CN109481666B - 一种人体血液肿瘤pdx模型的建立方法 - Google Patents

一种人体血液肿瘤pdx模型的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人体血液肿瘤PDX模型的建立方法，提取患者血液肿瘤细胞，加入兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白ATG和患者自体血清，混合后孵育，孵育完成后，所得细胞经重悬，接种于小鼠体内；接种的小鼠喂服环孢素CsA，从血液肿瘤细胞接种前2天开始，持续5‑10天。本发明首次采用我国自主研发的新型高度免疫缺陷型NCG小鼠建立人白血病PDX模型，通过“人胸腺细胞免疫球蛋白预处理样本联合环孢素长期口服”清除和抑制供者来源的T细胞，ATG对淋巴细胞的毒性作用联合CsA对T淋巴细胞的功能性阻断作用，可持久抑制T淋巴细胞免疫功能，显著提高血液肿瘤PDX建模的成功率。

Description

一种人体血液肿瘤PDX模型的建立方法
技术领域
本发明涉及血液肿瘤实验动物模型构建方法，具体是一种人体血液肿瘤PDX模型的建立方法。
背景技术
根据最新统计，血液肿瘤在我国的发病率约为3-4人/10万，在恶性肿瘤死亡率中，居第6位(男性)和第8位(女性)，在儿童及35岁以下成人中则居第一位。患者肿瘤组织的异种移植(PDX)模型是针对恶性肿瘤创建的一种临床前研究和药筛动物模型。该模型直接将病人新鲜的肿瘤组织移植到免疫缺陷型小鼠体内，建立能够稳定传代的肿瘤组织细胞库，为肿瘤相关基础和临床研究提供重要的支撑。但是这一模型现阶段也存在一定的问题。一方面，PDX模型构建需要采用免疫缺陷型小鼠。尽管现有的免疫缺陷型小鼠品种已经可以满足某些种类的实体瘤PDTX模型建立的需求，但是白血病PDX模型建立依然具有较大难度和挑战，难以做到稳定传代。事实上，如果 PDTX模型不能成功传至第3代及第4代，将无法广泛应用于相关疾病研究和临床药物研发。国外报道应用新一代高度免疫缺陷NOG或NSG小鼠进行多种实体瘤PDX建模，成功率高达70％以上，而血液***肿瘤的PDX建模成功率则低于30％。另一方面，申请人及国外部分研究者都观察到，白血病样本中含有的少量患者来源的T淋巴细胞，在PDX建模过程中会在小鼠体内大量扩增，这一问题目前被认为是造成血液肿瘤PDX 建模效率低下的另一主要原因。以往研究者试图通过“CD3磁珠分选”方案去除患者外周血或骨髓来源的单核细胞中的T淋巴细胞。但并不是全部的T淋巴细胞都表达胞外抗原CD3，T细胞前体(包括Pro-T、Pre-T)主要表达CD44、CD25和c-kit，CD4/CD8 双阳性T细胞只有弱阳性的CD3表达。所以“CD3磁珠分选法”不能高效去除T淋巴细胞，且成本较高，具有一定得局限性，需要进一步改进。
该领域在知识产权上的竞争日趋激烈，因此我国疾病动物模型领域在多方面都加大了研究力度，加快了研究步伐。现阶段疾病动物模型建模策略以基因修饰类动物模 型为主，自发性疾病动物模型、环境诱导、物理因素诱导等也有涉及，近年来通过研 究者们不断的努力取得了一定的成果。例如，在利用基因编辑技术在斑马鱼中建立了 白血病模型等。但是相较于其他实体肿瘤，白血病动物模型种类有限，现阶段还无法 提供足够的数量用于临床前研究，阻碍了临床疗效的预测和识别病人的异质性反应。 因此，建立高效稳定的白血病PDX模型将会产生巨大的经济效益和社会效益。
2002年开始PDX模型建立取得一系列突破性进展，日本实验动物研究所的 MamoruIto研究组培育建立了以NOD/SCID为基础NOG(NOD/Shi-scid,IL-2Rγnull) 小鼠模型，他们通过杂交NOD/scid小鼠和γ-链IL-2受体敲除小鼠成功建立了一个免疫功能严重不全的小鼠品系。2005年，美国杰克逊实验室相关研究人员又发布了以 NOG为基础的NSG改进模型。NOG和NSG小鼠与NOD/scid小鼠相比，无T，B淋巴细胞免疫泄漏，寿命更长，人体细胞和组织移植存活率有了显著提高，同时能够植入近70～80％的正常或癌变人类细胞和组织。但是包括我国在内的许多实验机构因为没有这两种类型小鼠的自主知识产权，需要高价进口以便进行相关的实验研究，实验成本较高且获取小鼠的时间和数量不能够得到保障，不利于大规模疾病模型的建立。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种成功率高、能够稳定传代的人体血液肿瘤PDX模型的建立方法。
临床上异体移植前或移植后早期，使用针对T淋巴细胞的抑制剂可以成功减少急性排斥发生率和移植相关的患者死亡率。临床经常采用兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(rabbit anti-human themocyte immunoglobulin,ATG)和环孢素(cyclosporin a,CsA)来治疗移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)，这为我们的研究提供了新的思路。兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白为抗淋巴细胞免疫抑制剂，在补体(C1～C4)的参与下可抑制T(胸腺依赖)淋巴细胞的功能。其可以识别胸腺来源的T细胞表面的活性物质如：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD25、HLA-DR和Ⅰ级HLA，T细胞被补体依赖性溶解并且通过由单核细胞和吞噬细胞作用形成的Fc-依赖性调理素机制从循环中清除。因此，ATG是一种识别抗原较全面，能够针对胸腺来源各发育阶段的T淋巴细胞，清除效力最强的免疫抑制剂。环孢素(CsA)是一种特异性较高，抑制作用强的免疫抑制剂，可以选择性地作用于T淋巴细胞活化初期，而不影响骨髓的正常造血功能，对B细胞、粒细胞及巨噬细胞的影响小。具有对造血组织无毒，不增加感染机会，使用方便等特点，可以大大提高移植存活率。
本发明具体方案如下：
一种人体血液肿瘤PDX模型的建立方法，包括如下步骤：
(1)提取患者血液肿瘤细胞；
(2)取步骤(1)血液肿瘤细胞中加入兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白和患者自体血清，混合后孵育；
(3)孵育完成后，所得细胞经重悬，接种于小鼠体内；
(4)接种的小鼠喂服环孢素，从血液肿瘤细胞接种前2天开始，持续5-10天。
步骤(1)中，提取方式为采集患者血液或骨髓5-50ml，利用Ficoll分离液进行梯度离心；分离的单个核细胞采用生理盐水洗涤，然后以0.5-2ml生理盐水重悬。
步骤(2)中，取血液肿瘤细胞储存于生理盐水中，然后按照每只小鼠接种量加入50-400μg兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白和1ml患者自体血清。
部分白血病患者血清中补体低下，需要补充兔补体，自体血清采用1ml，需要补充的兔补体占20％-50％。
优选地，所述孵育的条件为：37℃恒温下孵育0.5-1.5h。
步骤(3)中，接种量为每只小鼠接种0.1-0.25ml重悬后所得混合体系，混合体系中血液肿瘤细胞接种量为2×105-1×106个，接种方式为经鼠尾静脉注射。
所述小鼠为雌性NCG小鼠，6～8周龄，购买于南京大学模式动物研究所。
步骤(4)中，所述环孢素注射/喂服量按15-35mg·kg-1·d-1计量。
有益效果：
1、本发明首次采用我国自主研发的新型高度免疫缺陷型NCG小鼠建立人白血病PDX模型。该种小鼠与现有并广泛使用的NOG小鼠(来自日本动物研究所)和NSG 小鼠(来自美国杰克逊实验室)相比背景更纯，免疫***缺陷更严重，寿命更长，适合长期实验观察和用药，异种移植成活率高，是目前成瘤率最高的免疫缺陷小鼠，特别适合于非实体瘤，即血液***肿瘤的建立。
2、对于患者外周血或骨髓来源的单核细胞，本发明采用“人胸腺细胞免疫球蛋白预处理样本联合环孢素长期口服”清除和抑制供者来源的T细胞，ATG对淋巴细胞的毒性作用联合CsA对T淋巴细胞的功能性阻断作用，可持久抑制T淋巴细胞免疫功能，显著提高血液肿瘤PDX建模的成功率。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/ 或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明B-ALL/NCG小鼠模型。
图2为P1代B-ALL/NCG小鼠外周血及骨髓涂片。
图3为HE染色及免疫组化显示人源CD45白血病细胞浸润脾脏、肝脏、肾脏等脏器情况。
图4为流式检测3只P2代小鼠外周血CD45/CD19人白血病细胞在建模过程中的增殖情况。
图5为P3代B-ALL NCG小鼠药敏实验观察：生理盐水对照组、氟达拉滨联合及硼替佐米+甲氨蝶呤给药组体内肿瘤细胞生长率。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
一、患者白血病样本预处理：
1、采集患者5-50ml血液或5-50ml骨髓，利用Ficoll分离液进行梯度离心，分离患者单个核细胞，用生理盐水洗涤两遍单个核细胞后，以0.5-2ml体积生理盐水重悬，细胞计数。
2、ATG+补体孵育组：患者样本细胞取一部分加入ATG(200μg/只)与患者自体血清1ml(血清中含有补体，若患者自身补体不足可补充一定量的兔补体)，混匀后在 37度孵育1小时。产物留取一部分做流式检测鉴定T淋巴细胞的含量，同时重悬细胞后并计数，以每1×106个细胞/0.2ml混合物/只，经鼠尾静脉注射接种小鼠。
二、NCG小鼠饲养及接种：
1)小鼠饲养条件：雌性NCG小鼠，6-8周龄。符合SPF级条件下分笼饲养。保持室温18-25℃，相对湿度40％-60％，专用鼠笼、垫料，饲料及饮水经121℃，30min高压灭菌。每周至少1次更换垫料。
2)NCG小鼠分组：进行试验前，取20只小鼠进行称重，记录，随机分组分成2 组，每组10只，分别按照上述细胞处理方式接种。
3)环孢素喂服处理：不做处理组对照组配以正常饮用水，ATG+补体孵育组计量喂服环孢素(CsA)。
三、建系成功评判指标：
1)一般观察指标：异种移植后，观察各组小鼠有无精神萎糜、纳差、消瘦、弓背、腹泻、脱毛、皮肤溃疡偏瘫、失明等表现及有无肿块生长，定期给各组小鼠体重，记录数据，观察至移植后60天。
2)尾静脉采血：每周监测小鼠外周细胞形态学以及流式检测白血病免疫表型，判断是否移植接种成功，以及T淋巴细胞是否在小鼠体内的大量扩增。
3)选择移植接种成功的小鼠处死：采集小鼠的外周血、骨髓、脾脏、肝脏，做成涂片或者印片，经瑞氏染色观察后细胞形态，计算肿瘤细胞百分比；脾脏细胞悬液经流式细胞术分析免疫表型分析。
4)各组织器官病理检查：PDX小鼠于濒死前或死亡后即行解剖，其余小鼠在层流架中观察至异种移植后第60天统一处死，取小鼠的瘤组织及小鼠肝脏、脾脏、肺组织、肾脏、脑组织、骨髓、皮肤等。采用常规固定、石蜡包埋、切片。取正常小鼠NCG 对应组织用于组织病理学等对照。采用苏木素-伊红染色法对所取组织进行染色，对荷瘤组织形态学观察。采用免疫组织化学染色，检测PDX小鼠不同组织的人CD45抗原表达。
5)白血病细胞连续接种传代：从原代植活NCG小鼠抽取血液，或采用冻存的原代小鼠脾脏悬液快速化冻，生理盐水洗涤，按每1×106细胞加入0.2ml生理盐水中重新悬浮，经鼠尾静脉注射接种下一代NCG小鼠。
四、实验结果：
1、“ATG+CsA”方案处理NCG小鼠副反应小
为了初步验证“ATG+CsA”理论依据的科学性和评估两种药物联合免疫的毒副作用，我们首先尝试采用ATG+补体(200μg/只，尾静脉注射)联合CsA(35mg/kg，饮水喂服)用于NCG小鼠实验(共6只)，持续观察2月，小鼠饮食饮水无影响，毛色及活动能力正常，未出现造血功能异常和感染等不良反应。
2、“ATG+CsA”方案构建B-ALL/NCG小鼠模型成功
图1为B-ALL/NCG小鼠模型：注射血液肿瘤细胞后8-9周后小鼠出现毛皮色泽暗淡，精神萎靡，活动减少等现象。解剖发现小鼠出现脾脏严重肿大(图1黑色箭头所示)。
发明人进一步分离了一例复发难治B细胞急性淋巴白血病B-ALL患者外周血来源的白血病细胞，建立了P1代B-ALL/NCG小鼠，小鼠外周血及脾脏细胞有大量肿瘤细胞浸润。图2为P1代B-ALL/NCG小鼠外周血及骨髓涂片观察：可见大量白血病细胞。
但是当用P1代小鼠的脾脏悬液接种扩大数目的P2代小鼠时，只有一部分P2代小鼠(6只中的3只)有白血病细胞扩增，另外3只小鼠外周血及脾脏出现大量人源T 细胞而没有白血病细胞，不能稳定传代。我们将P1代小鼠脾脏悬液与ATG加补体37° C孵育1h后，再次接种P2代小鼠6只，同时喂服CsA，流式检测结果显示在一个月的时间里全部小鼠外周血出现大量白血病细胞，并且未发现T淋巴细胞扩增的现象。采用HE染色及免疫组化显示人源CD45白血病细胞浸润脾脏、肝脏、肾脏等脏器情况，见图3；在脾脏的全部范围，肝脏的静脉血管区，肾脏的肾小球区域都有大量的肿瘤细胞浸润，苏木精伊红染色及人源抗体CD45都呈现深色阳性表达。
流式检测3只P2代小鼠外周血中表达CD45/CD19的人B-ALL白血病细胞，在建模过程中的增殖情况。分别在建模10天、20天、30天进行尾经脉采血及流式检测人源CD45/CD19阳性细胞，见图4。发现在建模10天后外周血已出现肿瘤细胞增殖，随着天数增多比例逐渐增高，30天时可占小鼠外周血50％以上的比例，此结果表明肿瘤细胞在该B-ALL小鼠模型中可稳定传代，大量扩增，且所占比例可适用于后期药物的筛选。
此种方案应用到18只P3代小鼠同样有效，并且P3代小鼠能够成功应用到后续的药敏实验中。图5为P3代B-ALL/NCG小鼠常规药敏实验观察：利用稳定建系且扩增到一定数量的P3代B-ALL小鼠进行药敏实验，分成生理盐水对照组、硼替佐米+ 甲氨蝶呤联合给药组，分别检测体内肿瘤细胞生长率，结果显示硼替佐米+甲氨蝶呤联合给药组较对照组，在前期用药时可以在一定程度上抑制该患者的肿瘤细胞，随着后期肿瘤细胞的大量增殖，已无法继续控制肿瘤细胞的增殖程度，提示还需进一步探索该复发难治B细胞急性淋巴白血病B-ALL患者有效的用药方式及其他的治疗模式。以上结果说明ATG加补体联合环孢素的方案针对这一例B-ALL小鼠建模是有效的。综上，利用该方案现已成功构建急性淋巴白血病，慢性淋巴性白血病，慢性粒细胞白血病CML，骨髓瘤MM等多种血液***PDX小鼠模型，并且能够稳定传代，并且能够成功应用到后期药敏试验中。
本发明提供了一种人体血液肿瘤PDX模型的建立方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (3)

1.一种白血病异种移植模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取患者白血病肿瘤细胞；
（2）取步骤（1）白血病肿瘤细胞中加入兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白和患者自体血清，混合后孵育；
（3）孵育完成后，所得细胞经重悬，经鼠尾静脉注射接种于小鼠体内；
（4）接种的小鼠喂服环孢素，从白血病肿瘤细胞接种前2天开始，持续5-10天；
步骤（2）中，取白血病肿瘤细胞储存于生理盐水中，然后按照每只小鼠接种量加入50-400μg兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白和1 ml患者自体血清；所述患者自体血清中需要补入20-50 vt%的兔补体；
步骤（3）中，接种量为每只小鼠接种0.1-0.25 ml重悬后所得混合体系，其中含有的白血病肿瘤细胞接种量为2× 105-1×106个；
步骤（3）中，所述小鼠为雌性NCG小鼠，6~8周龄，购买于南京大学模式动物研究所；
步骤（4）中，所述环孢素的喂服量按15-35mg·kg-1·d-1计量。
2.根据权利要求1所述的白血病异种移植模型的建立方法，其特征在于，步骤（1）中，提取方式为采集患者血液或骨髓5-50 ml，利用Ficoll分离液进行梯度离心；分离的单个核细胞采用生理盐水洗涤，然后以0.5-2 ml生理盐水重悬。
3.根据权利要求1所述的白血病异种移植模型的建立方法，其特征在于，步骤（2）中，所述孵育的条件为：37℃恒温下孵育0.5-1.5 h。
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应用环孢菌素Ａ制备BALB/C小鼠肺癌模型的实验研究;吴洁等;《右江民族医学院学报》;20131231(第3期);摘要，第269页左栏第4-6段（即1.3节），第270页左栏第4、5段 *
抗人胸腺细胞免疫球蛋白与抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白体外淋巴细胞杀伤效价的比较;王筱啸等;《实用医院临床杂志》;20140731;第11卷(第4期);摘要，第59页左栏第1、2段，第59页左栏最后1段至右栏第1段 *
荧光素酶表达的淋巴瘤NCG小鼠模型的构建;钟杨城等;《复旦学报（自然科学版）》;20181213;第57卷(第6期);第727页第5段（即1.2.7节 *
血液肿瘤PDX模型的构建及应用进展;张华青等;《重庆医学》;20190729;第48卷(第22期);第3883-3887页 *

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