CN110987572A - 真姬菇菌丝核相染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种真姬菇菌丝核相染色方法，涉及生物组织学技术领域。上述染色方法包括以下步骤：提供附着有真姬菇菌丝的盖玻片，然后依次对盖玻片上的真姬菇菌丝进行DAPI染色和Calcoflour White染色，随后封片，完成染色。通过上述染色方法能够获得组织结构清晰的真姬菇菌丝细胞核和细胞壁结构图像，可以为真姬菇的生理、遗传和形态学研究提供严谨可靠方法，具有较好的科研应用前景，同时该染色方法还具有可操作性强、可重复性高以及荧光信号质量高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织学技术领域，尤其是涉及一种真姬菇菌丝核相染色方法。
背景技术
菌丝是食用菌的基本结构单位，也是其营养生长的主要模式。菌丝形态是反应食用菌生长情况最直观的参考依据。在菌丝细胞核研究中，一般认为细胞壁与细胞核共同组成菌丝细胞为基本观察单元，特别是菌丝内细胞核的核相变化被认为是食用菌菌丝生长状态的重要观察依据。
真姬菇又名玉蕈、蟹味菇、胶玉蘑、鸿喜菇等，是一种大型木质腐生真菌。在自然环境中，一般秋季群生于山毛榉等阔叶树枯木或活立木上。真姬菇味比平菇鲜，肉比滑菇厚，质比香菇韧，口感极佳，还具有独特的蟹香味。而且真姬菇子实体提取物还具有提高免疫力、延缓衰老以及清除体内自由基等功效，是一种优良的珍稀美味食用菌。因此，研究开发一种菌丝核相染色方法并将其应用于真姬菇菌丝核相观察中，对观察到细胞壁和细胞核进行观察，进而为真姬菇的生理、遗传和形态学研究提供严谨可靠方法，变得十分必要和迫切。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法能够获得组织结构清晰的真姬菇菌丝细胞核和细胞壁结构图像，可以为真姬菇的生理、遗传和形态学研究提供严谨可靠方法，具有较好的科研应用前景，同时该染色方法还具有可操作性强、可重复性高以及荧光信号质量高的特点。
本发明的第二目的在于提供一种上述真姬菇菌丝核相染色方法在真姬菇菌丝核相观察中的应用。
本发明提供的一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
提供附着有真姬菇菌丝的盖玻片，然后依次对盖玻片上的真姬菇菌丝进行DAPI染色和Calcoflour White染色，随后封片，完成染色。
进一步的，所述附着有真姬菇菌丝的盖玻片的制备方法包括以下步骤：
将盖玻片***培养有真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片。
更进一步的，所述盖玻片***的角度为45度。
更进一步的，所述爬片培养在避光条件下进行；
优选地，所述爬片培养的时间为8～10d，优选为10d；
优选地，所述爬片培养的温度为20～25℃，优选为22℃。
进一步的，所述DAPI染色步骤中，所用的DAPI染色液的浓度为3～8μg/mL，优选为5μg/mL；
优选地，所述DAPI染色液的滴加量为180～220μL。
更进一步的，所述DAPI染色在0～4℃条件下进行；
优选地，所述DAPI染色的时间为20～30min。
进一步的，所述Calcoflour White染色步骤中，所用的Calcoflour White染色液的浓度为0.001～0.01‰，优选为0.002‰；
优选地，所述Calcoflour White染色液的滴加量为30～80μL。
更进一步的，所述Calcoflour White染色的染色时间为5～10min。
进一步的，所述染色方法还包括在Calcoflour White染色后封片前，对真姬菇菌丝进行洗涤的步骤；
优选地，所述洗涤为PBS缓冲液冲洗；
优选地，所述洗涤的时间为1～3min，优选为2min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的真姬菇菌丝核相染色方法，该染色方法包括以下步骤：提供附着有真姬菇菌丝的盖玻片，然后依次对盖玻片上的真姬菇菌丝进行DAPI染色和CalcoflourWhite染色，随后封片，完成染色。上述染色过程中，DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，4'，6-diamidino-2-phenylindole)染色细胞核；Calcoflour White(4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐)染色细胞壁；通过上述染色方法能够获得组织结构清晰的真姬菇菌丝细胞核和细胞壁结构图像，可以为真姬菇的生理、遗传和形态学研究提供严谨可靠方法，具有较好的科研应用前景，同时该染色方法还具有可操作性强、可重复性高以及荧光信号质量高的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的真姬菇菌丝的快速检测方法染色操作图示；
图2为本发明实施例5提供的真姬菇菌丝染色后的显微图像(A、B、C和D为经本发明提供的方法染色后用蔡司Axio observer荧光显微镜拍摄的真姬菇菌丝细胞结构；其中：a为菌丝内细胞壁，b为细胞核，c为锁状联合内细胞壁)；
图3为本发明对比例1提供的真姬菇菌丝染色后的显微图像(b为细胞核结构，c为锁状联合内细胞壁)；
图4为本发明实施例6提供的真姬菇菌丝染色后的显微图像(A、B为染色后用蔡司Axio observer荧光显微镜拍摄的真姬菇菌丝细胞结构；a为菌丝内细胞壁，b为细胞核，c为锁状联合内细胞壁)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
提供附着有真姬菇菌丝的盖玻片，然后依次对盖玻片上的真姬菇菌丝进行DAPI染色和Calcoflour White染色，随后封片，完成染色。
本发明提供的真姬菇菌丝核相染色方法，该染色方法包括以下步骤：提供附着有真姬菇菌丝的盖玻片，然后依次对盖玻片上的真姬菇菌丝进行DAPI染色和CalcoflourWhite染色，随后封片，完成染色。上述染色过程中，DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，4'，6-diamidino-2-phenylindole)染色细胞核；Calcoflour White(4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐)染色细胞壁；通过上述染色方法能够获得组织结构清晰的真姬菇菌丝细胞核和细胞壁结构图像，可以为真姬菇的生理、遗传和形态学研究提供严谨可靠方法，具有较好的科研应用前景，同时该染色方法还具有可操作性强、可重复性高以及荧光信号质量高的特点。
在本发明的一种优选实施方式中，所述附着有真姬菇菌丝的盖玻片的制备方法包括以下步骤：
将盖玻片***培养有真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片。
在上述优选实施方式中，所述爬片培养的时间为7～12d，优选为10d；
作为一种优选的实施方式，所述爬片培养的时间为7～12d，时间多短菌丝量太少，不方便染色观察，时间久了菌丝又太密了影响染色效果，经研究得到爬片培养的时间在10d效果较佳。
上述爬片培养的时间典型但非限制性的优选实施方案为：8d、8.5d、9d、9.5d和10d。
在上述优选实施方式中，所述爬片培养的温度为20～25℃，优选为22℃。
作为一种优选的实施方式，上述爬片培养的温度20～25℃培养温度是比较适合大多数真姬菇生长的温度，在这个范围外温度高了或者低了都会影响真姬菇菌丝的生长速度。
上述爬片培养的温度典型但非限制性的优选实施方案为：20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
在本发明的一种优选实施方式中，所述DAPI染色步骤中，所用的DAPI染色液的浓度为3～8μg/mL，优选为5μg/mL；
作为一种优选地实施方式，上述DAPI染色液的浓度为3～8μg/mL，浓度较低，荧光较暗染色效果差。如果浓度较高荧光过亮，也会影响到细胞壁的显色。
上述DAPI染色液的浓度典型但非限制性的优选实施方案为：3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL和8μg/mL。
在上述优选实施方式中，所述DAPI染色液的滴加量为180～220μL。
在本发明的一种优选实施方式中，所述DAPI染色在0～4℃条件下进行；
作为一种优选的实施方式，上述DAPI染色在0～4℃条件下，即冰浴条件下进行，细胞核染色效果最好。
上述DAPI染色的温度典型但非限制性的优选实施方案为：0℃、1℃、2℃、3℃和4℃。
在上述优选实施方式中，所述DAPI染色的时间为20～30min。
上述DAPI染色的时间典型但非限制性的优选实施方案为：20min、22min、24min、25min、26min、28min和30min。
在本发明的一种优选实施方式中，所述Calcoflour White染色步骤中，所用的Calcoflour White染色液的浓度为0.001～0.01‰，优选为0.002‰；
上述Calcoflour White染色液的浓度典型但非限制性的优选实施方案为：0.001μg/mL、0.002μg/mL、0.004μg/mL、0.006μg/mL、0.008μg/mL和0.01μg/mL。
在上述优选实施方式中，所述Calcoflour White染色液的滴加量为30～80μL。
作为一种优选的实施方式，上述Calcoflour White染色液的滴加量优选为80μL。
在本发明的一种优选实施方式中，所述Calcoflour White染色的染色时间为5～10min。
上述Calcoflour White染色的时间典型但非限制性的优选实施方案为：5min、6min、7min、8min、9min和10min。
优选地，所述Calcoflour White染色的温度为15～30℃。
在本发明的一种优选实施方式中，所述染色方法还包括在Calcoflour White染色后封片前，对真姬菇菌丝进行洗涤的步骤；
在上述优选实施方式中，所述洗涤为PBS缓冲液冲洗；
作为一种优选的实施方式，上述PBS缓冲液冲洗具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，维持生物蛋白的结构及生物特性。
优选地，所述洗涤的时间为1～3min，优选为2min。
上述洗涤的时间典型但非限制性的优选实施方案为：1min、1.5min、2min、2.5min和3min。
下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
注：本发明实施例和对比例中所使用的DAPI染色液均为生工生物工程(上海)股份有限公司生产的E607303染色液；所述Calcoflour White染色液均为Fluka公司生产的18909-100ML-F染色液。
实施例1
图1为真姬菇菌丝的快速检测方法染色操作图示；
如图1所示，一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
(a)、将干燥的盖玻片以45度的角度***培养有真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片；
所述爬片培养的时间为8d，温度为20℃；
(b)、向步骤(a)附着有真姬菇菌丝的盖玻片滴加180μL的3μg/ml DAPI染色液，在冰浴条件下中染色20min，得到DAPI染色后的盖玻片；
随后向DAPI染色后的盖玻片滴加30μL的0.001‰的Calcoflour White染色液，在室温25℃下进行染色5min，得到Calcoflour White染色后的盖玻片；
(c)、将步骤(b)Calcoflour White染色后的盖玻片用PBS缓冲液冲洗1min，随后取洁净的载玻片，在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片，制得染色镜检片。
实施例2
一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
(a)、将干燥的盖玻片以45度的角度***培养有真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片；
所述爬片培养的时间为10d，温度为25℃；
(b)、向步骤(a)附着有真姬菇菌丝的盖玻片滴加220μL的4μg/ml DAPI染色液，在冰浴条件下中染色30min，得到DAPI染色后的盖玻片；
随后向DAPI染色后的盖玻片滴加80μL的0.002‰的Calcoflour White染色液，在室温25℃下进行染色8min，得到Calcoflour White染色后的盖玻片；
(c)、将步骤(b)Calcoflour White染色后的盖玻片用PBS缓冲液冲洗2min，随后取洁净的载玻片，在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片，制得染色镜检片。
实施例3
一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
(a)、将干燥的盖玻片以45度的角度***具有培养7天的真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片；
所述爬片培养的时间为9d，温度为24℃；
(b)、向步骤(a)附着有真姬菇菌丝的盖玻片滴加190μL的6μg/ml DAPI染色液，在冰浴条件下中染色22min，得到DAPI染色后的盖玻片；
随后向DAPI染色后的盖玻片滴加50μL的0.002‰的Calcoflour White染色液，在室温25℃下进行染色7min，得到Calcoflour White染色后的盖玻片；
(c)、将步骤(b)Calcoflour White染色后的盖玻片用PBS缓冲液冲洗3min，随后取洁净的载玻片，在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片，制得染色镜检片。
实施例4
一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
(a)、将干燥的盖玻片以45度的角度***具有培养7天的真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片；
所述爬片培养的时间为9d，温度为21℃；
(b)、向步骤(a)附着有真姬菇菌丝的盖玻片滴加210μL的7μg/ml DAPI染色液，在冰浴条件下中染色28min，得到DAPI染色后的盖玻片；
随后向DAPI染色后的盖玻片滴加70μL的0.008‰的Calcoflour White染色液，在室温25℃下进行染色9min，得到Calcoflour White染色后的盖玻片；
(c)、将步骤(b)Calcoflour White染色后的盖玻片用PBS缓冲液冲洗3min，随后取洁净的载玻片，在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片，制得染色镜检片。
实施例5
一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
(a)、将干燥的盖玻片以45度的角度***具有培养7天的真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片；
所述爬片培养的时间为10d，温度为22℃；
(b)、向步骤(a)附着有真姬菇菌丝的盖玻片滴加200μL的5μg/ml DAPI染色液，在冰浴条件下中染色30min，得到DAPI染色后的盖玻片；
随后向DAPI染色后的盖玻片滴加50μL的0.002‰的Calcoflour White染色液，在室温25℃下进行染色10min，得到Calcoflour White染色后的盖玻片；
(c)、将步骤(b)Calcoflour White染色后的盖玻片用PBS缓冲液冲洗2min，随后取洁净的载玻片，在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片，制得染色镜检片。
实施例6
一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
(a)、将干燥的盖玻片以45度的角度***具有培养7天的真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片；
所述爬片培养的时间为10d，温度为22℃；
(b)、向步骤(a)附着有真姬菇菌丝的盖玻片滴加200μL的5μg/ml DAPI染色液，在冰浴条件下中染色30min，得到DAPI染色后的盖玻片；
随后向DAPI染色后的盖玻片滴加50μL的0.0005‰的Calcoflour White染色液，在室温25℃下进行染色10min，得到Calcoflour White染色后的盖玻片；
(c)、将步骤(b)Calcoflour White染色后的盖玻片用PBS缓冲液冲洗2min，随后取洁净的载玻片，在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片，制得染色镜检片。
本实施例除Calcoflour White染色步骤中采用浓度为0.0005‰的条件对菌丝进行染色外，其余同实施例5。
对比例1
一种真姬菇菌丝核相染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
(a)、将干燥的盖玻片以45度的角度***具有培养7天的真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片；
所述爬片培养的时间为10d，温度为22℃；
(b)、向步骤(a)附着有真姬菇菌丝的盖玻片滴加50μL的0.002‰的CalcoflourWhite染色液，在室温25℃下进行染色10min，得到Calcoflour White染色后的盖玻片；随后向Calcoflour White染色后的盖玻片滴加200μL的5μg/ml DAPI染色液，在冰浴条件下染色30min，得到DAPI染色后盖玻片；
(c)、将步骤(b)DAPI染色后的盖玻片用PBS缓冲液冲洗2min，随后取洁净的载玻片，在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片，制得染色镜检片。
本对比例除步骤(b)中先进行Calcoflour White染色，后进行DAPI染色外，其余同实施例5。
效果例1
现将本申请实施例5、6以及对比例1制备得到的染色镜检片置于蔡司Axioobserver荧光显微镜下，使用10×目镜，100×物镜，于紫外光下观察，其结果如下所示。
图2为本发明实施例5提供的真姬菇菌丝染色后的显微图像；
参照图2所示，图2中A、B、C和D为经本发明提供的方法染色后用蔡司Axioobserver荧光显微镜拍摄的真姬菇菌丝细胞结构；其中：a为菌丝内细胞壁，b为细胞核，c为锁状联合内细胞壁。
进而由图2得到，采用本申请实施例5制备得到的染色镜检片对真姬菇菌丝进行观察，能够较好的观察到真姬菇菌丝细胞核、细胞壁和锁状联合结构，具有荧光信号质量高、图像清晰度较高，结构完整的优势。
图3为本发明对比例1提供的真姬菇菌丝染色后的显微图像；
参照图3所示，对比例1是步骤(b)中先进行Calcoflour White染色，后进行DAPI染色的实施方式，其中：b为细胞核，c为锁状联合内细胞壁。
由图3可知，对比例1制备得到的染色镜检片真姬菇菌丝细胞壁尚可勉强观察到，但细胞核图像模糊较难分辨。而采用本申请实施例5先进行DAPI染色，后进行CalcoflourWhite染色的顺序所得到的染色镜检片可以同时观察到真姬菇菌丝细胞核、细胞壁和锁状联合结构，图像清晰度较高，结构完整。
图4为本发明实施例6提供的真姬菇菌丝染色后的显微图像。
参照图4所示，实施例6为步骤(b)Calcoflour White染色步骤中采用浓度为0.0005‰的条件对菌丝进行染色的实施方式，其中：a为菌丝内细胞壁，b为细胞核，c为锁状联合内细胞壁。
由图4中的A、B可知，染色后的显微图像真姬菇菌丝内细胞核清晰可见，但是真姬菇菌丝内细胞壁和锁状联合的结构均较难辨别，图像模糊。而本申请实施例5步骤(b)采用Calcoflour White染色步骤中采用浓度为0.002‰的实施方案得到的染色镜检片可以同时观察到真姬菇菌丝细胞核、细胞壁和锁状联合结构，图像清晰度较高，结构完整。
综上所述，通过本申请染色方法能够获得组织结构清晰的真姬菇菌丝细胞核和细胞壁结构图像，可以为真姬菇的生理、遗传和形态学研究提供严谨可靠方法，具有较好的科研应用前景，同时该染色方法还具有可操作性强、可重复性高以及荧光信号质量高的特点。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种真姬菇菌丝核相染色方法，其特征在于，所述染色方法包括以下步骤：
提供附着有真姬菇菌丝的盖玻片，然后依次对盖玻片上的真姬菇菌丝进行DAPI染色和Calcoflour White染色，随后封片，完成染色。
2.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，所述附着有真姬菇菌丝的盖玻片的制备方法包括以下步骤：
将盖玻片***培养有真姬菇菌落的培养基中进行爬片培养，得到附着有真姬菇菌丝的盖玻片。
3.根据权利要求2所述的染色方法，其特征在于，所述盖玻片***的角度为45度。
4.根据权利要求2所述的染色方法，其特征在于，所述爬片培养在暗培养条件下进行；
优选地，所述爬片培养的时间为7～12，优选为10d；
优选地，所述爬片培养的温度为20～25℃，优选为22℃。
5.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，DAPI染色步骤中，所用的DAPI染色液的浓度为3～8μg/mL，优选为5μg/mL；
优选地，所述DAPI染色液的滴加量为180～220μL。
6.根据权利要求5所述的染色方法，其特征在于，所述DAPI染色在0～4℃条件下进行；
优选地，所述DAPI染色的时间为20～30min。
7.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，所述Calcoflour White染色步骤中，所用的Calcoflour White染色液的浓度为0.001～0.01‰，优选为0.002‰；
优选地，所述Calcoflour White染色液的滴加量为30～80μL。
8.根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于，所述Calcoflour White染色的染色时间为5～10min。
9.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，所述染色方法还包括在CalcoflourWhite染色后封片前，对真姬菇菌丝进行洗涤的步骤；
优选地，所述洗涤为PBS缓冲液冲洗；
优选地，所述洗涤的时间为1～3min，优选为2min。
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