CN111031949A - 通过两极纳秒脉冲的干扰进行的靶向远程电刺激 - Google Patents

Abstract

提供了通过叠加两个生物无效的两极纳秒电脉冲来生成生物有效的单极纳秒电脉冲的方法和相关方面，如电穿孔和/或这些方法用于无创地将电刺激(ES)选择性靶向到深部组织和器官的治疗性应用。

Description

通过两极纳秒脉冲的干扰进行的靶向远程电刺激

政府支持

本发明根据由国立卫生研究院授予的FA9550-15-1-0517Eb016912和由空军科学研究局授予的FA9550-15-1-0517在政府支持下进行。政府具有本发明中的某些权利。

技术领域

本申请要求2017年8月16日提交的美国临时专利申请第62/546,229号的权益并依赖于其提交日期，其全部内容通过引用并入。

背景技术

电刺激(ES)用于在各种应用中操纵生物功能。然而，本领域中仍然需要例如无创地将ES选择性靶向到深部组织和器官。

发明内容

在一方面，本公开提供了一种生成生物有效的单极纳秒电脉冲的方法。所述方法包括叠加由第一对电极生成的第一生物无效的两极纳秒电脉冲和由第二对电极生成的第二生物无效的两极纳秒电脉冲，以在远离所述第一对和第二对电极的位置处产生生物有效的单极纳秒电脉冲。与在叠加步骤不存在的情况下生成的第一或第二生物无效的两极纳秒电脉冲相比，生物有效的单极纳秒电脉冲具有增强的刺激效率。在叠加步骤不存在的情况下生成的第一或第二生物无效的两极纳秒电脉冲诱导由第一或第二生物无效的两极纳秒电脉冲的第二相产生的抵消作用，从而抵消或减少第一或第二生物无效的两极纳秒电脉冲的第一相的刺激作用。此外，生物有效的单极纳秒电脉冲的增强的刺激效率由抵消或减少抵消作用产生。

在一些实施例中，第一对和第二对电极各自连接到独立的纳秒电脉冲递送通道。在某些实施例中，第一对和第二对电极各自以线性阵列对齐。在一些实施例中，单极纳秒电脉冲无创地递送到受试者。任选地，单极纳秒电脉冲无创地递送到受试者中的局部细胞、组织或器官。在某些实施例中，单极纳秒电脉冲无创地递送到受试者中的局部细胞、组织或器官。在一些实施例中，所述组织是深部组织。在其他实施例中，单极纳秒电脉冲通常体外或离体递送到样品。任选地，所述样品含有细胞。在一些实施例中，生物有效的单极纳秒电脉冲的增强的刺激效率与抵消作用的抵消或减少程度成正比。在某些实施例中，第一和/或第二生物无效的两极纳秒电脉冲是两相的或三相的。在一些实施例中，第一和/或第二生物无效的两极纳秒电脉冲具有至少第一相和第二相，并且第一相的振幅为100/70/40％。

另一方面涉及一种用于实施本文所述的方法的设备。又一方面涉及这种设备用于治疗需要电穿孔的受试者的用途。在某些实施例中，所述设备用于治疗性应用，包括但不限于疼痛控制、神经或肌肉激活、免疫或内分泌细胞的活化、靶向肿瘤消融、精神病症的治疗或帕金森氏病的治疗。所述设备还可以用于非治疗性应用，包括例如电穿孔。

附图说明

并入本说明书且构成其一部分的附图示出某些实施例，并连同书面描述一起用于解释本文公开的组成和方法的某些原理。

图1示出通过两极和单极nsEP进行的Ca²⁺活化。顶部：根据一个实施例的刺激形状和振幅。底部：CHO细胞中的峰Ca²⁺应答(平均值±s.e.，n＝20-28)。

图2示出根据一个实施例通过叠加相控两极刺激的远程ES的概念。左侧：A-A I和8-8′是两对接地隔离刺激电极。虚线近似向其递送刺激的体积，在C-c～区域中具有重叠。右侧：施加在A-A I与8-8′之间的阻尼正弦波在C-C′区域中叠加为单极脉冲。

图3示出例示根据一个实施例的CANCAN概念的示意图。顶部：A-A′和B-B′是独立的两对nsEP递送电极。虚线表示从每对电极向其递送电场的区域，其在C-C′区域中重叠并彼此抵消。底部：每对电极递送阻尼正弦波(DSW)，其本身是生物无效的。当来自B-B′的DSW相移时，两个DSW在C-C′区域中叠加为生物有效的单极脉冲。在这一区域中，存在“抵消作用的抵消”或CANCAN。

图4示出根据一个实施例的用于CANCAN实验的电极的示例性模型。

图5示出根据一个实施例的示例性电场放射量测定和抵消效率。

图6示出根据一个实施例两极和单极nsEP的叠加远程产生CANCAN。A)示出从4电极线性阵列中的每对电极递送的nsEP的示意图。通道1电极(1和2)递送两相nsEP(bi-AB)，并且通道2电极(3和4)递送单相脉冲(uni-C)。uni-C的振幅与bi-AB的第二相的振幅相同，并且为第一相(设定为100％)的50％。当uni-C相移并且与bi-AB递送同步时，被认为是“CANCAN”暴露。替代性地，当两个nsEP分开10-ms递送时，认为暴露是“异步的”。绿色箭头指示进行测量的区域。B)代表性的明视场图像(BF，顶部图)或荧光图像(YP，底部图)，其涵盖针对每种暴露条件的中间一对电极(2和3)。比例尺＝500μm。在每个图像中，左圆圈和右圆圈分别对应于电极2和3的痕迹。沿电极(白色虚线)之间的X轴画的感兴趣的16个区域内定量YP摄取，并且作为uni-A期间的局部电场的函数绘制(C)。图(D)示出作为电极2与3之间的距离的函数的“CANCAN”暴露与“异步”暴露的比率。平均值±S.E.，n＝5。

图7示出根据一个实施例多相nsEP的示例性同步改善了CANCAN作用。A)通道1电极(2和3)递送三相两极nsEP(bi-ABC)并且通道2电极(3和4)递送两相nsEP(bi-DE)。在每组实验中，将第二相和第三相的振幅(分别为B/D和C/E)分别调整为第一相(设定为100％)的50％和25％(图B和图C)、70％和25％(图D和图E)或者70％和40％(图F和图G)。沿电极2与3(图A中的绿色箭头)之间的X轴定量YP摄取，并且作为uni-A期间的局部电场的函数绘制(图B、D和F)。在图C、E和G中，作为电极之间的距离的函数绘制“CANCAN”与“异步”暴露的比率。平均值±S.E.，n＝5-8。

具体实施方式

本公开涉及在不***电极的情况下将电刺激(ES)选择性靶向到深部组织和器官的方法和相关方面，其例如通过纳秒持续时间的两极刺激的局部叠加完成。这一范式增加利用无创ES的治疗性和诊断性治疗的穿透深度、选择性和精度。ES方法的示例性应用的范围是从精神病症、帕金森氏病和疼痛控制到靶向深部肿瘤消融等。

电刺激(ES)广泛用于操纵生物功能。ES的作用是各种各样的，并且包括神经和肌肉兴奋、免疫和内分泌细胞的活化、细胞分化、电穿孔等。ES具有良好建立的临床应用，包括心脏起搏、除颤、肌肉训练和康复、疼痛控制、帕金森氏病症状减轻、神经肌肉和精神病症的诊断和治疗。之前，将ES精确靶向到大脑或身体内的特定区域的唯一方式是通过用***或植入的电极进行直接刺激。与电极放置相关联的组织损伤、疼痛、出血风险、感染和炎症限制了这一技术用于患者检查、疾病诊断学和不适合植入手术的治疗。

本公开提供了一种能够进行深部靶标的选择性、无创性、局部ES的范式。在某些实施例中，本公开涉及纳秒电脉冲(nsEP)在刺激极性反转之后抵消其刺激作用的独特特性的用途。在一些实施例中，两极nsEP的第二相抵消第一相的刺激作用，因此整个两极刺激变得比其一半更弱(图1)。反过来，将两个两极刺激叠加为单极刺激抵消了抵消作用(CANCAN)并且恢复了刺激效率。图2中的实例示出了两个阻尼正弦波如何在远离电极的C-C′区域中产生电极刺激。以这一方式，CANCAN能够在远离电极的位置处进行选择性ES。

CANCAN作用是基于两极抵消的现象。还如实例中所述，重复证明了各种不同的细胞类型(CHO，U937，心肌细胞)和使用各种终点(Ca²⁺动员、染料摄取、膜电导率、细胞存活率、磷脂酰丝氨酸外化)以及不同持续时间和形状的nsEP的两极抵消作用。

如本文所述，所述方法和相关方面是微破坏性的(例如，无创性的)。竞争性方法通常需要细胞脱离和旋转以转移到不同介质。这些程序对于电穿孔细胞是有害的或致命的，从而降低转染细胞的产率或使得实验不可行。本文公开的方法和相关方面通常还涉及比现有方法更少的程序步骤、更低的成本以及更少的细胞。此外，本文公开的方法和相关方面还涉及使用连续且精确限定的电场、有效的介质交换和药物施加/去除以及添加到无菌条件。

电穿孔(或电通透)描述了在暴露于高压电脉冲(EP)时发生的膜渗透性增加(4，5)。电穿孔具有各种生物医学应用，包括基因电转移(8)、电化疗(9)和通过不可逆电穿孔或Ca²⁺电穿孔进行的肿瘤消融(10，11)。虽然常规电穿孔方案利用毫秒和微秒持续时间EP(分别为ms-EP和μs-EP)，最近的研究集中于纳秒持续时间的EP(nsEP)(5，12，13)。与ms-EP和μs-EP相比，nsEP对于细胞具有不同的作用，包括在质膜中形成纳米大小的孔(14-16)以及细胞内膜结构(17-21)、细胞骨架重组和磷脂扰乱(21-24)、Ca²⁺动员(20，25，26)和细胞死亡途径诱导(27-31)。

最近报告了nsEP所独有的并且与更长的ms-EP和μs-EP明显不同的特征(32-39)。与相同的总持续时间的单极nsEP相比，暴露于两极nsEP的细胞电穿孔更少并且具有更好的细胞存活率(33)。同样，两倍于单极脉冲的持续时间的两极nsEP导致更少的膜渗透，尽管递送了两倍的能量(32)。通过电场反转导致的生物作用的这一衰减被称为“两极抵消作用”。这是因为在第一脉冲结束之后施加第二相反极性脉冲能够消除或“抵消”第一脉冲的作用。已在多种细胞类型中并且针对不同的终点显示了两极抵消作用，所述不同的终点包括分子和离子的跨膜运输(33，34，37-39)、磷脂酰丝氨酸外化(39)、Ca²⁺动员(32，36)和细胞存活率(32，33)。两极抵消作用的脉冲间隔持续长达10μs(32)或甚至50μs(38)。相比之下，相同极性的两个脉冲产生大于两倍的渗透(38，40)。针对每个相，对于不同持续时间和形状(包括纳秒电场振荡(NEFO))(34，39)的nsEP和具有不同振幅(39)或持续时间(37)的不对称两极nsEP观察到这一抵消作用。值得注意的是，甚至当第二相振幅降低至第一相的23％时，如在NEFO中所看到的，仍然观察到抵消作用。因此，两极抵消作用是稳健的且可再现的现象，这是nsEP所独有的，对于更长的ms-EP和μs-EP没有观察到(41-44)。

两极抵消作用的现象可以解释辐射电磁脉冲的生物作用的缺乏(45-47)。辐射电磁脉冲，包括射频(RF)和超宽带(UWB)发射的特征在于具有极短的脉冲宽度(纳秒量级)并且固有地具有两极性。若干研究调查了体外(48-53)和体内(54-56)的辐射RF和UWB脉冲的生物作用，包括对于细胞生长和遗传毒性(48，50，52，53)、心脏和神经元兴奋性的生物作用(49，51)以及心血管、神经、行为、运动和发育作用(45，46，54-56)。来自各种研究的主要发现是与假暴露对照作用没有显著差异。所采用的甚至最强的脉冲暴露产生与仅热响应一致的作用。有趣的是，“微波听觉”作用是脉冲RF发射的唯一被最广泛接受的生物作用(57)。因此，RF和UWB发射的生物作用缺乏和无效性可能是两极抵消作用的结果。

在某些方面，本公开提供了克服两极nsEP的固有无效性以用于靶向的无创电穿孔或电刺激的方法。这一概念利用了两极nsEP自身具有低生物效率的事实。如图3所示，在一对电极(A-A′，黑色)之间施加的阻尼正弦波(DSW)是生物无效的。相移的第二DSW(在电极B-B′之间施加，蓝色)是相似无效的。然而，两个DSW的叠加和同步在远离两对电极的区域(C-C′，红色)中产生生物有效的单极脉冲。换言之，叠加两个生物无效的DSW的作用抵消了两极nsEP的抵消作用，从而产生了单极脉冲。这一概念被称为“抵消作用的抵消(cancellationof cancellation)”或CANCAN作用。

虽然本文描述了各种例示性实施例，但是可以在不脱离如权利要求所述的本公开的范围的情况下对各种实施例做出任何数量的变化。例如，替代性实施例，通常，各种所述方法步骤进行的顺序可以变化，并且在其他替代性实施例中，可以完全略过一个或多个方法步骤。各种装置和***实施例的任选特征可以包括在一些实施例中，但不包括在其他实施例中。因此，本公开主要出于示例性目的来提供，并且不应解释为限制本文所述的***、设备和方法的范围。本公开旨在覆盖各种实施例的任何和所有变型或变化。在查看以上描述之后，本文所述的实施例和未在本文中具体描述的其他实施例的组合将对于本领域技术人员是明显的。

实例

实例1

通过用Fura-2进行比率测定荧光成像来监测胞浆游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)，如先前所述^1，2。简而言之，将负载染料的细胞置于安装在IX71显微镜上的玻璃底腔室(OlympusAmerica，森特瓦利，宾夕法尼亚州)中。将腔室连续灌注含有以下的溶液(以mM计)：140NaCl、5.4KCl、1.5MgCl2、2CaCl2、10葡萄糖和10HEPES(pH 7.3，290-300mOsm/kg)。对于无Ca²⁺条件，用2mM Na-EGTA替代CaCl2。在一些实验中，通过与10μM环匹阿尼酸(CPA)一起预温育来从内质网(ER)消耗Ca²⁺。使用快速波长转换器Lambda DG4(Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州)在340nm和380nm处替代性地激发Fura-2。用iXon Ultra 897背照CCD照相机(Andor Technology，贝尔法斯特，英国)在510nm处测量发射。用Metafluor版本7.5(Molecular Devices，森尼维耳市，加利福尼亚州)由Fura-2发射比计算[Ca²⁺]i。

用一对0.1mm直径的钨棒将电刺激递送到盖片上的所选细胞³。用MPC-200操纵器(Sutter)，将棒精确定位在盖片表面上30μm处，使得所选细胞在其尖端之间0.175mm的间距的中间。用有限元麦克斯韦方程解算器Amaze 3D(Field Precision，阿尔伯克基，新墨西哥州)通过3D模拟来确定电场。使用Digidata 1440A板和Clampex版本10.2软件(MolecularDevices)，通过TTL脉冲方案在外部触发NsEP并与图像采集同步。用TDS 3052示波器(Tektronix，比佛顿，俄勒冈州)捕获脉冲迹线。之后，所报告的两极脉冲的振幅为第一相的振幅。每个细胞仅暴露一次。

实例2

在这一实例中，进一步测试CANCAN概念的可行性。使用独立的两对nsEP递送电极，测量包埋在琼脂糖凝胶中的CHO-K1细胞的渗透。发现，两个nsEP的同步和叠加导致在远离每对刺激电极的区域中渗透的增强，这与单极脉冲的相等。因此，第一次示出了通过叠加两个独立的nsEP远程产生生物有效的单极脉冲的概念验证，证明了成功的CANCAN。这一技术的优化对于无创性的深部组织电穿孔或电刺激具有许多影响。

材料和方法

细胞系和培养基

中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯弗吉尼亚州)。将细胞在增补有10％胎牛血清(Atlanta Biologicals，Flowery Branch，乔治亚州)、100IU/mL青霉素和0.1μg/mL链霉素(Gibco实验室，盖瑟斯堡，马里兰州)的F-12K培养基(Mediatech Cellgro，亨顿，弗吉尼亚州)中。

三维细胞培养物

在实验当天，将细胞包埋在琼脂糖凝胶三维(3D)培养物中，与先前所述的方法相似(55)。简而言之，将60mm培养皿的底部涂覆在F-12K生长培养基中的7mL 2％低胶凝温度琼脂糖(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)。收获细胞并且以5×10⁶个细胞/mL的浓度重悬浮在生长培养基中的0.75％琼脂糖中；将4mL的这一悬浮液逐滴沉积在60mm培养皿中的2％琼脂糖基底层上。将培养皿在4℃下温育5分钟以加速琼脂糖凝胶化并防止细胞沉降，然后转移到培养箱，持续至少30分钟，之后进行nsEP暴露。在进行nsEP暴露之前5分钟将YO-PRO-1碘化物(YP；1μM，在PBS中；Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)添加到每个培养皿，并且在37℃下温育以使染料在整个琼脂糖凝胶上平衡。

电极和nsEP暴露

使用以线性阵列布置的两对不锈钢针电极(图4；直径为1.66mm，具有2mm电极间距)完成向包埋在琼脂糖3D培养物中的细胞递送nsEP。将每对电极连接到独立的nsEP递送通道，其中电极1和2连接到通道1并且电极3和4连接到通道2(图4C)。位于线性阵列中心的电极2和3是有源的(a)，并且周围的电极1和4是接地的(g)。将线性阵列安装在微操纵器上以将电极准确且稳定地***到含有细胞的琼脂糖凝胶中。

使用三个单独的基于MOSFET的脉冲发生器(如最近所述(59)，其各自能够产生单极或两极nsEP)和两个单独的高压DC电源的组合产生nsEP。每个发生器由两组基本模块组成，每个含有充电电容器和MOSFET开关，其产生所需电压的正脉冲或负脉冲。将三个发生器组合以产生多相脉冲发生器，将其随后通过两个独立的nsEP递送通道连接到电极(参见上文)。使用数字延时发生器(型号577-8C，Berkeley Nucleonics公司，圣拉斐尔市，加利福尼亚州)来控制每个相之间的脉冲持续时间(每个相600ns)和延时。使用Hantek DSO5202P示波器(中国，山东省，青岛)监测nsEP的准确形状和振幅。将每个相的振幅表示为第一相的百分比(其中第一相等于100％)，并且在对应的图例中进行指示。之后，所报告的脉冲振幅和电场强度为在从通道1递送的nsEP的第一相的峰处测量的那些。

在每个实验中，将细胞暴露于100次600-ns EP(10Hz)，作为以下暴露条件中的一个：来自通道1的单极；来自通道1的两极(两相或三相)；来自通道2的单极；来自通道2的两极(两相)；“CANCAN”暴露(通道1和通道2nsEP，同步且相移)；异步(通道1和通道2nsEP，间隔10ms递送)；假(没有nsEP递送)。为了进行准确比较，在相同的细胞样品中以随机顺序进行所有的nsEP和假暴露，其中每个60mm培养皿进行高达8次暴露。在室温下(22±2℃)下进行所有的nsEP暴露。

nsEP放射量测定和CANCAN建模

使用商业有限元法解算器COMSOL

Release 5.0(COMSOL公司，斯德哥尔摩，瑞典)实现匹配实验条件的3D模型。

将两对不锈钢针电极(1.66mm直径，3cm高度)以线性阵列布置(2mm电极间距)，如图4B和图4C所示。将电极浸没在具有1.4S/m导电率和相对介电常数76的溶液中，并且定位在培养皿底部上方1mm处。后者建模为介质柱体(35mm直径，2mm厚度)，相对介电常数为3.8。***被空气圈(35mm直径)包围。

选择来使模拟域离散的四面体网格产生0.10mm的网格元件最小尺寸、2.45mm的最大尺寸和401,038个元件的总数量，模拟体积为22449.3mm³。在整个解域上使用二次元，得到0.54×10⁶自由度。

使用电流界面来解稳态条件下的麦克斯韦方程，其中：

其中V是用于计算电场

和电流J＝σE的电势，其中σ是介质的导电率。在静电条件下，忽略介质的色散特性。

在实验期间，通过两个通道(图5A)递送适当同步和延时的多相矩形脉冲，每个通道连接到两个电极。取相A的振幅作为参考(100％)，并且每个随后的相的振幅设定为A的百分比。对两个脉冲暴露建模，100/70/40％和100/50/25％。

在模拟中，单独对每个相组合建模。当通过通道1递送相A时，电极1和4设定为接地，向电极2施加1V，并且将电极3与电路断开。当分别通过通道1和2递送相B和D时，电极1和4设定为接地，同时在电极2和3两者处施加-0.7(70％)或-0.5(50％)V。最后，当分别通过通道1和2递送相C和E时，电极1和4设定为接地，并且在电极2和3两者处施加0.4(40％)或0.25(25％)V。

两个多相脉冲的叠加产生单极和两极暴露的不同区域

计算图5A的电极阵列产生的|E|分布的数值模拟来提供实验研究的放射量测定并验证CANCAN概念。这一方法利用两个多相脉冲的空间叠加：通过两个通道产生的电场，同向分量相加并且反向分量相减，从而产生远离电极的区域中的单极暴露和在其他地方的两极暴露。CANCAN概念确保在两极暴露的区域中，即在电极附近的生物作用的减少，和在它们之间仅递送单极脉冲的区域中的增强。

图5B示出在垂直于距离培养皿3.8mm处(即，对应于细胞层)的电极的xy平面中不同相组合的|E|分布。当仅通道1为有源时(图5B，图A)时，|E|在电极1与2之间最强，并且朝向电极4衰减。电极3不接地，因此它仅产生电场的失真。当两个通道递送相同极性的电压时(图5B，图B+D和图C+E)，相反方向的E分量相减在电极3与4之间的区域中产生|E|减少。

根据图5B，针对三个点(两个在电极2或3附近，并且一个在它们之间的中心)，作为时间的函数提取电场。图5C示出|E|在相A(0-600ns)期间最大。在随后的相(600-1800ns)的递送期间，|E|在电极2与3之间的中心处完全消除(0kV/cm)，从而产生单极脉冲。然而，在电极边缘附近，这一减少为-20％，指示两极暴露。

电极2与3之间的计算定量3.6×3.6mm区域中的这一减少：

图5D显示100/50％和100/70％的R％。对于两种情况，减少在电极之间的中心最大，对于100/70％暴露具有更急剧的衰减。作为x的函数绘制R％突显了这一差异(图5D，右图)，表明100/70％条件可以提供更有效和靶向的CANCAN作用。

细胞成像和数据处理

在nsEP暴露之后，将培养皿保持覆盖15分钟，然后用PBS洗涤5次以除去所有的YP。使用配备有Hamamatsu C9100 EM-CCD照相机(Hamamatsu，静冈县，日本)和0.8x，0.12NA物镜的Olympus SZX16荧光立体显微镜(Olympus America，哈姆登，康涅狄格州)采集电渗透细胞的图像。使用X-Cite系列120Q荧光光源(Excelitas Technologies公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和GFP滤光器(ex.460-490nm/em.510-)检测YP发射。

使用MetaMorph 7.8.13软件(Molecular Devices，福斯特市，加利福尼亚州)定量图像。沿电极2与3之间的x平面画的感兴趣的16个区域(ROI)内测量YP荧光，并且作为与电极之间中心的距离(mm；参见图4)的函数绘制。对于每个图像，针对背景荧光校正每个ROI内的荧光强度。数据呈现为n个独立实验的平均值±SE。

结果

两极和单极nsEP的同步导致电穿孔的增强

在CANCAN假设中，两个适当形状的两极nsEP(其本身为无效的)的叠加和同步远程恢复生物有效的单极脉冲(参见图3)。这是因为在远离电极的中心位置处，在最终重合的随后的每个相期间产生的电场彼此抵消，使得仅剩下作为电极脉冲的第一相。当来自两个独立的nsEP的电场分量方向相反时，发生这一抵消作用，从而在此区域中产生0kV/cm的|E|强度(参见图5以及材料和方法)。

作为以实验方式测试CANCAN的第一方法，我们评估了仅具有2个相反极性相的电场抵消作用的潜力(图6)。成功的CANCAN至少部分取决于两极抵消作用的程度。因此，基于先前的结果，使第二相的振幅为第一相的50％，所述先前的结果显示在梯形nsEP的50％第二相振幅的情况下两极抵消作用最大(39)。电场建模预测最大电场抵消作用，并且进而预测最大CANCAN作用在电极2与3之间的中心(参见材料和方法)。因此，我们重点关注这一区域(即，沿电极2与3之间的X平面)来评定生物作用(图6B)。

我们通过YO-PRO-1(YP)染料的摄取来测量包埋在琼脂糖凝胶中的CHO-K1细胞中的电渗透。使用独立的两对nsEP递送电极，将细胞暴露于来自一对或两对电极的单极或两极nsEP(100次，600ns，10Hz)。通道1电极(1和2)递送单极(uni-A)或两极nsEP(bi-AB)；通道2电极(3和4)递送相移的单极脉冲(uni-C)，使得它在同步递送时与bi-AB的第二相重合(“CANCAN”暴露；图6A)。发现，在电极(图6B和图6C)之间的整个长度上，与uni-A相比，bi-AB导致渗透减少约2-3倍，指示3D培养物模型中的两极抵消成功。通过uni-C进行的渗透在电极3(通道2中的有源电极)附近最大，并且随着与电极3的距离增加而降低。当bi-AB和uni-C异步递送(即，它们之间具有10ms的延时)时，在电极之间的大部分长度上，电渗透作用与bi-AB没有不同。距离电极3越近，作用变得与uni-C越相似，因为感觉到了来自通道2电场的影响。相比之下，bi-AB和uni-C的同步递送导致在电极之间的整个长度上渗透的增强，其最大为电极之间的中心的异步递送的约3倍(图6D)。值得注意的是，中心处的渗透程度等于uni-A暴露的渗透程度，这与电场建模结果一致。因此，这些发现证明了通过同步递送两极和单极nsEP远程产生了生物有效的单极脉冲，并且因此揭示了成功的CANCAN。

多相nsEP的同步进一步远程增强电穿孔

在先前的实验中，我们示出了可以通过从独立的两对电极递送的电场的抵消作用远程产生电极脉冲。因此，在下一组实验中，我们评估了在添加相反极性第三相的情况下电场抵消作用的效率，并且进而评估了CANCAN(图7)。通道1电极递送三相两极nsEP(bi-ABC)，并且通道2递送两相nsEP(bi-DE)，使得相D和E分别与来自bi-ABC的相B和C重合(图7A)。保持第二相的振幅为第一相的50％，并且第三相同样降低一半至相A的25％。值得注意的是，由于脉冲的限制，相C和E的振幅在这些实验中不完全匹配，由此振幅分别为相A的约20％和30％。因为每个相在靶向25％相振幅的5％内，所以我们用稍微不匹配的振幅进行了实验。

发现，来自通道1的bi-ABC导致渗透的抵消作用，与uni-A相比YP摄取减少了约2-3倍，揭示两极抵消作用在三相nsEP的情况下发生(图7B)。同样，从通道2递送的bi-DE导致与uni-D相比渗透减少约2倍。因此，每个两极nsEP本身具有相对低的生物效率。异步递送两个两极nsEP不增强渗透作用。在通道1电极附近，渗透的程度与bi-ABC的相似；距离通道3更近，来自两个通道的组合电场的影响产生的渗透作用基本上是来自bi-ABC和bi-DC的累加。此累加作用在通道1附近未观察到，主要是因为bi-DC的作用在电极2附近非常小(接近0)，从而对渗透度的贡献可忽略不计。当两个两极nsEP同步递送，与异步递送相比，渗透作用明显增强(约3-4倍大；图7B和图7C)，并且与中心的uni-A的渗透作用更相似(并且，实际上更大)。比中心的uni-A暴露更大的通过同步递送产生的增强渗透可能是由于相C和E的振幅的轻微不匹配。这可能导致第三相期间E的不完全抵消，从而产生未减少并且有助于总体生物作用的残余电场。然而，我们示出了在叠加两个无效两极nsEP的情况下的CANCAN作用来远程产生生物有效的nsEP。

增加随后的相反极性相的振幅改善CANCAN

成功CANCAN的主要目标之一是与nsEP递送电极附近的单极脉冲相比具有更低的作用，同时远程产生等于单极的作用。虽然在先前的实验中我们在电极之间的中心成功地产生了生物等效的单极nsEP，但是生物作用仍然与电极附近的单极脉冲相似或更大。因此，我们寻求通过改变nsEP参数来改善CANCAN作用。电场建模结果预测70％的第二相振幅可以在电极附近提供比50％第二相振幅更少的电场抵消作用(参见图5)。这进而可能在同步递送两个nsEP时在电极附近产生更少的两极抵消作用。因此，作为第一方法，我们仅将第二相的振幅增加至相A的70％，同时第三相的振幅保持为25％。如在先前的实验中，通道1递送bi-ABC三相nsEP，并且通道2递送bi-DE两相nsEP。与先前的结果一致，在电极2与3之间的整个长度上，bi-ABC和bi-DE分别导致比uni-A和uni-D小约2-3倍的渗透(图7D)。两个异步递送产生的渗透作用单独地与每个两极nsEP相似。即，在电极2附近，渗透的程度与bi-ABC的相似，同时距离电极3更近，作用与bi-DE相似。使两个两极nsEP的递送同步增强了电极之间的中心的渗透作用，其为异步递送的约2倍(图7E)并且与uni-A的相似。鉴于约2倍的两极抵消效率，如果我们假设完全电场抵消作用，中心处约2倍的渗透增强为理论上可以预期的最大值。值得注意的是，距离电极更近，渗透程度比从每个通道递送的单极nsEP(即，来自通道1的uni-A和来自通道2的uni-D)的更小，并且与电极3附近的异步递送没有不同。综合来看，这些结果表明在70％的第二相振幅的情况下，在电极附近具有更少的电场抵消作用，致使两极抵消作用占主导地位。相比之下，在电极之间的中心，所述作用与异步递送有最大的不同并且与uni-A暴露的相似，指示最大电场抵消作用和CANCAN。

作为下一步骤，我们想要增强两极抵消效率，以试图进一步改善远程CANCAN作用。为了达到这一目的，我们将第三相的振幅增加至相A的40％(使得它的降低程度与第二相相似)，这进而提供更好的两极抵消作用。如在前一组实验中，将第二相的振幅保持为70％。发现，将bi-ABC的第三相的振幅增加至40％增加了两极抵消作用的效率，使得与两极之间的中心处的uni-A相比，渗透减少了约3-4倍(图7F)。两相bi-DE导致与uni-D相比渗透减少约2-3倍，指示通过增加相E的振幅，抵消效率没有进一步增强。当异步递送两个nsEP时，渗透作用与单个递送的两极nsEP没有不同。然而，同步递送bi-ABC和bi-DE导致电极之间的中心处的渗透增强，其与uni-A的相似并且为异步递送的约3倍(图7G)。同步与异步nsEP递送之间的作用差异与两极抵消程度紧密匹配，表明中心区域中的完全电场抵消作用。如在先前的结果中，距离电极更近，渗透作用比单极暴露的更小，并且变得与异步递送相似。换言之，距离电极更近，具有更少的电场抵消作用，并且相反，两极抵消作用占主导地位。有趣的是，绘制同步与异步暴露的比率时产生的曲线(图7G)的形状使人想起图5D中所示的减少百分比曲线，从而进一步验证了电场建模结果。因此，增加第三相的振幅增加了两极抵消作用的效率，其进而改善并增强了电极之间的中心处的CANCAN的效率。

讨论

在这一研究中，我们首次示出了了通过将两个生物无效的两极nsEP叠加为生物有效的单极脉冲来进行远程电穿孔。当在每个两极nsEP的重合相期间产生的电场方向相反并且彼此抵消时，发生被称为抵消作用的抵消或CANCAN的这一作用，从而仅在远离电极的区域中留下单极暴露，同时在其他地方保持两极暴露。因此，CANCAN依赖于两极nsEP对于靶向电穿孔的固有无效性。使两个独立的nsEP的递送同步远程产生与异步nsEP递送(即，间隔10ms递送)相比3倍大的电穿孔。通过CANCAN进行的电穿孔的这一单独增强在用不同的nsEP参数进行的不同组的实验中可再现地观察到。因此，我们呈现了产生靶向和远程电穿孔的CANCAN概念的概念验证。

预期CANCAN的效率与所实现的两极抵消作用的程度成正比。因此，在每组实验中，我们改变了nsEP参数，包括相的数量和振幅以测试两极抵消作用的效率，并且进而测试CANCAN的效率。当施加两相以及三相nsEP时，我们均观察到了成功的CANCAN。当使用具有第一相的100/70/40％的相振幅的三相nsEP时，发生最有效的CANCAN作用(图7F和图7G)。如果考虑到先前结果显示的50％的第二相振幅提供最好的抵消效率(39)，这是意料之外的。基于我们的先前研究的结果，我们可以推测40％第二相振幅可以类似50％振幅的程度抵消生物作用。因此，可能的是，添加40％振幅的第三相本身产生足够的抵消作用，其在与来自第二相的作用组合时增强总体两极抵消效率。值得注意的是，我们的实验结果证实了在电场建模中所做的预测(图5)。定量不同相振幅的E的减少百分比指示当第二相为第一相的70％时，电极附近的E的减少更少，从而表明了更具靶向性的CANCAN作用。实际上，我们的实验结果对此已经进行了证明，由此同步递送两个nsEP远程产生的作用最大为异步递送的约3倍，与两极抵消程度一致，同时与其中两极抵消作用占主导地位的电极附近没有不同。因此，在预期最大电场抵消作用的区域中，基于两极抵消作用的程度，通过CANCAN进行的电穿孔的增强为理论上可能的最大值。因此，使用电场建模和实验方法的组合，我们示出了通过CANCAN进行的最有效的靶向电穿孔在第一相的100/70/40％的nsEP振幅下发生。

通过CANCAN远程形成单极脉冲为无创地接近深部靶标提供了可能性。虽然我们的结果呈现了通过CANCAN进行的远程电穿孔的概念验证，但是CANCAN作用可以同样延伸到电刺激。由此，CANCAN的潜在生物医学应用众多并且包括：位于深部的肿瘤的消融和/或通过电穿孔进行的血液转移、用于治疗各种神经或精神病症(例如，帕金森氏病、癫痫或抑郁)的深部脑刺激、疼痛控制和心脏除颤。采用电穿孔或电刺激的当前治疗方法是创伤性的并且需要***或植入接触电极(60，61)。因此，它们具有与手术相关联的常见风险，包括炎症、感染或出血。电刺激的无创性技术，包括经颅磁刺激(TMS)、经皮神经电刺激(TENS)和经颅直流电流刺激(tDCS)，由于缺乏靶精度和/或较差的渗透深度而受限(60，62)。因此，需要开发一种用于无创性电穿孔或电刺激的技术。最近的研究评估了使用两个时间干扰电场来进行无创性深部脑刺激的可能性(63)。它们显示了两个同时递送的高频率电场在大脑的海马层内的位置处产生神经元刺激。它们的方法基于与声波相关的长期存在的现象(64)。简而言之，当同时递送两个具有固定振幅的阈下刺激时，它们加和而产生具有阈上振幅的较低频率的振荡电场包络。换言之，它们的方法依赖于两个阈下刺激的加和而远程产生具有阈上振幅的刺激。相比之下，通过CANCAN进行的电刺激或电穿孔相反地唯一地依赖于来自两极的脉冲成为单极的形状变化，而不是依赖于脉冲振幅或持续时间的变化。因此，CANCAN概念是新颖的，并且为选择性地电穿孔或电刺激深部靶标且不影响浅表组织提供了可能性。我们的研究为开发CANCAN的先进技术提供了基础。一种潜在的CANCAN开发将利用脉冲RF发射器，其可以聚焦于身体深部的靶标。

概括地说，我们在此呈现了通过CANCAN作用进行远程电穿孔的概念验证。我们示出了同步递送两个nsEP远程产生电穿孔的增强，其最大为异步递送的约3倍，并且与单极暴露的相似。通过CANCAN进行的电穿孔的远程增强在使用不同的nsEP参数进行的不同组的实验中为可再现的。将CANCAN概念开发为先进技术为无创地电穿孔或电刺激身体深部的靶标提供了可能性。

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62.Roth Y，Amir A，Levkovitz Y，&Zangen A(2007)通过使用8字形和深H线圈进行的经颅磁刺激在大脑中诱导的电场的三维分布(Three-dimensional distribution ofthe electric field induced in the brain by transcranial magnetic stimulationusing figure-8and deep H-coils).《临床神经生理学杂志：美国脑电图学会官方出版物(Journal of clinical neurophysiology：official publication of the AmericanElectroencephalographic Society)》24(1)：31-38。

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虽然已经出于清楚和理解的目的在一些细节中描述了前述本发明，但是在阅读了本公开之后对于本领域技术人员将清楚的是，可以在不脱离本发明的真实范围的情况下对形式和细节作出各种变化。例如，可以各种组合使用以上所述的所有技术和设备。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件出于所有目的以引用的方式整体并入，就如同每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文件单独被指示为出于所有目的通过引用并入。

Claims (14)

1.一种生成生物有效的单极纳秒电脉冲的方法，所述方法包括叠加由第一对电极生成的第一生物无效的两极纳秒电脉冲和由第二对电极生成的第二生物无效的两极纳秒电脉冲，以在远离所述第一对和第二对电极的位置处产生生物有效的单极纳秒电脉冲。

2.根据权利要求1所述的方法，其中与在所述叠加步骤不存在的情况下生成的所述第一或第二生物无效的两极纳秒电脉冲相比，所述生物有效的单极纳秒电脉冲具有增强的刺激效率，

其中在所述叠加步骤不存在的情况下生成的所述第一或第二生物无效的两极纳秒电脉冲诱导由所述第一或第二生物无效的两极纳秒电脉冲的第二相产生的抵消作用，从而抵消或减少所述第一或第二生物无效的两极纳秒电脉冲的第一相的刺激作用，并且

其中所述生物有效的单极纳秒电脉冲的所述增强的刺激效率由抵消或减少所述抵消作用产生。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一对和第二对电极各自连接到独立的纳秒电脉冲递送通道。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一对和第二对电极各自以线性阵列对齐。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单极纳秒电脉冲无创地递送到受试者。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述单极纳秒电脉冲无创地递送到所述受试者中的局部细胞、组织或器官。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组织是深部组织。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单极纳秒电脉冲递送到样品。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述样品含有细胞。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物有效的单极纳秒电脉冲的所述增强的刺激效率与所述抵消作用的抵消或减少程度成正比。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二生物无效的两极纳秒电脉冲是两相的或三相的。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二生物无效的两极纳秒电脉冲具有至少第一相和第二相，并且所述第一相的振幅为100/70/40％。

13.一种设备，其用于实施根据前述权利要求中任一项所述的方法。

14.根据权利要求13所述的设备用于治疗需要电刺激的受试者的用途。

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