CN111020061B - 基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 - Google Patents

基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111020061B
CN111020061B CN201911409567.3A CN201911409567A CN111020061B CN 111020061 B CN111020061 B CN 111020061B CN 201911409567 A CN201911409567 A CN 201911409567A CN 111020061 B CN111020061 B CN 111020061B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
primer
magnetic beads
sample
multiplex pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911409567.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111020061A (zh
Inventor
蔡兴盛
王春林
李梦真
邓泱泱
马志海
钱冬媛
刘雅思
乐小炎
杨冬成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Mygene Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Mygene Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Mygene Medical Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Mygene Medical Technology Co ltd
Priority to CN201911409567.3A priority Critical patent/CN111020061B/zh
Publication of CN111020061A publication Critical patent/CN111020061A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111020061B publication Critical patent/CN111020061B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组及试剂盒。目前的方法都难以实现HPV高通量样本检测。在检测样本量需求大的时候，需要大量的人力进行操作。本发明建立的方法可通过一步法扩增和纯化，一步法建库，中途不转管，不开盖，有效避免样本之间混淆或者交叉污染；5个小时能够完成96个样本的文库构建，操作简便，能够轻易实现大量样本的检测。通过增加接头引物中样本标签的的数目，可以增加一次测序能够完成的样本检测数目，进一步减少单个样本的平均手工操作时间。

Description

基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组、试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于二代测序领域，具体涉及基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组、试剂盒及其方法。
背景技术
根据世界卫生组织2018年的统计数据，***是全球第四大女性恶性肿瘤，2018年新增的病例接近57万例，因***死亡超过31万人。全球范围内，***患者呈逐年上升以及年轻化的趋势。我国的新增病例每年超过10万例；其它发展国家/地区的发病人数更是超过了总数的85%。
***是目前唯一病因明确、可以早期预防和治愈的恶性肿瘤，99.9%的***与人类***瘤病毒（Human Papilloma Virus；HPV）感染相关，高危型HPV持续感染是***发生的必要因素，且不同型别的HPV感染带来的风险不同。研究表明，超过七成女性一生中至少有一次HPV病毒感染，但绝大多数HPV感染都能够被机体自身的免疫***清除，只有1%-4%的HPV感染者会逐渐发展病变，最终导致癌变。世界卫生组织建议，30-49岁的女性，每3-5年做一次细胞学筛查，或者每5年做一次HPV筛查。因此，推行规范有效的HPV筛查策略***防治的关键。
高通量测序，又称大规模平行测序，或者二代测序。高通量测序能一次过一个样本多个目标区域或者多个样本进行测序，其在临床，包括药物基因组学，遗传病研究和筛查，肿瘤突变基因检测以及临床微生物检测上的应用也逐渐得到重视。整个高通量测序流程包括样本的核酸提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。首先，提取的核酸样本在进行高通量测序之前，需要进行文库构建，一是给样本带上测序仪器能够识别的特异性片段，以便于让样本进行模板制备和能够被测序仪识别并且进行测序；二是给样本带上样本特异性标签，以区分不同的样本，达到一次过同时对多个样本进行测序，降低当样本的测序成本。
目前文库构建的主要方式有杂交捕获和多重PCR。
杂交捕获是指通过设计特异识别目标区域的探针库，对目的区域进行特异性结合然后捕获的过程。杂交捕获流程包含：核酸片段化-末端修复-连接加接头-扩增-预文库纯化-目标区域捕获-文库扩增-纯化等步骤。这种建库方式流程长，整个超过流程需要超过24个小时；操作复杂，当中有许多精细的步骤，对操作人员的能力要求比较高。因此，杂交捕获用于大规模样本上的文库构建相对困难。
多重PCR建库方法是对PCR技术的拓展性应用。目前使用的多重PCR建库方法的操作流程包括：PCR、部分引物消化、连接加接头、样本纯化等。操作相对比较简单，实验人员较容易掌握。但在操作过程中，完成PCR之后存在一步或者多步开盖以进行后续操作，样品容易受环境气溶胶污染；同时，样本PCR之后产生的气溶胶也可能会对后续的检测样本产生污染；另外，多重PCR的开发难度较大，除了需要考虑引物的特异性，还需要考虑引物的错配以及引物之间形成的二聚体问题，引物越多，形成错配或者二聚体的可能性越大。
无论是杂交还是多重PCR，在操作过程中，都存在转管或者PCR之后的开盖操作，存在有样本相互之间交叉污染的可能性；而且每个样本都需要进行多步骤操作，操作复杂，在应对大量的样本时存在困难。
根据以上问题，本发明致力于研究一种基于高通量测序的HPV检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于高通量测序的HPV检测方法及应用，利用多重PCR的方法，解决样品检测过程中样本容易污染、检测结果不够精确、样本量大等问题。
本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，提出了基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组，每条多重引物由桥接序列和靶向不同类型HPV的特异序列组成；所述桥接序列与接头引物相匹配；所述多重PCR引物组的核苷酸如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述的多重PCR引物组的核酸序列编号：F001～F011编号为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.11；R001～R012编号为SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.23。
本发明第二个方面，提出了一种基于高通量测序检测HPV的试剂盒，包括所述的多重PCR引物组和接头引物。
根据本发明的实施例，所述的接头引物从5’端到3’端依次是：测序仪相关通用序列，8bp样本标签序列，以及与多重PCR引物5’端匹配的桥接序列。
根据本发明的实施例，所述接头引物与多重PCR引物通过桥接序列相匹配连接，核苷酸序列如下：
Figure 492962DEST_PATH_IMAGE002
根据本发明的实施例，所述8 bp的标签序列，在实例中可以替换不同的8 bp标签序列或替换成6-12bp的样本标签，用以增加标签数量，进一步扩大对样本的检测量。
根据本发明的实施例，所述核酸序列编号为：P5-01～P5-08编号为SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.31；P7-01～P7-12编号为SEQ ID NO.32～SEQ ID NO.43。
本发明第四个方面，提出了一种基于高通量测序检测HPV试剂盒中的方法，包括以下步骤：提取样本基因组DNA，使用上述引物组、引物进行PCR扩增反应，将扩增产物纯化构建文库，测序检测样本是否存在HPV核酸。
根据本发明的实施例，内参基因GADPH的多重PCR引物序列的核酸序列：
F-control CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCGCTTGCCCTGTCCAGTTA（SEQ IDNO.44）；
R-control TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCAGGCTGGCCTGGCT（SEQ IDNO.45）。
根据本发明的实施例，PCR扩增体系为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
根据本发明的实施例，PCR扩增程序为：
Figure 713859DEST_PATH_IMAGE004
根据本发明的实施例，
其中，上述引物库的制备方法为：将上述的多重PCR引物组稀释至50～200 μM后混合，即得；
上述P5接头的序列如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.31所示；
上述P7接头的序列如SEQ ID NO.32～SEQ ID NO.43所示。
根据本发明的实施例，所述纯化构建文库步骤如下：
1）PCR反应完成后，合并PCR反应得到的PCR扩展产物，用核酸纯化试剂盒进行纯化浓缩至30~100μL；
2）加入0.6-0.8倍体积AMpure XP磁珠（可核酸纯化或者片段筛选），混匀，室温放置2~5min，上磁力架，待磁珠完全吸附后，分别用150~200μL新鲜配制70~80%的乙醇洗2~3次；短暂离心后再上磁力架，待磁珠完全吸附后，用移液器吸净残留乙醇，室温干燥后加入30~50μL的TE洗脱，室温放置2~5min；
3）上磁力架吸附后将上清转移至一个新的EP管中，加入等体积AMpureXP磁珠，混匀，室温放置2~5 min，上磁力架，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；分别用150~200μL新鲜配制70~80%乙醇洗2~3次，短暂离心后再上磁力架，待磁珠完全吸附后，用移液器吸净残留乙醇，室温干燥后加入20~50 μL TE洗脱，室温放置2~5 min；
4）上磁力架，待磁珠完全吸附后，将上清转移至一个新的EP管中，所得上清即为所需要文库。
本发明的有益效果是：
本发明采用一管式一步法完成文库构建，通过一轮PCR就能够完成文库的构建；同时给每个样本对应文库加上双端样本标签，能够区分不同样本，防止样本之间的窜扰。覆盖范围广，能够对多达40种HPV类型进行同时检测。特异性强，在现有方法学中，某个HPV类型的风度特别高的话，就会把丰度低的类型的信号掩盖了，造成结果判读的时候不够准确。本发明通过二代测序进行结果的判读，每一种类型的信号均能够发现，结果更加准确。HPV是一个检测量非常大的项目。涵盖的HPV类型多，灵敏度高，对所覆盖所有类型的HPV进行全面且准确的检测，需要花费大量的人力物力操作。
本发明建立的方法通过一步法扩增和纯化，5个小时能够完成96个样本的文库构建，操作简便，能够轻易实现大量样本的检测。通过增加接头引物中样本标签的数目，可以增加一次测序能够完成的样本检测数目。例如，用20个样本标签（8个P5接头引物+12个P7接头引物）一次可检测96个样本；如果用40个样本标签（16个P5接头引物+24个P7接头引物）一次可检测384个样本；如果是60个样本标签（24个P5接头引物+36个P7接头引物），则一次可检测864个样本，因此本发明可进一步减少单个样本的平均手工操作时间。
附图说明
图1为临床样本一致性测试中的文库质检图谱。
具体实施方式
为了更好地阐述本发明的技术方案，下面将结合实施例以及附图对本技术方案进行说明，但并不局限于此。
试验材料：
QIAamp DNA Blood Mini Kit购自凯杰企业管理（上海）有限公司；核酸纯化试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR MixPlatinum™ Multiplex PCR MasterMix购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，AMpureXP磁珠购自贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司。
实施例1引物设计
引物设计，包含多重PCR引物、接头引物。
多重PCR引物包含特异序列和桥接序列。特异序列是针对40种类型的HPV而设计，均为兼并引物，退火温度控制在58°C～62°C；桥接序列是所有上游引物或者下游引物都一样的部分，主要是与接头引物的桥接序列结合的部分，根据实际情况调整桥接序列的长度。
接头引物从5’端到3’端依次是：测序仪相关的通用序列，8bp样本标签序列，以及与多重PCR引物5’端匹配的桥接序列。每一条接头引物带的样本标签各不同，桥接序列部分的退火温度在68°C～72°C。可以更换接头引物中的8 bp的样本标签以实现大样本量的需求；内参引物特异部分为针对人类基因组GADPH基因设计。接头引物与多重PCR引物通过桥接序列相匹配连接。
实例中，通过上述的设计方法得到的多重PCR引物有23条，引物序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.23，多重PCR引物在试验前需稀释至100 μM，并等体积比混合成引物库。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
接头引物20条，其中包括8条P5样本标签和12条P7样本标签，如下：
Figure 474005DEST_PATH_IMAGE006
内参基因核苷酸序列：
F-control CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCGCTTGCCCTGTCCAGTTA（SEQ IDNO.44）；
R-control TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCAGGCTGGCCTGGCT（SEQ IDNO.45）。
实施例2 人工合成质粒特异性和灵敏度测试
人工合成7个质粒：HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV58，HPV68。设置了3个测试浓度，分别为105拷贝/测试，103拷贝/测试，102拷贝/测试。设置三个阳性对照（均为HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV58，HPV35，HPV68等质粒与人类基因组DNA的混合物：PC-1（200拷贝/测试），PC-2（1000拷贝/测试），PC-3（5000拷贝/测试），和一个阴性对照（NC），一共25个样本，接头引物设置如表1所示：
表1接头引物设置
Figure DEST_PATH_IMAGE007
PCR扩增反应体系配制：
Figure 678721DEST_PATH_IMAGE008
PCR扩增反应程序设置：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
构建文库：
1）PCR反应完成后，合并样本，用核酸纯化试剂盒进行纯化浓缩至50μL；
2）加入35μLAMpure XP磁珠，混匀，室温放置3min，上磁力架，待磁珠完全吸附后，分别用150μL新鲜配制80%的乙醇洗2次；短暂离心后再上磁力架，待磁珠完全吸附后，用移液器吸净残留乙醇，室温干燥后加入30μL的TE洗脱，室温放置2~5min；
3）上磁力架吸附后将上清转移至一个新的EP管中，加入30μLAMpureXP磁珠，混匀，室温放置3 min，上磁力架，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；分别用150μL新鲜配制80%乙醇洗2次，短暂离心后再上磁力架，待磁珠完全吸附后，用移液器吸净残留乙醇，室温干燥后加入30 μL TE洗脱，室温放置3 min；
4）上磁力架，待磁珠完全吸附后，将上清转移至一个新的EP管中，所得上清即为所需要文库。
用Illumina MiniSeq中通量测序试剂盒进行测序，测序数据簇密度为148K/mm2，簇通过率为82.7%，Q30为90.8%，实际产生0.6 M reads。
结果分析：结果如表2所示，三个阳性样本中，所有类型均有reads，阴性样本reads数为0；21个样本中，有良好的特异性，并且展示出良好的梯度效应；对于100拷贝的质粒能够检出。
表2数据分析后每个样本的结果
Figure 815304DEST_PATH_IMAGE010
注：+表示阳性；-表示阴性。
实施例3 临床样本一致性测试
取临床来源的宫颈拭子样本92例，经过荧光PCR法检测为HPV阳性，用QIAamp DNAblood mini kit提取基因组DNA，每例样本1个测试，总共92个测试，依次标记为样本1～样本92；设置三个阳性对照PC-1（200拷贝/测试），PC-2（1000拷贝/测试），PC-3（5000拷贝/测试），和一个阴性对照（NC），共96个样本。完成一个96孔板的测试，接头引物设置如表3所示：
表3接头引物设置
Figure DEST_PATH_IMAGE011
PCR扩增反应体系配制：
Figure 687445DEST_PATH_IMAGE008
PCR扩增反应程序设置：
Figure 146721DEST_PATH_IMAGE009
构建文库：
1）PCR反应完成后，合并样本，用核酸纯化试剂盒进行纯化浓缩至50μL；
2）加入35μLAMpure XP磁珠，混匀，室温放置3min，上磁力架，待磁珠完全吸附后，分别用150μL新鲜配制80%的乙醇洗2次；短暂离心后再上磁力架，待磁珠完全吸附后，用移液器吸净残留乙醇，室温干燥后加入30μL的TE洗脱，室温放置2~5min；
3）上磁力架吸附后将上清转移至一个新的EP管中，加入30μL AMpureXP磁珠，混匀，室温放置3 min，上磁力架，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；分别用150μL新鲜配制80%乙醇洗2次，短暂离心后再上磁力架，待磁珠完全吸附后，用移液器吸净残留乙醇，室温干燥后加入30 μL TE洗脱，室温放置3 min；
4）上磁力架，待磁珠完全吸附后，将上清转移至一个新的EP管中，所得上清即为所需要文库。
所纯化文库用珀金埃尔默LabChip GX Touch HT进行质检，结果如图1所示。
用Illumina MiniSeq中通量测序试剂盒进行测序，测序数据簇密度为110K/mm2，簇通过率为95.2%，Q30为96.7%，实际产生1.9M reads。
结果分析：如表4所示，本试验结果与荧光PCR法展示出良好的一致性。其中有1例（样本43），本专利NGS法检测结果少了81型阳性。另外7例（样本46,48,49,51,52,57,81），在检出与PCR法相同结果的基础上，NGS法均更明显检出HPV类型的阳性。
表4PCR检测和NGS检测结果
Figure 635471DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure 310166DEST_PATH_IMAGE014
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州迈景基因医学科技有限公司
<120> 基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组、试剂盒及其方法
<130>
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatcg caacgtgcmc arggccata 49
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatcc tacarcgtgc acaaggtcat aa 52
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatct acaacgkgca cagggycata a 51
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatct tacaacgwgc rcarggmcac a 51
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatct gcawcgtgcy cagggacaya a 51
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatcc tscamcgtgc scagggycac a 51
<210> 7
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatcc tscaccgtmg scagggycac aa 52
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatcc awarggcrca gggycaya 48
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatca cataaggccc agggccayaa 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatct acaaaargcc cagggmcata 50
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatcc tkcamaaggc acagggayah aa 52
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcta aatrgmcggg rtcatasyat gaatatatg 59
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tctttcccta cacgacgctc ttccgatctc aaaatagtgg yatycatmtt atgaatgtat 60
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tctttcccta cacgacgctc ttccgatctc aaaataktgg aattcataga atgtatrtat 60
g 61
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcta ayaaygtrgg atccatwgca tgaatatat 59
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcta watrytrsta ttcataytrt gdatatakg 59
<210> 17
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tctttcccta cacgacgctc ttccgatctc aaaatagcag gattcatast rtgwatatat 60
g 61
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tctttcccta cacgacgctc ttccgatctc aaaacagarg gattcattgt gtgawtatag 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcta atatasmrgv attcatartr tgaadatarg 60
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcta raatkgtagr atccatkgtg tgyarataa 59
<210> 21
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tctttcccta cacgacgctc ttccgatctc agtargktag mattcatakt atgtaaatak 60
g 61
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcta ataaakkwtt attcatayta tgyarrtat 59
<210> 23
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcta yadkgmstta ttcatawtat gtadgtar 58
<210> 24
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
caagcagaag acggcatacg agataacgtg atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 25
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
caagcagaag acggcatacg agataaacat cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 26
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
caagcagaag acggcatacg agatatgcct aagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 27
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
caagcagaag acggcatacg agatagtggt cagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 28
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
caagcagaag acggcatacg agataccact gtgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 29
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
caagcagaag acggcatacg agatacattg gcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 30
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
caagcagaag acggcatacg agatcagatc tggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 31
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
caagcagaag acggcatacg agatcatcaa gtgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 32
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gatcgcaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 33
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gcaggaaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 34
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gtcactaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 35
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tcctgtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 36
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ttgaggaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 37
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc aaccacaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 38
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg actagtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 39
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc aatggaaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 40
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc acttcgaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 41
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc agcgttaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 42
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ataccaaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 43
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc cagttcaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 44
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ctggagttca gacgtgtgct cttccgatcg cttgccctgt ccagtta 47
<210> 45
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
tctttcccta cacgacgctc ttccgatctg ccaggctggc ctggct 46

Claims (6)

1.基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组，其特征在于，每条多重引物由桥接序列和靶向不同类型HPV的特异序列组成；所述多重PCR引物组的核苷酸序列如下：
名称 引物序列(5’→3’) F001 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCGCAACGTGCMCARGGCCATA F002 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCCTACARCGTGCACAAGGTCATAA F003 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAACGKGCACAGGGYCATAA F004 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTACAACGWGCRCARGGMCACA F005 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAWCGTGCYCAGGGACAYAA F006 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCCTSCAMCGTGCSCAGGGYCACA F007 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCCTSCACCGTMGSCAGGGYCACAA F008 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCCAWARGGCRCAGGGYCAYA F009 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCACATAAGGCCCAGGGCCAYAA F010 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAAAARGCCCAGGGMCATA F011 CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCCTKCAMAAGGCACAGGGAYAHAA R001 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAATRGMCGGGRTCATASYATGAATATATG R002 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAAATAGTGGYATYCATMTTATGAATGTAT R003 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAAATAKTGGAATTCATAGAATGTATRTATG R004 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAYAAYGTRGGATCCATWGCATGAATATAT R005 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAWATRYTRSTATTCATAYTRTGDATATAKG R006 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAAATAGCAGGATTCATASTRTGWATATATG R007 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAAACAGARGGATTCATTGTGTGAWTATAG R008 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAATATASMRGVATTCATARTRTGAADATARG R009 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTARAATKGTAGRATCCATKGTGTGYARATAA R010 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAGTARGKTAGMATTCATAKTATGTAAATAKG R011 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAATAAAKKWTTATTCATAYTATGYARRTAT R012 TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAYADKGMSTTATTCATAWTATGTADGTAR
。
2.一种基于高通量测序检测HPV的多重PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多重PCR引物组和接头引物；
其中，所述接头引物从5’端到3’端依次是：通用序列、样本标签序列，以及桥接序列；所述接头引物的序列如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.43所示。
3.一种基于权利要求2所述的多重PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样本基因组DNA，使用权利要求1所述多重PCR引物组以及权利要求2所述接头引物进行PCR扩增反应，将扩增产物纯化，即为所构建的文库，经过测序和数据分析，确定样本中HPV的类型；
其中，所述使用方法不适用于疾病的诊断与治疗。
4.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：
Figure FDA0002756593380000021
其中，所述引物库的制备方法为：将权利要求1所述的多重PCR引物组稀释至50～200μM后混合，即得；
所述P5接头的序列如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.31所示；
所述P7接头的序列如SEQ ID NO.32～SEQ ID NO.43所示。
5.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，PCR扩增程序为：
Figure FDA0002756593380000022
6.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述纯化构建文库步骤如下：
1)PCR反应后，合并PCR反应得到的PCR扩增产物，浓缩至30～100μL；
2)加入0.6～0.8倍体积AMpure XP磁珠，混匀，吸附磁珠至溶液澄清，弃上清，留磁珠，加乙醇，吸附磁珠至溶液澄清，挥干乙醇，留磁珠，TE洗脱；
3)将上清转移至新的EP管，加入等体积AMpure XP磁珠，
4)混匀，吸附磁珠至溶液澄清，弃上清，留磁珠，加乙醇，吸附磁珠至溶液澄清，挥干乙醇，加TE洗脱，吸附磁珠至溶液澄清，上清即为文库。
CN201911409567.3A 2019-12-31 2019-12-31 基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 Active CN111020061B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911409567.3A CN111020061B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911409567.3A CN111020061B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111020061A CN111020061A (zh) 2020-04-17
CN111020061B true CN111020061B (zh) 2021-01-05

Family

ID=70197482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911409567.3A Active CN111020061B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111020061B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111455114B (zh) * 2020-05-22 2023-09-05 深圳华大智造科技股份有限公司 SARS-CoV-2的高通量检测试剂盒
CN112029842B (zh) * 2020-08-31 2021-04-27 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 一种基于高通量测序进行abo血型基因分型的试剂盒和方法
CN112251501B (zh) * 2020-10-28 2023-07-25 深圳人体密码基因科技有限公司 一种内参基因集合及其筛选方法、通用引物组、试剂盒、反应体系及应用
CN112458195B (zh) * 2020-12-28 2023-03-24 广州迈景基因医学科技有限公司 基于高通量测序检测性传播病原体的多重pcr引物组、试剂盒及其方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592200A (zh) * 2019-09-25 2019-12-20 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种改善扩增特异性和均一性的多重pcr方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561372A (zh) * 2014-12-11 2015-04-29 南京普东兴生物科技有限公司 人类***瘤病毒基因的扩增和分型的组合引物及其应用
CN111201324B (zh) * 2017-10-09 2024-03-29 普梭梅根公司 单分子测序和唯一分子标识符以表征核酸序列
CN107988372A (zh) * 2018-01-03 2018-05-04 杭州联川基因诊断技术有限公司 一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒及其检测方法
CN108728578A (zh) * 2018-06-12 2018-11-02 苏州国科闻普生物科技有限公司 在单管反应中同时检测多种高危型人***瘤病毒及其亚型的方法及试剂盒
CN109517885A (zh) * 2018-12-27 2019-03-26 北京迈基诺基因科技股份有限公司 一种基于高通量测序检测小鼠DNA TCR beta链免疫组库的方法及其专用引物组
CN110093454A (zh) * 2019-04-24 2019-08-06 南京格致医学检验有限公司 用于多种hpv分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592200A (zh) * 2019-09-25 2019-12-20 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种改善扩增特异性和均一性的多重pcr方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Analytical workflow of double-digest restriction site-associated DNA sequencing based on empirical and in silico optimization in tomato;Kenta Shirasawa等;《DNA Research》;20160229;第23卷(第2期);第145–153页 *
多重PCR法和HPV分型基因芯片法在高危型人***瘤病毒感染检测中的应用;吴文苑等;《国际检验医学杂志》;20090731;第30卷(第7期);第632-634页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111020061A (zh) 2020-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111020061B (zh) 基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法
WO2006066353A9 (en) Detection of human papilloma virus
JP2013529471A (ja) Ｓｏｌｅｘａ塩基配列決定法に基づくヒトパピローマウイルス検出方法
CN112391477B (zh) 一种检测游离核酸微卫星不稳定性的方法及装置
CN108546785B (zh) 检测生殖道病原微生物dna的方法
CN104928399A (zh) 引物组、试剂盒及其在hpv全基因组检测中的用途
CN110241212B (zh) 一种用于brca1和brca2基因扩增子测序检测的引物组及其应用
CN116144811B (zh) 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒
CN114214416B (zh) 与***前病变发生相关联的生物标志物及其应用
CN110734982A (zh) 基于高通量测序技术的连锁常染色体str分型***及试剂盒
KR101401940B1 (ko) 고위험군 인유두종바이러스 유전자 분석용 키트 및 그 분석방법
CN111443065A (zh) 一种肺癌的筛查试剂盒
CN104561349A (zh) 一种广谱灵活的检测人***瘤病毒基因型的方法
CN107937510A (zh) 一种家族性恶化性房室传导阻滞基因诊断试剂盒
CN108300778A (zh) 一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒
CN111172319A (zh) 一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用
Oh et al. Improved DNA extraction method for molecular diagnosis from smaller numbers of cells
CN114657248B (zh) 用于检测早期结直肠癌的血浆游离dna甲基化生物标记物或其组合物、应用及试剂盒
CN111455045B (zh) ***性红斑狼疮的诊断试剂及其平台和应用
CN114395626B (zh) 用于***筛查的标志物、探针组合物及其应用
CN112195286B (zh) 一种用于检测人***瘤病毒hpv26的探针及其试剂盒
CN114369664B (zh) 用于胰腺癌筛查的标志物、探针组合物及其应用
CN117721209B (zh) 一种用于***检测的组合检测试剂、试剂盒
CN114438261B (zh) 一种鹅星状病毒、鹅坦布苏病毒检测引物组和方法
CN118207291A (zh) 极微量食管鳞癌组织ATAC-seq测序文库的构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Cai Xingsheng

Inventor after: Wang Chunlin

Inventor after: Li Mengzhen

Inventor after: Deng Yangyang

Inventor after: Ma Zhihai

Inventor after: Qian Dongyuan

Inventor after: Liu Yasi

Inventor after: Yue Xiaoyan

Inventor after: Yang Dongcheng

Inventor before: Cai Xingsheng

Inventor before: Li Mengzhen

Inventor before: Deng Yangyang

Inventor before: Wang Chunlin

Inventor before: Ma Zhihai

Inventor before: Qian Dongyuan

Inventor before: Liu Yasi

Inventor before: Yue Xiaoyan

Inventor before: Yang Dongcheng

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant