttggat ttatgcctaa cctatcagct tatccaaaat ctcacggtaa aactgccaaa 32580
agtaacattg tcagtcaagt ttacttaaac ggagacaaaa ctaaacctgt aacactaacc 32640
attacactaa acggtacaca ggaaacagga gacacaactc caagtgcata ctctatgtca 32700
ttttcatggg actggtctgg ccacaactac attaatgaaa tatttgccac atcctcttac 32760
actttttcat acattgccca agaataaaga atcgtttgtg ttatgtttca acgtgtttat 32820
ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt ttcattcagt agtatagccc caccaccaca 32880
tagcttatac agatcaccgt accttaatca aactcacaga accctagtat tcaacctgcc 32940
acctccctcc caacacacag agtacacagt cctttctccc cggctggcct taaaaagcat 33000
catatcatgg gtaacagaca tattcttagg tgttatattc cacacggttt cctgtcgagc 33060
caaacgctca tcagtgatat taataaactc cccgggcagc tcacttaagt tcatgtcgct 33120
gtccagctgc tgagccacag gctgctgtcc aacttgcggt tgcttaacgg gcggcgaagg 33180
agaagtccac gcctacatgg gggtagagtc ataatcgtgc atcaggatag ggcggtggtg 33240
ctgcagcagc gcgcgaataa actgctgccg ccgccgctcc gtcctgcagg aatacaacat 33300
ggcagtggtc tcctcagcga tgattcgcac cgcccgcagc ataaggcgcc ttgtcctccg 33360
ggcacagcag cgcaccctga tctcacttaa atcagcacag taactgcagc acagcaccac 33420
aatattgttc aaaatcccac agtgcaaggc gctgtatcca aagctcatgg cggggaccac 33480
agaacccacg tggccatcat accacaagcg caggtagatt aagtggcgac ccctcataaa 33540
cacgctggac ataaacatta cctcttttgg catgttgtaa ttcaccacct cccggtacca 33600
tataaacctc tgattaaaca tggcgccatc caccaccatc ctaaaccagc tggccaaaac 33660
ctgcccgccg gctatacact gcagggaacc gggactggaa caatgacagt ggagagccca 33720
ggactcgtaa ccatggatca tcatgctcgt catgatatca atgttggcac aacacaggca 33780
cacgtgcata cacttcctca ggattacaag ctcctcccgc gttagaacca tatcccaggg 33840
aacaacccat tcctgaatca gcgtaaatcc cacactgcag ggaagacctc gcacgtaact 33900
cacgttgtgc attgtcaaag tgttacattc gggcagcagc ggatgatcct ccagtatggt 33960
agcgcgggtt tctgtctcaa aaggaggtag acgatcccta ctgtacggag tgcgccgaga 34020
caaccgagat cgtgttggtc gtagtgtcat gccaaatgga acgccggacg tagtcatatt 34080
tcctgaagca aaaccaggtg cgggcgtgac aaacagatct gcgtctccgg tctcgccgct 34140
tagatcgctc tgtgtagtag ttgtagtata tccactctct caaagcatcc aggcgccccc 34200
tggcttcggg ttctatgtaa actccttcat gcgccgctgc cctgataaca tccaccaccg 34260
cagaataagc cacacccagc caacctacac attcgttctg cgagtcacac acgggaggag 34320
cgggaagagc tggaagaacc atgttttttt ttttattcca aaagattatc caaaacctca 34380
aaatgaagat ctattaagtg aacgcgctcc cctccggtgg cgtggtcaaa ctctacagcc 34440
aaagaacaga taatggcatt tgtaagatgt tgcacaatgg cttccaaaag gcaaacggcc 34500
ctcacgtcca agtggacgta aaggctaaac ccttcagggt gaatctcctc tataaacatt 34560
ccagcacctt caaccatgcc caaataattc tcatctcgcc accttctcaa tatatctcta 34620
agcaaatccc gaatattaag tccggccatt gtaaaaatct gctccagagc gccctccacc 34680
ttcagcctca agcagcgaat catgattgca aaaattcagg ttcctcacag acctgtataa 34740
gattcaaaag cggaacatta acaaaaatac cgcgatcccg taggtccctt cgcagggcca 34800
gctgaacata atcgtgcagg tctgcacgga ccagcgcggc cacttccccg ccaggaacca 34860
tgacaaaaga acccacactg attatgacac gcatactcgg agctatgcta accagcgtag 34920
ccccgatgta agcttgttgc atgggcggcg atataaaatg caaggtgctg ctcaaaaaat 34980
caggcaaagc ctcgcgcaaa aaagaaagca catcgtagtc atgctcatgc agataaaggc 35040
aggtaagctc cggaaccacc acagaaaaag acaccatttt tctctcaaac atgtctgcgg 35100
gtttctgcat aaacacaaaa taaaataaca aaaaaacatt taaacattag aagcctgtct 35160
tacaacagga aaaacaaccc ttataagcat aagacggact acggccatgc cggcgtgacc 35220
gtaaaaaaac tggtcaccgt gattaaaaag caccaccgac agctcctcgg tcatgtccgg 35280
agtcataatg taagactcgg taaacacatc aggttgattc acatcggtca gtgctaaaaa 35340
gcgaccgaaa tagcccgggg gaatacatac ccgcaggcgt agagacaaca ttacagcccc 35400
cataggaggt ataacaaaat taataggaga gaaaaacaca taaacacctg aaaaaccctc 35460
ctgcctaggc aaaatagcac cctcccgctc cagaacaaca tacagcgctt ccacagcggc 35520
agccataaca gtcagcctta ccagtaaaaa agaaaaccta ttaaaaaaac accactcgac 35580
acggcaccag ctcaatcagt cacagtgtaa aaaagggcca agtgcagagc gagtatatat 35640
aggactaaaa aatgacgtaa cggttaaagt ccacaaaaaa cacccagaaa accgcacgcg 35700
aacctacgcc cagaaacgaa agccaaaaaa cccacaactt cctcaaatcg tcacttccgt 35760
tttcccacgt tacgtaactt cccattttaa gaaaactaca attcccaaca catacaagtt 35820
actccgccct aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac 35880
tccaccccct cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat tgatgatg 35938
<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 2
tcaccagg 8
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 3
ctgacctc 8
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的Ela启动子
<400> 4
ggtgttttgg 10
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的Ela启动子
<400> 5
ctaggactg 9
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 6
taaaacataa ataaaaaacc agactctgtt tggatttgga tcaagcaagt gtcttgctgt 60
cttta 65
<210> 7
<211> 132
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 7
taaagaatcg tttgtgttat gtttcaacgt gtttattttt caattgcaga aaatttcaag 60
tcatttttca ttcagtagta tagccccacc accacatagc ttatacagat caccgtacct 120
taatcaaact ca 132
<210> 8
<211> 3
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 8
taa 3
<210> 9
<211> 3
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 9
tta 3
<210> 10
<211> 3
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 10
tca 3
<210> 11
<211> 8
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> SwaI限制性内切位点
<400> 11
atttaaat 8
<210> 12
<211> 6
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 12
aataaa 6
<210> 13
<211> 6
<212> DNA
<213> 人腺病毒5
<400> 13
tttatt 6
<210> 14
<211> 530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5初始 空
<400> 14
aataaagaat cgtttgtgtt atgtttcaac ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 60
aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 120
accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 180
aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 240
agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 300
gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 360
ttttgcaaaa agctttgcaa agatttaaat aacttgttta ttgcagctta taatggttac 420
aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 480
tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggtgtttatt 530
<210> 15
<211> 956
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5初始 mGMCSF
<400> 15
aataaagaat cgtttgtgtt atgtttcaac ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 60
aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 120
accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 180
aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 240
agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 300
gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 360
ttttgcaaaa agctttgcaa agatttatgt ggctgcagaa cctgctgttc ctgggcatcg 420
tggtgtacag cctgagcgcc cccaccagat cccccatcac cgtgaccaga ccctggaagc 480
acgtggaagc catcaaagag gccctgaacc tgctggacga catgcccgtg accctgaacg 540
aagaggtgga agtggtgtcc aacgagttca gcttcaagaa actgacctgc gtgcagacca 600
gactgaagat cttcgagcag ggcctgagag gcaacttcac caagctgaag ggcgctctga 660
acatgaccgc cagctactac cagacctact gccctcccac acccgagaca gactgcgaga 720
cacaggtcac aacctacgcc gacttcatcg acagcctgaa aaccttcctg accgacatcc 780
ccttcgagtg caagaaaccc ggccagaagt gaaaataact tgtttattgc agcttataat 840
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 900
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggtg tttatt 956
<210> 16
<211> 8
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> NotI限制性内切位点
<400> 16
gcggccgc 8
<210> 17
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IX初始 空
<400> 17
aataaaaaac cagactctgt ttggatttgg atcaagcaag tgtcttgctg tcttacggta 60
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 120
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 180
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 240
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 300
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 360
cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 420
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 480
aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 540
agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aattaatacg 600
actcactata gggagacccg cggccgcctg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 660
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 720
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 780
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 840
tgggctctat ggtttatt 858
<210> 18
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5 mIL7
<400> 18
gctttgcaaa gatttatgtt ccatgtttct tttagatata tctttggaat tcctccactg 60
atccttgttc tgctgcctgt cacatcatct gagtgccaca ttaaagacaa agaaggtaaa 120
gcatatgaga gtgtactgat gatcagcatc gatgaattgg acaaaatgac aggaactgat 180
agtaattgcc cgaataatga accaaacttt tttagaaaac atgtatgtga tgatacaaag 240
gaagctgctt ttctaaatcg tgctgctcgc aagttgaagc aatttcttaa aatgaatatc 300
agtgaagaat tcaatgtcca cttactaaca gtatcacaag gcacacaaac actggtgaac 360
tgcacaagta aggaagaaaa aaacgtaaag gaacagaaaa agaatgatgc atgtttccta 420
aagagactac tgagagaaat aaaaacttgt tggaataaaa ttttgaaggg cagtatataa 480
aaataacttg tttattgcag 500
<210> 19
<211> 461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5 wt mGMCSF
<400> 19
gctttgcaaa gatttatgtg gctgcagaat ttacttttcc tgggcattgt ggtctacagc 60
ctctcagcac ccacccgctc acccatcact gtcacccggc cttggaagca tgtagaggcc 120
atcaaagaag ccctgaacct cctggatgac atgcctgtca cgttgaatga agaggtagaa 180
gtcgtctcta acgagttctc cttcaagaag ctaacatgtg tgcagacccg cctgaagata 240
ttcgagcagg gtctacgggg caatttcacc aaactcaagg gcgccttgaa catgacagcc 300
agctactacc agacatactg ccccccaact ccggaaacgg actgtgaaac acaagttacc 360
acctatgcgg atttcataga cagccttaaa acctttctga ctgatatccc ctttgaatgc 420
aaaaaaccag gccaaaaatg aaaataactt gtttattgca g 461
<210> 20
<211> 463
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IX wt mGMCSF
<400> 20
atagggagac ccgcggccat gtggctgcag aatttacttt tcctgggcat tgtggtctac 60
agcctctcag cacccacccg ctcacccatc actgtcaccc ggccttggaa gcatgtagag 120
gccatcaaag aagccctgaa cctcctggat gacatgcctg tcacgttgaa tgaagaggta 180
gaagtcgtct ctaacgagtt ctccttcaag aagctaacat gtgtgcagac ccgcctgaag 240
atattcgagc agggtctacg gggcaatttc accaaactca agggcgcctt gaacatgaca 300
gccagctact accagacata ctgcccccca actccggaaa cggactgtga aacacaagtt 360
accacctatg cggatttcat agacagcctt aaaacctttc tgactgatat cccctttgaa 420
tgcaaaaaac caggccaaaa atgaggccgc tgtgccttct agt 463
<210> 21
<211> 760
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IX 改进 空
<400> 21
aataaaatac accttttttc gattgtacgt atttttattt acggtaaatg gcccgcctgg 60
ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 120
gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 180
ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 240
atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 300
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 360
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 420
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 480
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctctctg 540
gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga 600
gacccgcggc cgctgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 660
cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaaa accagactct 720
gtttggattt ggatcaagca agtgtcttgc tgtctttatt 760
<210> 22
<211> 1526
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IX 改进的 hIL12A
<400> 22
aataaaatac accttttttc gattgtacgt atttttattt acggtaaatg gcccgcctgg 60
ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 120
gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 180
ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 240
atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 300
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 360
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 420
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 480
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctctctg 540
gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga 600
gacccgcggc catgtggccc cctgggtcag cctcccagcc accgccctca cctgccgcgg 660
ccacaggtct gcatccagcg gctcgccctg tgtccctgca gtgccggctc agcatgtgtc 720
cagcgcgcag cctcctcctt gtggctaccc tggtcctcct ggaccacctc agtttggcca 780
gaaacctccc cgtggccact ccagacccag gaatgttccc atgccttcac cactcccaaa 840
acctgctgag ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag acaaactcta gaattttacc 900
cttgcacttc tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc agcacagtgg 960
aggcctgttt accattggaa ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc agagagacct 1020
ctttcataac taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg atggccctgt 1080
gccttagtag tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag accatgaatg 1140
caaagcttct gatggatcct aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg ctggcagtta 1200
ttgatgagct gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa aaatcctccc 1260
ttgaagaacc ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt catgctttca 1320
gaattcgggc agtgactatt gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc taaggccgct 1380
gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 1440
gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaaaacca gactctgttt ggatttggat 1500
caagcaagtg tcttgctgtc tttatt 1526
<210> 23
<211> 1517
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5初始 hIL12B
<400> 23
aataaagaat cgtttgtgtt atgtttcaac ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 60
aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 120
accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 180
aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 240
agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 300
gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 360
ttttgcaaaa agctttgcaa agatttatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt 420
ccctggtttt tctggcatct cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg 480
tcgtagaatt ggattggtat ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca 540
cccctgaaga agatggtatc acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg 600
gcaaaaccct gaccatccaa gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca 660
aaggaggcga ggttctaagc cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt 720
ggtccactga tattttaaag gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg 780
aggccaagaa ttattctgga cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt 840
tgacattcag tgtcaaaagc agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag 900
ctgctacact ctctgcagag agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg 960
agtgccagga ggacagtgcc tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg 1020
tggatgccgt tcacaagctc aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca 1080
tcatcaaacc tgacccaccc aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg 1140
tggaggtcag ctgggagtac cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga 1200
cattctgcgt tcaggtccag ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg 1260
acaagacctc agccacggtc atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg 1320
accgctacta tagctcatct tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt tagaaataac 1380
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 1440
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 1500
catgtctggt gtttatt 1517
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> furin切割位点
<400> 24
Arg Ala Lys Arg
1
<210> 25
<211> 1625
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL12 furin
<400> 25
atctgacctc gtcgacatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt 60
tctggcatct cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt 120
ggattggtat ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga 180
agatggtatc acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct 240
gaccatccaa gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga 300
ggttctaagc cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga 360
tattttaaag gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa 420
ttattctgga cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag 480
tgtcaaaagc agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact 540
ctctgcagag agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga 600
ggacagtgcc tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt 660
tcacaagctc aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc 720
tgacccaccc aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag 780
ctgggagtac cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt 840
tcaggtccag ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc 900
agccacggtc atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta 960
tagctcatct tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt cgtgctaagc gaagaaacct 1020
ccccgtggcc actccagacc caggaatgtt cccatgcctt caccactccc aaaacctgct 1080
gagggccgtc agcaacatgc tccagaaggc cagacaaact ctagaatttt acccttgcac 1140
ttctgaagag attgatcatg aagatatcac aaaagataaa accagcacag tggaggcctg 1200
tttaccattg gaattaacca agaatgagag ttgcctaaat tccagagaga cctctttcat 1260
aactaatggg agttgcctgg cctccagaaa gacctctttt atgatggccc tgtgccttag 1320
tagtatttat gaagacttga agatgtacca ggtggagttc aagaccatga atgcaaagct 1380
tctgatggat cctaagaggc agatctttct agatcaaaac atgctggcag ttattgatga 1440
gctgatgcag gccctgaatt tcaacagtga gactgtgcca caaaaatcct cccttgaaga 1500
accggatttt tataaaacta aaatcaagct ctgcatactt cttcatgctt tcagaattcg 1560
ggcagtgact attgatagag tgatgagcta tctgaatgct tcctaataac tcgagtcacc 1620
aggcg 1625
<210> 26
<211> 445
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5 改进的 SV40
<400> 26
aataaaaggt ttattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc 60
ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag 120
tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 180
atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 240
ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct 300
gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt 360
tgcaaagatt taaataactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagaatcgtt 420
tgtgttatgt ttcaacgtgt ttatt 445
<210> 27
<211> 502
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IX mIL7
<400> 27
atagggagac ccgcggccat gttccatgtt tcttttagat atatctttgg aattcctcca 60
ctgatccttg ttctgctgcc tgtcacatca tctgagtgcc acattaaaga caaagaaggt 120
aaagcatatg agagtgtact gatgatcagc atcgatgaat tggacaaaat gacaggaact 180
gatagtaatt gcccgaataa tgaaccaaac ttttttagaa aacatgtatg tgatgataca 240
aaggaagctg cttttctaaa tcgtgctgct cgcaagttga agcaatttct taaaatgaat 300
atcagtgaag aattcaatgt ccacttacta acagtatcac aaggcacaca aacactggtg 360
aactgcacaa gtaaggaaga aaaaaacgta aaggaacaga aaaagaatga tgcatgtttc 420
ctaaagagac tactgagaga aataaaaact tgttggaata aaattttgaa gggcagtata 480
taaggccgct gtgccttcta gt 502
<210> 28
<211> 445
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5 改进的 SV40 wt 空
<400> 28
aataaaaggt ttattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc 60
ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag 120
tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 180
atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 240
ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 300
gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt 360
tgcaaagatt taaataactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagaatcgtt 420
tgtgttatgt ttcaacgtgt ttatt 445
<210> 29
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5 改进的 EF1A 空
<400> 29
aataaaaggt ttattaggcg gcctccccgt caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga 60
gctgagagta attcatacaa aaggactcgc ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg 120
ttaaactccc actaacgtag aacccagaga tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg 180
ctctcgtcat cactgaggtg gagaagagca tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc 240
agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg 300
tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct 360
ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt 420
tcgcaacggg tttgccgcca gaacacaatt taaataactt gtttattgca gcttataatg 480
gttacaaata aagaatcgtt tgtgttatgt ttcaacgtgt ttatt 525
<210> 30
<211> 502
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL7 no poly-A
<400> 30
atagggagac ccgcggccat gttccatgtt tcttttagat atatctttgg aattcctcca 60
ctgatccttg ttctgctgcc tgtcacatca tctgagtgcc acattaaaga caaagaaggt 120
aaagcatatg agagtgtact gatgatcagc atcgatgaat tggacaaaat gacaggaact 180
gatagtaatt gcccgaataa tgaaccaaac ttttttagaa aacatgtatg tgatgataca 240
aaggaagctg cttttctaaa tcgtgctgct cgcaagttga agcaatttct taaaatgaat 300
atcagtgaag aattcaatgt ccacttacta acagtatcac aaggcacaca aacactggtg 360
aactgcacaa gtaaggaaga aaaaaacgta aaggaacaga aaaagaatga tgcatgtttc 420
ctaaagagac tactgagaga aatcaaaact tgttggaaca aaattttgaa gggcagtata 480
taaggccgct gtgccttcta gt 502
<210> 31
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mGMCSF Kozak
<400> 31
atttgccacc atgtggctgc agaatttact tttcctgggc attgtggtct acagcctctc 60
agcacccacc cgctcaccca tcactgtcac ccggccttgg aagcatgtag aggccatcaa 120
agaagccctg aacctcctgg atgacatgcc tgtcacgttg aatgaagagg tagaagtcgt 180
ctctaacgag ttctccttca agaagctaac atgtgtgcag acccgcctga agatattcga 240
gcagggtcta cggggcaatt tcaccaaact caagggcgcc ttgaacatga cagccagcta 300
ctaccagaca tactgccccc caactccgga aacggactgt gaaacacaag ttaccaccta 360
tgcggatttc atagacagcc ttaaaacctt tctgactgat atcccctttg aatgcaaaaa 420
accaggccaa aaatgaaaat aacttgttta ttgcag 456
<210> 32
<211> 591
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 腺病毒死亡蛋白
<400> 32
gaaaatgcct taatttacta agttacaaag ctaatgtcac cactaactgc tttactcgct 60
gcttgcaaaa caaattcaaa aagttagcat tataattaga ataggattta aaccccccgg 120
tcatttcctg ctcaatacca ttcccctgaa caattgactc tatgtgggat atgctccagc 180
gctacaacct tgaagtcagg cttcctggat gtcagcatct gactttggcc agcacctgtc 240
ccgcggattt gttccagtcc aactacagcg acccacccta acagagatga ccaacacaac 300
caacgcggcc gccgctaccg gacttacatc taccacaaat acaccccaag tttctgcctt 360
tgtcaataac tgggataact tgggcatgtg gtggttctcc atagcgctta tgtttgtatg 420
ccttattatt atgtggctca tctgctgcct aaagcgcaaa cgcgcccgac cacccatcta 480
tagtcccatc attgtgctac acccaaacaa tgatggaatc catagattgg acggactgaa 540
acacatgttc ttttctctta cagtatgata ataaaaaaaa ataataaagc a 591
<210> 33
<211> 4509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Costim IRES
<400> 33
atctgacctc gtcgacatgg cttgcaattg tcagttgatg caggatacac cactcctcaa 60
gtttccatgt ccaaggctca ttcttctctt tgtgctgctg attcgtcttt cacaagtgtc 120
ttcagatgtt gatgaacaac tgtccaagtc agtgaaagat aaggtattgc tgccttgccg 180
ttacaactct cctcatgaag atgagtctga agaccgaatc tactggcaaa aacatgacaa 240
agtggtgctg tctgtcattg ctgggaaact aaaagtgtgg cccgagtata agaaccggac 300
tttatatgac aacactacct actctcttat catcctgggc ctggtccttt cagaccgggg 360
cacatacagc tgtgtcgttc aaaagaagga aagaggaacg tatgaagtta aacacttggc 420
tttagtaaag ttgtccatca aagctgactt ctctaccccc aacataactg agtctggaaa 480
cccatctgca gacactaaaa ggattacctg ctttgcttcc gggggtttcc caaagcctcg 540
cttctcttgg ttggaaaatg gaagagaatt acctggcatc aatacgacaa tttcccagga 600
tcctgaatct gaattgtaca ccattagtag ccaactagat ttcaatacga ctcgcaacca 660
caccattaag tgtctcatta aatatggaga tgctcacgtg tcagaggact tcacctggga 720
aaaaccccca gaagaccctc ctgatagcaa gaacacactt gtgctctttg gggcaggatt 780
cggcgcagta ataacagtcg tcgtcatcgt tgtcatcatc aaatgcttct gtaagcacag 840
aagctgtttc agaagaaatg aggcaagcag agaaacaaac aacagcctta ccttcgggcc 900
tgaagaagca ttagctgaac agaccgtctt cctttagtaa cgttactggc cgaagccgct 960
tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg 1020
gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 1080
cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 1140
aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 1200
ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 1260
cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 1320
caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 1380
atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aacgtctagg 1440
ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat atggaccagc 1500
acacacttga tgtggaggat accgcggatg ccagacatcc agcaggtact tcgtgcccct 1560
cggatgcggc gctcctcaga gataccgggc tcctcgcgga cgctgcgctc ctctcagata 1620
ctgtgcgccc cacaaatgcc gcgctcccca cggatgctgc ctaccctgcg gttaatgttc 1680
gggatcgcga ggccgcgtgg ccgcctgcac tgaacttctg ttcccgccac ccaaagctct 1740
atggcctagt cgctttggtt ttgctgcttc tgatcgccgc ctgtgttcct atcttcaccc 1800
gcaccgagcc tcggccagcg ctcacaatca ccacctcgcc caacctgggt acccgagaga 1860
ataatgcaga ccaggtcacc cctgtttccc acattggctg ccccaacact acacaacagg 1920
gctctcctgt gttcgccaag ctactggcta aaaaccaagc atcgttgtgc aatacaactc 1980
tgaactggca cagccaagat ggagctggga gctcatacct atctcaaggt ctgaggtacg 2040
aagaagacaa aaaggagttg gtggtagaca gtcccgggct ctactacgta tttttggaac 2100
tgaagctcag tccaacattc acaaacacag gccacaaggt gcagggctgg gtctctcttg 2160
ttttgcaagc aaagcctcag gtagatgact ttgacaactt ggccctgaca gtggaactgt 2220
tcccttgctc catggagaac aagttagtgg accgttcctg gagtcaactg ttgctcctga 2280
aggctggcca ccgcctcagt gtgggtctga gggcttatct gcatggagcc caggatgcat 2340
acagagactg ggagctgtct tatcccaaca ccaccagctt tggactcttt cttgtgaaac 2400
ccgacaaccc atgggaatga ggtttccaca actgataaaa ctcgtgcaac ttgaaactcc 2460
gcctggtctt tccaggtcta gaggggttac actttgtact gtgctcgact ccacgcccgg 2520
tccactggcg ggtgttagta gcagcactgt tgtttcgtag cggagcatgg tggccgtggg 2580
aactcctcct tggtgacaag ggcccacggg gccgaaagcc acgtccagac ggacccacca 2640
tgtgtgcaac cccagcacgg caacttttac tgcgaacacc accttaaggt gacactggta 2700
ctggtactcg gtcactggtg acaggctaag gatgcccttc aggtaccccg aggtaacacg 2760
ggacactcgg gatctgagaa ggggattggg acttctttaa aagtgcccag tttaaaaagc 2820
ttctacgcct gaataggcga ccggaggccg gcgcctttcc attacccact actaaatcca 2880
tggcttcaac ccgtgccaag cccacgctac ctctgctcct ggccctggtc accgttgtga 2940
tccctgggcc tggtgatgct caggtatcca tccatcccag agaagccttc ctgccccagg 3000
gtgggtccgt gcaggtgaac tgttcttcct catgcaagga ggacctcagc ctgggcttgg 3060
agactcagtg gctgaaagat gagctcgaga gtggacccaa ctggaagctg tttgagctga 3120
gcgagatcgg ggaggacagc agtccgctgt gctttgagaa ctgtggcacc gtgcagtcgt 3180
ccgcttccgc taccatcacc gtgtattcgt ttccggagag tgtggagctg agacctctgc 3240
cagcctggca gcaagtaggc aaggacctca ccctgcgctg ccacgtggat ggtggagcac 3300
cgcggaccca gctctcagca gtgctgctcc gtggggagga gatactgagc cgccagccag 3360
tgggtgggca ccccaaggac cccaaggaga tcacattcac ggtgctggct agcagagggg 3420
accacggagc caatttctca tgccgcacag aactggatct caggccgcaa gggctggcat 3480
tgttctctaa tgtctccgag gccaggagcc tccggacttt cgatcttcca gctaccatcc 3540
caaagctcga cacccctgac ctcctggagg tgggcaccca gcagaagttg ttttgctccc 3600
tggaaggcct gtttcctgcc tctgaagctc ggatatacct ggagctggga ggccagatgc 3660
cgacccagga gagcacaaac agcagtgact ctgtgtcagc cactgccttg gtagaggtga 3720
ctgaggagtt cgacagaacc ctgccgctgc gctgcgtttt ggagctagcg gaccagatcc 3780
tggagacgca gaggacctta acagtctaca acttttcagc tccggtcctg accctgagcc 3840
agctggaggt ctcggaaggg agccaagtaa ctgtgaagtg tgaagcccac agtgggtcga 3900
aggtggttct tctgagcggc gtcgagccta ggccacccac cccgcaggtc caattcacac 3960
tgaatgccag ctcggaggat cacaaacgaa gcttcttttg ctctgccgct ctggaggtgg 4020
cgggaaagtt cctgtttaaa aaccagaccc tggaactgca cgtgctgtat ggtcctcggc 4080
tggacgagac ggactgcttg gggaactgga cctggcaaga ggggtctcag cagactctga 4140
aatgccaggc ctgggggaac ccatctccta agatgacctg cagacggaag gcagatggtg 4200
ccctgctgcc catcggggtg gtgaagtctg tcaaacagga gatgaatggt acatacgtgt 4260
gccatgcctt tagctcccat gggaatgtca ccaggaatgt gtacctgaca gtactgtacc 4320
actctcaaaa taactggact ataatcattc tggtgccagt actgctggtc attgtgggcc 4380
tcgtgatggc agcctcttat gtttataacc gccagagaaa gatcaggata tacaagttac 4440
agaaggctca ggaggaggcc ataaaactca agggacaagc cccacctccc tgactcgagt 4500
caccaggcg 4509
<210> 34
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19k mCD80
<400> 34
atctgacctc atggcttgca attgtcagtt gatgcaggat acaccactcc tcaagtttcc 60
atgtccaagg ctcattcttc tctttgtgct gctgattcgt ctttcacaag tgtcttcaga 120
tgttgatgaa caactgtcca agtcagtgaa agataaggta ttgctgcctt gccgttacaa 180
ctctcctcat gaagatgagt ctgaagaccg aatctactgg caaaaacatg acaaagtggt 240
gctgtctgtc attgctggga aactaaaagt gtggcccgag tataagaacc ggactttata 300
tgacaacact acctactctc ttatcatcct gggcctggtc ctttcagacc ggggcacata 360
cagctgtgtc gttcaaaaga aggaaagagg aacgtatgaa gttaaacact tggctttagt 420
aaagttgtcc atcaaagctg acttctctac ccccaacata actgagtctg gaaacccatc 480
tgcagacact aaaaggatta cctgctttgc ttccgggggt ttcccaaagc ctcgcttctc 540
ttggttggaa aatggaagag aattacctgg catcaatacg acaatttccc aggatcctga 600
atctgaattg tacaccatta gtagccaact agatttcaat acgactcgca accacaccat 660
taagtgtctc attaaatatg gagatgctca cgtgtcagag gacttcacct gggaaaaacc 720
cccagaagac cctcctgata gcaagaacac acttgtgctc tttggggcag gattcggcgc 780
agtaataaca gtcgtcgtca tcgttgtcat catcaaatgc ttctgtaagc acagaagctg 840
tttcagaaga aatgaggcaa gcagagaaac aaacaacagc cttaccttcg ggcctgaaga 900
agcattagct gaacagaccg tcttccttta gtcaggtgaa tctgggtcac c 951
<210> 35
<211> 967
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IX mCD137L
<400> 35
atagggagac ccgcggccat ggaccagcac acacttgatg tggaggatac cgcggatgcc 60
agacatccag caggtacttc gtgcccctcg gatgcggcgc tcctcagaga taccgggctc 120
ctcgcggacg ctgcgctcct ctcagatact gtgcgcccca caaatgccgc gctccccacg 180
gatgctgcct accctgcggt taatgttcgg gatcgcgagg ccgcgtggcc gcctgcactg 240
aacttctgtt cccgccaccc aaagctctat ggcctagtcg ctttggtttt gctgcttctg 300
atcgccgcct gtgttcctat cttcacccgc accgagcctc ggccagcgct cacaatcacc 360
acctcgccca acctgggtac ccgagagaat aatgcagacc aggtcacccc tgtttcccac 420
attggctgcc ccaacactac acaacagggc tctcctgtgt tcgccaagct actggctaaa 480
aaccaagcat cgttgtgcaa tacaactctg aactggcaca gccaagatgg agctgggagc 540
tcatacctat ctcaaggtct gaggtacgaa gaagacaaaa aggagttggt ggtagacagt 600
cccgggctct actacgtatt tttggaactg aagctcagtc caacattcac aaacacaggc 660
cacaaggtgc agggctgggt ctctcttgtt ttgcaagcaa agcctcaggt agatgacttt 720
gacaacttgg ccctgacagt ggaactgttc ccttgctcca tggagaacaa gttagtggac 780
cgttcctgga gtcaactgtt gctcctgaag gctggccacc gcctcagtgt gggtctgagg 840
gcttatctgc atggagccca ggatgcatac agagactggg agctgtctta tcccaacacc 900
accagctttg gactctttct tgtgaaaccc gacaacccat gggaatgagg ccgctgtgcc 960
ttctagt 967
<210> 36
<211> 1649
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L5 mICAM1
<400> 36
cgccagaaca catttatggc ttcaacccgt gccaagccca cgctacctct gctcctggcc 60
ctggtcaccg ttgtgatccc tgggcctggt gatgctcagg tatccatcca tcccagagaa 120
gccttcctgc cccagggtgg gtccgtgcag gtgaactgtt cttcctcatg caaggaggac 180
ctcagcctgg gcttggagac tcagtggctg aaagatgagc tcgagagtgg acccaactgg 240
aagctgtttg agctgagcga gatcggggag gacagcagtc cgctgtgctt tgagaactgt 300
ggcaccgtgc agtcgtccgc ttccgctacc atcaccgtgt attcgtttcc ggagagtgtg 360
gagctgagac ctctgccagc ctggcagcaa gtaggcaagg acctcaccct gcgctgccac 420
gtggatggtg gagcaccgcg gacccagctc tcagcagtgc tgctccgtgg ggaggagata 480
ctgagccgcc agccagtggg tgggcacccc aaggacccca aggagatcac attcacggtg 540
ctggctagca gaggggacca cggagccaat ttctcatgcc gcacagaact ggatctcagg 600
ccgcaagggc tggcattgtt ctctaatgtc tccgaggcca ggagcctccg gactttcgat 660
cttccagcta ccatcccaaa gctcgacacc cctgacctcc tggaggtggg cacccagcag 720
aagttgtttt gctccctgga aggcctgttt cctgcctctg aagctcggat atacctggag 780
ctgggaggcc agatgccgac ccaggagagc acaaacagca gtgactctgt gtcagccact 840
gccttggtag aggtgactga ggagttcgac agaaccctgc cgctgcgctg cgttttggag 900
ctagcggacc agatcctgga gacgcagagg accttaacag tctacaactt ttcagctccg 960
gtcctgaccc tgagccagct ggaggtctcg gaagggagcc aagtaactgt gaagtgtgaa 1020
gcccacagtg ggtcgaaggt ggttcttctg agcggcgtcg agcctaggcc acccaccccg 1080
caggtccaat tcacactgaa tgccagctcg gaggatcaca aacgaagctt cttttgctct 1140
gccgctctgg aggtggcggg aaagttcctg tttaaaaacc agaccctgga actgcacgtg 1200
ctgtatggtc ctcggctgga cgagacggac tgcttgggga actggacctg gcaagagggg 1260
tctcagcaga ctctgaaatg ccaggcctgg gggaacccat ctcctaagat gacctgcaga 1320
cggaaggcag atggtgccct gctgcccatc ggggtggtga agtctgtcaa acaggagatg 1380
aatggtacat acgtgtgcca tgcctttagc tcccatggga atgtcaccag gaatgtgtac 1440
ctgacagtac tgtaccactc tcaaaataac tggactataa tcattctggt gccagtactg 1500
ctggtcattg tgggcctcgt gatggcagcc tcttatgttt ataaccgcca gagaaagatc 1560
aggatataca agttacagaa ggctcaggag gaggccataa aactcaaggg acaagcccca 1620
cctccctgaa aataacttgt ttattgcag 1649
<210> 37
<211> 72
<212> DNA
<213> 人腺病毒35
<400> 37
aataaaaaaa attccagaat caatgaataa ataaacgagc ttgttgttga tttaaaatca 60
agtgttttta tt 72
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人腺病毒35
<400> 38
aataaagttt aagtgttttt att 23
<210> 39
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ad35 IX-E2盒
<400> 39
tcgagatcgg tggtccaggg cataccgtgc gcgaaaaatg aaataaaata cacctttttt 60
cgattgtacg tatttttatt tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 120
cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 180
tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 240
catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 300
gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 360
gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 420
tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa 480
aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 540
aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctctct ggctaactag agaacccact 600
gcttactggc ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccgcgg ccgctgtgcc 660
ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 720
tgccactccc actgtccttt cctaataaaa acacttgatt ttaaatcaac aacaagctcg 780
tttatttat 789
<210> 40
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ad35 L5-E4盒
<400> 40
tttcttttct tacattacag aagacgacaa ctaaaataaa aggtttatta ggcggcctcc 60
ccgtcaccac cccccccaac ccgccccgac cggagctgag agtaattcat acaaaaggac 120
tcgcccctgc cttggggaat cccagggacc gtcgttaaac tcccactaac gtagaaccca 180
gagatcgctg cgttcccgcc ccctcacccg cccgctctcg tcatcactga ggtggagaag 240
agcatgcgtg aggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 300
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 360
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 420
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 480
aatttaaata acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagttt aagtgttttt 540
atttaaaatc acaaaattcg 560
<210> 41
<211> 34794
<212> DNA
<213> 人腺病毒35
<400> 41
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtt 180
acgcataaaa aggcttcttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgtg aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aaggattaga attagatccg cctttggaca ctttcaatac 840
tccaggggtg attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga tattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaga aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaga gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagagcgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcca gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
agaggatgat tgggcggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag atcagtagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa gacagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctgga gtagtcggta tggaagcagt cacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac gggggtgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattc caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgtca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttaattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgtggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgttga ccaagtgcac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tctttgacat gaacacgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tgcgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ccgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gacatgagtg gaaatgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gttcaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ccgctgccgc cgcctctgtc gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcgtggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctacact gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg ccgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaaat tccagaatca atgaataaat aaacgagctt gttgttgatt taaaatcaag 3960
tgtttttatt tcatttttcg cgcacggtat gccctggacc accgatctcg atcattgaga 4020
actcggtgga ttttttccag aatcctatag aggtgggatt gaatgtttag atacatgggc 4080
attaggccgt ctttggggtg gagatagctc cattgaaggg attcatgctc cggggtagtg 4140
ttgtaaatca cccagtcata acaaggtcgc agtgcatggt gttgcacaat atcttttaga 4200
agtaggctga ttgccacaga taagcccttg gtgtaggtgt ttacaaaccg gttgagctgg 4260
gaggggtgca ttcgaggtga aattatgtgc attttggatt ggatttttaa gttggcaata 4320
ttgccgccaa gatcccgtct tgggttcatg ttatgaagga ctaccaagac ggtgtatccg 4380
gtacatttag gaaatttatc gtgcagcttg gatggaaaag cgtggaaaaa tttggagaca 4440
cccttgtgtc ctccgagatt ttccatgcac tcatccatga taatagcaat ggggccgtgg 4500
gcagcggcgc gggcaaacac gttccgtggg tctgacacat catagttatg ttcctgagtt 4560
aaatcatcat aagccatttt aatgaatttg gggcggagcg taccagattg gggtatgaat 4620
gttccttcgg gccccggagc atagttcccc tcacagattt gcatttccca agctttcagt 4680
tctgagggtg gaatcatgtc cacctggggg gctatgaaga acaccgtttc gggggcgggg 4740
gtgattagtt gggatgatag caagtttctg agcaattgag atttgccaca tccggtgggg 4800
ccataaataa ttccgattac aggttgcagg tggtagttta gggaacggca actgccgtct 4860
tctcgaagca agggggccac ctcgttcatc atttccctta catgcatatt ttcccgcacc 4920
aaatccatta ggaggcgctc tcctcctagt gatagaagtt cttgtagtga ggaaaagttt 4980
ttcagcggtt ttagaccgtc agccatgggc attttggaaa gagtttgctg caaaagttct 5040
agtctgttcc acagttcagt gatgtgttct atggcatctc gatccagcag acctcctcgt 5100
ttcgcgggtt tggacggctc ctggagtagg gtatgagacg atgggcgtcc agcgctgcca 5160
gggttcggtc cttccagggt ctcagtgttc gagtcagggt tgtttccgtc acagtgaagg 5220
ggtgtgcgcc tgcttgggcg cttgccaggg tgcgcttcag actcattctg ctggtggaga 5280
acttctgtcg cttggcgccc tgtatgtcgg ccaagtagca gtttaccatg agttcgtagt 5340
tgagcgcctc ggctgcgtgg cctttggcgc ggagcttacc tttggaagtt ttcttgcata 5400
ccgggcagta taggcatttc agcgcataca gcttgggcgc aaggaaaatg gattctgggg 5460
agtatgcatc cgcgccgcag gaggcgcaaa cagtttcaca ttccaccagc caggttaaat 5520
ccggttcatt ggggtcaaaa acaagttttc cgccatattt tttgatgcgt ttcttacctt 5580
tggtctccat aagttcgtgt cctcgttgag tgacaaacag gctgtccgta tctccgtaga 5640
ctgattttac aggcctcttc tccagtggag tgcctcggtc ttcttcgtac aggaactctg 5700
accactctga tacaaaggcg cgcgtccagg ccagcacaaa ggaggctatg tgggaggggt 5760
agcgatcgtt gtcaaccagg gggtccacct tttccaaagt atgcaaacac atgtcaccct 5820
cttcaacatc caggaatgtg attggcttgt aggtgtattt cacgtgacct ggggtccccg 5880
ctgggggggt ataaaagggg gcggttcttt gctcttcctc actgtcttcc ggatcgctgt 5940
ccaggaacgt cagctgttgg ggtaggtatt ccctctcgaa ggcgggcatg acctctgcac 6000
tcaggttgtc agtttctaag aacgaggagg atttgatatt gacagtgccg gttgagatgc 6060
ctttcatgag gttttcgtcc atttggtcag aaaacacaat ttttttattg tcaagtttgg 6120
tggcaaatga tccatacagg gcgttggata aaagtttggc aatggatcgc atggtttggt 6180
tcttttcctt gtccgcgcgc tctttggcgg cgatgttgag ttggacatac tcgcgtgcca 6240
ggcacttcca ttcggggaag atagttgtta attcatctgg cacgattctc acttgccacc 6300
ctcgattatg caaggtaatt aaatccacac tggtggccac ctcgcctcga aggggttcat 6360
tggtccaaca gagcctacct cctttcctag aacagaaagg gggaagtggg tctagcataa 6420
gttcatcggg agggtctgca tccatggtaa agattcccgg aagtaaatcc ttatcaaaat 6480
agctgatggg agtggggtca tctaaggcca tttgccattc tcgagctgcc agtgcgcgct 6540
catatgggtt aaggggactg ccccagggca tgggatgggt gagagcagag gcatacatgc 6600
cacagatgtc atagacgtag atgggatcct caaagatgcc tatgtaggtt ggatagcatc 6660
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ccggacccaa gttggtgcga ttgggttttt ctgttctgta gacgatctgg cgaaagatgg 6780
cgtgagaatt ggaagagatg gtgggtcttt gaaaaatgtt gaaatgggca tgaggtagac 6840
ctacagagtc tctgacaaag tgggcataag attcttgaag cttggttacc agttcggcgg 6900
tgacaagtac gtctagggcg cagtagtcaa gtgtttcttg aatgatgtca taacctggtt 6960
ggtttttctt ttcccacagt tcgcggttga gaaggtattc ttcgcgatcc ttccagtact 7020
cttctagcgg aaacccgtct ttgtctgcac ggtaagatcc tagcatgtag aactgattaa 7080
ctgccttgta agggcagcag cccttctcta cgggtagaga gtatgcttga gcagcttttc 7140
gtagcgaagc gtgagtaagg gcaaaggtgt ctctgaccat gactttgaga aattggtatt 7200
tgaagtccat gtcgtcacag gctccctgtt cccagagttg gaagtctacc cgtttcttgt 7260
aggcggggtt gggcaaagcg aaagtaacat cattgaagag aatcttaccg gctctgggca 7320
taaaattgcg agtgatgcgg aaaggctgtg gtacttccgc tcgattgttg atcacctggg 7380
cagctaggac gatttcgtcg aaaccgttga tgttgtgtcc tacgatgtat aattctatga 7440
aacgcggcgt gcctctgacg tgaggtagct tactgagctc atcaaaggtt aggtctgtgg 7500
ggtcagataa ggcgtagtgt tcgagagccc attcgtgcag gtgaggattt gcatgtagga 7560
atgatgacca aagatctacc gccagtgctg tttgtaactg gtcccgatac tgacgaaaat 7620
gccggccaat tgccattttt tctggagtga cacagtagaa ggttctgggg tcttgttgcc 7680
atcgatccca cttgagttta atggctagat cgtgggccat gttgacgaga cgctcttctc 7740
ctgagagttt catgaccagc atgaaaggaa ctagttgttt gccaaaggat cccatccagg 7800
tgtaagtttc cacatcgtag gtcaggaaga gtctttctgt gcgaggatga gagccgatcg 7860
ggaagaactg gatttcctgc caccagttgg aggattggct gttgatgtga tggaagtaga 7920
agtttctgcg gcgcgccgag cattcgtgtt tgtgcttgta cagacggccg cagtagtcgc 7980
agcgttgcac gggttgtatc tcgtgaatga gctgtacctg gcttcccttg acgagaaatt 8040
tcagtgggaa gccgaggcct ggcgattgta tctcgtgctc ttctatattc gctgtatcgg 8100
cctgttcatc ttctgtttcg atggtggtca tgctgacgag cccccgcggg aggcaagtcc 8160
agacctcggc gcgggagggg cggagctgaa ggacgagagc gcgcaggctg gagctgtcca 8220
gagtcctgag acgctgcgga ctcaggttag taggtaggga cagaagatta acttgcatga 8280
tcttttccag ggcgtgcggg aggttcagat ggtacttgat ttccacaggt tcgtttgtag 8340
agacgtcaat ggcttgcagg gttccgtgtc ctttgggcgc cactaccgta cctttgtttt 8400
ttcttttgat cggtggtggc tctcttgctt cttgcatgct cagaagcggt gacggggacg 8460
cgcgccgggc ggcagcggtt gttccggacc cgggggcatg gctggtagtg gcacgtcggc 8520
gccgcgcacg ggcaggttct ggtattgcgc tctgagaaga cttgcgtgcg ccaccacgcg 8580
tcgattgacg tcttgtatct gacgtctctg ggtgaaagct accggccccg tgagcttgaa 8640
cctgaaagag agttcaacag aatcaatttc ggtatcgtta acggcagctt gtctcagtat 8700
ttcttgtacg tcaccagagt tgtcctggta ggcgatctcc gccatgaact gctcgatttc 8760
ttcctcctga agatctccgc gacccgctct ttcgacggtg gccgcgaggt cattggagat 8820
acggcccatg agttgggaga atgcattcat gcccgcctcg ttccagacgc ggctgtaaac 8880
cacggccccc tcggagtctc ttgcgcgcat caccacctga gcgaggttaa gctccacgtg 8940
tctggtgaag accgcatagt tgcataggcg ctgaaaaagg tagttgagtg tggtggcaat 9000
gtgttcggcg acgaagaaat acatgatcca tcgtctcagc ggcatttcgc taacatcgcc 9060
cagagcttcc aagcgctcca tggcctcgta gaagtccacg gcaaaattaa aaaactggga 9120
gtttcgcgcg gacacggtca attcctcctc gagaagacgg atgagttcgg ctatggtggc 9180
ccgtacttcg cgttcgaagg ctcccgggat ctcttcttcc tcttctatct cttcttccac 9240
taacatctct tcttcgtctt caggcggggg cggagggggc acgcggcgac gtcgacggcg 9300
cacgggcaaa cggtcgatga atcgttcaat gacctctccg cggcggcggc gcatggtttc 9360
agtgacggcg cggccgttct cgcgcggtcg cagagtaaaa acaccgccgc gcatctcctt 9420
aaagtggtga ctgggaggtt ctccgtttgg gagggagagg gcgctgatta tacattttat 9480
taattggccc gtagggactg cgcgcagaga tctgatcgtg tcaagatcca cgggatctga 9540
aaacctttcg acgaaagcgt ctaaccagtc acagtcacaa ggtaggctga gtacggcttc 9600
ttgtgggcgg gggtggttat gtgttcggtc tgggtcttct gtttcttctt catctcggga 9660
aggtgagacg atgctgctgg tgatgaaatt aaagtaggca gttctaagac ggcggatggt 9720
ggcgaggagc accaggtctt tgggtccggc ttgctggata cgcaggcgat tggccattcc 9780
ccaagcatta tcctgacatc tagcaagatc tttgtagtag tcttgcatga gccgttctac 9840
gggcacttct tcctcacccg ttctgccatg catacgtgtg agtccaaatc cgcgcattgg 9900
ttgtaccagt gccaagtcag ctacgactct ttcggcgagg atggcttgct gtacttgggt 9960
aagggtggct tgaaagtcat caaaatccac aaagcggtgg taagcccctg tattaatggt 10020
gtaagcacag ttggccatga ctgaccagtt aactgtctgg tgaccagggc gcacgagctc 10080
ggtgtattta aggcgcgaat aggcgcgggt gtcaaagatg taatcgttgc aggtgcgcac 10140
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gcaagacccg ggctatgtga caccggtgga acacgaggaa gagttgaaac gctttctaga 23700
gagagaggat gaaaactgcc caaaacagcg agcagataac tatcaccaag atgctggaaa 23760
tagggatcag aacaccgact acctcatagg gcttgacggg gaagacgcgc tccttaaaca 23820
tctagcaaga cagtcgctca tagtcaagga tgcattattg gacagaactg aagtgcccat 23880
cagtgtggaa gagctcagct gcgcctacga gcttaacctt ttttcacctc gtactccccc 23940
caaacgtcag ccaaacggca cctgcgagcc aaatcctcgc ttaaactttt atccagcttt 24000
tgctgtgcca gaagtactgg ctacctatca catctttttt aaaaatcaaa aaattccagt 24060
ctcctgccgc gctaatcgca cccgcgccga tgccctactc aatctgggac ctggttcacg 24120
cttacctgat atagcttcct tggaagaggt tccaaagatc ttcgagggtc tgggcaataa 24180
tgagactcgg gccgcaaatg ctctgcaaaa gggagaaaat ggcatggatg agcatcacag 24240
cgttctggtg gaattggaag gcgataatgc cagactcgca gtactcaagc gaagcgtcga 24300
ggtcacacac ttcgcatatc ccgctgtcaa cctgccccct aaagtcatga cggcggtcat 24360
ggaccagtta ctcattaagc gcgcaagtcc cctttcagaa gacatgcatg acccagatgc 24420
ctgtgatgag ggtaaaccag tggtcagtga tgagcagcta acccgatggc tgggcaccga 24480
ctctccccgg gatttggaag agcgtcgcaa gcttatgatg gccgtggtgc tggttaccgt 24540
agaactagag tgtctccgac gtttctttac cgattcagaa accttgcgca aactcgaaga 24600
gaatctgcac tacactttta gacacggctt tgtgcggcag gcatgcaaga tatctaacgt 24660
ggaactcacc aacctggttt cctacatggg tattctgcat gagaatcgcc taggacaaag 24720
cgtgctgcac agcaccctta agggggaagc ccgccgtgat tacatccgcg attgtgtcta 24780
tctctacctg tgccacacgt ggcaaaccgg catgggtgta tggcagcaat gtttagaaga 24840
acagaacttg aaagagcttg acaagctctt acagaaatct cttaaggttc tgtggacagg 24900
gttcgacgag cgcaccgtcg cttccgacct ggcagacctc atcttcccag agcgtctcag 24960
ggttactttg cgaaacggat tgcctgactt tatgagccag agcatgctta acaattttcg 25020
ctctttcatc ctggaacgct ccggtatcct gcccgccacc tgctgcgcac tgccctccga 25080
ctttgtgcct ctcacctacc gcgagtgccc cccgccgcta tggagtcact gctacctgtt 25140
ccgtctggcc aactatctct cctaccactc ggatgtgatc gaggatgtga gcggagacgg 25200
cttgctggag tgccactgcc gctgcaatct gtgcacgccc caccggtccc tagcttgcaa 25260
cccccagttg atgagcgaaa cccagataat aggcaccttt gaattgcaag gccccagcag 25320
ccaaggcgat gggtcttctc ctgggcaaag tttaaaactg accccgggac tgtggacctc 25380
cgcctacttg cgcaagtttg ctccggaaga ttaccacccc tatgaaatca agttctatga 25440
ggaccaatca cagcctccaa aggccgaact ttcggcttgc gtcatcaccc agggggcaat 25500
tctggcccaa ttgcaagcca tccaaaaatc ccgccaagaa tttctactga aaaagggtaa 25560
gggggtctac cttgaccccc agaccggcga ggaactcaac acaaggttcc ctcaggatgt 25620
cccaacgacg agaaaacaag aagttgaagg tgcagccgcc gcccccagaa gatatggagg 25680
aagattggga cagtcaggca gaggaggcgg aggaggacag tctggaggac agtctggagg 25740
aagacagttt ggaggaggaa aacgaggagg cagaggaggt ggaagaagta accgccgaca 25800
aacagttatc ctcggctgcg gagacaagca acagcgctac catctccgct ccgagtcgag 25860
gaacccggcg gcgtcccagc agtagatggg acgagaccgg acgcttcccg aacccaacca 25920
gcgcttccaa gaccggtaag aaggatcggc agggatacaa gtcctggcgg gggcataaga 25980
atgccatcat ctcctgcttg catgagtgcg ggggcaacat atccttcacg cggcgctact 26040
tgctattcca ccatggggtg aactttccgc gcaatgtttt gcattactac cgtcacctcc 26100
acagccccta ctatagccag caaatcccga cagtctcgac agataaagac agcggcggcg 26160
acctccaaca gaaaaccagc agcggcagtt agaaaataca caacaagtgc agcaacagga 26220
ggattaaaga ttacagccaa cgagccagcg caaacccgag agttaagaaa tcggatcttt 26280
ccaaccctgt atgccatctt ccagcagagt cggggtcaag agcaggaact gaaaataaaa 26340
aaccgatctc tgcgttcgct caccagaagt tgtttgtatc acaagagcga agatcaactt 26400
cagcgcactc tcgaggacgc cgaggctctc ttcaacaagt actgcgcgct gactcttaaa 26460
gagtaggcag cgaccgcgct tattcaaaaa aggcgggaat tacatcatcc tcgacatgag 26520
taaagaaatt cccacgcctt acatgtggag ttatcaaccc caaatgggat tggcagcagg 26580
cgcctcccag gactactcca cccgcatgaa ttggctcagc gccgggcctt ctatgatttc 26640
tcgagttaat gatatacgcg cctaccgaaa ccaaatactt ttggaacagt cagctcttac 26700
caccacgccc cgccaacacc ttaatcccag aaattggccc gccgccctag tgtaccagga 26760
aagtcccgct cccaccactg tattacttcc tcgagacgcc caggccgaag tccaaatgac 26820
taatgcaggt gcgcagttag ctggcggctc caccctatgt cgtcacaggc ctcggcataa 26880
tataaaacgc ctgatgatca gaggccgagg tatccagctc aacgacgagt cggtgagctc 26940
tccgcttggt ctacgaccag acggaatctt tcagattgcc ggctgcggga gatcttcctt 27000
cacccctcgt caggctgttc tgactttgga aagttcgtct tcgcaacccc gctcgggcgg 27060
aatcgggacc gttcaatttg tagaggagtt tactccctct gtctacttca accccttctc 27120
cggatctcct gggcactacc cggacgagtt cataccgaac ttcgacgcga ttagcgagtc 27180
agtggacggc tacgattgat gtctggtgac gcggctgagc tatctcggct gcgacatcta 27240
gaccactgcc gccgctttcg ctgctttgcc cgggaactta ttgagttcat ctacttcgaa 27300
ctccccaagg atcaccctca aggtccggcc cacggagtgc ggattactat cgaaggcaaa 27360
atagactctc gcctgcaacg aattttctcc cagcggcccg tgctgatcga gcgagaccag 27420
ggaaacacca cggtttccat ctactgcatt tgtaatcacc ccggattgca tgaaagcctt 27480
tgctgtctta tgtgtactga gtttaataaa aactgaatta agactctcct acggactgcc 27540
gcttcttcaa cccggatttt acaaccagaa gaacaaaact tttcctgtcg tccaggactc 27600
tgttaacttc acctttccta ctcacaaact agaagctcaa cgactacacc gcttttccag 27660
aagcattttc cctactaata ctactttcaa aaccggaggt gagctccacg gtctccctac 27720
agaaaaccct tgggtggaag cgggccttgt agtactagga attcttgcgg gtgggcttgt 27780
gattattctt tgctacctat acacaccttg cttcactttc ctagtggtgt tgtggtattg 27840
gtttaaaaaa tggggcccat actagtcttg cttgttttac tttcgctttt ggaaccgggt 27900
tctgccaatt acgatccatg tctagacttt gacccagaaa actgcacact tacttttgca 27960
cccgacacaa gccgcatctg tggagttctt attaagtgcg gatgggaatg caggtccgtt 28020
gaaattacac acaataacaa aacctggaac aataccttat ccaccacatg ggagccagga 28080
gttcccgagt ggtacactgt ctctgtccga ggtcctgacg gttccatccg cattagtaac 28140
aacactttca ttttttctga aatgtgcgat ctggccatgt tcatgagcaa acagtattct 28200
ctatggcctc ctagcaagga caacatcgta acgttctcca ttgcttattg cttgtgcgct 28260
tgccttctta ctgctttact gtgcgtatgc atacacctgc ttgtaaccac tcgcatcaaa 28320
aacgccaata acaaagaaaa aatgccttaa cctctttctg tttacagaca tggcttctct 28380
tacatctctc atatttgtca gcattgtcac tgccgctcac ggacaaacag tcgtctctat 28440
cccactagga cataattaca ctctcatagg acccccaatc acttcagagg tcatctggac 28500
caaactggga agcgttgatt actttgatat aatctgtaac aaaacaaaac caataatagt 28560
aacttgcaac atacaaaatc ttacattgat taatgttagc aaagtttaca gcggttacta 28620
ttatggttat gacagataca gtagtcaata tagaaattac ttggttcgtg ttacccagtt 28680
gaaaaccacg aaaatgccaa atatggcaaa gattcgatcc gatgacaatt ctctagaaac 28740
ttttacatct cccaccacac ccgacgaaaa aaacatccca gattcaatga ttgcaattgt 28800
tgcagcggtg gcagtggtga tggcactaat aataatatgc atgcttttat atgcttgtcg 28860
ctacaaaaag tttcatccta aaaaacaaga tctcctacta aggcttaaca tttaatttct 28920
ttttatacag ccatggtttc cactaccaca ttccttatgc ttactagtct cgcaactctg 28980
acttctgctc gctcacacct cactgtaact ataggctcaa actgcacact aaaaggacct 29040
caaggtggtc atgtcttttg gtggagaata tatgacaatg gatggtttac aaaaccatgt 29100
gaccaacctg gtagattttt ctgcaacggc agagacctaa ccattatcaa cgtgacagca 29160
aatgacaaag gcttctatta tggaaccgac tataaaagta gtttagatta taacattatt 29220
gtactgccat ctaccactcc agcaccccgc acaactactt tctctagcag cagtgtcgct 29280
aacaatacaa tttccaatcc aacctttgcc gcgcttttaa aacgcactgt gaataattct 29340
acaacttcac atacaacaat ttccacttca acaatcagca tcatcgctgc agtgacaatt 29400
ggaatatcta ttcttgtttt taccataacc tactacgcct gctgctatag aaaagacaaa 29460
cataaaggtg atccattact tagatttgat atttaatttg ttcttttttt ttatttacag 29520
tatggtgaac accaatcatg gtacctagaa atttcttctt caccatactc atctgtgctt 29580
ttaatgtttg cgctactttc acagcagtag ccacagcaac cccagactgt ataggagcat 29640
ttgcttccta tgcacttttt gcttttgtta cttgcatctg cgtatgtagc atagtctgcc 29700
tggttattaa ttttttccaa cttctagact ggatccttgt gcgaattgcc tacctgcgcc 29760
accatcccga ataccgcaac caaaatatcg cggcacttct tagactcatc taaaaccatg 29820
caggctatac taccaatatt tttgcttcta ttgcttccct acgctgtctc aaccccagct 29880
gcctatagta ctccaccaga acaccttaga aaatgcaaat tccaacaacc gtggtcattt 29940
cttgcttgct atcgagaaaa atcagaaatc cccccaaatt taataatgat tgctggaata 30000
attaatataa tctgttgcac cataatttca tttttgatat accccctatt tgattttggc 30060
tggaatgctc ccaatgcaca tgatcatcca caagacccag aggaacacat tcccccacaa 30120
aacatgcaac atccaatagc gctaatagat tacgaaagtg aaccacaacc cccactactc 30180
cctgctatta gttacttcaa cctaaccggc ggagatgact gaaacactca ccacctccaa 30240
ttccgccgag gatctgctcg atatggacgg ccgcgtctca gaacaacgac ttgcccaact 30300
acgcatccgc cagcagcagg aacgcgtggc caaagagctc agagatgtca tccaaattca 30360
ccaatgcaaa aaaggcatat tctgtttggt aaaacaagcc aagatatcct acgagatcac 30420
cgctactgac catcgcctct cttacgaact tggcccccaa cgacaaaaat ttacctgcat 30480
ggtgggaatc aaccccatag ttatcaccca acaaagtgga gatactaagg gttgcattca 30540
ctgctcctgc gattccatcg agtgcaccta caccctgctg aagaccctat gcggcctaag 30600
agacctgcta ccaatgaatt aaaaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 30660
gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 30720
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 30780
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 30840
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 30900
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc cagacggagt 30960
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 31020
gggaggggga cttacagtgg atgacactga tggtacctta caagaaaaca tacgtgctac 31080
agcacccatt actaaaaata atcactctgt agaactatcc attggaaatg gattagaaac 31140
tcaaaacaat aaactatgtg ccaaattggg aaatgggtta aaatttaaca acggtgacat 31200
ttgtataaag gatagtatta acaccttatg gactggaata aaccctccac ctaactgtca 31260
aattgtggaa aacactaata caaatgatgg caaacttact ttagtattag taaaaaatgg 31320
agggcttgtt aatggctacg tgtctctagt tggtgtatca gacactgtga accaaatgtt 31380
cacacaaaag acagcaaaca tccaattaag attatatttt gactcttctg gaaatctatt 31440
aactgaggaa tcagacttaa aaattccact taaaaataaa tcttctacag cgaccagtga 31500
aactgtagcc agcagcaaag cctttatgcc aagtactaca gcttatccct tcaacaccac 31560
tactagggat agtgaaaact acattcatgg aatatgttac tacatgacta gttatgatag 31620
aagtctattt cccttgaaca tttctataat gctaaacagc cgtatgattt cttccaatgt 31680
tgcctatgcc atacaatttg aatggaatct aaatgcaagt gaatctccag aaagcaacat 31740
agctacgctg accacatccc cctttttctt ttcttacatt acagaagacg acaactaaaa 31800
taaagtttaa gtgtttttat ttaaaatcac aaaattcgag tagttatttt gcctccacct 31860
tcccatttga cagaatacac caatctctcc ccacgcacag ctttaaacat ttggatacca 31920
ttagagatag acattgtttt agattccaca ttccaaacag tttcagagcg agccaatctg 31980
gggtcagtga tagataaaaa tccatcgcga tagtctttta aagcgctttc acagtccaac 32040
tgctgcggat gcgactccgg agtttggatc acggtcatct ggaagaagaa cgatgggaat 32100
cataatccga aaacggtatc ggacgattgt gtctcatcaa acccacaagc agccgctgtc 32160
tgcgtcgctc cgtgcgactg ctgtttatgg gatcagggtc cacagtttcc tgaagcatga 32220
ttttaatagc ccttaacatc aactttctgg tgcgatgcgc gcagcaacgc attctgattt 32280
cactcaaatc tttgcagtag gtacaacaca ttattacaat attgtttaat aaaccataat 32340
taaaagcgct ccagccaaaa ctcatatctg atataatcgc ccctgcatga ccatcatacc 32400
aaagtttaat ataaattaaa tgacgttccc tcaaaaacac actacccaca tacatgatct 32460
cttttggcat gtgcatatta acaatctgtc tgtaccatgg acaacgttgg ttaatcatgc 32520
aacccaatat aaccttccgg aaccacactg ccaacaccgc tcccccagcc atgcattgaa 32580
gtgaaccctg ctgattacaa tgacaatgaa gaacccaatt ctctcgaccg tgaatcactt 32640
gagaatgaaa aatatctata gtggcacaac atagacataa atgcatgcat cttctcataa 32700
tttttaactc ctcaggattt agaaacatat cccagggaat aggaagctct tgcagaacag 32760
taaagctggc agaacaagga agaccacgaa cacaacttac actatgcata gtcatagtat 32820
cacaatctgg caacagcggg tggtcttcag tcatagaagc tcgggtttca ttttcctcac 32880
aacgtggtaa ctgggctctg gtgtaagggt gatgtctggc gcatgatgtc gagcgtgcgc 32940
gcaaccttgt cataatggag ttgcttcctg acattctcgt attttgtata gcaaaacgcg 33000
gccctggcag aacacactct tcttcgcctt ctatcctgcc gcttagcgtg ttccgtgtga 33060
tagttcaagt acagccacac tcttaagttg gtcaaaagaa tgctggcttc agttgtaatc 33120
aaaactccat cgcatctaat tgttctgagg aaatcatcca cggtagcata tgcaaatccc 33180
aaccaagcaa tgcaactgga ttgcgtttca agcaggagag gagagggaag agacggaaga 33240
accatgttaa tttttattcc aaacgatctc gcagtacttc aaattgtaga tcgcgcagat 33300
ggcatctctc gcccccactg tgttggtgaa aaagcacagc taaatcaaaa gaaatgcgat 33360
tttcaaggtg ctcaacggtg gcttccaaca aagcctccac gcgcacatcc aagaacaaaa 33420
gaataccaaa agaaggagca ttttctaact cctcaatcat catattacat tcctgcacca 33480
ttcccagata attttcagct ttccagcctt gaattattcg tgtcagttct tgtggtaaat 33540
ccaatccaca cattacaaac aggtcccgga gggcgccctc caccaccatt cttaaacaca 33600
ccctcataat gacaaaatat cttgctcctg tgtcacctgt agcgaattga gaatggcaac 33660
atcaattgac atgcccttgg ctctaagttc ttctttaagt tctagttgta aaaactctct 33720
catattatca ccaaactgct tagccagaag ccccccggga acaagagcag gggacgctac 33780
agtgcagtac aagcgcagac ctccccaatt ggctccagca aaaacaagat tggaataagc 33840
atattgggaa ccaccagtaa tatcatcgaa gttgctggaa atataatcag gcagagtttc 33900
ttgtagaaat tgaataaaag aaaaatttgc caaaaaaaca ttcaaaacct ctgggatgca 33960
aatgcaatag gttaccgcgc tgcgctccaa cattgttagt tttgaattag tctgcaaaaa 34020
taaaaaaaaa acaagcgtca tatcatagta gcctgacgaa caggtggata aatcagtctt 34080
tccatcacaa gacaagccac agggtctcca gctcgaccct cgtaaaacct gtcatcgtga 34140
ttaaacaaca gcaccgaaag ttcctcgcgg tgaccagcat gaataagtct tgatgaagca 34200
tacaatccag acatgttagc atcagttaag gagaaaaaac agccaacata gcctttgggt 34260
ataattatgc ttaatcgtaa gtatagcaaa gccacccctc gcggatacaa agtaaaaggc 34320
acaggagaat aaaaaatata attatttctc tgctgctgtt taggcaacgt cgcccccggt 34380
ccctctaaat acacatacaa agcctcatca gccatggctt accagagaaa gtacagcggg 34440
cacacaaacc acaagctcta aagtcactct ccaacctctc cacaatatat atacacaagc 34500
cctaaactga cgtaatggga ctaaagtgta aaaaatcccg ccaaacccaa cacacacccc 34560
gaaactgcgt caccagggaa aagtacagtt tcacttccgc aatcccaaca agcgtcactt 34620
cctctttctc acggtacgtc acatcccatt aacttacaac gtcattttcc cacggccgcg 34680
ccgccccttt taaccgttaa ccccacagcc aatcaccaca cggcccacac tttttaaaat 34740
cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattattgat gatg 34794
<210> 42
<211> 688
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆到具有表达盒的改进的IX-E2位点的NotI限
制性内切位点中的小鼠IL12A
<400> 42
ctatagggag acccgcggcc atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg 60
ccctcctaaa ccacctcagt ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc 120
ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa 180
aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc 240
aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg 300
ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagacgtctt 360
tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt 420
tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg 480
gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc 540
gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc 600
tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct 660
ccgcctgagg ccgctgtgcc ttctagtt 688
<210> 43
<211> 1048
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用EF1A启动子克隆到具有表达盒的L5-E4位点
的SwaI限制性内切位点的小鼠IL12Br
<400> 43
ttgccgccag aacacaattt atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60
ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120
aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180
aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240
ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300
gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360
ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420
ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480
agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540
cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600
atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660
agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720
acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780
agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840
tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900
tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960
ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020
gatcctagaa ataacttgtt tattgcag 1048
<210> 44
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的TATA框
<400> 44
agtgcccg 8
<210> 45
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的TATA框
<400> 45
tattcccg 8
<210> 46
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的CAAT框
<400> 46
ttccgtggcg 10

Claims (153)

1.一种重组腺病毒，包含：***到***位点中的核苷酸序列，其中所述***位点位于第一病毒转录单元的终止密码子和第二病毒转录单元的终止密码子之间，
其中与所述第一病毒转录单元的起始位点距离所述第二病毒转录单元的终止密码子相比，所述第一病毒转录单元的终止密码子更靠近所述第二病毒转录单元的终止密码子，
其中与所述第二病毒转录单元的起始位点距离所述第一病毒转录单元的终止密码子相比，所述第二病毒转录单元的终止密码子更靠近所述第一病毒转录单元的终止密码子，和
其中在***所述核苷酸序列之前，在所述第一病毒转录单元和所述第二病毒转录单元之间没有病毒转录单元。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述第一病毒转录单元是腺病毒IX基因，并且所述第二病毒转录单元是腺病毒IVa2基因。
3.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述第一病毒转录单元是腺病毒纤维基因，并且所述第二病毒转录单元是腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7。
4.一种重组腺病毒，包含：***到IX-E2***位点中的核苷酸序列，其中所述IX-E2***位点位于腺病毒IX基因的终止密码子和腺病毒IVa2基因的终止密码子之间。
5.如权利要求1、2和4中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029到4093位的核苷酸之间。
6.如权利要求1、2和4中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899到3970位的核苷酸之间。
7.如权利要求1、2、4和5中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029和4050位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ IDNO:1)的4050和4070位的核苷酸之间或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4070和4093位的核苷酸之间。
8.如权利要求中任一项所述的重组腺病毒1、2、4和6，其中所述核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899和3920位的核苷酸之间，对应于Ad35基因组(SEQID NO:41)的3920和3940位的核苷酸之间或对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3940和3970位的核苷酸之间。
9.一种重组腺病毒，包含：***到L5-E4***位点中的核苷酸序列，其中所述L5-E4***位点位于腺病毒纤维基因的终止密码子和腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的终止密码子之间。
10.如权利要求1、3和9中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32916位的核苷酸之间。
11.如权利要求1、3、9和10中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785和32800位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQID NO:1)的32800和32820位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32820和32840位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32840和32860位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32860和32880核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ IDNO:1)的32880和32900位的核苷酸之间或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32900和32916位的核苷酸之间。
12.如权利要求1、3和9中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的31799和31821位的核苷酸之间。
13.如权利要求中1、3、9和12中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的31799和32810位的核苷酸之间或对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的32810和31821位的核苷酸之间。
14.一种重组腺病毒，包含：***到IX-E2***位点中的第一核苷酸序列和***到L5-E4***位点中的第二核苷酸序列，其中所述IX-E2***位点位于腺病毒IX基因的终止密码子和腺病毒IVa2基因的终止密码子之间和其中所述L5-E4***位点位于腺病毒纤维基因的终止密码子和腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的终止密码子之间。
15.如权利要求14所述的重组腺病毒，其中所述第一核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029和4093位的核苷酸之间。
16.如权利要求14或权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述第一核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4029和4050位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQID NO:1)的4050和4070位的核苷酸之间或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的4070和4093位的核苷酸之间。
17.如权利要求14所述的重组腺病毒，其中所述第一核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899和3970位的核苷酸之间。
18.如权利要求14或权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述第一核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3899和3920位的核苷酸之间，对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3920和3940位的核苷酸之间或对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的3940和3970位的核苷酸之间。
19.如权利要求14-18中任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785到32916位的核苷酸之间。
20.如权利要求14-19中任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32785和32800位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQID NO:1)的32801和32820位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32821和32840位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32841和32860位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32861和32880，对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32881和32900位的核苷酸之间或对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的32901和32916位的核苷酸之间。
21.如权利要求14-18中任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二核苷酸序列被***到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:41)的31799和31821位的核苷酸之间。
22.如权利要求14-18和21中任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二核苷酸序列被***到对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的31799和32810位的核苷酸之间或对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的32810和31821位的核苷酸之间。
23.如权利要求4-8和14-22中任一项所述的重组腺病毒，其中所述IX-E2***位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸的缺失。
24.如权利要求9-23中任一项所述的重组腺病毒，其中所述L5-E4***位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个核苷酸的缺失。
25.如权利要求1-24中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列包含至少一个转基因。
26.如权利要求所述25的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列进一步包含启动子，其中所述转基因可操作地连接到所述启动子。
27.如权利要求1-26中任一项所述的重组腺病毒，其以5’到3’的方向包含：
(i)第一聚腺苷酸化信号；
(ii)启动子；
(iii)转基因；
(iv)第二聚腺苷酸化信号；和
(v)第三聚腺苷酸化信号；
其中所述转基因可操作地连接到所述启动子，其中所述转基因***到所述第一聚腺苷酸化信号和所述第三聚腺苷酸化信号之间。
28.如权利要求27所述的重组腺病毒，其中所述第一聚腺苷酸化信号是所述纤维(L5)基因的聚腺苷酸化信号，所述第二聚腺苷酸化信号是所述转基因的聚腺苷酸化信号，并且所述第三聚腺苷酸化信号是所述腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的聚腺苷酸化信号，或者所述第一聚腺苷酸化信号是所述IX基因的聚腺苷酸化信号，所述第二聚腺苷酸化信号是所述转基因的聚腺苷酸化信号，并且所述第三聚腺苷酸化信号是所述腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
29.如权利要求1-26中任一项所述的重组腺病毒，其以5’到3’的方向包含：
(i)第一聚腺苷酸化信号；
(ii)第二聚腺苷酸化信号；
(iii)启动子；
(iv)转基因；
(v)第三聚腺苷酸化信号；和
(vi)第四聚腺苷酸化信号；
其中所述转基因可操作地连接到所述启动子，其中所述转基因***到所述第一聚腺苷酸化信号和所述第四聚腺苷酸化信号之间，和其中所述第二聚腺苷酸化信号位于所述第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。
30.如权利要求29所述的重组腺病毒，其中所述第一聚腺苷酸化信号是所述纤维(L5)基因的聚腺苷酸化信号，所述第三聚腺苷酸化信号是所述转基因的聚腺苷酸化信号，并且所述第四聚腺苷酸化信号是所述腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的聚腺苷酸化信号，或者所述第一聚腺苷酸化信号是所述IX基因的聚腺苷酸化信号，所述第三聚腺苷酸化信号是所述转基因的聚腺苷酸化信号，并且所述第四聚腺苷酸化信号是所述腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
31.如权利要求26-30中任一项所述的重组腺病毒，其中所述启动子是泛素启动子、组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
32.如权利要求1-31中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒进一步包含***到E1b-19K***位点、E3***位点或E4***位点中的核苷酸序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列包含含有第一转基因的第一核苷酸序列和包含第二转基因的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列通过连接子隔开。
34.如权利要求33所述的重组腺病毒，其中所述连接子编码可通过一种蛋白酶或多种蛋白酶切割的肽。
35.如权利要求33或权利要求34所述的重组腺病毒，其中所述连接子编码内部核糖体进入位点(IRES)或自切割2A肽。
36.如权利要求32所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K***位点位于Elb-19K的起始位点和Elb-19K的终止密码子之间。
37.如权利要求32或权利要求36所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K***位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约100至约305，约100至约300，约100至约250，约100至约200，约100至约150，约150至约305，约150至约300，约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。
38.如权利要求32、36和37中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K***位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约200个核苷酸的缺失。
39.如权利要求32、36和37中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K***位点包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的核苷酸1714-1917的缺失。
40.如权利要求32、36和37中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K***位点包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的核苷酸1611-2153的缺失。
41.如权利要求32所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点位于腺病毒pVIII基因的终止密码子和腺病毒纤维基因的起始位点之间。
42.如权利要求32或权利要求41所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点位于E3-10.5K的终止密码子和E3-14.7K的终止密码子之间。
43.如权利要求32、41和42中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点包含约500至约3185，约500至约3000，约500至约2500，约500至约2000，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约3185，约1000至约3000，约1000至约2500，约1000至约2000，约1000至约1500，约1500至约3185，约1500至约3000，约1500至约2000，约2000至约3185，约2000至约3000，约2000至约2500，约2500至约3185，约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。
44.如权利要求32和41-43中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含约500至约1551，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约1551，约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。
45.如权利要求32和41-44中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含约1,050个核苷酸的缺失。
46.如权利要求32和41-44中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点在E3-10.5K的终止密码子之后包含1,063个核苷酸的缺失。
47.如权利要求32和41-43中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点包含对应于Ad5 dl309 E3缺失的缺失。
48.如权利要求32和41-47中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的核苷酸29773-30836的缺失。
49.如权利要求32和41-46中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3***位点包含对应于Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的核苷酸29119-30622的缺失。
50.如权利要求1-49中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含具有功能性Pea3结合位点的一个或多个缺失的E1a启动子。
51.如权利要求50所述的重组腺病毒，其中所述缺失包含对应于Ela起始位点上游约-300至约-250的核苷酸的缺失。
52.如权利要求50所述的重组腺病毒，其中所述缺失包含对应于Ela起始位点上游-305至-255的核苷酸的缺失。
53.如权利要求50所述的重组腺病毒，其中所述缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ IDNO:1)的195-244的核苷酸的缺失。
54.如权利要求50所述的重组腺病毒，其中所述E1a启动子包含序列GGTGTTTTGG(SEQID NO:4)。
55.如权利要求1-54中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒在E1A区中包含一个或多个Pea3转录结合位点缺失，而没有一个或多个E2F转录结合位点缺失。
56.如权利要求1-54中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒在E1A区中包含一个或多个E2F转录结合位点缺失，而没有一个或多个Pea3转录结合位点缺失。
57.如权利要求1-48中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含可操作地连接至基因的修饰的基于TATA框的启动子，其中所述修饰的基于TATA框的启动子缺乏功能性TATA框并允许所述基因在过度增殖细胞中的选择性表达，和/或可操作地连接至基因的修饰的基于CAAT框的启动子，其中所述修饰的基于CAAT框的启动子缺乏功能性CAAT框并允许所述基因在过度增殖细胞中的选择性表达。
58.如权利要求57所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于TATA框的启动子是早期基因启动子。
59.如权利要求58所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于TATA框的启动子是E1a启动子、E1b启动子或E4启动子。
60.如权利要求59所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于TATA框的启动子是E1a启动子。
61.如权利要求57-60中任一项所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于TATA框的启动子中所包含的修饰包括整个TATA框的缺失。
62.如权利要求57-60中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-27至-24的核苷酸的缺失。
63.如权利要求57-62中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-31至-24的核苷酸的缺失。
64.如权利要求57-63中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-44至+54的核苷酸的缺失。
65.如权利要求57-64中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-146至+54的核苷酸的缺失。
66.如权利要求57-60中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的472至475的核苷酸的缺失。
67.如权利要求66所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的468至475的核苷酸的缺失。
68.如权利要求67所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的455至552的核苷酸的缺失。
69.如权利要求68所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的353至552的核苷酸的缺失。
70.如权利要求57-69中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：CTAGGACTG(SEQ ID NO:5)，AGTGCCCG(SEQ ID NO:44)，和/或TATTCCCG(SEQ ID NO:45)。
71.如权利要求57所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于CAAT框的启动子是早期基因启动子。
72.如权利要求71所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于CAAT框的启动子是E1a启动子、E1b启动子或E4启动子。
73.如权利要求72所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于CAAT框的启动子是E1a启动子。
74.如权利要求71-73中任一项所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于CAAT框的启动子中所包含的修饰包括整个CAAT框的缺失。
75.如权利要求71-74中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-76至-68的核苷酸的缺失。
76.如权利要求71-74中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO:1)的423至431的核苷酸的缺失。
77.如权利要求71-76中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：TTCCGTGGCG(SEQ ID NO:46)。
78.如权利要求57-80中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述Ad35基因组(SEQ ID NO:41)的477至484的核苷酸的缺失。
79.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码单体、二聚、三聚、四聚、或多聚蛋白质。
80.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码具有治疗活性的RNA。
81.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码包含至少一个结合结构域的融合蛋白。
82.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码免疫调节分子。
83.如权利要求82所述的重组腺病毒，其中所述免疫调节分子是共刺激配体、细胞因子或细胞因子受体。
84.如权利要求82或权利要求83所述的重组腺病毒，其中所述免疫调节分子选自下组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-7、IL-10、IL-10trap、IL-10R、IL-12A/p35、IL-12B/p40、IL-15、IL-23A/p19、IL24、IL-27、IL-33、IL-35、IL-15、IL-15受体融合蛋白、TGF-β、TGF-βtrap、IL-10trap、VEGF、吲哚胺-2,3-二氧合酶(IDO)、诱导型T细胞共刺激配体(ICOS-L)、CD80、CD137L、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ或GM-CSF、GITR配体(GITRL)、OX40配体(OX40L)、CD40配体(CD40L)、药物诱导型CD40(iCD40)、CD154、CD70、CD86、CD137、CD137L、BORIS/CTCFL、骨形态发生蛋白(BMP)、TNFSF9、FGF、ICAM、足糖萼蛋白、其功能片段，及其衍生物。
85.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码抗原结合分子。
86.如权利要求85所述的重组腺病毒，其中所述抗原结合分子是抗PD-1抗体、抗TGF-β抗体、抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体或其功能片段。
87.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码抗原或该抗原的配体。
88.如权利要求87所述的重组腺病毒，其中所述抗原选自下组：CAIX、CEA、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD80、CD133、CD135(Flt3)、Flt3I、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染细胞抗原、4-1BB、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erbB2、erbB3、erbB4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、KRAS、HPV E6、E7、BING-4、EphA3、钙激活氯离子通道-2、细胞周期蛋白B1、9D7、Ep-CAM、SAP-1、PRAME、SSX-2、不成熟层粘连蛋白受体、叶酸受体-a、端粒酶、酪氨酸酶、黑色素-A、NY-ESO-1、GD2、GD3、hTERT、IL13R-a2、x-轻链、KDR、LeY、LI细胞粘附分子、MAGE-A1、MAGE-A3、MART1、MART2、MUC1、间皮素、HER-2/neu、EGFRvIII、NKG2D配体、NY-ES0-1、gp100、TRP-1/-2、TRP-1/-2、P多肽、MC1R、***特异性抗原、BRAF、雄激素受体、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、p53、TGF-βRII、T细胞受体、癌胚抗原、5T4、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、WT-1、其功能片段，及其衍生物。
89.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码毒素。
90.如权利要求89所述的重组腺病毒，其中所述毒素是假单胞菌外毒素、蓖麻毒素或白喉毒素。
91.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码酶。
92.如权利要求91所述的重组腺病毒，其中所述酶选自下组：β-葡糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、酯酶、金属蛋白酶、松弛素、胶原酶、链激酶、精氨酸酶、NOS-2、其片段，及其衍生物。
93.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码细胞周期控制剂、生长因子、抗凝剂、前药激活基因，肿瘤抑制基因，凋亡基因，抗血小板剂，凝血因子，囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)蛋白，其片段，或其衍生物。
94.如权利要求25-78中任一项所述的重组腺病毒，其中所述转基因、所述第一转基因和所述第二转基因中的一个或多个编码血管抑素、内皮抑素、乙酰胆碱、DKK1/Wnt、Ox40L、GITRL、分泌鞭毛蛋白、胸苷激酶、其功能片段，或其衍生物。
95.如权利要求1-94中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒是5型腺病毒(Ad5)或35型腺病毒(Ad35)。
96.如权利要求1-95中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒是溶瘤性的。
97.如权利要求1-96中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在过度增殖细胞中复制。
98.如权利要求1-97中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在过度增殖细胞中表达转基因。
99.如权利要求97或权利要求98所述的重组腺病毒，其中所述过度增殖细胞是肿瘤细胞。
100.一种分离的核苷酸序列，其包含权利要求1-99中任一项的重组腺病毒，任选地其中所述核苷酸序列是cDNA。
101.一种分离的载体，其包含权利要求100的核苷酸序列。
102.一种分离的细胞，其包含权利要求100的核苷酸序列或权利要求101的载体。
103.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞暴露于有效量的权利要求1-99中任一项的重组腺病毒以抑制肿瘤细胞的增殖。
104.一种抑制需要其的受试者的肿瘤生长的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求1-99中任一项的重组腺病毒以抑制肿瘤生长。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述肿瘤是HER2/neu阳性的肿瘤和其中所述重组腺病毒包含具有不多于一个功能性Pea3结合位点缺失的E1a启动子。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述HER2/neu阳性的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌或非小细胞肺癌(NSCLC)。
107.如权利要求103或权利要求104所述的方法，其中所述肿瘤选自下组：黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、***肿瘤、***、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺肿瘤、肾细胞癌、***肿瘤、胃食管肿瘤、结直肠肿瘤、睾丸肿瘤、***、卵巢肿瘤、肝细胞癌、胆管癌、脑肿瘤、子宫内膜肿瘤、神经内分泌肿瘤、Merkel细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤和胰腺肿瘤。
108.一种治疗需要其的受试者的癌症的方法，所述方法包括：对受试者施用有效量的权利要求1-99中任一项的重组腺病毒以治疗受试者的癌症。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈部癌、乳腺癌、***肿瘤、***、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、***癌、胃食管癌、结直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胆管癌、脑癌、子宫内膜癌、神经内分泌癌、Merkel细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤、***癌、白血病、淋巴瘤和胰腺癌。
110.一种治疗需要其的受试者的疾病或病症的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求1-99中任一项的重组腺病毒。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述疾病或病症选自下组：感染、糖尿病性视网膜病、银屑病、类风湿性关节炎、子宫内膜异位症、黄斑变性病症和良性生长障碍、诸如***肥大和脂肪瘤、血管病、心血管病、感染、肝硬化、***病、肿瘤、血管病变、溃疡病变、炎症、血栓形成和新生内膜形成。
112.如权利要求104-111中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
113.如权利要求104-112中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
114.如权利要求113所述的方法，其中所述受试者是儿童。
115.如权利要求113所述的方法，其中所述受试者是成人。
116.如权利要求104-115中任一项所述的方法，其中所述重组腺病毒通过以下方式施用：肌内、静脉内、动脉内、瘤内、皮内、吸入、透皮、局部、滴眼、鼻内、透粘膜或直肠施用。
117.如权利要求104-116中任一项所述的方法，进一步包括对受试者施用选自下组的一种或多种疗法：手术、放疗、化疗、免疫疗法、激素疗法和病毒疗法。
118.如权利要求104-117中任一项所述的方法，进一步包括对受试者施用一种或多种免疫检查点调节剂。
119.如权利要求117所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是选自下组的一种或多种分子的抑制剂、拮抗剂或激动剂：PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4、TIGIT、LAG3、Tim3、BTLA、CD160、GITR、KIR、4-1BB和CTLA4。
120.一种药物组合物，其包含权利要求1-99中任一项的重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。
121.一种用于腺病毒的制剂，其包含：
(a)权利要求1-99中任一项的重组腺病毒；
(b)至少一种缓冲剂；
(c)至少一种张力修饰剂；
(d)至少一种糖或至少一种稳定剂或二者；和
其中所述制剂的pH在约7.0至约9.0范围内。
122.如权利要求121所述的制剂，其中所述稳定剂是甘油。
123.如权利要求121或权利要求122所述的制剂，其中所述稳定剂为约2％至约5％(v/v)。
124.如权利要求121-123中任一项所述的制剂，其中所述缓冲剂是Tris。
125.如权利要求121-123中任一项所述的制剂，其中所述缓冲剂的浓度为约1mM至约30mM。
126.如权利要求119-123中任一项所述的制剂，其中所述张力修饰剂是NaCl。
127.如权利要求119-124中任一项所述的制剂，其中所述张力修饰剂的浓度为约10mM至约250mM。
128.如权利要求119-125中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含第一张力修饰剂和第二张力修饰剂，其中所述第一张力修饰剂是一价阳离子和其中所述第二张力修饰剂是二价阳离子。
129.如权利要求119-128中任一项所述的制剂，其中所述张力修饰剂或二价阳离子是MgCl2。
130.如权利要求119-129中任一项所述的制剂，其中所述张力修饰剂或二价阳离子的浓度为约0.1mM至约5mM。
131.如权利要求119-130中任一项所述的制剂，其中所述糖是蔗糖。
132.如权利要求119-131中任一项所述的制剂，其中所述糖的重量比体积百分比为约2％至约8％。
133.如权利要求119-132中任一项所述的制剂，其进一步包括至少一种非离子表面活性剂。
134.如权利要求133所述的制剂，其中非离子表面活性剂是聚山梨糖醇-80或聚山梨糖醇-40。
135.如权利要求133或权利要求134所述的制剂，其中所述非离子表面活性剂的浓度为约0.001％至约1％。
136.如权利要求119-135中任一项所述的制剂，其进一步包括至少一种自由基氧化抑制剂。
137.如权利要求136所述的制剂，其中所述自由基氧化抑制剂是EDTA。
138.如权利要求136或权利要求137所述的制剂，其中所述自由基氧化抑制剂的浓度为约0.01mM至约5mM。
139.如权利要求119-138中任一项所述的制剂，其进一步包括至少一种冷冻保护剂。
140.如权利要求139所述的制剂，其中所述冷冻保护剂是EtOH。
141.如权利要求139或权利要求140所述的制剂，其中所述冷冻保护剂的浓度为约0.5％。
142.如权利要求119-141中任一项所述的制剂，其中所述制剂的摩尔渗透压浓度为约200mOs/L至约800mOs/L。
143.如权利要求119-142中任一项所述的制剂，其中所述重组腺病毒的浓度为约1x107vp/mL至1x 1013vp/mL。
144.如权利要求119-143中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约20mM Tris、约25mM NaCl、约2.5％甘油，和其中所述制剂的pH为约8.0。
145.如权利要求119-144中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约20mM Tris、约25mM NaCl、约3-5％蔗糖，和其中所述制剂的pH为约8.0。
146.如权利要求119-145中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约10mM Tris、约75mM NaCl、约5％蔗糖、约0.02％聚山梨糖醇-80、约1mM MgCl2、约0.1mM EDTA、约0.5％EtOH和其中所述制剂的pH为约8.0。
147.如权利要求119-146中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包含至少一种免疫佐剂。
148.如权利要求147所述的制剂，其中所述免疫佐剂选自：1)明矾，2)皂苷，3)非离子聚合物表面活性剂，4)单磷酰脂质A，5)胞壁酰二肽和6)细胞因子。
149.如权利要求119-148中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包含至少一种染料。
150.如权利要求119-149中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包含至少一种可逆型蛋白酶抑制剂。
151.如权利要求150所述的制剂，其中所述可逆型蛋白酶抑制剂是L3/p23半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
152.如权利要求119-151中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包含至少一种抗氧化剂。
153.如权利要求所述的制剂152，其中所述抗氧化剂是维生素A、维生素C、维生素E、维生素B6、维生素B12、叶酸或叶酸盐。
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