CN103392746B - 一种何首乌提取物的应用 - Google Patents
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Abstract
一种何首乌提取物在控制草莓灰霉病中的应用，该提取物是取何首乌块根，用无菌水浸提而得。本发明将何首乌作物植物源提取物资源，从中提取抑菌物质，并明确了该提取物对草莓灰霉病菌具有抑制作用和一定的离体防治效果，可进一步开发成新的植物源杀菌剂。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，主要涉及一种何首乌提取物的应用，尤其涉及何首乌提取物在控制草莓灰霉病中的应用。
背景技术
由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.et Tris.)引起的草莓灰霉病是草莓的主要病害之一，该病主要危害草莓的果实，还可为害叶，造成严重减产，甚至绝收，常常对保护地草莓的安全生产构成威胁。自该病发生以来，世界各地均有报道，已经成为草莓增产的限制性障碍。目前，生产上尚未发现草莓灰霉病的抗源，防治上主要采用化学药剂，其中最主要的是采用苯并咪唑类和二甲酰亚胺类杀菌剂防治，也有报道使用腐霉利、异菌脲、嘧霉胺、多菌灵、醚菌酯、咯菌腈等药剂，但连续使用，使病菌产生了抗药性，防效逐年降低，对环境也造成污染。随着人们生活质量的提高，对绿色安全无残留草莓的需求越来越大，急需寻求高效、低毒，不污染环境的生物源农药对草莓病害进行防治。
植物是天然产物农药的宝库，从植物中寻找新的杀菌抑菌活性物质，研制开发新型植物源杀菌剂，是当今世界新农药开发的热点。何首乌(Polygonummultiflo-rum Thunb.)又称首乌、山精、地精、山首乌、赤首乌、赤敛、小独根等，属于蓼科植物。据报道，何首乌提取物主要有以下几方面的药理活性:抗氧化、抗衰老；防辐射、抗自由基；降血脂、抗动脉硬化；保护肝脏作用；增强机体免疫力；改善记忆力、保护神经细胞和益智；抗菌、抗炎、镇痛等作用。由此可见，何首乌提取物的医用价值十分广泛，而且研究得也比较***，但是该提取在防治农业植物病害方面的研究未见报道。一般来讲，由于对动物(人或兽)具有致病作用的微生物和对植物具有致病的微生物两者作用的对象不同，致病方式也不一样，所使用的药剂对动物致病菌具有抑制作用，但未必对植物致病菌具有抑制作用。前人的研究结果表明：何首乌提取物对动物致病菌具有一定的抑制作用，但对植物病原菌抑制作用的研究鲜见报道。本发明根据这一问题，对何首乌提取抑制农业植物病害-草莓灰霉病的研究进行了初步探讨，旨在为防控草莓灰霉病提供理论依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种何首乌提取物对植物病原菌的控制作用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种何首乌提取物在控制草莓灰霉病中的应用，该何首乌提取物为何首乌的水提取物。
上述何首乌提取物是取何首乌的块根晒干粉碎后，用无菌水进行浸提，所得滤液再蒸发浓缩至膏状而得，具体为：
A、取何首乌块根洗净后晒干至含水量为1.5-4.5％，经高速粉碎机以3000-5000r/min的转速粉碎至75-95目细粉。
B、用无菌水对何首乌粉末进行浸提，何首乌粉末一次性加入，无菌水分3次加入，每次按1g何首乌粉末加30-50mL无菌水的比例加入后，于摇床上在25-29℃下以100-130r/min振摇36-60h，过滤，收集滤液，合并3次滤液；
C、将所得滤液置入旋转浓缩蒸发仪，在0.08-0.1MPa气压、水浴温度为45-55℃和冷凝温度为5-9℃条件下，110-130r/min浓缩至膏状。
上述所提的何首乌提取物可采用现有技术进行制备，本发明只是采用其中一制备方法说明其制备的可行性。
本发明的何首乌提取物通过抑制分生孢子萌发、微菌核萌发等方式，对草莓灰霉病菌具有抑制作用，同时，该何首乌提取物对防治离体草莓叶片灰霉病和离体草莓果实灰霉病具有一定的效果，可进一步开发成新的植物源杀菌剂。并且，本发明提取物的提取方法简单、快捷、操作方便，易推广和应用；分离方法所需的材料易购买，分离速度快，不污染环境，对人畜安全环保，节省成本，节约资源。
附图说明
图1是本发明的何首乌提取物对草莓灰霉病病叶的离体防治效果图；
其中：1代表何首乌提取物；2代表对照药剂多菌灵；3代表空白对照无菌水。
图2是本发明的何首乌提取物对草莓灰霉病果实的离体防治效果图；
其中：1代表何首乌提取物；2代表对照药剂多菌灵；3代表空白对照无菌水。
具体实施方式
下面结合具体试验和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明所使用的原料何首乌块根可以通过种植或购买，生产技术成熟；原料供应充足，获得途径多样。
实施例中用到的病原菌种草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.etTris.)由湖南农业大学植物病理学实验室提供。该菌种的活化：采用接种环刮取3环草莓灰霉病菌菌种接入马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，28℃下培养24-48h。
实施例1
取何首乌块根洗净后晒干，用高速粉碎机以3000r/min的转速粉碎至75目细粉，获得何首乌粉末。取何首乌粉末10g装入三角瓶中，用无菌水对何首乌粉末进行浸提，无菌水分3次加入，每次加30mL后，置三角瓶于摇床上在25℃下以100r/min振摇60h，过滤，收集滤液，合并3次滤液，将滤液装入旋转浓缩蒸发仪，在0.08MPa气压、水浴温度为45℃和冷凝温度为5℃条件下，110r/min蒸发浓缩至膏状，得红黄色何首乌提取物。
实施例2
取何首乌洗净后晒干，用高速粉碎机以4000r/min的转速粉碎至85目细粉，获得何首乌粉末。取何首乌粉末10g装入三角瓶中，用无菌水对何首乌粉末进行浸提，无菌水分3次加入，每次加40mL后，置三角瓶于摇床上在27℃下以115r/min振摇48h，过滤，收集滤液，合并3次滤液，将滤液置入旋转浓缩蒸发仪，在0.09MPa气压、水浴温度为50℃和冷凝温度为7℃条件下，120r/min蒸发浓缩至膏状，得红黄色何首乌提取物。
实施例3
取何首乌洗净后晒干，用高速粉碎机以5000r/min的转速粉碎至95目细粉，获得何首乌粉末。取何首乌粉末10g装入三角瓶中，用无菌水对何首乌粉末进行浸提，无菌水分3次加入，每次加50mL后，置三角瓶于摇床上在29℃下以130r/min振摇36h，过滤，收集滤液，合并3次滤液，将滤液置入旋转浓缩蒸发仪，在0.1MPa气压、水浴温度为55℃和冷凝温度为9℃条件下，130r/min蒸发浓缩至膏状，得红黄色何首乌提取物。
实例4何首乌提取物对草莓灰霉病菌的抑制效果
称取上述制备的何首乌提取物装入三角瓶中，用无菌水稀释成浓度为35mg/mL溶液，再称取1mL溶液与9mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基(加40μg/mL链霉素)混合，摇匀制成平板。接种直径为5mm的草莓灰霉病病菌菌饼置平板中央，同时以多菌灵(98％的多菌灵原药用0.1mol/L稀盐酸溶解后得)作药剂对照，无菌水作空白对照，每处理重复3次，于28-30℃下培养，48h后测量菌落直径，计算抑制率，结果见下表1。
抑菌率(％)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-5)]×100％。
表1 本发明的何首乌提取物对草莓灰霉病菌的抑制作用
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)。
结果与分析：本发明的何首乌提取物对草莓灰霉病菌具有一定的抑制效果。室内抑菌试验结果表明：在培养48h后，本发明何首乌提取物对草莓灰霉病菌抑制率为70.26％，略低于对照药剂多菌灵的抑制效果。方差分析结果表明：何首乌提取物处理和对照药剂多菌灵处理差异显著，说明何首乌提取物可以用于防治草莓灰霉病菌，具有进一步开发植物源杀菌剂的潜力。
实例5本发明的何首乌提取物对草莓灰霉病菌分子孢子萌发的影响
采用载玻片萌发法检测何首乌提取物对草莓灰霉病菌分生孢子萌发的影响。首先将何首乌提取物用无菌水稀释为35mg/mL的溶液，同时，将草莓灰霉病菌菌饼置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养96h，待分生孢子长出后，用无菌水稀释为1×106个/mL的孢子悬浮液，取等量的分生孢子悬浮液与前述稀释后的溶液混合后滴于载玻片上，以多菌灵为对照药剂，并设空白对照，重复3次，于培养皿中保湿培养48h，在显微镜下观察分生孢子萌发情况，计算孢子萌发率，结果见下表2。
表2 何首乌提取物对孢子萌发的影响
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)。
结果与分析：何首乌提取物和多菌灵均能强烈地抑制分生孢子的萌发，其中何首乌提取物处理草莓灰霉病菌菌核萌发率低于未经何首乌提取物处理，但高于对照药剂多菌灵处理。方差分析结果表明：何首乌提取物处理和对照药剂多菌灵处理差异显著。由于分生孢子可造成保护地草莓灰霉病再侵染，引起减产，因此，通过施用何首乌提取物抑制分生孢子萌发，从而减少再侵染源，减轻病害发生。
实例6何首乌提取物对草莓灰霉病菌菌核萌发的影响
将草莓灰霉病菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，20℃培养7d，菌核变黑成熟时收集菌核待用。将菌核浸在含系列浓度(0.1mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、80mg/mL)何首乌提取物的溶液中48h，风干后置于PDA平板上；将未用何首乌提取物处理的菌核置于含上述系列浓度何首乌提取物的PDA培养基平板上，20℃培养，每处理重复3次，每个重复测定100个菌核。比较两种处理的菌核萌发情况，测定菌核萌发率，结果见下表3。
结果与分析：由表3可知，经何首乌提取物处理菌核萌发率明显低于未经何首乌提取物处理的萌发率，而且随着何首乌提取物浓度的升高，菌核萌发率逐渐降低，其中当药剂浓度提高到80mg/mL时，菌核的萌发率最低，说明何首乌提取物对微菌核萌发起到抑制作用。
方差分析结果表明：不同何首乌提取物处理的菌核萌发率差异显著，但是对照菌核差异也显著，这可能跟菌核大小不完全一致有关。由于菌核可以抵抗不良环境条件，可帮助病原物越过不良环境，本发明经研究发现何首乌提取物可降低菌核萌发率，减少草莓灰霉病菌初侵染源，从而降低病害的发生。由此可见，何首乌提取物不仅抑制菌核的萌发，而且抑制菌丝生长。
表3 何首乌对草莓灰霉病菌微菌核萌发的影响
| 浓度(mg/mL) | 处理菌核萌发率(％) | 未处理菌核萌发率(％) |
| 0.1 | 82.35aA | 93.24cC |
| 10 | 74.71bB | 92.21dD |
| 20 | 73.83cC | 94.22bB |
| 40 | 61.15dD | 93.41cC |
| 80 | 62.32eE | 95.59aA |
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)。
实例7何首乌提取物对草莓叶片灰霉病的离体防治效果
摘取生长一致，无病虫害的正常草莓叶片，先用无菌水清洗叶表杂质，接着用75％的酒精进行表面消毒5s，再用无菌水中冲掉残留的酒精，置于通风柜自然风干。分别取何首乌提取物、多菌灵药剂、无菌水均匀涂抹于草莓叶片正反两面，置于通风柜自然风干，用内径5mm的打孔器打取已活化的灰霉菌菌落边缘的新鲜菌饼，用接种环挑至叶片中间，接种时避免菌饼接触叶脉位置，涂抹完毕后将叶片放在培养皿中，于温度26-28℃下保湿培养3d，每处理3张叶片并重复3次，采用十字交叉法测量草莓果实病斑直径大小，计算防治效果，结果见下表4。
防治效果(％)＝[(对照病斑直径–处理病斑直径)/(对照病斑直径-5)]×100％。
结果与分析：由图1可知，何首乌提取物对草莓叶片正常代谢无影响，而且何首乌提取物处理的草莓叶片灰霉病病斑直径显著小于空白对照处理后灰霉病菌侵染形成的病斑直径，但大于对照药剂多菌灵处理。通过测量病斑直径，计算防治效果，结果发现，何首乌提取物的防病效果为49.68％，略低于对照药剂的防治效果。说明通过不断探索何首乌提取物最佳防病浓度、时间等，可以将其开发为生防制剂。
表4 本发明何首乌提取物对草莓叶片灰霉病的离体防治效果
| 处理 | 菌落直径(mm) | 平均菌落直径(mm) | 防效(％) |
| Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | |||
| 何首乌提取物 | 29.87 | 28.88 | 28.7 | 29.15 | 49.68bB |
| 多菌灵 | 22.35 | 23.35 | 22.76 | 22.82 | 62.86aA |
| 无菌水对照 | 53.43 | 53.2 | 52.34 | 52.99 |
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)。
实例8何首乌提取物对草莓果实灰霉病的离体防治效果
摘取果实大小一致，无病虫害的成熟的草莓果实，先用75％的酒精进行表面消毒3s，再用无菌水洗涤残留的酒精，置于通风柜自然风干。取何首乌提取物在草毒果实表面用无菌脱脂棉涂抹，置于通风柜自然风干。用无菌水将已活化72h的灰霉菌菌落上着生的新鲜灰霉菌孢子洗下，配制成1×106个/mL的浓度，用喷壶在草莓果实基部喷洒5mm的圆形斑，以多菌灵作为对照药剂，并以无菌水作空白对照，将果实放在直径为15cm的培养皿中保湿培养48h，每处理3个果并重复3次，并利用软皮尺十字交叉法测量菌落直径，计算防治效果，结果见下表5。
防治效果(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5)]×100。
结果与分析：由图2可知，何首乌提取物对草莓果实正常代谢无影响，而且经何首乌提取物处理后灰霉病菌侵染形成的病斑直径显著小于对照处理的灰霉病菌侵染形成的病斑直径，但大于对照药剂多菌灵的病斑直径。同时，通过十字交叉法测量病斑直径，计算防治效果发现：何首乌提取物对草莓灰霉病果实的防治效果低于对照药剂多菌灵。方差分析结果表明：何首乌提取物处理和对照药剂多菌灵处理差异显著。说明何首乌提取物可用于防治草莓灰霉病。
表5 本发明何首乌提取物对草莓果实灰霉病的离体防治效果
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)。
Claims (2)
1.一种何首乌提取物在控制草莓灰霉病中的应用，其特征在于，所述何首乌提取物为何首乌的水提取物，是按下述步骤制备而成：
A、取何首乌块根洗净后晒干至含水量为1.5-4.5％，经高速粉碎机以3000-5000r/min的转速粉碎至75-95目细粉；
B、用无菌水对何首乌粉末进行浸提，何首乌粉末一次性加入，无菌水分3次加入，每次按1g何首乌粉末加30-50mL无菌水的比例加入后，于摇床上在25-29℃下以100-130r/min振摇36-60h，过滤，收集滤液，合并3次滤液；
C、将所得滤液置入旋转浓缩蒸发仪，在0.08-0.1MPa气压、水浴温度为45-55℃和冷凝温度为5-9℃条件下，110-130r/min浓缩至膏状。
2.一种何首乌提取物在防治离体草莓叶片灰霉病和离体草莓果实灰霉病中的应用，其特征在于，所述何首乌提取物为何首乌的水提取物，是按下述步骤制而成：
A、取何首乌块根洗净后晒干至含水量为1.5-4.5％，经高速粉碎机以3000-5000r/min的转速粉碎至75-95目细粉；
B、用无菌水对何首乌粉末进行浸提，何首乌粉末一次性加入，无菌水分3次加入，每次按1g何首乌粉末加30-50mL无菌水的比例加入后，于摇床上在25-29℃下以100-130r/min振摇36-60h，过滤，收集滤液，合并3次滤液；
C、将所得滤液置入旋转浓缩蒸发仪，在0.08-0.1MPa气压、水浴温度为45-55℃和冷凝温度为5-9℃条件下，110-130r/min浓缩至膏状。
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