选择性封闭肿瘤STAT3的新型溶瘤腺病毒构建体的获得及用途
一、技术领域
本发明涉及一种人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5,Ad5)重组体的构建方案,其技术特征在于:定向缺失Ad5基因组的第920-946nt,即GAT CTTACC TGC CAC GAG GCTGGC TTT,该序列编码E1A蛋白121至129位氨基酸,在此基础上,进一步缺失Ad5 E3区29477-29714nt,在上述缺失区域引入一个ClaI酶切位点;在ClaI酶切位点中反向***770bp的外源性STAT3 cDNA片段,相当于STAT3 mRNA的第960-190nt,从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3。发明内容属于医学基因工程技术领域。
二、背景技术
恶性肿瘤正在成为危害人类健康的首要疾病。据国内最新流行病学调查资料显示:我国现有癌症病人300多万人,每年死于恶性肿瘤的患者约为130万人,每年有160万到200万新发的恶性肿瘤病例,并以3%的速度递增,给我国人民的生活和健康造成巨大威胁。目前常规的肿瘤治疗手段都无法从根本上清除恶性肿瘤,多数常见肿瘤的治疗仍面临着严峻的挑战,恶性肿瘤的彻底治疗需要肿瘤治疗方法的革新。
在肿瘤发病内在分子机制日益明了的新历史条件下,肿瘤分子医学理论和方法学的突破引发了一系列发展新型肿瘤治疗模式的尝试,大量分子靶点特异性抗癌化合物进入临床试用,标志着肿瘤治疗的突破到了一个关键的转折点,并已获得阶段性成果,初步凸显出未来肿瘤问题解决的基本轮廓,其最为核心的解决方法之一就是要从肿瘤繁复的基因调控网络中分解出最为关键的分子靶标,实施分子靶向治疗。截止至2001年底,获美国FDA批准进入临床实验阶段的分子治疗品种已超过三千种,包括细胞传导阻断剂、血管生成抑制剂、肿瘤疫苗和单克隆抗体,为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望,可以说,未来人类肿瘤的有效控制在根本上依赖分子治疗的发展和完善。
分子治疗的主要手段主要分为三类:单克隆抗体、小分子化合物和基因治疗,其中,基因治疗作为近年医学领域发展中最具有生命活力的部分之一,已广泛应用于多种肿瘤的临床试验性治疗,显示出良好的应用前景。从1989年至2000年底,美国生物制品评价和研究中心(Center for Biologics Evaluations and Research,CBER)批准的临床基因治疗试验项目已超过350项,其中约有70%的项目为肿瘤基因治疗, 部分已经进入III期临床试验,取得较好疗效,在巨大的医疗需求的推动下,基因治疗制剂将有可能在近年内正式上市成为临床治疗药物,成为肿瘤现有治疗体系的一个不可缺少的组成部分。
重组Ad5载体作为肿瘤基因治疗应用最为广泛的载体之一,其临床可行性和安全性已获公认,腺病毒基因治疗载体具有以下突出的生物学优势和临床应用优势:感染谱广;不整合入宿主基因组,无致突变、致癌的危险性;临床应用安全,副作用轻微;临床应用方便;腺病毒在细胞体内持续表达时间短,尤其适合肿瘤治疗;临床级数量、质量的病毒易于生产、纯化。
目前肿瘤临床试用的绝大部分载体为缺失了E1及E3区的复制缺陷性腺病毒,进入肿瘤病灶后,对肿瘤的杀灭效应依赖于体外高浓度治疗病毒的输入,距离注射点较远的病灶的杀灭效应较弱。为此,近年来,出现了从复制缺陷性腺病毒载体向条件复制性腺病毒载体(conditionally replicative adenovirus)转化的新的发展趋势,所谓条件性复制腺病毒载体是指载体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖,将肿瘤细胞作为生产病毒的场所,最终达到裂解杀灭肿瘤细胞的治疗目的,肿瘤细胞裂解释放出高浓度的病毒后,可进一步感染距离注射点较远的病灶肿瘤细胞,形成新一轮的感染波,周而复始形成一种正反馈,达到最大的治疗效应。此类载体另一个非常理想的优势是它们不能在正常细胞内完成复制,因此对正常细胞无任何杀伤效应。在第21届美国肿瘤研究年会上,来自休斯顿Anderson肿瘤中心的一份研究报告表明:局部注射后,复制缺陷性腺病毒在人体恶性胶质瘤病灶中的分布较局限,在一定程度上影响了疗效的发挥,与此形成鲜明的对比,能在肿瘤细胞内特异性复制的腺病毒ONYX-015,通过在肿瘤局部的增殖,其分布遍及全瘤灶,取得显著疗效。ONYX-015是美国ONYX药物生物技术公司近年研制出的能在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒,其构建特点是在wt-Ad5的基因组上,部分缺失E1B 55 kDa的编码序列,并加入翻译终止信号,但保留19kDa E1B的编码序列。
作为条件复制性腺病毒载体代表产品的ONYX-015在1996年进入临床试验以来,已经取得了非常令人鼓舞的临床疗效。目前,美国辉瑞(pifzer)药物公司已从ONYX生物技术公司购买使用专利,并已在多种肿瘤进行临床期试验,其中,对复发性,难治性头颈部肿瘤的治疗正进行临床III期试验,已取得非常满意的疗效,对其他肿瘤如转移性结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oral leukoplakia)和恶性胶质瘤的临床I-II期试验正在进行中。国内已有4例与ONYX-015类似原理的专利申请,其中专利申请(一种缺陷型病毒及其构建方法)99124030.8通过缺失E1B 55 kDa位于2809-3329bp编码序列,并在缺失部位***终止码的方法得到E1B 55 kDa部分缺失的构建体。专利申请(缺失凋亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用)96013494.7通过部分缺失E1B 55 kDa编码序列,并在该缺失部位***标志基因LacZ,得到E1B 55 kDa部分缺失同时携带标志基因的病毒构建体,该构建体的另一特点是有E3区的缺失。另外两项为申请人领导的研究小组提交的申请,专利号01144628.5“一种缺失E1A编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途”,缺失E1A 382-1630nt序列,筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体,专利号01144629.3“一种联合缺失19kDa、55kDa E1B编码序列重组腺病毒构建体的构建及用途”,筛选出不能表达E1B功能蛋白的重组腺病毒构建体。
国内外现有的条件复制性腺病毒载体发明与第一代Ad5基因治疗载体相比,无论在治疗原理上,还是在实际治疗效果上均具有明显的改进,并取得突破性进展,被称为第二代Ad5基因治疗载体。然而,第二代Ad5基因治疗载体均有一些共同的缺点:<1>、基于腺病毒生物学基础设计的载体虽然具备肿瘤条件复制性的治疗优势,由于设计上的种种不足,获取的腺病毒在肿瘤细胞中的复制、裂解肿瘤细胞的效力远远弱于wt-Ad5,如单用ONYX-015的抗癌有效率仅为0-14%。<2>、第二代Ad5基因治疗载体的应用仍以肿瘤局部注射为主,在应用中受到极大的限制,在绝大部分情况下,肿瘤是一种全身性疾病,需经静脉用药的途径,进行***性治疗,以控制原发及转移病灶,因此,第二代Ad5基因治疗载体的选择性和对肿瘤细胞的杀伤效率须进一步加强,以适应改进用药途径的需要。<3>、第二代Ad5基因治疗载体均未携带有效的治疗性目的基因,使治疗效应的发挥受到限制。<4>、由于现有的分子靶点绝大部分缺乏肿瘤特异性,以第二代Ad5基因治疗载体结合外源性启动子、治疗基因的策略虽然具有相对的肿瘤选择性,但仍不能避免对正常组织细胞的毒性作用。<5>、现有的携带治疗基因的Ad5载体感染靶细胞后,携带的治疗基因即获得表达的能力,不能避免地产生对正常组织细胞的毒性作用,尤其毒性或杀伤力较大的外源基因。<6>、第二代Ad5基因治疗载体结合的外源性启动子在细胞中的活性不稳定或较低。<7>、即使现有Ad5基因治疗载体有强大的溶瘤效应,但对肿瘤细胞过早的裂解导致携带的治疗基因不能有效表达,加上体内免疫对病毒的清除,使得病毒的治疗效果较低。
另一方面,近年来已经确定了许多肿瘤分子药靶,针对这些分子药靶设计单克隆抗体、小分子化合物,已成为肿瘤治疗发展的主要趋势,其中部分已经成为处方药,尚有大量的分子治疗手段正在临床试用评估阶段,取得了较好的初步结果。尽管如此,由于这些新的分子靶点及其分子阻遏手段,绝大部分缺乏肿瘤特异性,由此产生的剂量限制性毒性,仍然是这些疗法目前普遍面临和亟待解决的关键问题,极大地限制了肿瘤问题的解决。
三、发明内容
基于以上技术背景和重大的医疗需求,本发明将公开一种新的第三代AD5基因治疗载体的构建方案,通过该方案获得的构建体具有肿瘤特异性复制、高度肿瘤特异性大量表达外源性***基因、强大的肿瘤特异性旁观者效应等明显的优势,并具备高度的治疗指数,适于静脉用药,可以解决目前肿瘤治疗技术和实践中关键的不足之处。
本发明的理论基础基于现有研究对Ad5病毒生物学的深入认识。当AD5进入细胞后1小时内,Ad5就会表达出E1A功能蛋白,其生物学效应主要包括两方面,首先,E1A蛋白结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)蛋白,使宿主细胞内源性转录因子E2F从Rb-E2F的复合物中释放出来,与此同时,E1A蛋白将激活Ad5表达出E1B功能蛋白,以此灭活宿主细胞内源性转录因子P53对细胞周期驱动激酶的抑制,在E1A、E1B和E2F的共同驱动下,宿主细胞进入DNA合成期,为病毒基因组的自我复制提供前提条件;其次,Ad5依赖E1A蛋白激活Ad5的早期基因(E1B,E2,E3,E4)和晚期基因(L1-6)的表达,为病毒基因组的自我复制、病毒颗粒的包装、逃避宿主细胞的免疫清除、裂解细胞、释放病毒颗粒、再感染等完整的生命周期提供允许环境。由此可见,Ad5依赖E1A蛋白启动其它蛋白的序贯性合成,完成病毒的生命周期,最终裂解宿主细胞。
功能蛋白E1A的编码序列位于Ad5基因组560-1112nt,1229-1545nt,包含三个重要序列,分别为677-799nt,此序列为E1A保守序列1(CR1),用于结合转录辅助因子P300,917-979nt为E1A保守序列2(CR2),用于结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb),1007-1115nt为保守序列3(CR3),为基因转录激活区。由于几乎所有的肿瘤均存在Rb调控径路的缺陷,如果对E1A917-979nt的CR2区加以不同的缺失改造,达到灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果,由此获取的腺病毒重组体将有可能在肿瘤细胞内有效复制,最终杀灭肿瘤细胞,另一方面,正常细胞具有的Rb调控径路,可以有效遏止腺病毒重组体依赖E1A蛋白启动其序贯性的生命周期,最终仅形成流产感染。这一理论推测已经为近来两个独立的研究组的工作所证实,Fueyo等(Oncogene,2000,19:2-12)构建了缺失E1A923-946nt的腺病毒重组体,观察到该腺病毒重组体选择性地在肿瘤细胞内复制,其复制特性强于wt-Ad5,而对正常细胞无任何毒性作用,单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长;Heise等(Nature Medicine,2000,10:1134-1139)更深入地证实该构建体对肿瘤细胞具有高度选择性,从静脉单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长并抑制肿瘤转移。
尽管Fueyo与Heise等的前期工作为发展第三代Ad5基因治疗载体提供了关键的理论线索,他们的工作仍有明显的不足之处,他们发展出的Ad5基因治疗载体不包含任何***性外源性治疗基因,限制了抗肿瘤效应的发挥。为此,本发明在此基础上构建一种新型的Ad5重组体,其技术特征在于:定向缺失Ad5基因组的920-946nt序列,并进一步缺失Ad5 E3区29477-29714nt,在该缺失区域引入一个ClaI酶切位点;在ClaI酶切位点中反向***770bp的外源性STAT3 cDNA片段,该片段相当于STAT3 mRNA的第960-190nt,从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3。
STAT3基因全称为信号转导及转录活化因子3(signal transducer and activator oftranscription 3),在大部分肿瘤细胞中异常表达或呈持续活化状态,其功能在于促进肿瘤细胞增值抑制其凋亡,促进肿瘤血管生成,使肿瘤细胞获得免疫逃避的能力,而距常细胞并不依赖于这些功能。因此,在本发明中被选为分子药靶。
与现有的重组腺病毒构建体相比,本发明达到了以下效果:
1、本重组腺病毒构建体缺失E1A蛋白的920-946nt序列,在理论和实际上达到了在灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果。更为重要的是,我们在Δ920-946Ad5载体的E3 ADP区反向***770bp的外源性STAT3 cDNA片段,该片段相当于STAT3 mRNA的第960-190nt,使反义STAT3 cDNA的表达依赖Ad5自身E3区转录单位的内源性启动子,该启动子具有类似CMV启动子的高活性,启动子的开放完全依赖于病毒基因组DNA在细胞内的复制,病毒如不复制,外源性反义STAT3 cDNA将不表达;并且由于ADP基因的缺失,重组腺病毒裂解细胞的能力相对降低,但细胞内病毒的扩增量显著增加,因而被病毒感染的细胞就成为治疗基因的加工厂。由于这种全新的设计,使这一新的构建体可通过三重机制达到选择性杀灭肿瘤细胞的治疗目的,即:构建体只在肿瘤细胞内复制且裂解细胞的时间相对滞后,可使外源性反义STAT3 cDNA拷贝数大大增加;构建体携带的反义STAT3 cDNA只在肿瘤细胞内表达,该表达完全依赖于病毒基因组DNA在细胞内的复制,因此能特异性封闭肿瘤细胞的STAT3基因表达,达到杀灭肿瘤细胞的目的,避免了对正常细胞的攻击;构建体以肿瘤细胞为复制宿主,在肿瘤局部可产生高浓度病毒,形成强效旁观者效应。构建体的免疫调节蛋白功能完整,一定程度上避免了机体对重组腺病毒的清除。此外,本发明也将为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。
2、进年来大量的研究表明,STAT3在大部分肿瘤细胞中异常表达或呈持续活化状态,且肿瘤细胞更依赖于这种活化而存活,对这种活化的抑制也更为敏感。因而为对STAT3短暂的部分封闭提供了较为理想的治疗窗。
3、对肿瘤细胞系及正常对照细胞体外实验结果表明,该重组腺病毒构建体对正常细胞STAT3基因的表达无明显影响,对细胞活性无明显影响,相反,它可特异性封闭肿瘤细胞内STAT3基因的表达,有显著的杀灭肿瘤细胞的效应。
4、对肿瘤动物模型的体内模型研究证实,通过肿瘤局部注射或静脉注射的用药途径,该重组腺病毒构建体对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用,并可有效抑制肿瘤转移,且对动物无明显的治疗相关毒性。
四、附图说明
附图1:Ad5 E3区结构图,该区域编码7种蛋白,要缺失的区域为29477-29714bp,为E3 ADP基因,在该区域反向***770bp的外源性STAT3 cDNA片段,该片段相当于STAT3mRNA的第960-190nt。
附图2:组病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3结构示意图。
附录1:重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3序列及结构说明。
五、具体实施例
下列实施例中,除特别注明外,技术流程中所用的酶和PCR引物均购自美国Gibco公司。
例1、pXC1系列突变体(Δ920-946pXC1)的构建
pXC1购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato,Ontario,Canada,目录号:PD-01-03),该质粒包含人类5型腺病毒(Ad5)21-5790nt序列。
采用3次PCR法缺失920-946nt,片段1的获取:引物1=5′-CG GGA TCC GGG CCCCCATTT CC-3′,相当于9883-9902nt,下划线部分为BamHI酶切位点;引物2=5′-GTCACT GGG TGG ATC GAT CAC CTC CGG TAC-3′,相当于922-905nt,下划线部分为与引物3互补部分;
以pXC1为模板,行PCR反应,反应体系总体积为100μl包括:
含MgCl2的10×PCR缓冲液 10μl
2mM dNTP 10μl
10μM引物1 1μl
10μM引物2 1μl
pXC1 10ng/μl 1μl
pfu高保真Taq酶 2.5u
加水至 100μl;
反应条件为:95℃ 30秒;95℃ 45秒、60℃ 1分钟、72℃ 2分钟共28循环;72℃延伸10分钟。PCR产物长940bp,形成片段1,常规电泳分离纯化后,检测浓度用于后继PCR反应。
片段2的获取:引物3=5′-GAG GTG ATC GAT CCA CCC AGT GAC GAC GAG-3′,相当于911-947nt,下划线部分为与引物2互补部分;引物4=5′-TGC TCT AGA CAC AGGTGA TGT CG-3′,相当于1344-1325nt,下划线部分为XbaI酶切位点;
以pXC1为模板,行PCR反应,反应条件同上,产物长400bp,形成片段2,常规电泳分离纯化后,检测浓度用于后继PCR反应。
片段3的获取:将50ng/2μl片段1与25ng/1μl片段2混合,作为模板行PCR反应,上游引物为引物1,下游引物为引物4,反应条件同上,产物约为1400bp,形成片段3,用QIAquick 8 PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN,German,Cat:28142)纯化后,用BamHI,XbaI双酶切过夜,酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切片段用于克隆。
将pXC1用BamHI,XbaI双酶切过夜,酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后产生2条带,约为1400bp和8500bp,回收8500bp酶切片段用于克隆。
取40ng的8500bp pXC1酶切片段及90ng片段3,用DNAT4连接酶做连接反应,取1.5μl转化100μl DH5α感受态细菌,铺皿过夜培养,第二天挑取单个菌落克隆,提取其内扩增的质粒,DNA测序鉴定筛选得到缺失121-129AA 920-946nt的pXC1质粒突变体-Δ920-946pXC1,用于重组腺病毒的克隆。
例2、Δ920-946Ad5重组腺病毒的构建
pBHGE3购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato,Ontario,Canada,目录号:PD-01-12),该质粒包含除ADd5包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列。
pBHGE3从Microbix Biosystem Inc.获取时,总量为10μg,先电转入感受态细菌,挑取阳性克隆,提取质粒,得到的质粒用CsCl2-EB超速离心法纯化。
同源重组法获取Δ920-946Ad5重组腺病毒构建体,方法如下:
在15cm培养皿中种入7.5×105293细胞,培养液为10%FBS DMEM,到第二天,细胞应为1-1.5×106,大约70%的细胞融合;转染前3-4小时,换成新鲜培养液。
配制共转染DNA-磷酸钙溶液:将1600μl灭菌的2×HBS(280mM NaCl,43mMHEPES,10mM KCl,10mM Na2HPO4.7H2O,2%dextrose,pH 7.05-7.1 5)/pBHGE3和Δ920-946pXC1各42μg/加灭菌的双蒸水至2840μl混匀,缓慢加入50μl2.5M的CaCl2,颠倒混匀,在室温下让DNA/CaCl2沉淀45-60分钟,形成微混浊的沉淀。
加500μl上述混合液至含5ml 60mm培养皿的293细胞中,在37℃、5%CO2中孵育4-6小时,吸去上述液体,用PBS洗一次。
用含15%的甘油/DMEM处理1-2分钟以促进转染效率,用PBS洗一次,换为完全培养液。
制备1.8%低溶点琼脂糖,高压灭菌,分装成5ml,用前在沸水中融化,保温在45℃,用时加入等量4%FBS DMEM,即刻铺入培养皿中。
吸去培养液,加入5ml上述液体。每4-5天,加入3ml上述液体。
14-21天,噬斑出现,选定6-12个噬斑。将噬斑转移到含无血清DMEM培养基的1.5ml的EP管中,在37℃孵育24小时。
在24孔板培养皿中种入1×105293细胞,培养液为10%FBS DMEM,到第二天,细胞应为2×105,大约70%的细胞融合,吸去液体,从上述孵育液取100μl(大约为103病毒)加入,轻轻晃动液体3次,在37℃、5%CO2中孵育90分钟。
加入完全培养基至1ml,将细胞放置于37℃,5%CO2中孵育5-10天,直至完全的CPE出现,所谓CPE,即细胞毒效应,细胞表现为变圆、漂浮、细胞以核仁为主。假如10天后,完全的CPE未出现,则提示病毒的效价太低,需进行第二轮的扩增。
将培养板进行三轮的冻/解冻的循环,释放出病毒,将裂解液收集于15ml试管,最大速度离心10分钟,收集上清液,冻于-80℃,该液体称为第二代病毒,大约为5×107/ml病毒。
对以上病毒进行再次扩增,在75cm2培养皿中种入5×106293细胞,培养液为10ml10%FBS DMEM,到第二天,细胞应为1×107,大约70%细胞融合;
转染前3-4小时,换成新鲜培养液;
取1 ml第二代病毒储存液加入完全培养基至1ml,用于转染;该MOI约为5;除去75cm2培养皿的液体,加入以上液体,轻轻摇动三次;在37℃、5%CO2中孵育90分钟;加入9ml 2%FBS DMEM,在37 ℃、5%CO2中孵育4-7天,用于提取病毒DNA用于阳性病毒的筛选。
因为293细胞基因组包含完整的E1A基因,提取阳性病毒DNA时容易污染293细胞DNA,造成鉴定失败,为此将Δ920-946 Ad5在肿瘤细胞Hela中再扩增一次,用于鉴定,步骤如下:
在6孔板培养皿中种入1×105Hela细胞,培养液为10%FBS DMEM,到第二天,细胞应为2×105,大约70%的细胞融合,吸去液体,从上述滤过液取100μl(大约为103病毒)加入,轻轻晃动液体3次,在37℃、5%CO2中孵育90分钟。
加入完全培养基至1ml,将细胞放置于37℃、5%CO2中孵育5-10天,直至完全的CPE出现,将细胞刮下,收集于1.5ml EP管,离心弃上清,加入300μl PBS溶液,进行三轮的冻/解冻的循环,释放出病毒,将裂解液最大速度离心10分钟,收集上清液,冻于-80℃,用Qiagen公司试剂盒mini DNA isolation kit,参照试剂盒说明提取DNA。以病毒DNA为模板,行PCR反应,上游引物=5′-CG GGA TCC GGG CCC CCA TTT CC-3′,下游引物=5′-TGC TCT AGA CAC AGG TGA TGT CG-3′,反应体系总体积为100μl包括:含MgCl2的10×PCR缓冲液10μl/2mM dNTP 10μl/10μM上游引物1μl,10μM下游引物1μl/病毒DNA 10ng/pfu高保真Taq酶2.5u/加水至100μl。反应条件为:95℃30秒/95℃45秒、60℃ 1分钟、72℃ 2分钟共28循环/72℃延伸10分钟。PCR产物为1400bp,常规电泳分离纯化后,检测浓度用于DNA测序,测序引物为:5′-AGCCGGAGCAGAGAGCCTTG-3′,挑出正确克隆用于构建Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3重组腺病毒。
例3、Ad5 E3区的亚克隆载体pCDNA3.1-ΔADP的构建
Ad5 E3区全称为Ad5早期区域3,该区域在内源性启动子的驱动下,编码7种蛋白,序列、结构、功能参见附图1:12.5k,27858-28179nt,功能未明;6.7k,27547-28736nt,和RID复合体一起抑制TRAIL受体1、2在细胞表面的表达;gp19k,28735-29215nt,结合MHC I类抗原,抑制其至细胞表面的呈递,逃避CTL的清除;ADP,29419-29770nt,裂解细胞,释放病毒;RIDα,29784-30057nt,与RIDβ形成复合物,防止TNF的裂解,清除FAS抗原;RIDβ,30062-30458nt及14.7k,30453-30837,抑制TNF的裂解。
本实验的目的是要缺失E3区29477-29714nt区域,并在重组腺病毒的E3 ADP区域***外源性治疗基因。
采用3次PCR法缺失Ad5 E3区29477-29714nt:
片段1的获取:引物1=5′-ATACGCGCCCACCGAAAC-3′,相当于27306-27323nt;引物2=5′-AATCTATGGATATCGAT AGGGTGGGTCGCTGTAGTT-3′,相当于29477-29495nt,(下划线部分为与引物3互补部分,ATCGAT为ClaI酶切位点);
以Ad5 DNA为模板,行PCR反应,反应体系总体积为100μl包括:
含MgCl2的10×PCR缓冲液 10μl
2mM dNTP 10μl
10μM引物1 1μl
10μM引物2 1μl
Ad5 DNA 200ng/μl 1μl
pfu高保真Taq酶 2.5 u
加水至 100μl;
反应条件为:
94℃ 30秒;
94℃ 30秒、46℃ 1分钟、72℃ 1分钟共30循环;
72℃延伸10分钟。
PCR产物为2207bp(片段1),常规电泳分离纯化后,检测浓度用于后继PCR反应。
片段2的获取:
引物3=5′-CGACCCACCCTATCGATATCCATAGATTGGACGGACTG-3′(相当于29714-29734n)(下划线部分为与引物2互补部分,ATC GAT为Cla I酶切位点)引物4=5′-ATGTCTTTGAGGCTTGGAGG-3′(相当于30137-30118nt);PCR反应条件同上,产物为422bp(片段2),常规电泳分离纯化后,检测浓度用于后继PCR反应。
片段3的获取:将片段1与片段2等量混合,作为模板行PCR反应,上游引物为引物1,下游引物为引物4,反应条件同上,产物约为2612bp(片段3),用QIAquick 8 PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN,German,Cat:28142)纯化后,用EcoRI酶切过夜,酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收,酶切片段用于后继连接反应。
将pCDNA3.1(Invitrogen,U.S.A.,Cat:V79020)用EcoRI酶切过夜,酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切片段,去磷酸化后用于后继连接反应。
将PCR反应产物片段3与酶切、去磷酸化后pCDNA3.1连接,取1.5μl转入100μl DH5α感受态细菌,挑取阳性克隆,质粒小提,DNA测序鉴定筛选得到缺失29477-29714nt的pCDNA3.1质粒突变体-pCDNA3.1-ΔADP,用于***外源性治疗基因的亚克隆。
例4、在载体pCDNA3.1-ΔADP的中反向***770bp的外源性STAT3 cDNA片段
STAT3 cDNA片段从乳腺癌细胞系MDA-MB-231的RNA中扩增而来,逆转录条件:
5×MMLV缓冲液 4μl
10mM dNTP 1μl
OligdT(50ng/ml) 1μl
总RNA 2μl
Rnasin 0.5μl
MMLV逆转录酶 1μl
加无RNA酶水至 20μl;
逆转录反应产物用于PCR反应。上游引物为5′-CCATCGATGGCCTCTCGGCCTCTGCC-3′,该片段相当于STAT3 cDNA编码序列的第190-1207nt(下划线部分为Cla I酶切位点);下游引物为5′-CC ATCGATTTGCCGCCTCTTCCAGTCAGC-3′,该片段相当于STAT3cDNA编码序列的第960-961nt(下划线部分为Cla I酶切位点),扩增片段包括STAT3 cDNA编码序列的第960-190nt,全长约为770bp。
反应体系总体积为100μl包括:
含MgCl2的10×PCR缓冲液 10μl
2mM dNTP 10μl
10μM上游引物 1μl
10μM下游引物 1μl
逆转录反应产物 2μl
pfu高保真Taq酶 2.5u
加水至 100μl;
反应条件为:
94℃ 30秒;
94℃ 30秒、52℃ 1分钟、72℃ 1分钟共30循环;
72℃延伸10分钟。
PCR产物为776bp,Cla I酶切后,常规电泳分离纯化,检测浓度用于后继PCR反应。载体pCDNA3.1-ΔADP用Cla I酶切线形化后,常规电泳分离纯化,去磷酸化后与770bp的外源性STAT3 cDNA片段连接,取1.5μl转入100μl DH5α感受态细菌,挑取阳性克隆,质粒小提,DNA测序鉴定筛选得到在Cla I酶切位点反向***770bp的外源性STAT3 cDNA片段的质粒突变体-pCDNA3.1-ΔADP/ASSTAT3,用于后继重组腺病毒的克隆。
例5、重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3的获取
重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3的获取按照参考文献“Adenovirus methodsand protocol,edited by William S.M.Wold,construction of mutations in the adenovirus earlyregion 3(E3)transcription units,11-24”建立的连接法(ligation protocol)进行,主要步骤包括TPDNA的提取;用于重组腺病毒构建E3区DNA的准备;连接反应;共转染293细胞同源重组;噬斑的挑取和鉴定;阳性病毒的扩增和纯化。详细方法参见该文献。通过以上实验步骤得到重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3,该腺病毒缺失了Ad5 920-946nt序列(GATCTT ACC TGC CAC GAG GCT GGC TTT),该序列编码E1A蛋白121至129位氨基酸,并缺失Ad5 E3区29477-29714nt,在ClaI酶切位点中反向***770bp的外源性STAT3 cDNA片段,该片段相当于STAT3 mRNA的第960-190nt,其他基因组结构与wt-Ad5完全相同,其序列及结构见附图2及附录1。
例6、重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3特征鉴定
1、重组腺病毒构建体的体外肿瘤特异性复制的鉴定
本实验的目的在于鉴定Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3重组腺病毒在一系列肿瘤及正常细胞中的复制特点,实验将以wt-Ad5为阳性对照,以复制缺陷型病毒Ad5CMV-GFP为阴性对照。选用细胞系为人肺癌细胞系A549(P53+,RB-),人高转移性***癌细胞系PC3M-1E8(P53-,RB-),人成骨细胞瘤细胞系U-2OS(P53+,RB-),人结肠癌细胞系HCT-8(P53+,RB+),人乳腺癌细胞系MCF-7(P53+,RB+)。选用的细胞系具有不同的P53,RB基因表型;具有不同组织源性,因此实验结果可代表不同类型的肿瘤。选用的正常细胞为原代的血管内皮细胞、原代的肺小气管上皮细胞、***上皮细胞、骨髓单个核细胞,选用原则为:静脉用药后将接触大量腺病毒的正常组织细胞。
在24孔板培养皿中种入1×105肿瘤或正常骨髓单个核细胞,培养液为10%FBS DMEM或RIPM1640,到第二天大约70%的细胞融合,吸去液体,加入达到70%所需的MOI稀释至100μl加入,轻轻晃动液体3次,在37℃、5%CO2中孵育90分钟。
加入含2%FBS DMEM或RIPM1640培养基至1ml,将细胞放置于37℃ 5%CO2中孵育3-10天,观察细胞出现完全CPE所需的时间。
实验结果表明,阳性对照wt-Ad5无选择性地裂解肿瘤和正常细胞;复制缺陷型腺病毒Ad5CMV-GFP不能裂解任何细胞,重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3选择性地杀伤肿瘤细胞,其效应显著强于wt-Ad5对细胞的裂解效应,同时该重组腺病毒构建体对正常对照细胞系无明显影响。结果充分表明重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3选择性杀灭肿瘤细胞,具体数据见下表:
|
wt-Ad5 |
Ad5CMV-GFP |
Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3 |
A549 |
|
|
|
第3天 |
48% |
1% |
80% |
第6天 |
100% |
2% |
100% |
第10天 |
|
4% |
|
PC3M-1E8 |
|
|
|
第3天 |
62% |
1% |
90% |
第6天 |
100% |
2% |
100% |
第10天 |
|
4% |
|
U-2OS |
|
|
|
第3天 |
61% |
1% |
89% |
第6天 |
100% |
2% |
100% |
第10天 |
|
4% |
|
HCT-8 |
|
|
|
第3天 |
63% |
1% |
91% |
第6天 |
100% |
2% |
100% |
第10天 |
|
4% |
|
PGBE1 |
|
|
|
第3天 |
60% |
1% |
89% |
第6天 |
100% |
2% |
100% |
第10天 |
|
4% |
|
MCF-7 |
|
|
|
第3天 |
55% |
1% |
82% |
第6天 |
100% |
1% |
100% |
第10天 |
|
1% |
|
血管内皮细胞 |
|
|
|
第3天 |
58% |
1% |
1% |
第6天 |
100% |
2% |
2% |
第10天 |
|
4% |
3% |
肺小气管上皮细胞 |
|
|
|
第3天 |
61% |
1% |
1% |
第6天 |
100% |
2% |
2% |
第10天 |
|
4% |
3% |
***上皮细胞 |
|
|
|
第3天 |
63% |
1% |
2% |
第6天 |
100% |
2% |
3% |
第10天 |
|
4% |
3% |
骨髓单个核细胞 |
|
|
|
第3天 |
52% |
1% |
1% |
第6天 |
100% |
2% |
3% |
为进一步进行定量检测Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3重组腺病毒构建体在肿瘤细胞中复制效率,进行了以下实验:
在24孔板培养皿中各种入1×105各种肿瘤细胞或原代正常细胞,培养液为10%FBSDMEM或RIPM1640,到第二天,大约70%的细胞融合,吸去液体,加入Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3 10 MOI稀释至100μl加入,轻轻晃动液体3次,在37℃、5%CO2中孵育90分钟。
加入含2%FBS DMEM培养基至1ml,将细胞放置于37℃、5%CO2中孵育3天。
加入300μl PBS溶液,进行三轮的冻/解冻的循环,释放出病毒,将裂解液最大速度离心10分钟,收集上清液,冻于-80 ℃,TCID50法检测病毒的滴度。
结果表明Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3在肿瘤细胞中复制后其效价强于起始的3000-5000倍,而在正常细胞中感染效价无明显变化,结果充分表明该重组腺病毒构建体具有在肿瘤细胞内特异性复制的特性。
2、重组腺病毒构建体的体外选择性灭活肿瘤细胞STAT3表达特性的鉴定
本实验的目的在于鉴定Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3重组腺病毒在对一系列肿瘤及正常细胞STAT3表达的影响,实验选用细胞系为人肺癌细胞系A549(P53+,RB-),人成骨细胞瘤细胞系U-2OS(P53+,RB-),人转移性***癌细胞系PC3M-1E8(P53-,RB-),人结肠癌细胞系HCT-8(P53+,RB+),人乳腺癌细胞系MCF-7(P53+,RB+)。选用的细胞系具有不同的P53,RB基因表型;具有不同组织源性,因此实验结果可代表不同类型的肿瘤。选用的正常细胞为原代的血管内皮细胞、原代的肺小气管上皮细胞、***上皮细胞、骨髓单个核细胞,选用原则为:静脉用药后将接触大量腺病毒的正常组织细胞。
在24孔板培养皿中种入1×105肿瘤或正常细胞,培养液为10%FBS DMEM或RIPM1640,到第二天大约70%的细胞融合,吸去液体,加入达到70%所需的MOI稀释至100μl加入,轻轻晃动液体3次,在37℃、5%CO2中孵育90分钟。
加入含2%FBS DMEM或RIPM1640培养基至1ml,将细胞放置于37℃、5%CO2中孵育3-10天,提取细胞总蛋白检测STAT3蛋白表达水平的变化。
实验结果表明,重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3能选择性封闭肿瘤细胞STAT3蛋白的表达,同时该重组腺病毒构建体对正常对照细胞系STAT3蛋白表达无明显影响。结果充分表明重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3选择性灭活肿瘤细胞STAT3基因的表达。
3、重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3体内抗肿瘤效应的鉴定
肿瘤细胞动物模型:选择4~6周龄的BALB/c裸鼠,取对数生长期的胃癌细胞系MKN-45细胞,调整细胞密度1×106/100μl,每只裸鼠右侧背部皮下接种200μl,待肿瘤平均直径达到0.4-0.6cm时,按肿瘤大小随机分为4组,即介质对照组、wt-Ad5组、Ad5CMV-GFP组和Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3组,每组10只裸鼠,分别瘤内注射PBS,wt-Ad5,Ad5CMV-GFP和Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3,每只2×108pfu/(只·次),每天一次,连续5天。每周观察并测量肿瘤体积2次,直至实验终点(100天或肿瘤体积大于1cm3)。
实验结果表明,在实验终点时,wt-Ad5组平均肿瘤抑制率为40%±2%;Ad5CMV-GFP组肿瘤抑制率为-2%±3%;Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3组三只裸鼠肿瘤完全消退,平均肿瘤抑制率为90%±3%,结果充分表明重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3具有确定的体内抗肿瘤效应。
体静脉用药对胃原位癌模型的治疗及对肿瘤微转移的抑制:当胃癌皮下肿瘤生长至0.7-0.8cm时,选择全身状况较好荷瘤动物,颈椎脱臼处死,无菌条件下取出瘤块,用手术刀切割成1-2mm的瘤块,移植到胃小弯粘膜下。动物B超监测当肿瘤生长至3mm时,随机分为4组,即PBS对照组、wt-Ad5组、Ad5CMV-GFP组和Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3组,每组10只裸鼠,用2×108pfu病毒静脉内注射,连续治疗5天。动物B超监测肿瘤体积。至实验终点(30天或肿瘤体积大于1.2cm3),取出肺、肝、空、结肠及腹膜后、门静脉和肺门***,病理检测微转移。实验结果表明,在实验终点时,PBS对照组全部有多器官、组织肿瘤转移,wt-Ad5组肿瘤抑制率为25%±2%,10只裸鼠中8只发生肿瘤多器官转移;Ad5CMV-GFP肿瘤抑制率为-3%±4%;肿瘤转移的发生率为100%;ΔAD5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT31组3只裸鼠肿瘤完全消退,肿瘤抑制率为85%±4%,1只发生肿瘤空、结肠种植性转移。以上结果充分表明重组腺病毒构建体AD5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3静脉用药具有显著的体内抗肿瘤和抑制肿瘤转移的效应。
附件 DNA序列表
<110>深圳市奥尼克斯基因技术有限公司
<110>马丁 周剑峰 王世宣 卢运萍 韩志强
<120>选择性封闭肿瘤STAT3的新型溶瘤腺病毒构建体的获得及用途
<140>
<141>
<160>1
<170>
<210>1
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>misc_feature
<400>
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480
tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540
tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600
aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660
tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720
cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780
gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca 840
cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900
ccttgtaccg gaggtgatcg atcacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga 960
agagggtgag gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg 1020
tcattatcac cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag 1080
gacctgtggc atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt 1140
gggtttggtg tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt 1200
attgtgattt ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg 1260
gagcctgcaa gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca 1320
tcacctgtgt ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac 1380
acacctcctg agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga 1440
gttggtgggc gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa 1500
cctttggact tgagctgtaa acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg 1560
tggttaacgc ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg 1620
tttaacttgc atggcgtgtt aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg 1680
ctaatcttgg ttacatctga cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct 1740
gtgcgtaact tgctggaaca gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg 1800
ggctcatccc aggcaaagtt agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa 1860
gagcttttga aatcctgtgg tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt 1920
ttccaagaga aggtcatcaa gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct 1980
gttgcttttt tgagttttat aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg 2040
tacctgctgg attttctggc catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc 2100
ctgctactgt tgtcttccgt ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag 2160
caggaggaag ccaggcggcg gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg 2220
gaccctcggg aatgaatgtt gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt 2280
tgacaattac agaggatggg caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg 2340
aggctacaga ggaggctagg aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt 2400
gtattacttt tcaacagatc aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga 2460
agtattccat agagcagctg accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg 2520
ctattagggt atatgcaaag gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac 2580
ttgtaaatat caggaattgt tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata 2640
cggaggatag ggtggccttt agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca 2700
tggacggggt ggttattatg aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt 2760
tcctggccaa taccaacctt atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct 2820
gtgtggaagc ctggaccgat gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg 2880
gggtggtgtg tcgccccaaa agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta 2940
ccttgggtat cctgtctgag ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg 3000
gttgcttcat gctagtgaaa agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact 3060
gcgaggacag ggcctctcag atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga 3120
ccattcacgt agccagccac tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga 3180
cccgctgttc cttgcatttg ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt 3240
tgagtcacac taagatattg cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg 3300
tgtttgacat gaccatgaag atctggaagg tgctgaggta cgatgagacc cgcaccaggt 3360
gcagaccctg cgagtgtggc ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga 3420
ccgaggagct gaggcccgat cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta 3480
gcgatgaaga tacagattga ggtactgaaa tgtgtgggcg tggcttaagg gtgggaaaga 3540
atatataagg tgggggtctt atgtagtttt gtatctgttt tgcagcagcc gccgccgcca 3600
tgagcaccaa ctcgtttgat ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg cgcatgcccc 3660
catgggccgg ggtgcgtcag aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc cccgtcctgc 3720
ccgcaaactc tactaccttg acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg gagactgcag 3780
cctccgccgc cgcttcagcc gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact gactttgctt 3840
tcctgagccc gcttgcaagc agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat gacaagttga 3900
cggctctttt ggcacaattg gattctttga cccgggaact taatgtcgtt tctcagcagc 3960
tgttggatct gcgccagcag gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc aatgcggttt 4020
aaaacataaa taaaaaacca gactctgttt ggatttggat caagcaagtg tcttgctgtc 4080
tttatttagg ggttttgcgc gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg tcgttgaggg 4140
tcctgtgtat tttttccagg acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga tacatgggca 4200
taagcccgtc tctggggtgg aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc ggggtggtgt 4260
tgtagatgat ccagtcgtag caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg tctttcagta 4320
gcaagctgat tgccaggggc aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg ttaagctggg 4380
atgggtgcat acgtggggat atgagatgca tcttggactg tatttttagg ttggctatgt 4440
tcccagccat atccctccgg ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca gtgtatccgg 4500
tgcacttggg aaatttgtca tgtagcttag aaggaaatgc gtggaagaac ttggagacgc 4560
ccttgtgacc tccaagattt tccatgcatt cgtccataat gatggcaatg ggcccacggg 4620
cggcggcctg ggcgaagata tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt tccaggatga 4680
gatcgtcata ggccattttt acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc ggtataatgg 4740
ttccatccgg cccaggggcg tagttaccct cacagatttg catttcccac gctttgagtt 4800
cagatggggg gatcatgtct acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc ggggtagggg 4860
agatcagctg ggaagaaagc aggttcctga gcagctgcga cttaccgcag ccggtgggcc 4920
cgtaaatcac acctattacc gggtgcaact ggtagttaag agagctgcag ctgccgtcat 4980
ccctgagcag gggggccact tcgttaagca tgtccctgac tcgcatgttt tccctgacca 5040
aatccgccag aaggcgctcg ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa gcaaagtttt 5100
tcaacggttt gagaccgtcc gccgtaggca tgcttttgag cgtttgacca agcagttcca 5160
ggcggtccca cagctcggtc acctgctcta cggcatctcg atccagcata tctcctcgtt 5220
tcgcgggttg gggcggcttt cgctgtacgg cagtagtcgg tgctcgtcca gacgggccag 5280
ggtcatgtct ttccacgggc gcagggtcct cgtcagcgta gtctgggtca cggtgaaggg 5340
gtgcgctccg ggctgcgcgc tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc tggtgctgaa 5400
gcgctgccgg tcttcgccct gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg tgtcatagtc 5460
cagcccctcc gcggcgtggc ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg cgccgcacga 5520
ggggcagtgc agacttttga gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg attccgggga 5580
gtaggcatcc gcgccgcagg ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc aggtgagctc 5640
tggccgttcg gggtcaaaaa ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt tcttacctct 5700
ggtttccatg agccggtgtc cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt ccccgtatac 5760
agacttgaga ggcctgtcct cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata gaaactcgga 5820
ccactctgag acaaaggctc gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt gggaggggta 5880
gcggtcgttg tccactaggg ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca tgtcgccctc 5940
ttcggcatca aggaaggtga ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg gtgttcctga 6000
aggggggcta taaaaggggg tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg catcgctgtc 6060
tgcgagggcc agctgttggg gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga cttctgcgct 6120
aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc acctggcccg cggtgatgcc 6180
tttgagggtg gccgcatcca tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt caagcttggt 6240
ggcaaacgac ccgtagaggg cgttggacag caacttggcg atggagcgca gggtttggtt 6300
tttgtcgcga tcggcgcgct ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt cgcgcgcaac 6360
gcaccgccat tcgggaaaga cggtggtgcg ctcgtcgggc accaggtgca cgcgccaacc 6420
gcggttgtgc agggtgacaa ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta ggcgctcgtt 6480
ggtccagcag aggcggccgc ccttgcgcga gcagaatggc ggtagggggt ctagctgcgt 6540
ctcgtccggg gggtctgcgt ccacggtaaa gaccccgggc agcaggcgcg cgtcgaagta 6600
gtctatcttg catccttgca agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg caagcgcgcg 6660
ctcgtatggg ttgagtgggg gaccccatgg catggggtgg gtgagcgcgg aggcgtacat 6720
gccgcaaatg tcgtaaacgt agaggggctc tctgagtatt ccaagatatg tagggtagca 6780
tcttccaccg cggatgctgg cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg gagcgaggag 6840
gtcgggaccg aggttgctac gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct gcctgaagat 6900
ggcatgtgag ttggatgata tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg cgtctgtgag 6960
acctaccgcg tcacgcacga aggaggcgta ggagtcgcgc agcttgttga ccagctcggc 7020
ggtgacctgc acgtctaggg cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt catacttatc 7080
ctgtcccttt tttttccaca gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt ctttccagta 7140
ctcttggatc ggaaacccgt cggcctccga acggtaagag cctagcatgt agaactggtt 7200
gacggcctgg taggcgcagc atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct gcgcggcctt 7260
ccggagcgag gtgtgggtga gcgcaaaggt gtccctgacc atgactttga ggtactggta 7320
tttgaagtca gtgtcgtcgc atccgccctg ctcccagagc aaaaagtccg tgcgcttttt 7380
ggaacgcgga tttggcaggg cgaaggtgac atcgttgaag agtatctttc ccgcgcgagg 7440
cataaagttg cgtgtgatgc ggaagggtcc cggcacctcg gaacggttgt taattacctg 7500
ggcggcgagc acgatctcgt caaagccgtt gatgttgtgg cccacaatgt aaagttccaa 7560
gaagcgcggg atgcccttga tggaaggcaa ttttttaagt tcctcgtagg tgagctcttc 7620
aggggagctg agcccgtgct ctgaaagggc ccagtctgca agatgagggt tggaagcgac 7680
gaatgagctc cacaggtcac gggccattag catttgcagg tggtcgcgaa aggtcctaaa 7740
ctggcgacct atggccattt tttctggggt gatgcagtag aaggtaagcg ggtcttgttc 7800
ccagcggtcc catccaaggt tcgcggctag gtctcgcgcg gcagtcacta gaggctcatc 7860
tccgccgaac ttcatgacca gcatgaaggg cacgagctgc ttcccaaagg cccccatcca 7920
agtataggtc tctacatcgt aggtgacaaa gagacgctcg gtgcgaggat gcgagccgat 7980
cgggaagaac tggatctccc gccaccaatt ggaggagtgg ctattgatgt ggtgaaagta 8040
gaagtccctg cgacgggccg aacactcgtg ctggcttttg taaaaacgtg cgcagtactg 8100
gcagcggtgc acgggctgta catcctgcac gaggttgacc tgacgaccgc gcacaaggaa 8160
gcagagtggg aatttgagcc cctcgcctgg cgggtttggc tggtggtctt ctacttcggc 8220
tgcttgtcct tgaccgtctg gctgctcgag gggagttacg gtggatcgga ccaccacgcc 8280
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cagatgggag ctgtccatgg tctggagctc ccgcggcgtc aggtcaggcg ggagctcctg 8400
caggtttacc tcgcatagac gggtcagggc gcgggctaga tccaggtgat acctaatttc 8460
caggggctgg ttggtggcgg cgtcgatggc ttgcaagagg ccgcatcccc gcggcgcgac 8520
tacggtaccg cgcggcgggc ggtgggccgc gggggtgtcc ttggatgatg catctaaaag 8580
cggtgacgcg ggcgagcccc cggaggtagg gggggctccg gacccgccgg gagagggggc 8640
aggggcacgt cggcgccgcg cgcgggcagg agctggtgct gcgcgcgtag gttgctggcg 8700
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aactgctcga tctcttcctc ctggagatct ccgcgtccgg ctcgctccac ggtggcggcg 8940
aggtcgttgg aaatgcgggc catgagctgc gagaaggcgt tgaggcctcc ctcgttccag 9000
acgcggctgt agaccacgcc cccttcggca tcgcgggcgc gcatgaccac ctgcgcgaga 9060
ttgagctcca cgtgccgggc gaagacggcg tagtttcgca ggcgctgaaa gaggtagttg 9120
agggtggtgg cggtgtgttc tgccacgaag aagtacataa cccagcgtcg caacgtggat 9180
tcgttgatat cccccaaggc ctcaaggcgc tccatggcct cgtagaagtc cacggcgaag 9240
ttgaaaaact gggagttgcg cgccgacacg gttaactcct cctccagaag acggatgagc 9300
tcggcgacag tgtcgcgcac ctcgcgctca aaggctacag gggcctcttc ttcttcttca 9360
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cggcgacggc gcatggtctc ggtgacggcg cggccgttct cgcgggggcg cagttggaag 9540
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gcgctaacga tgcatctcaa caattgttgt gtaggtactc cgccgccgag ggacctgagc 9660
gagtccgcat cgaccggatc ggaaaacctc tcgagaaagg cgtctaacca gtcacagtcg 9720
caaggtaggc tgagcaccgt ggcgggcggc agcgggcggc ggtcggggtt gtttctggcg 9780
gaggtgctgc tgatgatgta attaaagtag gcggtcttga gacggcggat ggtcgacaga 9840
agcaccatgt ccttgggtcc ggcctgctga atgcgcaggc ggtcggccat gccccaggct 9900
tcgttttgac atcggcgcag gtctttgtag tagtcttgca tgagcctttc taccggcact 9960
tcttcttctc cttcctcttg tcctgcatct cttgcatcta tcgctgcggc ggcggcggag 10020
tttggccgta ggtggcgccc tcttcctccc atgcgtgtga ccccgaagcc cctcatcggc 10080
tgaagcaggg ctaggtcggc gacaacgcgc tcggctaata tggcctgctg cacctgcgtg 10140
agggtagact ggaagtcatc catgtccaca aagcggtggt atgcgcccgt gttgatggtg 10200
taagtgcagt tggccataac ggaccagtta acggtctggt gacccggctg cgagagctcg 10260
gtgtacctga gacgcgagta agccctcgag tcaaatacgt agtcgttgca agtccgcacc 10320
aggtactggt atcccaccaa aaagtgcggc ggcggctggc ggtagagggg ccagcgtagg 10380
gtggccgggg ctccgggggc gagatcttcc aacataaggc gatgatatcc gtagatgtac 10440
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ttccagatgt tgcgcagcgg caaaaagtgc tccatggtcg ggacgctctg gccggtcagg 10560
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gacgtcagac aacgggggag tgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc ggctgctgcg 10800
ctagcttttt tggccactgg ccgcgcgcag cgtaagcggt taggctggaa agcgaaagca 10860
ttaagtggct cgctccctgt agccggaggg ttattttcca agggttgagt cgcgggaccc 10920
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cggcagacat gcagggcacc ctcccctcct cctaccgcgt caggaggggc gacatccgcg 11160
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gagcgcatcc acaaggccgt gagcgtgagc cggcggcgcg agctcagcga ccgcgagctg 12060
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ccgtaaacct gagccaggct ttcaaaaact tgcaggggct gtggggggtg cgggctccca 12960
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actacctgct gaccaaccgg cggcagaaga tcccctcgtt gcacagttta aacagcgagg 13260
aggagcgcat tttgcgctac gtgcagcaga gcgtgagcct taacctgatg cgcgacgggg 13320
taacgcccag cgtggcgctg gacatgaccg cgcgcaacat ggaaccgggc atgtatgcct 13380
caaaccggcc gtttatcaac cgcctaatgg actacttgca tcgcgcggcc gccgtgaacc 13440
ccgagtattt caccaatgcc atcttgaacc cgcactggct accgccccct ggtttctaca 13500
ccgggggatt cgaggtgccc gagggtaacg atggattcct ctgggacgac atagacgaca 13560
gcgtgttttc cccgcaaccg cagaccctgc tagagttgca acagcgcgag caggcagagg 13620
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ctctataccc tacctagatg gaacctttta cctcaaccac acctttaaga aggtggccat 21000
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cggaccagcg cggccacttc cccgccagga accttgacaa aagaacccac actgattatg 34860
acacgcatac tcggagctat gctaaccagc gtagccccga tgtaagcttt gttgcatggg 34920
cggcgatata aaatgcaagg tgctgctcaa aaaatcaggc aaagcctcgc gcaaaaaaga 34980
aagcacatcg tagtcatgct catgcagata aaggcaggta agctccggaa ccaccacaga 35040
aaaagacacc atttctctct caaacatgtc tgcgggtttc tgcataaaca caaaataaaa 35100
taacaaaaaa acatttaaac attagaagcc tgtcttacaa caggaaaaac aacccttata 35160
agcataagac ggactacggc catgccggcg tgaccgtaaa aaaactggtc accgtgatta 35220
aaaagcacca ccgacagctc ctcggtcatg tccggagtca taatgtaaga ctcggtaaac 35280
acatcaggtt gattcatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg ggggaataca 35340
tacccgcagg cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa aattaatagg 35400
agagaaaaac acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag caccctcccg 35460
ctccagaaca acatacagcg cttcacagcg gcagcctaac agtcagcctt accagtaaaa 35520
aagaaaacct attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta 35580
aaaaagggcc aagtgcagag cgagtatata taggactaaa aaatgacgta acggttaaag 35640
tccacaaaaa acacccagaa aaccgcacgc gaacctacgc ccagaaacga aagccaaaaa 35700
acccacaact tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg ttacgtaact tcccatttta 35760
agaaaactac aattcccaac acatacaagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc 35820
ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca 35880
atccaaaata aggtatatta ttgatgatg 35909
附录1:重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3的序列及结构说明
1 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt
61 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt
121 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg
181 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag
241 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga
301 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg
361 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc
421 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg
481 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc
541 tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga
601 aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc
661 tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc
721 cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt
781 gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca
841 cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa
901 ccttgtaccg gaggtgatcg at ccac ccagtgacga
空缺部分为缺失部分
961 cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg
1021 caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg
1081 ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga
1141 tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa
1201 gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag
1261 ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga
1321 cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt
1381 ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt
1441 gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag
1501 cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga
1561 ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt
1621 gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg
1681 cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat
1741 ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg
1801 tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg
1861 gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac
1921 caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct
1981 gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg
2041 agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac
2101 aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag
2161 cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga
2221 gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga
2281 gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg
2341 gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc
2401 gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc
2461 tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt
2521 ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga
2581 tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg
2641 agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg
2701 tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg
2761 gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta
2821 acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct
2881 gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg
2941 aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct
3001 ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat
3061 gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc
3121 tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata
3181 acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc
3241 aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc
3301 tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc
3361 gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc
3421 tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt
3481 ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg
3541 tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg
3601 ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc
3661 gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc
3721 ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg
3781 agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg
3841 actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg
3901 acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt
3961 ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca
4021 atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt
4081 cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt
4141 cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat
4201 acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg
4261 gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt
4321 ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt
4381 taagctggga tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt
4441 tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag
4501 tgtatccggt gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact
4561 tggagacgcc cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg
4621 gcccacgggc ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt
4681 ccaggatgag atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg
4741 gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg
4801 ctttgagttc agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg
4861 gggtagggga gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc
4921 cggtgggccc gtaaatcaca cctattaccg ggtgcaactg gtagttaaga gagctgcagc
4981 tgccgtcatc cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt
5041 ccctgaccaa atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag
5101 caaagttttt caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa
5161 gcagttccag gcggtcccac agctcggtca cctgctctac ggcatctcga tccagcatat
5221 ctcctcgttt cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag
5281 acgggccagg gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac
5341 ggtgaagggg tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct
5401 ggtgctgaag cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt
5461 gtcatagtcc agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc
5521 gccgcacgag gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga
5581 ttccggggag taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca
5641 ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt
5701 cttacctctg gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc
5761 cccgtataca gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag
5821 aaactcggac cactctgaga caaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg
5881 ggaggggtag cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat
5941 gtcgccctct tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg
6001 tgttcctgaa ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc
6061 atcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctgaaaag cgggcatgac
6121 ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc
6181 ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcatccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc
6241 aagcttggtg gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc aacttggcga tggagcgcag
6301 ggtttggttt ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc
6361 gcgcgcaacg caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ccaggtgcac
6421 gcgccaaccg cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag
6481 gcgctcgttg gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagggggtc
6541 tagctgcgtc tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc
6601 gtcgaagtag tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc
6661 aagcgcgcgc tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga
6721 ggcgtacatg ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt
6781 agggtagcat cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg
6841 agcgaggagg tcgggaccga ggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agactatctg
6901 cctgaagatg gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctggc
6961 gtctgtgaga cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac
7021 cagctcggcg gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc
7081 atacttatcc tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc
7141 tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta
7201 gaactggttg acggcctggt aggcgcagca tcccttttct acgggtagcg cgtatgcctg
7261 cgcggccttc cggagcgagg tgtgggtgag cgcaaaggtg tccctgacca tgactttgag
7321 gtactggtat ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt
7381 gcgctttttg gaacgcggat ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc
7441 cgcgcgaggc ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt
7501 aattacctgg gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg atgttgtggc ccacaatgta
7561 aagttccaag aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat tttttaagtt cctcgtaggt
7621 gagctcttca ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc cagtctgcaa gatgagggtt
7681 ggaagcgacg aatgagctcc acaggtcacg ggccattagc atttgcaggt ggtcgcgaaa
7741 ggtcctaaac tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgg
7801 gtcttgttcc cagcggtccc atccaaggtt cgcggctagg tctcgcgcgg cagtcactag
7861 aggctcatct ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc
7921 ccccatccaa gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg
7981 cgagccgatc gggaagaact ggatctcccg ccaccaattg gaggagtggc tattgatgtg
8041 gtgaaagtag aagtccctgc gacgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaaacgtgc
8101 gcagtactgg cagcggtgca cgggctgtac atcctgcacg aggttgacct gacgaccgcg
8161 cacaaggaag cagagtggga atttgagccc ctcgcctggc gggtttggct ggtggtcttc
8221 tacttcggct gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcggac
8281 caccacgccg cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac
8341 aacatcgcgc agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg
8401 gagctcctgc aggtttacct cgcatagacg ggtcagggcg cgggctagat ccaggtgata
8461 cctaatttcc aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg
8521 cggcgcgact acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg ggggtgtcct tggatgatgc
8581 atctaaaagc ggtgacgcgg gcgagccccc ggaggtaggg ggggctccgg acccgccggg
8641 agagggggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcagga gctggtgctg cgcgcgtagg
8701 ttgctggcga acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa tctggcgcct ctgcgtgaag
8761 acgacgggcc cggtgagctt gagcctgaaa gagagttcga cagaatcaat ttcggtgtcg
8821 ttgacggcgg cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg agttgtcttg ataggcgatc
8881 tcggccatga actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc cgcgtccggc tcgctccacg
8941 gtggcggcga ggtcgttgga aatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc
9001 tcgttccaga cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc
9061 tgcgcgagat tgagctccac gtgccgggcg aagacggcgt agtttcgcag gcgctgaaag
9121 aggtagttga gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgtcgc
9181 aacgtggatt cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc
9241 acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg ttaactcctc ctccagaaga
9301 cggatgagct cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa aggctacagg ggcctcttct
9361 tcttcttcaa tctcctcttc cataagggcc tccccttctt cttcttctgg cggcggtggg
9421 ggagggggga cacggcggcg acgacggcgc accgggaggc ggtcgacaaa gcgctcgatc
9481 atctccccgc ggcgacggcg catggtctcg gtgacggcgc ggccgttctc gcgggggcgc
9541 agttggaaga cgccgcccgt catgtcccgg ttatgggttg gcggggggct gccatgcggc
9601 agggatacgg cgctaacgat gcatctcaac aattgttgtg taggtactcc gccgccgagg
9661 gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag
9721 tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggcggcg gtcggggttg
9781 tttctggcgg aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg
9841 gtcgacagaa gcaccatgtc cttgggtccg gcctgctgaa tgcgcaggcg gtcggccatg
9901 ccccaggctt cgttttgaca tcggcgcagg tctttgtagt agtcttgcat gagcctttct
9961 accggcactt cttcttctcc ttcctcttgt cctgcatctc ttgcatctat cgctgcggcg
10021 gcggcggagt ttggccgtag gtggcgccct cttcctccca tgcgtgtgac cccgaagccc
10081 ctcatcggct gaagcagggc taggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc
10141 acctgcgtga gggtagactg gaagtcatcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg
10201 ttgatggtgt aagtgcagtt ggccataacg gaccagttaa cggtctggtg acccggctgc
10261 gagagctcgg tgtacctgag acgcgagtaa gccctcgagt caaatacgta gtcgttgcaa
10321 gtccgcacca ggtactggta tcccaccaaa aagtgcggcg gcggctggcg gtagaggggc
10381 cagcgtaggg tggccggggc tccgggggcg agatcttcca acataaggcg atgatatccg
10441 tagatgtacc tggacatcca ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cggaaagtcg
10501 cggacgcggt tccagatgtt gcgcagcggc aaaaagtgct ccatggtcgg gacgctctgg
10561 ccggtcaggc gcgcgcaatc gttgacgctc tagaccgtgc aaaaggagag cctgtaagcg
10621 ggcactcttc cgtggtctgg tggataaatt cgcaagggta tcatggcgga cgaccggggt
10681 tcgagccccg tatccggccg tccgccgtga tccatgcggt taccgcccgc gtgtcgaacc
10741 caggtgtgcg acgtcagaca acgggggagt gctccttttg gcttccttcc aggcgcggcg
10801 gctgctgcgc tagctttttt ggccactggc cgcgcgcagc gtaagcggtt aggctggaaa
10861 gcgaaagcat taagtggctc gctccctgta gccggagggt tattttccaa gggttgagtc
10921 gcgggacccc cggttcgagt ctcggaccgg ccggactgcg gcgaacgggg gtttgcctcc
10981 ccgtcatgca agaccccgct tgcaaattcc tccggaaaca gggacgagcc ccttttttgc
11041 ttttcccaga tgcatccggt gctgcggcag atgcgccccc ctcctcagca gcggcaagag
11101 caagagcagc ggcagacatg cagggcaccc tcccctcctc ctaccgcgtc aggaggggcg
11161 acatccgcgg ttgacgcggc agcagatggt gattacgaac ccccgcggcg ccgggcccgg
11221 cactacctgg acttggagga gggcgagggc ctggcgcggc taggagcgcc ctctcctgag
11281 cggtacccaa gggtgcagct gaagcgtgat acgcgtgagg cgtacgtgcc gcggcagaac
11341 ctgtttcgcg accgcgaggg agaggagccc gaggagatgc gggatcgaaa gttccacgca
11401 gggcgcgagc tgcggcatgg cctgaatcgc gagcggttgc tgcgcgagga ggactttgag
11461 cccgacgcgc gaaccgggat tagtcccgcg cgcgcacacg tggcggccgc cgacctggta
11521 accgcatacg agcagacggt gaaccaggag attaactttc aaaaaagctt taacaaccac
11581 gtgcgtacgc ttgtggcgcg cgaggaggtg gctataggac tgatgcatct gtgggacttt
11641 gtaagcgcgc tggagcaaaa cccaaatagc aagccgctca tggcgcagct gttccttata
11701 gtgcagcaca gcagggacaa cgaggcattc agggatgcgc tgctaaacat agtagagccc
11761 gagggccgct ggctgctcga tttgataaac atcctgcaga gcatagtggt gcaggagcgc
11821 agcttgagcc tggctgacaa ggtggccgcc atcaactatt ccatgcttag cctgggcaag
11881 ttttacgccc gcaagatata ccatacccct tacgttccca tagacaagga ggtaaagatc
11941 gaggggttct acatgcgcat ggcgctgaag gtgcttacct tgagcgacga cctgggcgtt
12001 tatcgcaacg agcgcatcca caaggccgtg agcgtgagcc ggcggcgcga gctcagcgac
12061 cgcgagctga tgcacagcct gcaaagggcc ctggctggca cgggcagcgg cgatagagag
12121 gccgagtcct actttgacgc gggcgctgac ctgcgctggg ccccaagccg acgcgccctg
12181 gaggcagctg gggccggacc tgggctggcg gtggcacccg cgcgcgctgg caacgtcggc
12241 ggcgtggagg aatatgacga ggacgatgag tacgagccag aggacggcga gtactaagcg
12301 gtgatgtttc tgatcagatg atgcaagacg caacggaccc ggcggtgcgg gcggcgctgc
12361 agagccagcc gtccggcctt aactccacgg acgactggcg ccaggtcatg gaccgcatca
12421 tgtcgctgac tgcgcgcaat cctgacgcgt tccggcagca gccgcaggcc aaccggctct
12481 ccgcaattct ggaagcggtg gtcccggcgc gcgcaaaccc cacgcacgag aaggtgctgg
12541 cgatcgtaaa cgcgctggcc gaaaacaggg ccatccggcc cgacgaggcc ggcctggtct
12601 acgacgcgct gcttcagcgc gtggctcgtt acaacagcgg caacgtgcag accaacctgg
12661 accggctggt gggggatgtg cgcgaggccg tggcgcagcg tgagcgcgcg cagcagcagg
12721 gcaacctggg ctccatggtt gcactaaacg ccttcctgag tacacagccc gccaacgtgc
12781 cgcggggaca ggaggactac accaactttg tgagcgcact gcggctaatg gtgactgaga
12841 caccgcaaag tgaggtgtac cagtctgggc cagactattt tttccagacc agtagacaag
12901 gcctgcagac cgtaaacctg agccaggctt tcaaaaactt gcaggggctg tggggggtgc
12961 gggctcccac aggcgaccgc gcgaccgtgt ctagcttgct gacgcccaac tcgcgcctgt
13021 tgctgctgct aatagcgccc ttcacggaca gtggcagcgt gtcccgggac acatacctag
13081 gtcacttgct gacactgtac cgcgaggcca taggtcaggc gcatgtggac gagcatactt
13141 tccaggagat tacaagtgtc agccgcgcgc tggggcagga ggacacgggc agcctggagg
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13321 gcgacggggt aacgcccagc gtggcgctgg acatgaccgc gcgcaacatg gaaccgggca
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13681 gcgctgcggc cccgcggtca gatgctagta gcccatttcc aagcttgata gggtctctta
13741 ccagcactcg caccacccgc ccgcgcctgc tgggcgagga ggagtaccta aacaactcgc
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13861 gcctagtgga caagatgagt agatggaaga cgtacgcgca ggagcacagg gacgtgccag
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13981 acgatgactc ggcagacgac agcagcgtcc tggatttggg agggagtggc aacccgtttg
14041 cgcaccttcg ccccaggctg gggagaatgt tttaaaaaaa aaaaagcatg atgcaaaata
14101 aaaaactcac caaggccatg gcaccgagcg ttggttttct tgtattcccc ttagtatgcg
14161 gcgcgcggcg atgtatgagg aaggtcctcc tccctcctac gagagtgtgg tgagcgcggc
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14461 cccgggggag gcaagcacac agaccatcaa tcttgacgac cggtcgcact ggggcggcga
14521 cctgaaaacc atcctgcata ccaacatgcc aaatgtgaac gagttcatgt ttaccaataa
14581 gtttaaggcg cgggtgatgg tgtcgcgctt gcctactaag gacaatcagg tggagctgaa
14641 atacgagtgg gtggagttca cgctgcccga gggcaactac tccgagacca tgaccataga
14701 ccttatgaac aacgcgatcg tggagcacta cttgaaagtg ggcagacaga acggggttct
14761 ggaaagcgac atcggggtaa agtttgacac ccgcaacttc agactggggt ttgaccccgt
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14881 gctgccagga tgcggggtgg acttcaccca cagccgcctg agcaacttgt tgggcatccg
14941 caagcggcaa cccttccagg agggctttag gatcacctac gatgatctgg agggtggtaa
15001 cattcccgca ctgttggatg tggacgccta ccaggcgagc ttgaaagatg acaccgaaca
15061 gggcgggggt ggcgcaggcg gcagcaacag cagtggcagc ggcgcggaag agaactccaa
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15301 gacagaggac agcaagaaac gcagttacaa cctaataagc aatgacagca ccttcaccca
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15781 cattactgac gccagacgcc gcacctgccc ctacgtttac aaggccctgg gcatagtctc
15841 gccgcgcgtc ctatcgagcc gcactttttg agcaagcatg tccatcctta tatcgcccag
15901 caataacaca ggctggggcc tgcgcttccc aagcaagatg tttggcgggg ccaagaagcg
15961 ctccgaccaa cacccagtgc gcgtgcgcgg gcactaccgc gcgccctggg gcgcgcacaa
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16441 cgtgcccgtg cgcacccgcc ccccgcgcaa ctagattgca agaaaaaact acttagactc
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16561 caaagaagag atgctccagg tcatcgcgcc ggagatctat ggccccccga agaaggaaga
16621 gcaggattac aagccccgaa agctaaagcg ggtcaaaaag aaaaagaaag atgatgatga
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16741 gaaaggtcga cgcgtaaaac gtgttttgcg acccggcacc accgtagtct ttacgcccgg
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18661 cgttgcggcc cgtagccagt ggcaactggc aaagcacact gaacagcatc gtgggtctgg
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18781 atgtatgcgt ccatgtcgcc gccagaggag ctgctgagcc gccgcgcgcc cgctttccaa
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19261 tgctcttgaa ataaacctag aagaagagga cgatgacaac gaagacgaag tagacgagca
19321 agctgagcag caaaaaactc acgtatttgg gcaggcgcct tattctggta taaatattac
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19441 tcaacctgaa cctcaaatag gagaatctca gtggtacgaa actgaaatta atcatgcagc
19501 tgggagagtc cttaaaaaga ctaccccaat gaaaccatgt tacggttcat atgcaaaacc
19561 cacaaatgaa aatggagggc aaggcattct tgtaaagcaa caaaatggaa agctagaaag
19621 tcaagtggaa atgcaatttt tctcaactac tgaggcgacc gcaggcaatg gtgataactt
19681 gactcctaaa gtggtattgt acagtgaaga tgtagatata gaaaccccag acactcatat
19741 ttcttacatg cccactatta aggaaggtaa ctcacgagaa ctaatgggcc aacaatctat
19801 gcccaacagg cctaattaca ttgcttttag ggacaatttt attggtctaa tgtattacaa
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20041 tattgaaaat catggaactg aagatgaact tccaaattac tgctttccac tgggaggtgt
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26221 gccgccgcca cccacggacg aggaggaata ctgggacagt caggcagagg aggttttgga
26281 cgaggaggag gaggacatga tggaagactg ggagagccta gacgaggaag cttccgaggt
26341 cgaagaggtg tcagacgaaa caccgtcacc ctcggtcgca ttcccctcgc cggcgcccca
26401 gaaatcggca accggttcca gcatggctac aacctccgct cctcaggcgc cgccggcact
26461 gcccgttcgc cgacccaacc gtagatggga caccactgga accagggccg gtaagtccaa
26521 gcagccgccg ccgttagccc aagagcaaca acagcgccaa ggctaccgct catggcgcgg
26581 gcacaagaac gccatagttg cttgcttgca agactgtggg ggcaacatct ccttcgcccg
26641 ccgctttctt ctctaccatc acggcgtggc cttcccccgt aacatcctgc attactaccg
26701 tcatctctac agcccatact gcaccggcgg cagcggcagc ggcagcaaca gcagcggcca
26761 cacagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa gcccaagaaa tccacagcgg
26821 cggcagcagc aggaggagga gcgctgcgtc tggcgcccaa cgaacccgta tcgacccgcg
26881 agcttagaaa caggattttt cccactctgt atgctatatt tcaacagagc aggggccaag
26941 aacaagagct gaaaataaaa aacaggtctc tgcgatccct cacccgcagc tgcctgtatc
27001 acaaaagcga agatcagctt cggcgcacgc tggaagacgc ggaggctctc ttcagtaaat
27061 actgcgcgct gactcttaag gactagtttc gcgccctttc tcaaatttaa gcgcgaaaac
27121 tacgtcatct ccagcggcca cacccggcgc cagcacctgt cgtcagcgcc attatgagca
27181 aggaaattcc cacgccctac atgtggagtt accagccaca aatgggactt gcggctggag
27241 ctgcccaaga ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc gggaccccac atgatatccc
27301 gggtcaacgg aatccgcgcc caccgaaacc gaattctctt ggaacaggcg gctattacca
27361 ccacacctcg taataacctt aatccccgta gttggcccgc tgccctggtg taccaggaaa
27421 gtcccgctcc caccactgtg gtacttccca gagacgccca ggccgaagtt cagatgacta
27481 actcaggggc gcagcttgcg ggcggctttc gtcacagggt gcggtcgccc gggcagggta
27541 taactcacct gacaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa cgacgagtcg gtgagctcct
27601 cgcttggtct ccgtccggac gggacatttc agatcggcgg cgccggccgt ccttcattca
27661 cgcctcgtca ggcaatccta actctgcaga cctcgtcctc tgagccgcgc tctggaggca
27721 ttggaactct gcaatttatt gaggagtttg tgccatcggt ctactttaac cccttctcgg
27781 gacctcccgg ccactatccg gatcaattta ttcctaactt tgacgcggta aaggactcgg
27841 cggacggcta cgactgaatg ttaagtggag aggcagagca actgcgcctg aaacacctgg
27901 tccactgtcg ccgccacaag tgctttgccc gcgactccgg tgagttttgc tactttgaat
27961 tgcccgagga tcatatcgag ggcccggcgc acggcgtccg gcttaccgcc cagggagagc
28021 ttgcccgtag cctgattcgg gagtttaccc agcgccccct gctagttgag cgggacaggg
28081 gaccctgtgt tctcactgtg atttgcaact gtcctaacct tggattacat caagatcttt
28141 gttgccatct ctgtgctgag tataataaat acagaaatta aaatatactg gggctcctat
28201 cgccatcctg taaacgccac cgtcttcacc cgcccaagca aaccaaggcg aaccttacct
28261 ggtactttta acatctctcc ctctgtgatt tacaacagtt tcaacccaga cggagtgagt
28321 ctacgagaga acctctccga gctcagctac tccatcagaa aaaacaccac cctccttacc
28381 tgccgggaac gtacgagtgc gtcaccggcc gctgcaccac acctaccgcc tgaccgtaaa
28441 ccagactttt tccggacaga cctcaataac tctgtttacc agaacaggag gtgagcttag
28501 aaaaccctta gggtattagg ccaaaggcgc agctactgtg gggtttatga acaattcaag
28561 caactctacg ggctattcta attcaggttt ctctagaatc ggggttgggg ttattctctg
28621 tcttgtgatt ctctttattc ttatactaac gcttctctgc ctaaggctcg ccgcctgctg
28681 tgtgcacatt tgcatttatt gtcagctttt taaacgctgg ggtcgccacc caagatgatt
28741 aggtacataa tcctaggttt actcaccctt gcgtcagccc acggtaccac ccaaaaggtg
28801 gattttaagg agccagcctg taatgttaca ttcgcagctg aagctaatga gtgcaccact
28861 cttataaaat gcaccacaga acatgaaaag ctgcttattc gccacaaaaa caaaattggc
28921 aagtatgctg tttatgctat ttggcagcca ggtgacacta cagagtataa tgttacagtt
28981 ttccagggta aaagtcataa aacttttatg tatacttttc cattttatga aatgtgcgac
29041 attaccatgt acatgagcaa acagtataag ttgtggcccc cacaaaattg tgtggaaaac
29101 actggcactt tctgctgcac tgctatgcta attacagtgc tcgctttggt ctgtacccta
29161 ctctatatta aatacaaaag cagacgcagc tttattgagg aaaagaaaat gccttaattt
29221 actaagttac aaagctaatg tcaccactaa ctgctttact cgctgcttgc aaaacaaatt
29281 caaaaagtta gcattataat tagaatagga tttaaacccc ccggtcattt cctgctcaat
29341 accattcccc tgaacaattg actctatgtg ggatatgctc cagcgctaca accttgaagt
29401 caggcttcct ggatgtcagc atctgacttt ggccagcacc tgtcccgcgg atttgttcca
29461 gtccaactac agcgac (此处缺失29477-29714nt)
ATC GAT(人为加入的ClaI酶切位点) (以下大写部分为反义STAT3序列)
TTGCCGCCTCTTCCAGTCAGCCAGCTCCTCGTCCGTGAGAGTTTTCTGCACGTACTCCATCGCTG
ACAAAAGCCCCGCCAGCTCACTCACGATGCTTCTCCGCATCTGGTCCAGCGCAGTGAGCATCTGT
TCCAGCTGCTGCATCTTCTGCCTGGTCACTGACTGGTTGTTTCCATTCAGATCTTGCATGTCTCC
TTGACTCTTGAGGGTTTTATAGTTGAAATCAAAGTCATCCTGGAGATTCTCTACCACTTTCATTT
TCTGTTCTAGATCCTGCACTCTCTTCCGGACATCCTGAAGGTGCTGCTCCAGCATCTGCTGCT
TCTCCGTCACCACGGCTGCTGTGGGGTGGTTGGCCTGGCCCCCTTGCTGGGCCGCAGTGGCTG
CAGTCTGTAGAAGGCGTGATTCTTCCCACAGGCACCGGGCCACAATCCGGGCAATCTCCATTG
GCTTCTCAAGATACCTGCTCTGAAGAAACTGCTTGATTCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAA
CATTCGACTCTTGCAGGAAGCGGCTATACTGCTGGTCAATCTCTCCCAGGAGATTATGAAACA
CCAAAGTGGCATGTGATTCTTTGCTGGCCGCATATGCCCAATCTTGACTCTCAATCCAAGGGG
CCAGAAACTGCCGCAGCTCCATTGGGAAGCTGTCACTGTAGAGCTGATGGAGCTGCTCCAGGT
ACCGTGTGTCAAGCTGCTGTAGCTGATTCCATTGGGCCATCCTGTTTCTCCGGCAGAGGCCGA
GAGGCC ATC GAT(人为加入的ClaI酶切位点)
29701 atgatgg aatccataga ttggacggac tgaaacacat gttcttttct
29761 cttacagtat gattaaatga gacatgattc ctcgagtttt tatattactg acccttgttg
29821 cgcttttttg tgcgtgctcc acattggctg cggtttctca catcgaagta gactgcattc
29881 cagccttcac agtctatttg ctttacggat ttgtcaccct cacgctcatc tgcagcctca
29941 tcactgtggt catcgccttt atccagtgca ttgactgggt ctgtgtgcgc tttgcatatc
30001 tcagacacca tccccagtac agggacagga ctatagctga gcttcttaga attctttaat
30061 tatgaaattt actgtgactt ttctgctgat tatttgcacc ctatctgcgt tttgttcccc
30121 gacctccaag cctcaaagac atatatcatg cagattcact cgtatatgga atattccaag
30181 ttgctacaat gaaaaaagcg atctttccga agcctggtta tatgcaatca tctctgttat
30241 ggtgttctgc agtaccatct tagccctagc tatatatccc taccttgaca ttggctggaa
30301 acgaatagat gccatgaacc acccaacttt ccccgcgccc gctatgcttc cactgcaaca
30361 agttgttgcc ggcggctttg tcccagccaa tcagcctcgc cccacttctc ccacccccac
30421 tgaaatcagc tactttaatc taacaggagg agatgactga caccctagat ctagaaatgg
30481 acggaattat tacagagcag cgcctgctag aaagacgcag ggcagcggcc gagcaacagc
30541 gcatgaatca agagctccaa gacatggtta acttgcacca gtgcaaaagg ggtatctttt
30601 gtctggtaaa gcaggccaaa gtcacctacg acagtaatac caccggacac cgccttagct
30661 acaagttgcc aaccaagcgt cagaaattgg tggtcatggt gggagaaaag cccattacca
30721 taactcagca ctcggtagaa accgaaggct gcattcactc accttgtcaa ggacctgagg
30781 atctctgcac ccttattaag accctgtgcg gtctcaaaga tcttattccc tttaactaat
30841 aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta aaatcagtta gcaaatttct gtccagttta
30901 ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag ctctggtatt gcagcttcct cctggctgca
30961 aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca gtttcctcct gttcctgtcc atccgcaccc
31021 actatcttca tgttgttgca gatgaagcgc gcaagaccgt ctgaagatac cttcaacccc
31081 gtgtatccat atgacacgga aaccggtcct ccaactgtgc cttttcttac tcctcccttt
31141 gtatccccca atgggtttca agagagtccc cctggggtac tctctttgcg cctatccgaa
31201 cctctagtta cctccaatgg catgcttgcg ctcaaaatgg gcaacggcct ctctctggac
31261 gaggccggca accttacctc ccaaaatgta accactgtga gcccacctct caaaaaaacc
31321 aagtcaaaca taaacctgga aatatctgca cccctcacag ttacctcaga agccctaact
31381 gtggctgccg ccgcacctct aatggtcgcg ggcaacacac tcaccatgca atcacaggcc
31441 ccgctaaccg tgcacgactc caaacttagc attgccaccc aaggacccct cacagtgtca
31501 gaaggaaagc tagccctgca aacatcaggc cccctcacca ccaccgatag cagtaccctt
31561 actatcactg cctcaccccc tctaactact gccactggta gcttgggcat tgacttgaaa
31621 gagcccattt atacacaaaa tggaaaacta ggactaaagt acggggctcc tttgcatgta
31681 acagacgacc taaacacttt gaccgtagca actggtccag gtgtgactat taataatact
31741 tccttgcaaa ctaaagttac tggagccttg ggttttgatt cacaaggcaa tatgcaactt
31801 aatgtagcag gaggactaag gattgattct caaaacagac gccttatact tgatgttagt
31861 tatccgtttg atgctcaaaa ccaactaaat ctaagactag gacagggccc tctttttata
31921 aactcagccc acaacttgga tattaactac aacaaaggcc tttacttgtt tacagcttca
31981 aacaattcca aaaagcttga ggttaaccta agcactgcca aggggttgat gtttgacgct
32041 acagccatag ccattaatgc aggagatggg cttgaatttg gttcacctaa tgcaccaaac
32101 acaaatcccc tcaaaacaaa aattggccat ggcctagaat ttgattcaaa caaggctatg
32161 gttcctaaac taggaactgg ccttagtttt gacagcacag gtgccattac agtaggaaac
32221 aaaaataatg ataagctaac tttgtggacc acaccagctc catctcctaa ctgtagacta
32281 aatgcagaga aagatgctaa actcactttg gtcttaacaa aatgtggcag tcaaatactt
32341 gctacagttt cagttttggc tgttaaaggc agtttggctc caatatctgg aacagttcaa
32401 agtgctcatc ttattataag atttgacgaa aatggagtgc tactaaacaa ttccttcctg
32461 gacccagaat attggaactt tagaaatgga gatcttactg aaggcacagc ctatacaaac
32521 gctgttggat ttatgcctaa cctatcagct tatccaaaat ctcacggtaa aactgccaaa
32581 agtaacattg tcagtcaagt ttacttaaac ggagacaaaa ctaaacctgt aacactaacc
32641 attacactaa acggtacaca ggaaacagga gacacaactc caagtgcata ctctatgtca
32701 ttttcatggg actggtctgg ccacaactac attaatgaaa tatttgccac atcctcttac
32761 actttttcat acattgccca agaataaaga atcgtttgtg ttatgtttca acgtgtttat
32821 ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt ttcattcagt agtatagccc caccaccaca
32881 tagcttatac agatcaccgt accttaatca aactcacaga accctagtat tcaacctgcc
32941 acctccctcc caacacacag agtacacagt cctttctccc cggctggcct taaaaagcat
33001 catatcatgg gtaacagaca tattcttagg tgttatattc cacacggttt cctgtcgagc
33061 caaacgctca tcagtgatat taataaactc cccgggcagc tcacttaagt tcatgtcgct
33121 gtccagctgc tgagccacag gctgctgtcc aacttgcggt tgcttaacgg gcggcgaagg
33181 agaagtccac gcctacatgg gggtagagtc ataatcgtgc atcaggatag ggcggtggtg
33241 ctgcagcagc gcgcgaataa actgctgccg ccgccgctcc gtcctgcagg aatacaacat
33301 ggcagtggtc tcctcagcga tgattcgcac cgcccgcagc ataaggcgcc ttgtcctccg
33361 ggcacagcag cgcaccctga tctcacttaa atcagcacag taactgcagc acagcaccac
33421 aatattgttc aaaatcccac agtgcaaggc gctgtatcca aagctcatgg cggggaccac
33481 agaacccacg tggccatcat accacaagcg caggtagatt aagtggcgac ccctcataaa
33541 cacgctggac ataaacatta cctcttttgg catgttgtaa ttcaccacct cccggtacca
33601 tataaacctc tgattaaaca tggcgccatc caccaccatc ctaaaccagc tggccaaaac
33661 ctgcccgccg gctatacact gcagggaacc gggactggaa caatgacagt ggagagccca
33721 ggactcgtaa ccatggatca tcatgctcgt catgatatca atgttggcac aacacaggca
33781 cacgtgcata cacttcctca ggattacaag ctcctcccgc gttagaacca tatcccaggg
33841 aacaacccat tcctgaatca gcgtaaatcc cacactgcag ggaagacctc gcacgtaact
33901 cacgttgtgc attgtcaaag tgttacattc gggcagcagc ggatgatcct ccagtatggt
33961 agcgcgggtt tctgtctcaa aaggaggtag acgatcccta ctgtacggag tgcgccgaga
34021 caaccgagat cgtgttggtc gtagtgtcat gccaaatgga acgccggacg tagtcatatt
34081 tcctgaagca aaaccaggtg cgggcgtgac aaacagatct gcgtctccgg tctcgccgct
34141 tagatcgctc tgtgtagtag ttgtagtata tccactctct caaagcatcc aggcgccccc
34201 tggcttcggg ttctatgtaa actccttcat gcgccgctgc cctgataaca tccaccaccg
34261 cagaataagc cacacccagc caacctacac attcgttctg cgagtcacac acgggaggag
34321 cgggaagagc tggaagaacc atgttttttt ttttattcca aaagattatc caaaacctca
34381 aaatgaagat ctattaagtg aacgcgctcc cctccggtgg cgtggtcaaa ctctacagcc
34441 aaagaacaga taatggcatt tgtaagatgt tgcacaatgg cttccaaaag gcaaacggcc
34501 ctcacgtcca agtggacgta aaggctaaac ccttcagggt gaatctcctc tataaacatt
34561 ccagcacctt caaccatgcc caaataattc tcatctcgcc accttctcaa tatatctcta
34621 agcaaatccc gaatattaag tccggccatt gtaaaaatct gctccagagc gccctccacc
34681 ttcagcctca agcagcgaat catgattgca aaaattcagg ttcctcacag acctgtataa
34741 gattcaaaag cggaacatta acaaaaatac cgcgatcccg taggtccctt cgcagggcca
34801 gctgaacata atcgtgcagg tctgcacgga ccagcgcggc cacttccccg ccaggaacct
34861 tgacaaaaga acccacactg attatgacac gcatactcgg agctatgcta accagcgtag
34921 ccccgatgta agctttgttg catgggcggc gatataaaat gcaaggtgct gctcaaaaaa
34981 tcaggcaaag cctcgcgcaa aaaagaaagc acatcgtagt catgctcatg cagataaagg
35041 caggtaagct ccggaaccac cacagaaaaa gacaccattt ttctctcaaa catgtctgcg
35101 ggtttctgca taaacacaaa ataaaataac aaaaaaacat ttaaacatta gaagcctgtc
35161 ttacaacagg aaaaacaacc cttataagca taagacggac tacggccatg ccggcgtgac
35221 cgtaaaaaaa ctggtcaccg tgattaaaaa gcaccaccga cagctcctcg gtcatgtccg
35281 gagtcataat gtaagactcg gtaaacacat caggttgatt catcggtcag tgctaaaaag
35341 cgaccgaaat agcccggggg aatacatacc cgcaggcgta gagacaacat tacagccccc
35401 ataggaggta taacaaaatt aataggagag aaaaacacat aaacacctga aaaaccctcc
35461 tgcctaggca aaatagcacc ctcccgctcc agaacaacat acagcgcttc acagcggcag
35521 cctaacagtc agccttacca gtaaaaaaga aaacctatta aaaaaacacc actcgacacg
35581 gcaccagctc aatcagtcac agtgtaaaaa agggccaagt gcagagcgag tatatatagg
35641 actaaaaaat gacgtaacgg ttaaagtcca caaaaaacac ccagaaaacc gcacgcgaac
35701 ctacgcccag aaacgaaagc caaaaaaccc acaacttcct caaatcgtca cttccgtttt
35761 cccacgttac gtaacttccc attttaagaa aactacaatt cccaacacat acaagttact
35821 ccgccctaaa acctacgtca cccgccccgt tcccacgccc cgcgccacgt cacaaactcc
35881 accccctcat tatcatattg gcttcaatcc aaaataaggt atattattga tgatg