CN111012817A - 一种山茱萸籽提取物的制备方法及应用 - Google Patents
一种山茱萸籽提取物的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种山茱萸籽提取物的制备方法,包括以下步骤:a:将山茱萸籽干料粉碎成山茱萸籽超细粉料;b:将无水乙醇加入山茱萸籽超细粉料中,50℃条件下,浸泡24小时;c:取浸泡液置于旋转蒸发仪中,减压蒸馏,干燥后得到山茱萸籽粗提物。山茱萸籽粗提物对大肠杆菌、沙门氏菌具有较好的抑菌效果且对兔红细胞无明显得细胞毒性。本发明提出山茱萸籽提取物的制备方法,仅需要利用乙醇进行一步提取,提取时间短,提取效率高,得到的山茱萸籽有效成分多,受实验条件的影响小。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域,具体涉及一种山茱萸籽提取物的制备方法及应用。
背景技术
山茱萸,又名药枣或蜀枣,具有增强机体免疫功能,抗癌,利尿、降压及抗氧化等功效。山茱萸干熟果肉是一种滋补类名贵药材,研究发现山茱萸果肉含有山茱萸多糖、有机酸、鞣质等有效成分,其中山茱萸多糖尤其具有免疫调节、抗刷老等功效。山茱萸果肉在食品工业中也有广泛应用。而山茱萸籽常作为加工副产物被废弃。
有研究发现山茱萸籽的提取物具有舒张动脉、降血压功效,如中国发明专利(公开号102688275A)公开了山茱萸果核提取物及其在制备降血压组合物中的应用,本发明采用石油醚对山茱萸籽进行渗漉提取,该方法使用的溶剂为石油醚,众所周知,石油醚对人和动物具有较强的毒性,对水体、土壤和大气可造成污染,且该物质极度易燃。因此,操作石油醚的人员必须经过专门培训,操作环境密闭,全面通风。这些严格的操作条件不利用该分离技术的推广应用;中国发明专利(公开号103110685A)公开了一种山茱萸果核水提物,以及该水提物在制备舒张胸主动脉环组合物及降血压组合物中的应用,该方法使用的溶剂是水,可有效降低提取的成本,但是使用水作为提取液后,其提取液黏度大,过滤浓缩困难,且提取物容易霉变影响后续试验。
发明内容
本发明针对现有山茱萸开发利用过程中产生的废弃物进行回收利用,开发了一种山茱萸籽的高效率分离提取与纯化方法,获得的产物具有良好的抗菌活性。本发明拓宽了山茱萸的利用范围,延长了产业链。
一种山茱萸籽提取物的制备方法,包括以下步骤:
a:将山茱萸籽干料粉碎成山茱萸籽超细粉料;
b:将无水乙醇加入山茱萸籽超细粉料中,50℃条件下浸泡24小时;
c:取步骤b得到的浸泡液置于旋转蒸发仪中,50℃条件下减压蒸馏,低温真空冷冻干燥后得到山茱萸籽粗提物。
进一步地,所述山茱萸籽超细粉料为80目。
进一步地,所述山茱萸籽超细粉料和无水乙醇的料液比为1∶20。
进一步地,所述减压蒸馏的条件为0.09kPa。
上述提取的山茱萸籽粗提物对大肠杆菌、沙门氏菌具有较好的抑菌效果,且对兔红细胞无明显得细胞毒性。因此,可将上述提取的山茱萸籽粗提物在制备抗革兰氏阴性菌药物中进行应用。
本发明的有益效果:
(1)本发明将山茱萸籽首先进行粉碎,粉碎后可有效缩短无水乙醇的抽提时间;
(2)本发明对山茱萸籽的一步乙醇提取有效的保证了在不破坏山茱萸籽活性物质的结构的基础上,从而可以获得更高效的山茱萸籽粗提物;
(3)山茱萸籽本为山茱萸加工利用的废弃物,本发明以产业废料为基础,进一步提高了山茱萸的利用价值,延长了产业链。
(4)本发明以废料山茱萸籽为原料得到的提取物和目前已经商业化的以山茱萸果肉为原料得到的提取物基本一致。
附图说明
图1为山茱萸籽粗提物的红细胞的溶血率;
图2为山茱萸籽粗提物处理前后大肠杆菌形态变化;其中A和B分别表示正常的大肠杆菌和沙门氏菌,a和b分别表示山茱萸籽提取物作用的大肠杆菌和沙门氏菌。
具体实施方式
以下实施例是为了更好的说明本发明的技术方案,而不是以此来限制本发明的保护范围。
实施例1山茱萸籽提取物的制备
一种山茱萸籽提取物的制备方法,包括以下步骤:
a:将山茱萸籽干料,粉碎成山茱萸籽超细粉料(80目),其中山茱萸籽干料含水量低于13%;
b:将无水乙醇加入山茱萸籽超细粉料中,料液比是1∶20,50℃条件下,浸泡24小时;
c:取步骤b得到的浸泡液置于旋转蒸发仪中,0.09kPa条件下减压蒸馏,低温真空冷冻干燥后得到山茱萸籽粗提物。
实施例2山茱萸籽粗提物对标准菌株最小抑菌浓度的测定
将测试菌株在TSB液体培养基(购自Solarbio公司即北京索莱宝科技有限公司)中过夜扩大培养,并在OD600处测定培养菌液的OD值,当菌液的OD值达到0.6~0.8时,将培养的菌液在6000r/min条件下离心10min,离心后弃上清,收集菌体沉淀,然后用等体积0.01MPBS重悬细菌;再用MH培养基将待测细菌液稀释到2×106CFU/ml。用去离子水稀释山茱萸籽提取物溶液浓度为10μg/mL~320μg/mL。于细胞培养板各孔分别添加50μL不同浓度山茱萸籽粗提物稀释液和50μL稀释菌液,每个浓度重复实验3个孔,37℃培养16~20h,以小孔内细菌完全不生长的浓度(肉眼未见孔底部有混浊现象)即为山茱萸籽粗提物最小抑菌浓度,结果详见表1。
表1不同浓度下细菌生长情况
注:“-”表示没有细菌生长;“+”表示有细菌生长
由表1可以看出:本发明制备的山茱萸籽粗提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的最小抑菌浓度分别160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL。
实施例3山茱萸籽粗提物的溶血活性检测
取新鲜兔血液50mL,在3000rpm下离心20min,弃上清,以等渗PBS缓冲液洗涤红细胞,反复离心三次,至上清为无色、透明,制备成兔红细胞悬液;取1.5mL离心管5只,编号1~5;1~3号管分别添加本发明山茱萸籽粗提物干粉2mg、1mg、0.5mg,各管分别添加0.01M PBS(pH 7.2)缓冲液800μL。4号管添加800μL PBS缓冲液,为阴性对照组;5号管添加800μL、浓度为1%的Triton X-100去离子水稀释液(可使红细胞完全溶血),为阳性对照组。1~5每管添加200μL红细胞悬液。静置3h后,将1~5管在1500r/min条件下离心10min,分别取上清150μL至微量板进行吸光度测定;其中,对阳性样品进行全波长扫描,以确定牛血红蛋白最大吸收波长。并以最大吸收波长测定各样品吸收值,计算公式HD=(A样-A阴)/(A阳-A阴)×100%计算溶血度。
结果显示:血红蛋白在414nm波长处出现明显的吸收峰。采用红细胞计数法对使用的红细胞进行计数,结果显示红细胞的浓度为4.8×1013个/mL,如附图1所示,山茱萸籽提取物浓度为1mg/mL的条件下,山茱萸籽粗提物红细胞的溶血率与阴性对照的溶血率相当,说明本发明所得山茱萸籽粗提物对红细胞的渗透脆性可以忽略不计。
实施例3山茱萸籽粗提物作用大肠杆菌或沙门氏菌后的形态观察
大肠杆菌和沙门氏菌悬液的配制:根据上述山茱萸籽粗提物对大肠杆菌和沙门氏菌最小抑菌浓度分别为80μg/mL、40μg/mL,采用pH7.2、10mM的PBS缓冲液将山茱萸籽粗提物配制对应的80μg/mL、40μg/mL浓度的山茱萸籽粗提物溶液,即针对大肠杆菌体和沙门氏菌菌体,采用pH 7.2、10mM的PBS缓冲液将山茱萸籽粗提物配制成对应浓度的山茱萸籽粗提物0.75mL溶液;然后分别吸取2mL新鲜培养至对数期的大肠杆菌、沙门氏菌,将菌体在6000r/min条件下离心15min,离心后所得菌体用对应等体积80μg/mL、40μg/mL山茱萸籽粗提物溶液进行重新悬浮,悬浮后的菌体在37℃条件下孵育30min,分别得到山茱萸山茱萸籽粗提物作用后的大肠杆菌和沙门氏菌菌悬液;
以正常生长、不添加山茱萸籽提取物的细菌(大肠杆菌和沙门氏菌)为正常对照;取对数生长期的正常培养细菌大肠杆菌和沙门氏菌以及山茱萸籽粗提物作用后的菌悬液各3mL,首先在3000r/min条件下离心5min,弃上清;然后分别采用pH 7.2、10mM的PBS缓冲溶液洗涤菌体三次,最后分别采用3mL、5%的戊二醛溶液重新悬浮,悬浮后所得菌体分别在4℃条件下固定24h;然后分别在3000r/min条件下离心10min,收集菌体沉淀,接着分别采用30%~100%PBS溶液稀释的乙醇进行梯度脱水(每次脱水时间为20min),无水乙醇脱水两次(每次脱水时间为20min),最后一次脱水完成后,将所得菌液分别滴加在圆形盖玻片上,然后进行真空冷冻干燥,干燥后经离子溅射仪溅射金,最后于扫描电镜下观察样品表面结构变化,详见附图2。
由附图2可知:与正常的大肠杆菌形态结构相比,经过山茱萸籽粗提物处理的细菌发生较大的变化:山茱萸籽粗提物作用于细菌细胞后,可导致细菌细胞壁发生断裂,进而破坏细菌外膜结构的完整性,最终导致细菌的内容物丧失,发挥杀菌活性。
综上所述,本发明山茱萸籽提取物产品不产生溶血性,抗菌谱广,对革兰氏阴性菌、具有高效的抗菌作用。所以,本发明产品山茱萸籽粗提物在制备抗革兰氏阴性菌疾病药物中能够得到较佳的应用。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种山茱萸籽提取物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
a:将山茱萸籽干料粉碎成山茱萸籽超细粉料;
b:将无水乙醇加入山茱萸籽超细粉料中,50℃条件下浸泡24小时;
c:取步骤b得到的浸泡液置于旋转蒸发仪中,50℃条件下减压蒸馏,低温真空冷冻干燥后得到山茱萸籽粗提物。
2.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽提取物的制备方法,其特征在于,所述山茱萸籽超细粉料为80目。
3.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽提取物的制备方法,其特征在于,所述山茱萸籽超细粉料和无水乙醇的料液比为1∶20。
4.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽提取物的制备方法,其特征在于,所述减压蒸馏的条件为0.09kPa。
5.权利要求1制备的山茱萸籽粗提物在抗革兰氏阴性菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌和/或沙门氏菌。
7.权利要求1制备的山茱萸籽粗提物在制备抗革兰氏阴性菌药物中的应用。
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