CN111073883B - 一种类球红细菌的接合转移方法 - Google Patents

一种类球红细菌的接合转移方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类球红细菌的接合转移方法，包括：供体菌的培养，类球红细菌的培养，供体菌与类球红细菌的混合，混合菌的接合培养，以及接合转移子的筛选；在供体菌与类球红细菌混合之前，对类球红细菌进行等离子体处理，并在近红外光照射下进行类球红细菌的培养以及混合菌的接合培。本发明利用近红外光源对类球红细菌进行光照培养，并经过等离子体处理，显著提高了类球红细菌的接合转移效率，其转移率相对于目前较为成熟的接合转移方法提高了20～40倍，同时大大缩短了接合培养和筛选培养阶段的时间，有利于对类球红细菌进行定向遗传改造及基因功能研究。本发明方法具有高效、快速、便捷的特点。

Description

一种类球红细菌的接合转移方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种类球红细菌的接合转移方法。
背景技术
类球红细菌(Rhodobacter Sphaeroides)是一种革兰氏阴性菌，属于紫色非硫细菌中的α变形菌。类球红细菌具有多种用途，例如：作为光合细菌的模式菌和膜蛋白表达***。另外，类球红细菌可以合成辅酶Q10，是理想的辅酶Q10生产菌。
目前，研究者主要采用双亲本接合转移的方法对类球红细菌野生型菌株进行遗传操作。在双亲本接合转移***中，将提供质粒的宿主称为供体株，而接受质粒的宿主称为受体株。接合转移效率受很多因素影响，例如，受体菌细胞结构和生理状态、供体菌的选择、供受比、接合转移培养基的选择和培养温度等等，这些因素都会影响接合转移的发生或者影响接合转移的效率。
类球红细菌的接合转移效率普遍效率比较低。因此，需要提供一种能够明显提高类球红细菌接合转移效率的方法。
发明内容
本发明提供了一种类球红细菌的接合转移方法，该接合转移方法简单易行，操作方便，具有较高的接合转移效率。
具体技术方案如下：
一种类球红细菌的接合转移方法，包括：类球红细菌的培养，供体菌的培养，供体菌与类球红细菌的混合，混合菌的接合培养，以及接合转移子的筛选；在供体菌与类球红细菌混合之前，对类球红细菌进行等离子体处理，并在近红外光照射下进行类球红细菌的培养以及混合菌的接合培养；所述近红外光的波长为780nm～1100nm，光照强度为1000～6000Lx。
优选的，所述近红外光的波长为800nm～890nm，光照强度为2000～4000Lx。
进一步地，所述接合培养的时间为6～8h。
所述的近红外光照射所用的光源包括但不局限于卤钨灯、钨灯、LED灯或其组合。
所述类球红细菌为自然选育的菌株、经物理或化学诱变方法选育的菌株、或者基因工程方法改造的菌株；更优选所述类球红细菌为保藏编号CGMCCNo.5997的类球红细菌菌株、保藏编号CGMCC No.5998的类球红细菌菌株、保藏编号CGMCCNo.5999的类球红细菌菌株或保藏编号CGMCCNo.15927的类球红细菌菌株。
进一步地，所述供体菌为大肠杆菌(Escherichia coli)；更进一步地，所述供体菌为含外源质粒的大肠杆菌。
本发明通过利用近红外光源对类球红细菌进行光照培养，促进细菌叶绿素的能量吸收，从而降低菌体对色素和光合膜的需求，减少色素和光合膜的形成，为接合转移创造有利条件。
进一步地，所述等离子体为常压室温等离子体；采用的气源为氦气、氩气、氮气、氧气、空气或两种以上的混合气体。
进一步地，所述等离子体处理的气体流量为3～30SLM，功率为30～50W，照射距离为1～3mm。优选的，所述等离子体处理的气源为氦气，气体流量设定为5～15SLM，功率为35～45W，照射距离为1～3mm。
进一步地，所述等离子体处理的时间为10～60s；优选的时间为25～45s。
在本发明中，所产生的等离子体与空气中的组分反应，形成含有活性氮化物、活性氧化物的活性粒子；活性粒子首先对膜脂质和膜蛋白进行攻击和破坏，不仅使细胞膜流动性增强，造成细胞膜的完整结构被破坏，从而提高了营养物质和DNA的跨膜转运效率，同时促进了细胞膜的融合，为接合转移创造有利条件。
所述类球红细菌的接合转移方法，包括以下步骤：
(1)分别培养类球红细菌和含外源质粒的大肠杆菌，得到类球红细菌菌液和大肠杆菌菌液；
(2)对步骤(1)获得的类球红细菌菌液进行等离子体处理；
(3)将步骤(2)等离子体处理后的类球红细菌菌液与步骤(1)获得的大肠杆菌菌液按比例混匀，得到混合菌液，再将混合菌液置于接合培养基上进行接合培养，获得接合菌液；
(4)将接合菌液洗脱后，涂布于筛选培养基上进行筛选培养，得到接合转移子。
进一步地，步骤(1)中，所述类球红细菌菌液和大肠杆菌菌液的OD600为0.4～0.8；步骤(3)中，所述离子体处理后的类球红细菌菌液和大肠杆菌菌液混合时的体积比为1:0.1～10。
进一步地，步骤(1)中，所述类球红细菌菌液的培养方法为：将类球红细菌接种于液体培养基中，在30～32℃、200～230rpm、780nm～1100nm、1000～6000Lx的光照条件下培养36～60h；
所述大肠杆菌菌液的培养方法为：将大肠杆菌接种于LB液体培养基中，在36～38℃、200～300rpm的条件下培养15～20h。
进一步地，步骤(3)中，接合培养的时间为6～8h。
步骤(4)得到接合转移子后，挑取单菌落划线分离，并提取质粒后进行鉴定。
步骤(1)中，培养类球红细菌的液体培养基的具体成分包括：酵母提取物，FeSO4，K2HPO4，CoCl2，NaCl，MnSO4，MgSO4，葡萄糖，维生素B1，维生素K，维生素A，pH 7.0～7.5。
进一步地，步骤(1)中，所述的外源质粒为本领域常用的广宿主质粒，包括但不局限于pRK404、RSF1010、R388和pMG160及其衍生质粒，例如pIND4、pBBR1MCS2、pRKSK1、pRECTX、pTrc99a。
进一步地，步骤(1)中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1。
进一步地，步骤(3)中，所述接合培养基为固体培养基，具体成分包括：酵母提取物，FeSO4，K2HPO4，CoCl2，NaCl，MnSO4，MgSO4，葡萄糖，维生素B1，维生素K，维生素A，琼脂粉，pH 7.0～7.5。
进一步地，步骤(4)中，所述筛选培养基为固体培养基，具体成分包括：酵母提取物，FeSO4，K2HPO4，CoCl2，NaCl，MnSO4，MgSO4，葡萄糖，维生素B1，维生素K，维生素A，琼脂粉，pH 7.0～7.5。
所述的固体培养基可以使用一系列选择性标记的组合。例如，外源质粒所携带的抗性标记与萘啶酮酸的组合。
优选的，所述筛选培养基中还含有油菜素内酯及其类似物的一种或多种，浓度为0.1～1μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用近红外光源对类球红细菌进行光照培养来抑制类球红细菌色素和光合膜的形成，并通过等离子体处理，显著提高了类球红细菌的接合转移效率，其接合率相对于目前较为成熟的接合转移方法提高了20～40倍，同时大大缩短了接合培养和筛选培养阶段的时间，有利于对类球红细菌进行定向遗传改造及基因功能研究。本发明的接合转移方法具有高效、快速、便捷的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中所述的水为蒸馏水。
液体培养基的配方为(100ml)：酵母提取物0.8g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 0.13g，CoCl2 0.003g，NaCl 0.2g，MnSO4 0.0001g，MgSO4 0.025g，葡萄糖0.3g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg，pH调节为7.2。
固体培养基的配方为(100ml)：酵母提取物0.8g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 0.13g，CoCl2 0.003g，NaCl 0.2g，MnSO4 0.0001g，MgSO4 0.025g，葡萄糖0.3g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg，琼脂粉1.5g，pH调节为7.2。
本发明中所述的“LB培养基”是指“Luria-Bertani培养基”，其基本组成为：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，蒸馏水加至1000ml，pH 7.0。
ARTP诱变育种***为北京思清源生物科技有限公司根据ZL201110339695.2的发明专利而制备得到。
接合率的计算方法为：接合率＝(接合子数量/受体菌数量)×100％。
实施例1
一种类球红细菌的接合转移方法，具体步骤如下：
(1)接种类球红细菌CGMCC No.15927于含10ml液体培养基的试管中，将试管置于恒温振荡器中，培养温度为30℃，转速为200rpm，光源采用卤钨灯，光照强度为4000Lx，波长为870nm，培养50h，得到类球红细菌菌液；
32小时后，接种含有pTrc99a质粒的大肠杆菌S17-1至含有10ml LB培养基的试管中，于37℃、200rpm下过夜培养；15小时后，将100μl大肠杆菌S17-1菌液转接至含有5ml LB培养基的试管中，并加入500μg氨苄青霉素，放入37℃摇床培养至菌液OD600为0.5，得到大肠杆菌菌液；
(2)将步骤(1)得到的类球红细菌菌液用新鲜的液体培养基稀释至OD600为0.6后，用等离子体处理，收集菌体，得到等离子体处理后的类球红细菌菌液；
等离子体为常压室温等离子体，即：ARTP育种***，所用气源为氦气，气体流量设定为30SLM(StandardLiterperMinute，公升/分钟)，功率为40W，处理时间为30s，照射距离为2mm。
(3)各取1ml步骤(2)获得的类球红细菌菌液和1ml步骤(1)获得的大肠杆菌菌液分装至2ml离心管中，5000rpm离心5分钟；分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体，5000rpm离心5分钟；分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体；
按类球红细菌和大肠杆菌的体积比例为1：1的比例混匀菌液，得到混合菌液；在LB固体培养基的中央贴滤膜(0.22μm)，并将200μl混合菌液浇注于滤膜中心区域，将LB固体培养基小心移至32℃培养箱中，在870nm、4000Lx的近红外光照条件接合培养6h；
(4)用镊子将滤膜转移至2mL EP管中，再用500μl LB液体培养基将滤膜上的菌体冲洗下来并吹散，分装涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL萘啶酮酸的固体培养基和不含抗生素的固体培养基上，每板350μl菌液，放入32℃培养箱中，870nm、4000Lx的光照条件下培养71小时。
计算结果：接合率为5.6×10-4。
实施例2～8
在实施例1的基础上修改下列表格所示参数，即：光照条件、步骤1光照培养时间、等离子体处理条件、步骤3接合培养光照时间和筛选培养基额外添加物，计算接合率。
结果如下：
Figure BDA0002334050960000061
注：步骤1光照培养时间是指类球红细菌在近红外光照射条件下的培养时间。
对比例1常规的接合转移方法
具体步骤如下：
(1)接种类球红细菌CGMCCNo.15927于含10ml液体培养基的试管中，将试管置于恒温振荡器中，培养温度为30℃，转速为200rpm，光源采用20W荧光灯，培养50h，得到类球红细菌菌液；
32小时后，接种含有pTrc99a质粒的大肠杆菌S17-1至LB培养基中，于37℃、200rpm下过夜培养；15小时后，将100μl大肠杆菌S17-1菌液转接至含有5mlLB培养基的试管中，并加入500μg氨苄青霉素，放入37℃摇床培养至菌液OD600为0.5，得到大肠杆菌菌液；
(2)将步骤(1)得到的类球红细菌菌液用新鲜的液体培养基稀释至OD600为0.6。
(3)各取1ml步骤(2)获得的类球红细菌菌液和1ml步骤(1)获得的大肠杆菌菌液分装至2ml离心管中，5000rpm离心5分钟；分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体，5000rpm离心5分钟；分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体；
按类球红细菌和大肠杆菌的体积比例为1：1的比例混匀菌液，得到混合菌液；在LB固体培养基的中央贴滤膜(0.22μm)，并将200μl混合菌液浇注于滤膜中心区域，将LB固体培养基小心移至32℃培养箱中20W荧光灯光照条件下培养24h，进行接合培养；
(4)用镊子将滤膜转移至2mL EP管中，再用500μl LB液体培养基将滤膜上的菌体冲洗下来并吹散，分装涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL萘啶酮酸的固体培养基和不含抗生素的固体培养基上，每板350μl菌液，放入32℃培养箱中，20W荧光灯光照条件下培养72小时。
计算结果：接合率为1.6×10-5。
对比例2
具体步骤如下：
(1)接种类球红细菌于CGMCCNo.15927含10ml液体培养基的试管中，将试管置于恒温振荡器中，培养温度为30℃，转速为200rpm，光源采用20W荧光灯，培养50h，得到类球红细菌菌液；
32小时后，接种含有pTrc99a质粒的大肠杆菌S17-1至LB培养基中，于37℃、200rpm下过夜培养；15小时后，将100μl大肠杆菌S17-1菌液转接至含有5mlLB培养基的试管中，并加入500μg氨苄青霉素，放入37℃摇床培养至菌液OD600为0.5，得到大肠杆菌菌液；
(2)将步骤(1)得到的类球红细菌菌液用新鲜的液体培养基稀释至OD600为0.6后，用等离子体处理，收集菌体，得到等离子体处理后的类球红细菌菌液；
等离子体为常压室温等离子体，即：ARTP育种***，所用气源为氦气，气体流量设定为30SLM(StandardLiterperMinute，公升/分钟)，功率为40W，处理时间为30s，照射距离为2mm。
(3)各取1ml步骤(2)获得的类球红细菌菌液和1ml步骤(1)获得的大肠杆菌菌液分装至2ml离心管中，5000rpm离心5分钟；分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体，5000rpm离心5分钟；分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体；
按类球红细菌和大肠杆菌的体积比例为1：1的比例混匀菌液，得到混合菌液；在LB固体培养基的中央贴滤膜(0.22μm)，并将200μl混合菌液浇注于滤膜中心区域，将LB固体培养基小心移至32℃培养箱中20W荧光灯光照条件下培养24h，进行接合培养；
(4)用镊子将滤膜转移至2mL EP管中，再用500μl LB液体培养基将滤膜上的菌体冲洗下来并吹散，分装涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL萘啶酮酸的固体培养基和不含抗生素的固体培养基上，每板350μl菌液，放入32℃培养箱中，20W荧光灯光照条件下培养72小时。
计算结果：接合率为2.6×10-5。
对比例3
具体步骤如下：
(1)接种类球红细菌CGMCCNo.15927于含10ml液体培养基的试管中，将试管置于恒温振荡器中，培养温度为30℃，转速为200rpm，光源采用卤钨灯，光照强度为4000Lx，波长为870nm，培养50h，得到类球红细菌菌液；
32小时后，接种含有pTrc99a质粒的大肠杆菌S17-1至LB培养基中，于37℃、200rpm下过夜培养；15小时后，将100μl大肠杆菌S17-1菌液转接至含有5mlLB培养基的试管中，并加入500μg氨苄青霉素，放入37℃摇床培养至菌液OD600为0.5，得到大肠杆菌菌液；
(2)将步骤(1)得到的类球红细菌菌液用新鲜的液体培养基稀释至OD600为0.6。
(3)各取1ml步骤(2)获得的类球红细菌菌液和1ml步骤(1)获得的大肠杆菌菌液分装至2ml离心管中，5000rpm离心5分钟；分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体，5000rpm离心5分钟；分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体；
按类球红细菌和大肠杆菌的体积比例为1：1的比例混匀菌液，得到混合菌液；在LB固体培养基的中央贴滤膜(0.22μm)，并将200μl混合菌液浇注于滤膜中心区域，将LB固体培养基小心移至32℃培养箱中，在870nm、4000Lx的近红外光照条件接合培养6h；
(4)用镊子将滤膜转移至2mL EP管中，再用500μl LB液体培养基将滤膜上的菌体冲洗下来并吹散，分装涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL萘啶酮酸的固体培养基和不含抗生素的固体培养基上，每板350μl菌液，放入32℃培养箱中，870nm、4000Lx光照条件下培养72小时。
计算结果：接合率为3.1×10-5。
由实施例1、实施例2～8可看出，经过近红外光照射(波长为780nm～1100nm，光照强度为1000～6000Lx)和等离子体处理(气体流量为3～30SLM，功率为30～50W。照射距离为1～3mm)后的接合率与对比例1、2、3相比均有显著提高，同时大大缩短了接合培养所需的时间，且单一采用近红外光照射或等离子体处理并不能达到同样的效果。此外，在筛选培养基中添加一定量的油菜素内酯有助于进一步提高接合率和缩短筛选培养时间。

Claims (7)

1.一种类球红细菌的接合转移方法，包括：类球红细菌的培养，供体菌的培养，供体菌与类球红细菌的混合，混合菌的接合培养，以及接合转移子的筛选；其特征在于，在供体菌与类球红细菌混合之前，对类球红细菌进行等离子体处理，并在近红外光照射下进行类球红细菌的培养以及混合菌的接合培养；所述近红外光的波长为780nm～1100nm，光照强度为1000～6000Lx；
所述等离子体为常压室温等离子体；采用的气源为氦气、氩气、氮气、氧气、空气或两种以上的混合气体；所述等离子体处理的气体流量为3～30SLM，功率为30～50W，照射距离为1～3mm；所述等离子体处理的时间为10～60s；所述供体菌为含外源质粒的大肠杆菌；所述类球红细菌的保藏编号为CGMCC No.15927。
2.根据权利要求1所述的类球红细菌的接合转移方法，其特征在于，所述近红外光的波长为800nm～890nm，光照强度为2000～4000Lx。
3.根据权利要求1所述的类球红细菌的接合转移方法，其特征在于，所述接合培养的时间为6～8h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的类球红细菌的接合转移方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别培养类球红细菌和含外源质粒的大肠杆菌，得到类球红细菌菌液和大肠杆菌菌液；
(2)对步骤(1)获得的类球红细菌菌液进行等离子体处理；
(3)将步骤(2)等离子体处理后的类球红细菌菌液与步骤(1)获得的大肠杆菌菌液按比例混匀，得到混合菌液，再将混合菌液置于接合培养基上进行接合培养，获得接合菌液；
(4)将接合菌液洗脱后，涂布于筛选培养基上进行筛选培养，得到接合转移子。
5.根据权利要求4所述的类球红细菌的接合转移方法，其特征在于，步骤(1)中，所述类球红细菌菌液和大肠杆菌菌液的OD600为0.4～0.8；步骤(3)中，所述离子体处理后的类球红细菌菌液和大肠杆菌菌液混合时的体积比为1:0.1～10。
6.根据权利要求4所述的类球红细菌的接合转移方法，其特征在于，步骤(1)中，所述类球红细菌菌液的培养方法为：将类球红细菌接种于液体培养基中，在30～32℃、200～230rpm、780nm～1100nm、1000～6000Lx的光照条件下培养36～60h；
所述大肠杆菌菌液的培养方法为：将大肠杆菌接种于LB液体培养基中，在36～38℃、200～300rpm的条件下培养15～20h。
7.根据权利要求4所述的类球红细菌的接合转移方法，其特征在于，步骤(4)中，筛选培养基中含有油菜素内酯及其类似物的一种或多种，浓度为0.1～1μg/mL。
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