CN111069149A - 一种医用同种骨清洗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医用同种骨清洗方法。采用粗洗，循环清洗和后续清洗的操作步骤完成。采用本发明制备的医用同种骨，力学性能高，无细胞毒性，免疫原性达到骨移植规定的要求，清洗工艺中引入了NaOH清洗，NaOH具有精洗去油脂的作用，同时具有很好的病毒灭活作用，增强了清洗后的同种骨的各项功能指标。
Description
技术领域
本发明属于骨科医学材料制备技术领域，具体涉及一种医用同种骨清洗方法。
背景技术
研制理想的生物材料替代自体骨移植用于修复骨组织缺损是医学领域的一个重要课题，目前，临床上采用的骨移植材料有羟基磷灰石，脱蛋白骨，自体骨等，羟基磷灰石，脱蛋白骨的免疫原性强，自体骨来源有限，均限制了其应用。
去细胞同种骨作为新型的生物衍生支架材料，具有良好的空间结构，降解性，生物相容性，但是，其力学性能较差，通过传统的清洗方法制备的去细胞同种骨，力学性能差。
专利200510044335.4公开了一种脱细胞基质异种骨的制作方法。它包括如下步骤：a.去污：采用普通洗涤剂将异种骨的骨头表面的油污等杂质洗净，然后再用蒸馆水冲洗干净，凉干后获得完全的骨头基质；b.去蛋白：在室温或37℃烤箱的条件下，将上述去污步骤后获得的骨头基质放入浓度为15～20％的双氧水中浸泡24～48小时，然后再用双蒸水冲洗至干净无泡沫为止；c.去酶：在室温条件下，将上述去蛋白步骤后获得的骨头基质放入1∶1～3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持续震荡的方式浸泡24～48小时，然后再用双蒸水循环冲洗至无氯仿和甲醇的味道为止；d.脱细胞：在2～5℃条件下，将上述去酶步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.5～1.0％的十二炕基硫酸钠和浓度为0.8～1.2％的蛋白酶抑制剂的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡24～48小时，然后再用双蒸水循环冲洗24～48小时；在2～5℃条件下，再将骨头基质放入浓度为0.1～0.4％的膜蛋白酶中浸泡12～24小时，然后再用双蒸水循环冲洗20～28小时，获得脱细胞基质异种骨；e.杀菌消毒、包装：采用冻干机冻干的方式将脱细胞基质异种骨冻干，然后进行封装，采用环氧乙烷或Co60进行杀菌消毒。该技术采用氯仿，甲醇和Co60，都是毒性较大的物质，残留少许会对人体造成较大危害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种医用同种骨清洗方法。
一种医用同种骨清洗方法，按照如下步骤进行：
(1)粗洗：取新鲜同种骨，去除软组织、粗切割，0.5-0.8％H2O2清洗15-25min，然后用纯化水再次清洗15-25min，再次去除软组织，加入粗洗液，40-50℃水浴25-35min，最后用高压水枪冲洗2-5min；
(2)循环清洗：采用清洗液，摇床室温清洗步骤(1)处理好的同种骨，清洗25-35min，然后采用3-6％H2O2超声清洗1-2h，0.3-0.7mol/L NaOH摇床室温清洗25-35min，最后采用纯化水超声清洗10-20min；重复上述步骤1-3次；
(3)后续清洗：采用0.09-0.15mol/L HCL摇床清洗25-35min；然后采用纯化水超声清洗25-35min，清洗2-4次以去除以上清洗过程中的化学试剂残留；然后采用0.3-0.7mol/LNaH2PO4超声清洗25-35min，清洗2-4次；纯化水超声清洗10-20min，清洗2-4次；最后采用75％乙醇浸泡10-20min，纯化水冲洗1-3min，制成。
所述粗洗液包括2％TritonX-100和1％Na2CO3；同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml。
步骤(2)所述摇床的转速设置为120rpm。
所述清洗液包括1％TritonX-100和1％Na2CO3；同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml。
步骤(2)最后采用纯化水超声清洗1-4次。
步骤(3)所用同种骨与0.12mol/L HCL的用量比为：1g∶5ml。
步骤(3)所述摇床的转速设置为120rpm。
步骤(3)所用同种骨与0.5mol/L NaH2PO4的用量比为：1g∶5ml。
步骤(2)NaOH摇床室温清洗时加入等体积的1.0-1.5mol/L的葡萄糖苷溶液，作为保护液。NaOH清洗虽然有很强的去油脂的作用，但是，其碱性太强，往往造成过度腐蚀，其结果是导致清洗后的同种骨力学性能下降，且免疫原性增强，葡萄糖苷溶液加入后，能够在保证去油脂作用不减弱的情况下，对于骨质材料的腐蚀减弱。
本发明的有益效果：采用本发明制备的医用同种骨，力学性能高，无细胞毒性，免疫原性达到骨移植规定的要求，清洗工艺中引入了NaOH清洗，NaOH具有精洗去油脂的作用，同时具有很好的病毒灭活作用，增强了清洗后的同种骨的各项功能指标。
附图说明
图1为采用实施例1的清洗方法制备的同种骨清洗前后效果图。
图2为采用对比例的清洗方法制备的同种骨清洗前后效果图。
图3为免疫原性试验图。
图4为HE染色图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种医用同种骨清洗方法，按照如下步骤进行：
(1)粗洗：取新鲜同种骨，去除软组织、粗切割，0.6％H2O2清洗20min，然后用纯化水再次清洗20min，再次去除软组织，加入粗洗液(同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml)，45℃水浴30min，最后用高压水枪冲洗3min；所述粗洗液包括2％TritonX-100和1％Na2CO3；
(2)循环清洗：采用清洗液(同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml)，摇床室温清洗步骤(1)处理好的同种骨，摇床的转速设置为120rpm，清洗30min，然后采用5％H2O2超声清洗1.5h，0.5mol/L NaOH摇床室温清洗30min，最后采用纯化水超声清洗15min，清洗2次；重复上述步骤1次；所述清洗液包括1％TritonX-100和1％Na2CO3；
(3)后续清洗：采用0.12mol/L HCL摇床清洗(同种骨与0.12mol/L HCL的用量比为：1g∶5ml)，转速设置为120rpm，清洗30min；然后采用纯化水超声清洗30min，清洗2次以去除以上清洗过程中的化学试剂残留；然后采用0.5mol/L NaH2PO4(同种骨与0.5mol/LNaH2PO4的用量比为：1g∶5ml)超声清洗30min，清洗2次；纯化水超声清洗15min，清洗2次；最后采用75％乙醇浸泡15min，纯化水冲洗2min，制成。
实施例2
一种医用同种骨清洗方法，按照如下步骤进行：
(1)粗洗：取新鲜同种骨，去除软组织、粗切割，0.5％H2O2清洗25min，然后用纯化水再次清洗25min，再次去除软组织，加入粗洗液(同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml)，40℃水浴35min，最后用高压水枪冲洗4min；所述粗洗液包括2％TritonX-100和1％Na2CO3；
(2)循环清洗：采用清洗液(同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml)，摇床室温清洗步骤(1)处理好的牛松质骨，摇床的转速设置为120rpm，清洗35min，然后采用6％H2O2超声清洗1h，0.5mol/L NaOH摇床室温清洗32min，最后采用纯化水超声清洗10min，清洗2次；重复上述步骤1次；所述清洗液包括1％TritonX-100和1％Na2CO3；
(3)后续清洗：采用0.10mol/L HCL摇床清洗(同种骨与0.10mol/L HCL的用量比为：1g∶5ml)，转速设置为120rpm，清洗35min；然后采用纯化水超声清洗35min，清洗2次以去除以上清洗过程中的化学试剂残留；然后采用0.6mol/L NaH2PO4(同种骨与0.6mol/LNaH2PO4的用量比为：1g∶5ml)超声清洗25min，清洗2次；纯化水超声清洗10min，清洗2次；最后采用75％乙醇浸泡20min，纯化水冲洗3min，制成。
实施例3
一种医用同种骨清洗方法，按照如下步骤进行：
(1)粗洗：取新鲜同种骨，去除软组织、粗切割，0.6％H2O2清洗20min，然后用纯化水再次清洗20min，再次去除软组织，加入粗洗液(同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml)，45℃水浴30min，最后用高压水枪冲洗3min；所述粗洗液包括2％TritonX-100和1％Na2CO3；
(2)循环清洗：采用清洗液(同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml)，摇床室温清洗步骤(1)处理好的同种骨，摇床的转速设置为120rpm，清洗30min，然后采用5％H2O2超声清洗1.5h，等体积1.2mol/L的葡萄糖苷溶液和0.5mol/L NaOH摇床室温清洗30min，最后采用纯化水超声清洗15min，清洗2次；重复上述步骤1次；所述清洗液包括1％TritonX-100和1％Na2CO3；
(3)后续清洗：采用0.12mol/L HCL摇床清洗(同种骨与0.12mol/L HCL的用量比为：1g∶5ml)，转速设置为120rpm，清洗30min；然后采用纯化水超声清洗30min，清洗2次以去除以上清洗过程中的化学试剂残留；然后采用0.5mol/L NaH2PO4(同种骨与0.5mol/LNaH2PO4的用量比为：1g∶5ml)超声清洗30min，清洗2次；纯化水超声清洗15min，清洗2次；最后采用75％乙醇浸泡15min，纯化水冲洗2min，制成。
对照例：常规清洗方法
(1)粗洗：取新鲜同种骨，去除软组织、粗切割，0.6％H2O2清洗20min(同种骨与溶液的用量比为：1g∶5ml)，然后用纯化水再次清洗20min，再次去除软组织，高压水枪冲洗3min，最后用超声清洗30min；
(2)循环清洗：步骤(1)处理好的同种骨至于1∶1的氯仿∶甲醇的混合液中(同种骨与溶液的用量比为：1g∶5ml)，采用持续震荡的方式浸泡24小时，摇床的转速设置为120rpm，然后再用纯化水循环冲洗至无氯仿和甲醇的味道为止；重复上述步骤1次；
(3)后续清洗：采用0.12mol/L HCL摇床清洗(同种骨与0.12mol/L HCL的用量比为：1g∶5ml)，转速设置为120rpm，清洗30min；然后采用纯化水超声清洗30min，清洗2次以去除以上清洗过程中的化学试剂残留；然后采用0.5mol/L NaH2PO4(同种骨与0.5mol/LNaH2PO4的用量比为：1g∶5ml)超声清洗30min，清洗2次；纯化水超声清洗15min，清洗2次；最后采用75％乙醇浸泡15min，纯化水冲洗2min，制成。
采用实施例1的清洗方法制备的同种骨清洗前后效果如图1所示，采用常规清洗方法(对照例)制备的同种骨清洗前后效果如图2所示，由图1和图2的对比可以知道，清洗后，实施例1的同种骨颜色更白，目测净度较高，细胞杂质残留物少。
实验例1：力学检测
采用MTS858Mini Bionix生物材料力学机，将同种骨试件放置于力学实验机的夹具上(注意截骨端平整，与夹具紧密贴附)，施与载荷，结果用X-Y曲线记录，其中X轴为应力，Y轴为应变。本实验以5mm/min的速度对试样施加压应力，试样破坏后，计算机自动输出载荷、应力等数据。将同种骨试样置于试验机的弯曲支座上，支座跨距10mm，本实验以2mm/min的实验速度对试样施加弯矩，试样破坏后，计算机自动输出最大载荷、最大应力等。
实验结果见表1：
表1
注：*代表与实施例1比较P＜0.05。
实验例2：免疫原性试验
BALB/c小鼠经腹腔内注射0.3％戊巴比妥钠(0.02mL/g体重)麻醉后，常规备皮、消毒、铺巾，于背部皮下植入样品(实施例1-3及对照例制备的医用同种骨)0.02g。缝合皮肤，碘伏消毒创口，按组分笼饲养，2周后取材。取出脾脏研磨，收集淋巴细胞分散于培养基中，计数，按4x105个细胞/孔接种于96孔板中。37℃培养4天后采用CCK-8法检测细胞活力。
实验结果如图3所示：实施例1，实施例2，对照例与假手术组(阴性组)相比均具有显著性差异(P＜0.05)，会引起小鼠一定的细胞免疫反应，实施例3与假手术组(阴性组)相比没有显著性差异，免疫原性最低。
实验例3：HE染色(松质)
将实施例1制备的医用同种骨块切割为0.5x0.5x0.3cm薄片，10％甲醛溶液固定24后，脱钙、脱水、包埋、切片等过程，制成标本切片(厚度4μm)，HE染色，对其组织学形态进行观察，结果如图4所示，实施例1骨基质材料胶原纤维排列规则，骨陷窝空虚，均无细胞碎片残留；阳性组部分有完成的细胞核，部分无完整的细胞核。
Claims (9)
1.一种医用同种骨清洗方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)粗洗：取新鲜同种骨，去除软组织、粗切割，0.5-0.8％H2O2清洗15-25min，然后用纯化水再次清洗15-25min，再次去除软组织，加入粗洗液，40-50℃水浴25-35min，最后用高压水枪冲洗2-5min；
(2)循环清洗：采用清洗液，摇床室温清洗步骤(1)处理好的同种骨，清洗25-35min，然后采用3-6％H2O2超声清洗1-2h，0.3-0.7mol/L NaOH摇床室温清洗25-35min，最后采用纯化水超声清洗10-20min；重复上述步骤1-3次；
(3)后续清洗：采用0.09-0.15mol/L HCL摇床清洗25-35min；然后采用纯化水超声清洗25-35min，清洗2-4次以去除以上清洗过程中的化学试剂残留；然后采用0.3-0.7mol/LNaH2PO4超声清洗25-35min，清洗2-4次；纯化水超声清洗10-20min，清洗2-4次；最后采用75％乙醇浸泡10-20min，纯化水冲洗1-3min，制成。
2.根据权利要求1所述医用同种骨清洗方法，其特征在于，所述粗洗液包括2％TritonX-100和1％Na2CO3；同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml。
3.根据权利要求1所述医用同种骨清洗方法，其特征在于，步骤(2)所述摇床的转速设置为120rpm。
4.根据权利要求1所述医用同种骨清洗方法，其特征在于，所述清洗液包括1％TritonX-100和1％Na2CO3；同种骨与粗洗液的用量比为：1g∶5ml。
5.根据权利要求1所述医用同种骨清洗方法，其特征在于，步骤(2)最后采用纯化水超声清洗1-4次。
6.根据权利要求1所述医用同种骨清洗方法，其特征在于，步骤(3)所用同种骨与0.12mol/L HCL的用量比为：1g∶5ml。
7.根据权利要求1所述医用同种骨清洗方法，其特征在于，步骤(3)所述摇床的转速设置为120rpm。
8.根据权利要求1所述医用同种骨清洗方法，其特征在于，步骤(3)所用同种骨与0.5mol/L NaH2PO4的用量比为：1g∶5ml。
9.根据权利要求1所述医用同种骨清洗方法，其特征在于，步骤(2)NaOH摇床室温清洗时加入等体积的1.0-1.5mol/L的葡萄糖苷溶液，作为保护液。
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