CN111053770B - 黄连素作为同种异体心脏移植中所使用的免疫抑制剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了黄连素作为同种异体心脏移植中所使用的免疫抑制剂的应用。本发明在小鼠心脏移植模型中，黄连素单用即可以显著延长同种异体心脏移植物的生存期，并且单用效果优于一线临床免疫抑制剂FK506，同时毒副作用大幅降低，能够为移植患者术后生活质量的提高做出重大贡献。

Description

黄连素作为同种异体心脏移植中所使用的免疫抑制剂的应用
技术领域
本发明属于器官移植用药技术领域，具体涉及黄连素作为同种异体心脏移植中所使用的免疫抑制剂的应用。
背景技术
器官移植仍然是目前治疗终末器官衰竭最有效的治疗手段，急性排斥反应是临床上同种异体间器官移植中最常见的排斥类型。急性排斥反应根据作用的机制不同又可分为细胞型急性排斥反应和体液型急性排斥反应，而前者的作用更为重要，病理学检查可见移植物内大量的淋巴细胞和巨噬细胞等炎症细胞的浸润，也时也常见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。早期的淋巴细胞主要为CD4+T细胞，后期以具有杀伤性功能的CD8+T细胞为主，对移植物的实质细胞进行破坏，如未得到免疫抑制药物的控制，移植物功能将逐渐丧失。临床常用的免疫抑制剂通过阻断免疫细胞(T细胞，B细胞，巨噬细胞等)功能，降低机体免疫反应强度而被广泛应用于器官移植及疾病治疗中，但因多数免疫抑制剂具有较强毒副作用而限制其临床应用。寻找低毒副作用的免疫抑制药物一直是免疫学的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供黄连素(BBR，Berberine，盐酸小檗碱)作为同种异体心脏移植中所使用的免疫抑制剂的应用。
本发明的技术方案如下：
黄连素作为同种异体心脏移植中所使用的免疫抑制剂的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述黄连素单独作为同种异体心脏移植中所使用的免疫抑制剂。
在本发明的一个优选实施方案中，所述黄连素的使用剂量为4.5-5.5mg/kg.d。
进一步优选的，所述黄连素的使用剂量为5mg/kg.d。
本发明的有益效果是：
本发明在小鼠心脏移植模型中，黄连素单用即可以显著延长同种异体心脏移植物的生存期，并且单用效果优于一线临床免疫抑制剂他克莫司(FK506)，同时毒副作用大幅降低，能够为移植患者术后生活质量的提高做出重大贡献。
附图说明
图1为本发明实施例1中的黄连素抑制脾细胞增殖的结果图。
图2为本发明实施例2中的心脏移植的步骤照片。
图3为本发明实施例2中的黄连素延长同种移植物的生存期的结果图。
图4为本发明实施例2中的受体主要器官的病理学照片。
图5为本发明实施例2中的对受体脾脏淋巴细胞亚群的影响的流式细胞图。
图6为本发明实施例2中的相关炎性因子在移植物中的转录水平的检测图。
图7为本发明实施例2中的抗原特异性诱导的T细胞增殖的检测图。
图8为本发明实施例2中的各组移植物病理切片图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
提取
Figure BDA0002362807440000021
C57B/6小鼠的脾细胞，使用刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞，并加入不同浓度的黄连素，使最终体系中黄连素的浓度分别为50μM、100μM和200μM，NC组为不加ConA和黄连素的阴性对照组，PC为加入ConA不加黄连素的阳性对照组。用Brdu的方法检测在不同浓度的黄连素在培养环境下对T细胞增殖能力的影响，结果如图1所示，黄连素在50μM的时候抑制作用明显，在100、200μM的时候抑制作用进一步增加。
实施例2
对黄连素的使用剂量进行摸索。分别选取2.5、5、7.5、15mg/kg.d对受体(颈部异位心脏移植模型：采用套管法进行颈部异位心脏移植术，心脏移植简略步骤如技术路线图2所示；)进行腹腔注射，发现2.5mg/kg.d对移植物的存活期没有延长，5mg/kg.d和7.5mg/kg.d的延长效果一致，但7.5mg/kg.d有较高的致死率，15mg/kg.d致死率高达100％。
上述受体为体重(22±2)g，8～12周龄雌性C57BL/6(B6，H-2Kb)和BALB/c(H-2Kd)，均购买于中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司。所有实验动物均饲育在厦门大学器官移植研究所SPF级环境中，动物麻醉采用戊巴比妥钠腹腔注射。
本实施例选择5mg/kg.d作为研究剂量，小鼠心脏移植术后第0天(d0)至术后第30天，每天每只受体鼠给予5mg/kg的黄连素腹腔注射治疗，阴性对照组注射生理盐水。术后由颈部搏动情况判断移植物是否存活，搏动停止即判断为完全排斥。
经以上实验，如图3所示，本实施例的移植物中位数生存期为22天，其效果远高于他克莫司(tacrolimus，FK506，中位生存期15天，参见Wang Y，Qin Q，Chen J，Kuang X，XiaJ，Xie B et al.Synergistic effects of Isatis tinctoria L.and tacrolimus in theprevention of acute heart rejection in mice.Transpl Immunol 2009；22(1-2)：5-11.以及Onsager DR，Canver CC，Jahania MS，Welter D，Michalski M，Hoffman AM etal.Efficacy of tacrolimus in the treatment of refractory rejection in heartand lung transplant recipients.The Journal of heart and lung transplantation：the official publication of the International Society for HeartTransplantation 1999；18(5)：448-455.)
在给药20d后，取受体心肝肺肾进行病理学分析，结果如图4所示，未发现炎性细胞浸润、组织结构实质性病变。
在移植后7天，取受体小鼠脾细胞进行流式分析，结果如图5所示，发现单用黄连素组相比Control组的CD4/8+T细胞都出现显著降低。
如图6所示，通过qRT-PCR对心脏移植物内的炎性因子检测发现IFN-γ转录水平降低，说明黄连素抑制受体免疫排斥的Th1途径，也就是细胞介导的免疫排斥反应。Treg细胞相关因子TGF-β、Foxp3的基因转录水平也显著降低。
验证黄连素抑制T细胞功能：在心脏移植后第7天分离各组小鼠的脾脏T细胞作为反应细胞，用经丝裂霉素C处理的BALB/c的脾脏细胞作为刺激细胞，进行混合淋巴细胞培养，以此观察各组用药对T细胞应答的影响。三天后，使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷渗入法检测各组反应细胞在供者来源的同种异体抗原刺激下的增殖情况(MLR)。如图7所示，与对照组相比，单用黄连素组的T细胞应答均有所减弱。
用HE染色的方法观察各组移植物的炎症细胞浸润情况。如图8所示：在移植后7天，Control组移植物出现心肌细胞广泛坏死，炎性细胞大量浸润，血栓大量形成。单用BBR组，移植物显示中度炎症细胞浸润和组织损伤，血栓较少。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (2)

1.黄连素在制备用于作为同种异体心脏移植中所使用的免疫抑制剂的药物中的应用，其特征在于：所述药物的有效成分仅为黄连素，且黄连素的使用剂量为4.5-5.5mg/kg.d。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄连素的使用剂量为5mg/kg.d。
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