CN111073975A - 一种用于基因snp位点检测的探针体系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于基因SNP位点检测的探针体系及其应用，所述探针体系中至少包含2个探针对；每个探针对包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和相应互补结合的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；每个探针对的荧光基团不同；所述5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值不超过3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值。本发明还提出了所述探针体系在用于基因SNP位点检测的反应体系、基因SNP位点的检测方法及耳聋基因SNP位点的检测中的应用，该方法用于检测耳聋基因相关SNP位点中，对16个耳聋基因相关SNP位点的检测准确率高达100％。

Description

一种用于基因SNP位点检测的探针体系及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种用于基因SNP位点检测的探针体系及其应用。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP，single nucleotide polymorphism)位点是指人与人之间一个碱基之间的差异，是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，基因组序列差异包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的***和缺失等。人与人的基因序列中有99.9％以上的序列都是相同的，仅有0.1％不同，即1000个碱基中有1个不同，人类基因组有30亿对碱基，按此计算，整个人类基因组中有300万个碱基不同。通常这300万个不同的碱基被称为SNP 是由个人的遗传背景决定的，在目前的研究中，SNP位点可以作为临床具有意义的诊断标志物(Marker)，在临床上具有重大的意义，能够用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。
目前检测SNP位点的方法主要有测序法、芯片法和Taqman法。其中，测序法非常准确，但是价格也非常高，不适用于大样本量的检测；芯片法适用于超多位点分析，但是芯片设计成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检测，因此准确性较低；Taqman法准确性高，适用于大样本，但是价格比较贵。因此，开发一种低价、高效且适用于大样本检测的基因SNP位点检测的方法具有十分重要的意义。
根据2006年全国残疾人调查最新统计数据，我国听力言语残疾者达2780万，并且每年有3万左右聋儿出生，还有6～8万患有迟发性耳聋的患儿被发现，其中大部分为重度或极重度感音神经性耳聋。这一类耳聋严重影响患者的交流和认知能力，对个人、家庭和社会造成巨大的负担。
随着人类基因组计划的完成，遗传性耳聋的病因学研究取得很大进展，推测2/3的先天性感音神经性耳聋由遗传因素导致。非综合征型耳聋占所有遗传性耳聋的70％，这其中的80％为常染色体隐性遗传，15％为常染色体显性遗传，其他5％为线粒体或X连锁遗传。虽然耳聋相关基因很多，但绝大部分耳聋患者是由少数几个单基因的缺损导致。解放军总医院聋病分子诊断中心自2004年起进行了全国范围的聋病分子流行病学调查，确定了GJB2、SLC26A4、线粒体基因mtDNA(A1555G和C1494T突变)是导致中国大部分遗传性耳聋发生的3个最为常见的耳聋基因，发现21％的耳聋患者带有GJB2突变；14.5％的带有SLC26A4突变，另外分别有3.4％和0.6％的患者带有mtDNA A1555G和C1494T突变。GJB2突变主要导致先天性非综合征型耳聋，为常染色体隐性遗传模式。其主要突变为235delC。通过基因诊断明确的 GJB2耳聋，在明确病因的基础上，还可以排除其他神经***疾病，提示耳蜗神经和听觉中枢的完整性，多项研究表明此类患儿接受人工耳蜗植入后听力语言康复效果好，是人工耳蜗手术前一项理想的效果预测检查。SLC26A4突变可以造成两种临床表现，一种是Pendred综合征，表现为甲状腺肿大和耳聋；另一种在中国最为常见，患儿仅表现为耳聋，CT检查可发现前庭导水管扩大，称为大前庭水管综合征(en-larged vestibular aqueductsyndrome，EVAS)。我国EVAS占儿童期耳聋发病比例的20％～28％。其病因是由于联系颅腔与内耳的通道异常扩大，凡是引起颅内压变化的因素如轻度的头部碰撞、感冒等就能引起EVAS患儿听力下降。在我国的EVAS耳聋患者中，SLC26A4基因突变的检出率达97％左右，主要突变是c.919A>G。线粒体基因mtDNA A1555G与C1494T突变导致的耳聋主要与氨基糖甙类药物使用有关。突变携带者对氨基糖甙类药物异常敏感，低剂量使用就会出现耳鸣，甚至严重的听力下降。由于其遵循母系遗传方式，即此类突变基因的遗传只通过女性直接传给后代，如果在家族中有 1例，就可推算出这个家族中至少有10例携带这类突变基因。若母亲携带此类突变基因，可提醒其本人和后代一定要禁止使用氨基糖甙类药物，避免发生耳聋；同时，在家族中确诊1 例即可作为全家族的用药指导，由此阻断耳聋在家族中继续发生。
因此，通过耳聋基因SNP筛查，筛查出的mtDNA A1555G与C1494T突变携带者能通过禁止使用氨基糖甙类抗生素有效避免药物性耳聋的发生；GJB2耳聋患者，提示人工耳蜗预后良好，可直接进入听力康复程序。SLC26A4耳聋患者,提示为EVAS患儿，通过采取严格防护措施，可尽量保持患儿有效听力。并且耳聋基因诊断还可以为耳聋患者及耳聋家庭的婚配生育提供科学准确的遗传信息与指导。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于基因 SNP位点检测的探针体系，能够高效检测基因SNP位点进行基因分型。
本发明还提出一种用于基因SNP位点检测的反应体系。
本发明还提出一种基因SNP位点的检测方法。
本发明还提出上述基因SNP位点的检测方法的应用。
根据本发明的第一方面实施例的一种用于基因SNP位点检测的探针体系，所述探针体系中至少包含2个探针对；每个探针对包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和相应互补结合的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；每个探针对的荧光基团不同；所述5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值不超过3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值。
根据本发明的第一方面实施例的探针体系，至少具有如下有益效果：本发明中不同SNP 位点可以使用同一套探针体系，与Taqman方法相比大大节省了检测成本尤其是研发成本。
根据本发明的一些实施例，所述探针对选自以下4种探针对，探针对1包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对2包括核苷酸序列为SEQ ID NO.3的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.4的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对3包括核苷酸序列为SEQ ID NO.5的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.6的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对4包括核苷酸序列为SEQ ID NO.7的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.8的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述荧光基团修饰包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX和TAMRA中的至少一种；所述淬灭基团修饰包括BHQ-1和BHQ-2中的至少一种。
根据本发明的第二方面实施例的一种用于基因SNP位点检测的反应体系，所述所述反应体系包括上述的探针体系和针对SNP位点设计的引物组；每个所述引物组中包括1条野生型引物序列和1条突变型引物序列；所述野生型引物和突变型引物中均含有对应探针对中带有荧光基团的探针的寡核苷酸序列。
作为优选的，所述引物组的寡核苷酸序列由对应5’端荧光基团修饰的探针的寡核苷酸序列和SNP位点特异性引物序列构成。
根据本发明的第二方面实施例的反应体系，至少具有如下有益效果：本发明的反应体系含有的探针体系可以适用于不同SNP位点的检测，具有价格便宜、高效的优点，用于SNP 位点的检测准确率高且使用方便；本发明采用3’到5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶和 3’端硫化磷酸修饰的引物，可以大大降低非特异扩增，从而对SNP位点进行准确分型。
根据本发明的一些实施例，所述野生型引物序列和突变型引物序列的3’末端碱基或相邻碱基被硫化磷酸修饰；硫化修饰后的碱基对核酸外切酶消化具有一定的耐受性。
根据本发明的一些实施例，所述反应体系中还含有高保真DNA聚合酶；未经硫化磷酸修饰的引物不可耐受核酸外切酶消化，当发生错配时，高保真DNA聚合酶可切除错配碱基，延伸得以继续；而3’端硫化磷酸修饰的引物可耐受核酸外切酶消化，当发生错配时，不能及时将错配碱基切除，从而造成聚合反应终止，延伸无法进行。因此，只有当引物和模板完全匹配时才能进行有效延伸，从而减少非特异性扩增。
作为优选的，所述高保真聚合酶包括Pfu聚合酶和Deep Vent聚合酶中的至少一种。
作为优选的，所述反应体系各组分的用量为：引物组中各引物的浓度为0.05-0.25μM；探针体系中，5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列浓度为0.1μM，3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列浓度为0.15μM。
根据本发明的第三方面实施例的一种基因SNP位点的检测方法，包括以下步骤：
S1、针对每个SNP位点构建上述反应体系；
S2、进行PCR反应，得到检测结果。
根据本发明的第三方面实施例的检测方法，至少具有如下有益效果：本发明能够采用4 通道可以同时检测2个SNP位点，相较于常规的2通道检测1个SNP位点，通量提升了一倍。
根据本发明的一些实施例，所述PCR反应的程序为：94℃ 15min；94℃ 20s，60℃60s，10cycles；94℃ 20s，55℃ 60s，采集荧光，35cycles；30℃ 60s，采集荧光。
根据本发明的第四方面实施例的应用，上述方法应用于检测耳聋基因相关SNP位点中。
根据本发明的第四方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明选择的耳聋相关易感基因的16个SNP位点，基本覆盖了中国人群中主要的耳聋易感基因SNP位点，使用本发明提供的检测方法能够对耳聋基因相关的SNP进行准确分型，该检测方法价格便宜、使用高效且准确率高。
根据本发明的一些实施例，所述耳聋基因相关SNP位点包括位于GJB2、GJB3、SLC26A4 和MT-RNR1四个耳聋基因相关的16个SNP位点；所述16个SNP位点包括GJB2基因上的 c.176-191del16b、c.35delG、c.299-300delAT、c.235delC、512insAACG，GJB3基因上的c.538C ＞T，SLC26A4(PDS)基因上的c.919-2A＞G、c.2027T＞A、c.2168A＞G、c.1174A＞T、c.1226G ＞A、c.1229C＞T、1707+5G＞A、c.1975G>C，MT-RNR1(12S rRNA)基因上的m.1555A＞G、 m.1494C＞T。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中的检测原理图，图中，F表示荧光基团FAM，H表示荧光基团HEX，B表示淬灭基团BHQ2；
图2为本发明实施例2中GJB2-c.176-191del16bp分型结果；
图3为本发明实施例2中GJB2-c.35delG分型结果；
图4为本发明实施例2中GJB3-c.538C＞T分型结果；
图5为本发明实施例2中SLC26A4-c.919-2A＞G分型结果；
图6为本发明实施例2中SLC26A4-c.2027T＞A分型结果；
图7为本发明实施例2中SLC26A4-c.2168A＞G分型结果；
图8为本发明实施例3中GJB2-c.235delC分型结果；
图9为本发明实施例3中SLC26A4-c.919-2A＞G分型结果。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
实施例1：通用探针和检测耳聋基因位点引物的设计
1、设计思路
设计探针体系：共设计4个探针对，每个探针对都包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和相应互补结合的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列，每个探针对的荧光基团不同。
探针和引物的设计方法：
(1)每个探针对都包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列，这两个序列能部分或全部互补结合，形成发光-淬灭探针***。
(2)每个探针对的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和3’端猝灭基团修饰的寡核苷酸序列可以具有不同的Tm值，5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值与3’端猝灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值相同，或比3’端猝灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值低。
(3)引物组的寡核苷酸序列由5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和SNP位点特异性引物序列构成。SNP位点特异性引物序列的Tm值比5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm 值高。
设计相关SNP位点检测引物组：引物组的寡核苷酸序列由5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和SNP位点特异性引物序列构成。引物组包括野生引物序列和突变引物序列。当野生型引物或突变型引物与模板完全配对时，进行聚合反应，生成与5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列配对的产物，当此产物与5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列结合时，发出相应的可检测的荧光信号。野生型引物序列和突变型引物序列的3’末端碱基或相邻碱基被硫化磷酸修饰，硫化修饰后的碱基对核酸外切酶消化具有一定的耐受性。
寡核苷酸合成时引物硫化磷酸修饰，能达到耐核酸外切酶消化，延长寡核苷酸半衰期的效果。张佳等通过比较含3’到5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶与不含3’到5’外切酶活性的低保真DNA聚合酶对3’不完全配对引物的延伸反应，发现高保真DNA酶在发生错配时，无法及时修复或不能修复，会造成聚合反应非成熟性终止，延伸无法进行。利用高保真酶的这种特性，设计末端硫化磷酸修饰的野生型引物和突变型引物，通过发光-淬灭探针***，可以检测相应位点的单核苷酸多态性。
本方案的检测原理如图1所示，在体系中，当野生型引物或突变型引物与模板完全配对时，进行聚合反应，生成与5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列配对的产物，当此产物与5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列结合时，发出相应的可检测的荧光信号。
2、设计的探针和引物
设计的探针和引物序列如下表1所示：
表1.引物和探针序列表
Figure RE-GDA0002406114200000071
Figure RE-GDA0002406114200000081
Figure RE-GDA0002406114200000091
实施例2：两重体系测试
采用CY5/ROX两重探针分别对耳聋基因GJB2-c.176-191del16bp、GJB2-c.35delG、GJB3-c.538C＞T、SLC26A4-c.919-2A＞G、SLC26A4-c.2027T＞A、SLC26A4-c.2168A＞G 6 个位点的野生型白细胞、质粒及相应的白细胞和质粒的混合样本进行荧光定量PCR反应。
1、测试样本：
A：人白细胞DNA；
B：GJB2突变质粒；
C：GJB3突变质粒；
D：SLC26A4突变质粒1；
E：SLC26A4突变质粒2；
G：人白细胞DNA与GJB2突变质粒混合物；
H：人白细胞DNA与GJB3突变质粒混合物；
I：人白细胞DNA与SLC26A4突变质粒1混合物；
J：人白细胞DNA与SLC26A4突变质粒2混合物；
K：人白细胞DNA与SLC26A4突变质粒3混合物；
将样本测定浓度后稀释为5ng/μL。
2、反应体系：
将反应所需的预混酶buffer以及特异性位点扩增的引物和公用探针按下表2配制反应体系(单位均为μL)：
表2.两重反应体系
DNA 2
2×buffer 5
WF 0.1
MF 0.1
R 0.25
CY5-P1 0.1
P2-BHQ2 0.15
ROX-P3 0.1
P4-BHQ2 0.15
ddH<sub>2</sub>O 2.05
Total 10
表2中，WF为野生型引物，MF为突变型引物，R为公用引物，分别对应实施例1中的引物和探针序列。
将样本放置荧光定量反应仪(博日LineGene9600)中，按照以下程序进行反应。
3、反应程序：
94℃ 15min；{94℃20s，60℃ 60s，10cycles}；{94℃20s，55℃ 60s，采集荧光，30cycles}； 30℃ 60s，采集荧光。
4、结果分析：
GJB2-c.176-191del16bp分型结果如图2所示；
GJB2-c.35delG分型结果如图3所示；
GJB3-c.538C＞T分型结果如图4所示；
SLC26A4-c.919-2A＞G分型结果如图5所示；
SLC26A4-c.2027T＞A分型结果如图6所示；
SLC26A4-c.2168A＞G分型结果如图7所示；
图2～图7中，等位基因1代表野生型，等位基因2代表突变型，杂合代表杂合型。
由图分析可知，耳聋基因GJB2-c.176-191del16bp、GJB2-c.35delG、GJB3-c.538C＞T、SLC26A4-c.919-2A＞G、SLC26A4-c.2027T＞A、SLC26A4-c.2168A＞G 6个位点的两重体系对野生型白细胞、质粒及相应的白细胞和质粒的混合样本进行荧光定量反应，分型均正确。
实施例3：四重体系测试
采用CY5/ROX/FAM/HEX四重探针对耳聋基因GJB2-c.235delC和SLC26A4-c.919-2A＞ G经测序确定SNP类型的样本进行荧光定量PCR反应。
1、测试样本：
A:白细胞DNA；
B:c.235delC杂合样本；
C:c.235delC纯突变样本；
D:c.919-2A＞G杂合样本；
将样本上述样本A到D测定浓度后稀释为5ng/uL。
2、反应体系：
将反应所需的预混酶buffer以及特异性位点扩增的引物和公用探针按下表3配制反应体系(单位均为μL)：
表3.四重反应体系
DNA 2
2×buffer 5
WF1 0.1
MF1 0.1
R1 0.25
WF2 0.1
MF2 0.1
R2 0.25
CY5-P1 0.1
P2-BHQ2 0.15
ROX-P3 0.1
P4-BHQ2 0.15
FAM-P5 0.1
P6-BHQ2 0.15
HEX-P7 0.1
P8-BHQ2 0.15
ddH<sub>2</sub>O 1.1
Total 10
表3中，WF为野生型引物，MF为突变型引物，R为公用引物，分别对应实施例1中的引物和探针序列。
将样本放置荧光定量反应仪(博日LineGene9600)中，按照以下程序进行反应。
3、反应程序：
94℃ 15min；{94℃ 20s，60℃ 60s，10cycles}；{94℃ 20s，55℃ 60s，采集荧光，35cycles}； 30℃ 60s，采集荧光。
4、结果分析：
GJB2-c.235delC分型结果如图8所示；
SLC26A4-c.919-2A＞G分型结果如图9所示；
图8～图9中，等位基因1代表野生型，等位基因2代表突变型，杂合代表杂合型。
由图分析可知，耳聋基因GJB2-c.235delC和SLC26A4-c.919-2A＞G四重体系对野生型白细胞、c.235delC杂合样本、c.235delC纯突变样本、c.919-2A＞G杂合样本分型，检测结果均正确。
实施例4：耳聋临床样本检测
检测经测序确定SNP类型的耳聋基因纯突变或突变携带者12例，具体情况如下表4所示：
表4.样本基因型情况
样本编号 基因 突变位点 测序基因型
1 GJB2 c.176delG 杂合
2 GJB2 c.235delC 杂合
3 GJB2 c.299delAT 杂合
4 GJB2 c.235delC 纯合突变
5 GJB2 c.299delAT 纯合突变
6 GJB2 c.35delG 杂合
7 GJB2 c.35delG 杂合
8 SLC26A4 c.1174A>T 杂合
9 SLC26A4 c.919-2A>G 纯合突变
10 SLC26A4 c.919-2A>G 杂合
11 SLC26A4 c.919-2A>G 杂合
12 SLC26A4 c.919-2A>G 杂合
1、样本提取：
采集人静脉血，并以EDTA抗凝管收集。取200μL外周血，采用QIAGEN公司的DNeasyBlood and Tissue kit进行基因组DNA提取，提取后的DNA采用Qubit进行定量，并标化到5ng/μL。
2、荧光定量PCR检测：
采用实施例2的四重检测体系，使用实施例1中设计的探针和引物，分别对12个样本提取的DNA进行16个耳聋基因突变位点的检测，对应的检测位点包括GJB2-c.176-191del16b、 GJB2-c.35delG、GJB2-c.299-300delAT、GJB2-c.235delC、GJB2-512insAACG、GJB3-c.538C ＞T、SLC26A4-c.919-2A＞G、SLC26A4-c.2027T＞A、SLC26A4-c.2168A＞G、SLC26A4-c.1174A＞T、SLC26A4-c.1226G＞A、SLC26A4-c.1229C＞T、SLC26A4-1707+5G＞ A、SLC26A4-c.1975G>C、MT-m.1555A＞G和MT-m.1494C＞T。
3、结果分析：
12例耳聋样本检测结果如下表5所示，表中空白表示野生型：
表5. 12例耳聋样本检测结果
Figure RE-GDA0002406114200000131
从表5耳聋基因SNP位点检测情况结果看出，耳聋基因相关SNP位点的检测准确度高达100％。中国人群相当一部分遗传性听力损失是由4个常见基因GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)、MT-RNR1(12S rRNA)的16个高发突变位点所引起，这些位点在正常人群及听力障碍人群中有非常高的携带率。本发明检测准确度达到了100％，能够有效应用于新生儿耳聋基因检测，使得突变患者及时得到干预治疗，或避免使用致聋性药物；同时，该检测体系可用婚前、孕前基因检测，为优生优育提供科学的判断依据，为可能存在的风险进行及时的干预和治疗。
本发明以耳聋相关易感基因SNP检测进行实施检测，但本发明所提供的方法不仅限于耳聋易感基因应用，其他以此方法所延伸的SNP分型检测均属于本专利所保护的范围。
本发明实施所采取的样本为白细胞DNA，但并不局限于此，其它任何核酸样本所涉及到与本发明相关的SNP分型检测均应纳入本专利的保护范围。
综上所述，本发明的有益效果在于：
1、本发明中不同SNP位点可以使用同一套探针体系，与Taqman方法相比，减少了探针的使用(探针合成价格昂贵)，大大节省了检测成本尤其是研发成本。
2、本发明能够采用4通道可以同时检测2个SNP位点，相较于常规的2通道检测1个SNP位点，通量提升了一倍。
3、本发明采用3’到5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶和3’端硫化磷酸修饰的引物，可以大大降低非特异扩增，从而对SNP位点进行准确分型。
4、本发明引物体系中包含与耳聋相关易感基因的16个SNP位点，基本覆盖了中国人群中主要的耳聋易感基因SNP位点，使用本发明提供的检测方法能对耳聋基因相关的SNP进行准确分型。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 一种用于基因SNP位点检测的探针体系及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtatcg tacgaatccg ta 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacggattcg tacgatacct tc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtcgta tccagaacgt ac 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtacgttctg gatacgacct tc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgactaagt agaggatgat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcatcctct acttagtcgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgagtgaac aggtttagac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtctaaacct gttcactcgc 20

Claims (10)

1.一种用于基因SNP位点检测的探针体系，其特征在于：所述探针体系中至少包含2个探针对；每个探针对包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和相应互补结合的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；每个探针对的荧光基团不同；所述5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值不超过3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值。
2.根据权利要求1所述的用于基因SNP位点检测的探针体系，其特征在于：所述探针对选自以下4种探针对，探针对1包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对2包括核苷酸序列为SEQ ID NO.3的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.4的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对3包括核苷酸序列为SEQ ID NO.5的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.6的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对4包括核苷酸序列为SEQ ID NO.7的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.8的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的用于基因SNP位点检测的探针体系，其特征在于：所述荧光基团修饰包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX和TAMRA中的至少一种；所述淬灭基团修饰包括BHQ-1和BHQ-2中的至少一种。
4.一种用于基因SNP位点检测的反应体系，其特征在于：所述反应体系包括如权利要求1至3任一项所述的探针体系和针对SNP位点设计的引物组；每个所述引物组中包括1条野生型引物序列和1条突变型引物序列；所述野生型引物和突变型引物中均含有对应探针对中带有荧光基团的探针的寡核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的用于基因SNP位点检测的反应体系，其特征在于：所述野生型引物序列和突变型引物序列的3’末端碱基或相邻碱基被硫化磷酸修饰。
6.根据权利要求4所述的用于基因SNP位点检测的反应体系，其特征在于：所述反应体系中还含有高保真DNA聚合酶；作为优选的，所述高保真DNA聚合酶包括Pfu聚合酶和DeepVent聚合酶中的至少一种。
7.一种基因SNP位点的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、针对每个SNP位点构建如权利要求4至6任一项所述的反应体系；
S2、进行PCR反应，得到检测结果。
8.根据权利要求7所述的基因SNP位点的检测方法，其特征在于：所述PCR反应的程序为：94℃15min；94℃20s，60℃60s，10cycles；94℃20s，55℃60s，采集荧光，35cycles；30℃60s，采集荧光。
9.根据权利要求7所述的基因SNP位点的检测方法在检测耳聋基因相关SNP位点中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述耳聋基因相关SNP位点包括位于GJB2、GJB3、SLC26A4和MT-RNR1四个耳聋基因相关的16个SNP位点；所述16个SNP位点包括GJB2-c.176-191del16b、GJB2-c.35delG、GJB2-c.299-300delAT、GJB2-c.235delC、GJB2-512insAACG、GJB3-c.538C＞T、SLC26A4-c.919-2A＞G、SLC26A4-c.2027T＞A、SLC26A4-c.2168A＞G、SLC26A4-c.1174A＞T、SLC26A4-c.1226G＞A、SLC26A4-c.1229C＞T、SLC26A4-1707+5G＞A、SLC26A4-c.1975G>C、MT-m.1555A＞G和MT-m.1494C＞T。
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